KR102002057B1 - 병원균 검출을 위한 등온 증폭 기반의 마이크로 디바이스 및 병원균 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

병원균 검출을 위한 등온 증폭 기반의 마이크로 디바이스 및 병원균 검출 방법이 개시된다. 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스는 분석 대상을 포함하는 샘플이 도입되는 샘플 챔버가 중앙에 형성되고, 샘플 챔버와 각각 연결되는 복수의 반응 챔버가 샘플 챔버의 원주 방향으로 배치되어 형성되는 메인 플라스틱 기재; 메인 플라스틱 기재의 하부면을 실링시키는 하부 실링필름; 메인 플라스틱 기재의 상부면을 실링시키는 상부 실링필름; 반응 챔버마다 배치되는 것으로 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification) 시약과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 함유하는 제1 여과지; 및 루프-매개 등온증폭 이후, 각 반응 챔버마다 배치되어 증폭된 타겟 유전자를 발색시키는 것으로 피세틴(Fisetin)을 함유하는 제2 여과지를 포함한다.

Description

병원균 검출을 위한 등온 증폭 기반의 마이크로 디바이스 및 병원균 검출 방법{ISOTHERMAL AMPLIFICATION MICRODEVICE FOR DETECTION OF PATHOGENS AND METHOD THE SAME}
본 발명은 병원균 검출을 위한 마이크로 디바이스 및 병원균 검출 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 병원균 검출을 위한 등온 증폭 기반의 마이크로 디바이스 및 병원균 검출 방법에 관한 것이다.
미소 체적을 갖는 샘플 유체를 이용하여 복잡한 생물화학적 반응을 달성하기 위하여 제조되는 마이크로 디바이스는 세포, 단백질, DNA 연구 등 다양한 분야에서 광범위하게 이용된다. 대표적으로 PCR(polymerase chain reaction) 기반의 마이크로 디바이스가 이용된다. PCR 기반 마이크로 디바이스는 박테리아 진단 등에 활발히 사용되고 있으나 다소 복잡한 장치인 써모 싸이클러(thermocycler)를 이용한 복합적인 온도 제어가 요구된다. PCR 기반 마이크로 디바이스가 현장 진단(point-of-care test)에서 한계를 갖는 이유다. PCR 기반 마이크로 디바이스의 이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 종류의 등온 증폭 기술이 개발되고 있다.
대안적인 기술들 중에서는 항온(constant temperature)에서 수행될 수 있는 반응이 가장 유리한데, 대표적으로 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification; 루프-매개 등온 증폭법)가 있다. LAMP를 이용한 핵산 증폭은 두 가지 측면에서 장점이 있다. 첫째, LAMP 반응은 프라이머 2~3쌍이 요구되므로 매우 특이적이고 높은 증폭 효율을 보인다. 둘째, LAMP 반응은 오직 DNA 폴리머라제만을 이용하여 지수 증폭(exponential amplification)을 달성할 수 있다. 핵산 시퀀스 기반의 증폭 기술이나 헬리카제-의존형 증폭 기술(HDA; helicase-dependent amplification)이 추가적인 효소를 요구하는 것과는 대조적이다. 따라서 LAMP는 칩 형태의 마이크로 디바이스에 적용되기에 매우 적합하다.
LAMP에서는 반응 부산물로 파이로인산(pyrophosphate)이 대량 합성된다. 파이로인산이 성공적인 LAMP 반응이 일어났음을 보여주는 지표로 고려되는 이유다. LAMP 반응에서의 파이로인산 이온은 마그네슘 이온과 반응하여 침전물을 형성한다. 이에 따라 LAMP 반응의 검출을 위해 파이로인산을 모니터링 하는 많은 기술들이 제안된 바 있다. 예컨대 탁도계(turbidimeter)를 이용한 탁도 측정 방법, 칼세인(calcein)과 같은 킬레이트제를 이용한 형광 검출 방법, HNB(hydroxynaphthol blue)나 EBT(Eriochrome Black T)를 이용한 비색 검출 방법 등이다. 한편 마그네슘 이온 농도 또한 LAMP 반응을 모니터링 하는 데 이용되는데, 이는 마그네슘 이온이 파이로인산과 반응 할 때 이온의 농도가 변하기 때문이다. 이에 따라 HNB 및 EBT가 대안적인 지표로 제안된 바 있다. HNB 및 EBT는 반응물의 마그네슘 이온 농도에 따라 용액의 색이 변하기 때문이다. 그러나 상술한 방법들은 주 반응물 보다는 부산물을 검출하는 간접 방식이라는 점에서 한계가 있다. 더욱이 파이로인산의 백색 탁도는 육안으로 구별하기 어렵다.
LAMP 반응의 검출을 위한 직접 방식의 기술로는 EtBr(ethidium bromide) 및 SYBR Green I와 같은 형광제를 이용한 겔 전기영동법 및 형광 탐지 방법이 있다. 겔 전기영동법은 DNA 증폭을 분석하는 표준 방법이다. 하지만 겔 전기영동법은 복잡한 장치들이 요구될뿐더러 시간이 많이 소요된다. 또한 EtBr 및 SYBR Green I는 모두 유전자독성을 가지고 돌연변이 유발물질로 알려져 있어 인체친화적이지 못하다는 단점이 있다.
한국공개특허 제10-2017-0078456호 (2017.7.7 공개)
본 발명은 DNA 추출, LAMP 핵산 증폭 및 온-칩 병원균의 복합 검출을 통합 수행할 수 있고, 특히 증폭된 핵산을 인체친화적인 방법으로 칩 상에서 검출할 수 있는 마이크로 디바이스를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 분석 대상을 포함하는 샘플이 도입되는 샘플 챔버가 중앙에 형성되고, 샘플 챔버와 각각 연결되는 복수의 반응 챔버가 샘플 챔버의 원주 방향으로 배치되어 형성되는 메인 플라스틱 기재; 메인 플라스틱 기재의 하부면을 실링시키는 하부 실링필름; 메인 플라스틱 기재의 상부면을 실링시키는 상부 실링필름; 반응 챔버마다 배치되는 것으로 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification) 시약과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 함유하는 제1 여과지; 및 루프-매개 등온증폭 이후, 각 반응 챔버마다 배치되어 증폭된 타겟 유전자를 발색시키는 것으로 피세틴(Fisetin)을 함유하는 제2 여과지를 포함하는 마이크로 디바이스가 제공될 수 있다.
또한, 샘플 챔버에 배치되는 것으로 도입된 샘플로부터 타겟 유전자만을 통과시키는 제3 여과지를 더 포함할 수 있고, 이 때 상기 제3 여과지는 폴리도파민(polydopamine)이 코팅된 여과지일 수 있다.
또한, 샘플 챔버를 기준으로 메인 플라스틱 기재를 회전시키는 회전부와, 루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 가열부를 더 포함할 수 있다.
한편, 상부 실링필름은 메인 플라스틱 기재의 상부면에 탈부착 가능하도록 접합되고, 샘플 챔버와 상응하는 영역에는 샘플 도입을 위한 샘플 도입구가 적어도 하나 이상 형성될 수 있다.
또한, 상기 샘플 챔버의 크기는 각 반응 챔버의 크기보다 크게 형성되는 마이크로 디바이스.
나아가 각 반응 챔버에 배치되는 제1 여과지들 중 적어도 일부는 서로 다른 프라이머를 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 상기 마이크로 디바이스를 이용한 병원균 검출 방법이고, a) 샘플 챔버에 샘플을 도입하는 단계; b) 샘플 챔버를 기준으로 메인 플라스틱 기재를 회전시켜 원심력에 의해 샘플을 각 반응 챔버로 분배시키는 단계; c) 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification)을 수행하여 타겟 유전자를 증폭시키는 단계; d) 상부 실링필름을 탈착한 후, 각 반응챔버에 제2 여과지를 배치하는 단계; 및 e) 반응챔버의 형광 스펙트럼을 획득하여 타겟 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 병원균 검출 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계; 증폭된 타겟 유전자에 피세틴(Fisetin)을 첨가하여 타겟 유전자를 발색시키는 단계; 및 형광 신호를 통해 타겟 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 병원균 검출 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 구체예들에 따른 마이크로 디바이스는 DNA 정제, 핵산 증폭 및 검출을 하나의 칩에서 구현할 수 있으며, 특히 생체 활성 식물 플라보노이드인 피세틴(fisetin)을 증폭된 유전자 검출을 위한 발색염료로 사용함으로써 현장 진단에 적합하고 친환경적인 온-칩 검출이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스를 개략적으로 도시한 분해 사시도이다.
도 2는 도 1의 마이크로 디바이스에서 제1,3 여과지가 배치된 모습을 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 마이크로디바이스를 제조하는 과정을 나타내는 도면이다.
도 4a는 마이크로 디바이스, 도 4b는 빨간색 잉크를 샘플 챔버에 주입한 후, 도 4b는 회전장치로 회전한 후의 사진을 각각 나타낸다.
도 5a는 튜브 챔버 및 여과지의 사진이고, 도 5b는 형광 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 6은 마이크로 디바이스에서의 복합 검출 실험 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 마이크로 디바이스를 이용한 온-칩 분석의 수행 과정을 개략적으로 나타내는 도면이다. 도 7a는 온-칩 분석의 과정을 요약하여 나타내고, 도 7b는 샘플로부터 DNA가 정제되는 원리를 나타낸다. 도 7c는 피세틴에 의한 DNA 검출 매커니즘을 나타낸다.
도 8은 온-칩 분석 수행 결과를 나타낸다. 도 8a는 Salmonella spp.(살모넬라 균) 농도별로 UV 조사 후의 마이크로 디바이스를 촬영한 사진이고, 도 8b는 Salmonella spp.(살모넬라 균) 농도별 형광 세기를 나타내는 그래프이다. 도 8c는 총 분석 시간을 나타내는 표이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 하기의 설명은 본 발명을 구체적인 예시를 들어 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 기술적 사상이 하기의 설명에 한정되는 것은 아니다. 그리고 첨부된 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 기술적 사상은 첨부된 도면에 한정되지 않는다. 또한 도면에서 각 부재의 두께나 크기 등은 설명의 편의 등을 위해 과장, 생략, 개략적으로 도시될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 위치관계나 방향은 특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에 첨부된 도면을 기준으로 한다.
본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 공간에 대한 설명이나 위치관계에 대한 설명은 본 발명을 이루는 구성요소들 간의 상대적인 위치를 의미한다. 또한 특별히 언급하지 않는 한, 하나의 구성요소와 다른 구성요소 사이의 공간에는 또 다른 구성요소가 존재할 수 있다. 예를 들어 본 명세서에서 하나의 구성요소의 "상부에" 또는 "위에" 다른 구성요소가 위치함을 언급하는 경우, 하나의 구성요소의 바로 위에 다른 구성요소가 위치하는 경우뿐만 아니라, 하나의 구성요소와 다른 구성요소들 사이에 또 다른 구성요소가 위치하는 경우까지를 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스(100)를 개략적으로 도시한 분해 사시도이고, 도 2는 도 1의 마이크로 디바이스(100)에서 제1,3 여과지(140,150)가 배치된 모습을 도시한 도면이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 마이크로 디바이스(100)는 메인 플라스틱 기재(110)와, 메인 플라스틱 기재(110)의 하부면을 실링시키는 하부 실링필름(120)과, 메인 플라스틱 기재(110)의 상부면을 실링시키는 상부 실링필름(130)을 포함한다.
메인 플라스틱 기재(110)는 열가소성 플라스틱 소재로 형성될 수 있다. 예를 들어 메인 플라스틱 기재(110)는 PC(폴리카보네이트), PMMA(폴리메틸메타크릴레이트) 또는 PP(폴리프로필렌)소재를 필름형으로 가공함으로써 형성될 수 있다. 메인 플라스틱 기재(110)의 두께는 대략 400㎛ ~ 600㎛ 일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
메인 플라스틱 기재(110)에는 샘플 챔버(111)와 복수의 반응 챔버(112)가 형성된다. 반응챔버(112)의 개수는 한정되지 않는다. 도 1에서는 반응 챔버(112)가 8개 형성된 경우를 도시하고 있으나 반응 챔버(112)의 개수는 이보다 많거나 적을 수 있다. 샘플챔버(111)와 반응 챔버(112)는 메인 플라스틱 기재(110)에 복수의 관통 부분을 형성함으로써 생성될 수 있다. 샘플 챔버(111)와 반응 챔버(112)의 형태는 원형일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만 편의를 위해 본 명세서에서는 샘플 챔버(111)와 반응 챔버(112)의 형태가 원형인 경우를 중심으로 설명한다. 샘플 챔버(111)와 반응 챔버(112)의 형태가 원형일 경우, 메인 플라스틱 기재(110)에 CNC(Computerized Numerical Control) 장치를 이용하여 결정된 위치에 쓰루홀(through hole)들을 형성하는 방식으로 샘플 챔버(111)와 반응 챔버(112)가 만들어질 수 있다.
일 구체예에 있어서, 샘플 챔버(111)의 크기는 반응 챔버(112)보다 클 수 있다. 예를 들어 샘플 챔버(111)가 6mm 내지 10mm의 직경을 가질 때, 각 반응 챔버(112)는 2mm 내지 3mm의 직경을 가질 수 있다. 더욱 구체적으로 샘플 챔버(111)가 8mm의 직경을 가질 때, 각 반응 챔버(112)는 2.5mm의 직경을 가질 수 있다. 물론 샘플 챔버(111)와 반응 챔버(112)의 높이는 메인 플라스틱 기재(110)의 높이에 상응할 것이다. 챔버의 부피를 기준으로 볼 때 샘플 챔버(111)는 대략 100 μL, 반응 챔버(112)는 대략 10 μL의 유체를 수용할 수 있는 크기를 가질 수 있다.
일 구체예에 있어서, 샘플 챔버(111)는 메인 플라스틱 기재(110)의 중앙에 형성될 수 있고 복수의 반응 챔버(112)는 샘플 챔버(111)의 원주 방향으로 배치될 수 있다. 반응 챔버(112)는 등간격으로 형성될 수 있다. 예컨대 반응 챔버(112)가 도 1에서와 같이 샘플 챔버(111)의 원주 방향으로 8개 형성되는 경우, 반응 챔버(112)는 샘플 챔버(111)의 중심점(central point)을 기준으로 45°간격으로 형성될 수 있다.
샘플 챔버(111)와 반응 챔버(112)는 상호 연결된다. 이를 위하여 메인 플라스틱 기재(110)에는 샘플 챔버(111)와 반응 챔버(112)를 각각 연결하는 마이크로 채널(미표기)이 형성될 수 있다. 마이크로 채널은 샘플 챔버(111)와 반응 챔버(112)를 연결시키는 라인(line) 형태를 가질 수 있으며 CNC 장치를 이용하여 형성할 수 있다. 이 때 메인 플라스틱 기재(110)의 두께가 실질적으로 마이크로 채널의 높이를 형성하게 된다. 일 구체예에 있어서, 마이크로 채널의 길이는 4mm 내지 6mm 일 수 있고, 보다 구체적으로는 5mm 일 수 있다. 마이크로 채널은 샘플 챔버(111)로부터 반응 챔버(112)로 유체를 이송시킨다.
샘플 챔버(111)에는 분석 대상을 포함하는 샘플이 도입된다. 여기에서 분석 대상은 표적 미생물일 수 있다. 표적 미생물의 예로는 바이러스, 세균, 원생동물, 효모, 곰팡이, 버섯, 조류, 리케차, 동식물의 분화되지 않은 세포, 조직 배양물 등을 포함한다. 보다 구체적으로 표적 미생물은 식중독을 유발할 수 있는 다양한 종류의 식품매개 병원균(foodborne pathogens)을 포함할 수 있다. 식품매개 병원균의 대표적인 예로는 대장균(E.coli; Escherichia coli)이 있다. 샘플은 분석 대상을 포함하는 유체(fluid)일 수 있다. 샘플의 예로는 혈액, 전혈과 같은 바이오 샘플, 또는 우유, 주스와 같은 음료 액적 등이 있다.
반응 챔버(112)는 샘플 챔버(111)로부터 타겟 유전자를 전달 받는다. 그리고 반응 챔버(112)에서는 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification) 방법에 의해 타겟 유전자가 증폭된다. 루프-매개 등온증폭 방법은 일정한 온도에서 접합 및 신장이 이루어지는 핵산 증폭법의 일 종류다. 루프-매개 등온증폭 방법의 개념 및 원리 등은 당업계에 알려져 있으므로 구체적인 설명은 생략한다.
하부 실링필름(120)은 메인 플라스틱 기재(110)의 하부면을 실링한다. 상부 실링필름(130)은 메인 플라스틱 기재(110)의 상부면을 실링한다. 하부 실링필름(120) 및 상부 실링필름(130)은 투명성을 갖는 수지로 형성되며 일면에는 점착면(adhesive side)을 가질 수 있다. 이 때 점착면이 메인 플라스틱 기재(110)를 향하도록 위치된 상태에서 각 실링필름(120,130)이 메인 플라스틱 기재(110)에 상하부면을 각각 실링할 수 있다.
상부 실링필름(130)에는 샘플이 도입될 수 있는 샘플 도입구(131)가 형성될 수 있다. 샘플 도입구(131)는 1 이상 형성될 수 있으며, 상부 실링필름(130)이 메인 플라스틱 기재(110)의 상부면을 덮었을 때 샘플 챔버(111)에 상응하는 위치에 형성될 수 있다. 샘플 도입구(131)는 통상의 시린지(syringe) 주입구에 상응하는 크기를 가질 수 있다.
마이크로 디바이스(100)는 반응 챔버(112)마다 배치되는 제1 여과지(140)와, 루프-매개 등온증폭 이후에 반응 챔버(112)마다 배치되는 제2 여과지(160)와, 샘플 챔버(111)에 배치되는 제3 여과지(150)를 더 포함할 수 있다. 제1 여과지(140)는 타겟 유전자의 루프-매개 등온증폭을 위한 시약 및 프라이머 세트를 반응 챔버(112)에 제공할 수 있다. 제2 여과지(160)는 루프-매개 등온증폭 반응 후에, 증폭된 유전자를 발색시키기 위한 발색염료를 제공할 수 있다. 제3 여과지(150)는 샘플로부터 증폭하고자 하는 유전자를 분리해 내기 위해 제공될 수 있다.
제1 여과지(140)는 각 반응 챔버(112)마다 배치될 수 있다. 이를 위해 제1 여과지(140)는 반응 챔버(112)에 삽입될 수 있는 크기와 형태를 가질 수 있다. 제1 여과지(140)가 반응 챔버(112)에 빈틈 없이 삽입되는 것이 보다 바람직하다. 일 구체예에 있어서 제1 여과지(140)는 셀룰로오즈 멤브레인 필터일 수 있다. 이 때 제1 여과지(140)의 포어사이즈(pore size)는 0.1㎛~0.3㎛, 보다 구체적으로는 0.2㎛일 수 있다.
제1 여과지(140)는 루프-매개 등온증폭 시약(LAMP reagents)과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 함유한다. 일 구체예에 있어서, 루프-매개 등온증폭 시약과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 포함하는 용액에 여과지를 담궈 상기 용액을 흡수시킨 후에 상온에서 건조 처리하는 방식으로 제1 여과지(140)를 형성할 수 있다.
루프-매개 등온증폭 시약은 Bst DNA 폴리머라제(중합효소), 등온 증폭 버퍼(10x), dNTPs, 100 mM MgSO4 등을 포함할 수 있다. 이러한 루프-매개 등온증폭 시약은 통상의 방법을 통해 입수 가능하다.
프라이머는 샘플에 포함되는 분석 대상, 즉 표적 미생물의 유전자에 특이적으로 혼성화 된다. 프라이머는 자유 3'말단 하이드록시기를 포함하는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 이와 같은 프라이머는 표적 미생물에 존재하는 핵산과 혼성화되어 표적 미생물의 타겟 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 프라이머는 표적 미생물의 존부를 판단할 수 있도록 표적 미생물의 특징적인 유전자에 혼성화되도록 제조될 수 있으며, 샘플 내에 목적하는 미생물이 존재하는 경우 루프-매개 등온증폭 반응에 의해 상기 특징적인 유전자의 염기서열이 증폭된다. 따라서 증폭된 앰플리콘(amplicon)을 검출함으로써 표적 미생물의 존부를 확인할 수 있다. 이러한 프라이머는 증폭하고자 하는 타겟 유전자의 종류에 따라 설계될 수 있으며, 본 발명에서는 각 표적 미생물의 타겟 유전자에 따라 알려진 방법에 의해 설계된 프라이머를 사용할 수 있다.
한편 제1 여과지(140)는 각 반응 챔버(112)마다 배치되며, 이 때 각 제1 여과지(140)에 함유되는 프라이머들은 서로 다른 타겟 유전자에 특이적으로 혼성화되도록 설계될 수 있다. 이 경우 반응 챔버(112) 및 제1 여과지(140)의 수가 늘어날수록 마이크로 디바이스(100)에서 한 번의 샘플 도입을 통해 검출할 수 있는 표적 미생물의 수가 늘어날 수 있다. 즉 마이크로 디바이스(100)에서 다중 검출이 가능하다.
제2 여과지(160)는 제1 여과지(140)와 마찬가지로 각 반응 챔버(112)마다 배치될 수 있다. 이를 위해 제2 여과지(160)는 반응 챔버(112)에 삽입될 수 있는 크기와 형태를 가질 수 있다. 제2 여과지(160)가 반응 챔버(112)에 빈틈 없이 삽입되는 것이 보다 바람직하다. 일 구체예에 있어서 제2 여과지(160)는 셀룰로오즈 멤브레인 필터일 수 있다. 이 때 제2 여과지(160)의 포어사이즈(pore size)는 0.1㎛~0.3㎛, 보다 구체적으로는 0.2㎛일 수 있다.
제2 여과지(160)는 피세틴(Fisetin)을 함유한다. 일 구체예에 있어서, 피세틴을 포함하는 용액에 여과지를 담궈 상기 용액을 흡수시킨 후에 상온에서 건조 처리하는 방식으로 제2 여과지(160)를 형성할 수 있다.
피세틴(Fisetin; 3,7,3',4'-tetrahydroxyflavone)은 생체 활성 식물 플라보노이드이다. 피세틴은 생물 의학 연구에서 다양한 자유 라디칼(free radical) 관련 및 전염병에 유용한 잠재적 치료제로 주목받아 왔다. 그러나 본 발명의 발명자들은 피세틴을 기존의 생물 의학의 관점에서가 아닌 형광 행동에 주목하였다. 피세틴은 이중나선 DNA(Double-stranded DNA)에 삽입되는 방식으로 DNA와 상호 작용한다. 보다 구체적으로 DNA의 존재 하에서 피세틴 분자는 3-OH 및 4-carbonyl 잔기 사이의 여기상태 분자 내 양성자 전이현상(excited-state intramolecular proton trasnfer)으로 인해 정상 상태(normal state)에서 상호변이 상태(tautomeric state)로 전환한다. 정상 상태일 때 피세틴은 수용액에서 약한 형광 특성을 나타내지만, 상호변이 상태일 때 피세틴은 이중나선 DNA에 결합하면서 형광 특성이 강해진다. 이러한 점에 착안하여 본 발명의 발명자들은 생체 활성 식물 플라보노이드인 피세틴의 친환경적 특성과 거대 분자 타겟(예컨대 이중나선 DNA)과 상호작용할 때 나타나는 형광 특성을 활용하여 증폭된 유전자 검출을 위한 발색염료로 사용하고자 하였다. 이에 대해서는 후술할 시험예에서 보다 구체적으로 기술될 것이다.
또한 상술한 피세틴과 이중나선 DNA의 상호 작용은 소수성 결합으로 상대적으로 약한 결합에 해당한다. 이는 기존 DNA 염색에 사용되던 EtBr(Ethidium bromide)와 DNA 사이에 발생하는 상대적으로 강한 결합과 차이가 있다. 후자의 경우 EtBr의 ethidium exocyclic amines의 양이온과 DNA를 구성하는 phosphate기의 음이온과의 정전기적 인력이 강한 수소결합에 해당한다. 따라서 EtBr과 DNA의 상호 작용에서는 DNA가 정상적으로 합성되고 전사 및 번역되는 것을 억제하게 되어 결과적으로 특이한 단백질을 합성하게 되므로 EtBr은 발암물질로 작용할 위험이 높다. 하지만 피세틴의 경우 DNA와 상대적으로 약한 결합을 이루므로 이러한 위험이 낮다는 장점이 있다.
한편, 제2 여과지(160)는 반응 챔버(112)에서 루프-매개 등온 증폭 반응이 수행된 후에 반응 챔버(112)에 배치될 수 있다. 제2 여과지(160)는 증폭된 타겟 유전자를 발색시키는 역할을 하기 때문이다. 이를 위해 상부 실링필름(130)은 메인 플라스틱 기재(110)의 상부면에 탈부착 가능하도록 접합될 수 있다. 일 구체예에 있어서 반응 챔버(112)에 제1 여과지(140)를 배치하여 루프-매개 등온 증폭 반응을 수행한 후, 상부 실링필름(130)을 박리하여 제2 여과지(150)를 배치할 수 있다.
제3 여과지(150)는 샘플 챔버(111)에 배치될 수 있다. 이를 위해 제3 여과지(150)는 샘플 챔버(111)에 삽입될 수 있는 크기와 형태를 가질 수 있다. 제3 여과지(150)가 샘플 챔버(111)에 빈틈 없이 삽입되는 것이 보다 바람직하다. 일 구체예에 있어서 제3 여과지(150)는 셀룰로오즈 멤브레인 필터일 수 있다. 이 때 제3 여과지(150)의 포어사이즈(pore size)는 0.1㎛~0.3㎛, 보다 구체적으로는 0.2㎛일 수 있다.
제3 여과지(150)는 폴리도파민(polydopamine)이 코팅된 여과지일 수 있다. 도파민(Dopamine)은 폴리도파민의 단량체 형태로서, 신경전달물질로 잘 알려져 있다. 도파민은 바다 속 홍합류에서 발견되는 3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌(3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine : L-DOPA) 분자의 모방 분자이다. 특히 도파민의 산화제-유도 자체 고분자화(Oxidant-induced self-polymerization)와 전기화학적 고분자화 반응(Electrochemical polymerization)들에 의해 생성된 폴리도파민은 카테콜(Catechol), 아민(Amine) 및 이민(Imine) 작용기를 가지고 있어 생체물질, 합성 고분자 등의 유기질뿐만 아니라 고체 표면들에서도 강한 결합을 형성하므로 표면 개질(Surface reforming), 표면 변환(Surface modification), 자기조립 다층박막(Self-assembled multilayer), 나노복합체 박막(Nanocomposite thin film)의 형성 등이 가능하다. 도파민의 카테콜 작용기는 산소의 존재하에서 쉽게 산화되며 자체-고분자화(Self-polymerization)에 의해 폴리도파민을 형성할 수 있다. 폴리도파민이 코팅된 제3 여과지(150)는 표면 개질이 되므로, 샘플 챔버(111)로 도입된 샘플 내에 포함된 DNA를 통과시키고 나머지 부산물들(세포파쇄 부산물 등)은 쉬프 염기 반응(Schiff base reaction) 및 킬레이션 반응(chelation reaction)을 통해 반응하여 포집할 수 있다. 즉 폴리도파민이 코팅된 제3 여과지(150)에 의해 샘플 내의 단백질, 칼슘, 기타 박테리아 세포막 등이 폴리도파민에 의해 포집되고, 이에 따라 DNA 만이 제3 여과지(150)를 통과하게 되므로 DNA 정제가 수행될 수 있다. 만약 마이크로 디바이스(100)로 도입되는 샘플이 DNA 정제가 수행된 샘플일 경우에, 제3 여과지(150)는 생략될 수도 있다.
일 구체예에 있어서, 도파민 또는 이의 유도체가 용해된 혼합액을 준비하고 여과지를 담궈 상기 혼합액으로 여과지 표면을 적신 후에 상온에서 건조 처리하는 방식으로 제3 여과지(150)를 형성할 수 있다.
마이크로 디바이스(100)는 샘플 챔버(111)를 기준으로 메인 플라스틱 기재(110)를 회전시키는 회전부(미도시)와, 루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 가열부(미도시)와, 형광물질이 여기 되어 발생된 광신호를 검출하여 전기적 신호로 바꾸어 주는 광검출기(미도시)를 더 포함할 수 있다.
회전부는 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 회전장치를 사용할 수 있으며, 마이크로 디바이스(100)가 거치되며 회전하는 회전체와, 회전체를 회전시키는 구동장치와, 회전체의 회전속도 등을 제어하는 제어부 등을 포함하여 구성될 수 있다. 예를 들어 마이크로 디바이스(100)를 회전체에 거치시킨 후, 회전체를 회전시키면 마이크로 디바이스(100)의 중앙에 형성된 샘플 챔버(111)의 중심점을 기준으로 마이크로 디바이스(100)가 회전될 수 있다. 그리고 마이크로 디바이스(100)가 회전할 때 발생하는 원심력에 의해 샘플 챔버(111)에 도입된 샘플이 반응 챔버(112)로 이동될 수 있다. 반응 챔버(112)가 복수인 경우 샘플 챔버(111)에 도입된 샘플이 각 반응 챔버(112)로 분배될 수 있다.
가열부는 루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 것으로, 특정 종류로 제한되지 않는다. 예를 들어 가열부는 구리 가열 블록, 박막 히터, 고무 히터, 적외선 히터, 할로겐 히터, 마이크로웨이브, 유도 가열 장치 등 다양한 장치를 사용할 수 있다.
광검출기는 광원에서 발생된 빛에 의해 타겟 유전자의 발색물질로(여기에서는 피세틴)부터 형광물질이 여기 되어 발생된 광신호를 검출하여 전기적 신호로 변환한다. 이러한 광검출기는 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 광검출기를 사용할 수 있으며 광신호의 종류에 따라 다이오드형 광검출 소자, 광전도체형 광검출 소자, CCD 등이 사용될 수 있다. 일 구체예에 있어서 광원은 UV 광원이고, 광검출기는 분광광도계(UV-visible spectrophotometer)일 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 마이크로 디바이스는 첫째, 하나의 장치를 통해 다중 검출이 가능하다. 구체적으로 마이크로 디바이스(100)는 샘플 챔버(111)로부터 복수의 반응 챔버(112)로 샘플이 분배되며 각 반응 챔버(112)에는 제1 여과지(140)들이 배치되는데, 제1 여과지(140)에 함유되는 프라이머를 달리 하여 각 반응 챔버(112)마다 다른 종류의 타겟 유전자를 검출할 수 있기 때문이다. 나아가 제1 여과지(140)의 교체 및 배치가 용이하므로 다양한 형태의 병원균을 검출할 수 있는 마이크로 디바이스(100)를 용이하게 제작할 수 있다. 둘째, 전통적인 PCR 디바이스에 비해 간단하다. 기존 PCR 디바이스의 경우 복잡한 히팅 수단 등이 요구되는데, 본 발명에 따른 마이크로 디바이스(100)에서는 LAMP를 기반으로 하므로 그 구성이 상대적으로 크게 간단해진다. 셋째, 피세틴을 LAMP 검출에 발색물질로 이용함으로써 타겟 앰플리콘들을 직접 검출할 수 있을 뿐더러, 인체 친화적이다. 종래 사용되던 검출 방법은 부산물을 검출하는 간접 방식이거나, 직접 방식이더라도 유전자독성을 갖거나 돌연변이 유발물질로 알려져 있어 인체친화적이지 못하였기 때문이다. 나아가 피세틴은 이중나선 DNA와 상호작용하여 강한 형광 특성을 나타내므로 마이크로 디바이스의 전체적인 분석 민감도를 향상시킬 수 있다.
한편, 본 발명은 병원균 검출 방법을 추가적으로 제공할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 병원균 검출 방법은 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계; 증폭된 타겟 유전자에 피세틴(Fisetin)을 첨가하여 타겟 유전자를 발색시키는 단계; 및 형광 신호를 통해 타겟 유전자를 검출하는 단계를 포함한다. 각 단계의 구체적인 내용은 앞에서 설명한 것과 동일하므로 중복 설명은 생략하도록 한다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로 디바이스를 이용한 병원균 검출 방법을 추가적으로 제공할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 병권균 검출 방법은 a) 샘플 챔버에 샘플을 도입하는 단계; b) 샘플 챔버를 기준으로 메인 플라스틱 기재를 회전시켜 원심력에 의해 샘플을 각 반응 챔버로 분배시키는 단계; c) 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification)을 수행하여 타겟 유전자를 증폭시키는 단계; d) 상부 실링필름을 탈착한 후, 각 반응챔버에 제2 여과지를 배치하는 단계; 및 e) 반응챔버의 형광 스펙트럼을 획득하여 타겟 유전자를 검출하는 단계를 포함한다. 각 단계의 구체적인 내용은 앞에서 설명한 것과 동일하므로 중복 설명은 생략하도록 한다.
시험예
이하 본 발명의 시험예들에 대해 설명한다. 다만 본 발명이 하기 시험예들에 의해 제한되지 않음을 밝혀둔다.
(1) 마이크로 디바이스의 제조
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 마이크로디바이스를 제조하는 과정을 나타내는 도면이다. 도 3을 참조하면, 중앙에 샘플 챔버(111)가 형성되고 8개의 반응 챔버(112)가 샘플 챔버(111)의 원주 방향으로 배치된 메인 플라스틱 기재(110)를 폴리카보네이트 필름(Goodfellow社)으로 제작하였다(두께 500㎛). 샘플 챔버(111)의 직경은 8mm, 반응 챔버(112)의 직경은 2.5mm 였으며 샘플 챔버(111)와 반응 챔버(112)를 연결하는 마이크로 채널의 직경 및 길이는 각각 2.5mm, 5mm 였다. 메인 플라스틱 기재(110)의 하부를 하부 실링필름(120, BioFACT社)으로 실링하였다(이상 도 3a).
셀룰로오즈 멤브레인 필터(포어사이즈 0.2㎛, CHMLAB group)을 반응 챔버(112)의 크기에맞추어 재단하고 루프-매개 등온증폭 시약(LAMP reagents) 및 프라이머 세트를 함유하는 용액에 담근 후에 꺼내어 상온에서 건조 처리하여 제1 여과지(140)를 제조하였다. 제1 여과지(140)는 8개 제조되었으며, 프라이머 세트를 달리하여 4종의 제1 여과지(140)가 제조되었다. 이후 제1 여과지(140)를 반응 챔버(112)에 배치하였다. 루프-매개 등온증폭 시약(LAMP reagents)는 New England BioLabs社의 제품을 이용하였으며, 프라이머 세트는 각각 E.coli O157:H7(대장균), Salmonella spp.(살모넬라 종), S.aureus(황색포도상구균), C.polykrikoides(코클로디니움 폴리크리코이데스)를 타겟으로 하여 설계되었다(이상 도 3b).
그 외 제2 여과지(160) 및 제3 여과지(150)를 셀룰로오즈 멤브레인 필터(포어사이즈 0.2㎛, CHMLAB group)를 이용하여 제조하였다. 제2 여과지(160)는 피세틴을 포함하는 용액(Sigma-Aldrich社)에 여과지를 담근 후에 꺼내서 상온에서 건조 처리하여 제조되었으며, 제3 여과지(150)는 도파민 하이드로클로라이드가 용해된 혼합액(Sigma-Aldrich社)에 여과지를 담근 후에 꺼내서 상온에서 건조 처리하여 제조되었다. 제3 여과지(150)는 샘플 챔버(111)에 배치되었다.
메인 플라스틱 기재(110)의 상부를 상부 실링필름(130, BioFACT社)로 실링하였다. 상부 실링필름(130)의 중앙에는 샘플 도입구(131)를 형성하였다(이상 도 3c). 이로써 마이크로 디바이스(100)가 제조되었다.
(2) 샘플의 준비
E.coli O157:H7(대장균), Salmonella spp.(살모넬라 종), S.aureus(황색포도상구균)이 5mL의 저염 및 200rpm 교반 환경 하에 LB(lysogeny broth), NB(nutrient broth), MHB(Mueller-Hinton brotn)에서 각각 밤새 배양되었다(온도는 37℃). 그리고 gDNA 정제 키트(Promega社)를 이용하여 배양액으로부터 2mL gDNA를 추출하였다. 추출된 gDNA는 2~8℃에서 보관되었다. 한편 C.polykrikoides(코클로디니움 폴리크리코이데스)를 바다에서 직접 수득하고 RNeasy mini kit(Promega社)를 이용하여 조류(algae) gDNA를 추출하였다. 마찬가지로 추출된 gDNA는 2~8℃에서 보관되었다. 이후 추출된 gDNA들을 혼합하여 샘플을 제조하였다.
(3) 마이크로 디바이스의 샘플 분배 작동의 검증
제조된 마이크로 디바이스(100)를 회전장치의 중심에 거치시켰다. 마이크로 디바이스(100)의 샘플 도입구에 빨간색 잉크를 주입하고 회전장치로 회전시켰다. 그 결과, 빨간색 잉크가 샘플 챔버(111)에서 반응 챔버(112)로 이동함을 확인할 수 있었다. 도 4는 관련 실험 내용을 촬영한 사진이다. 도 4a는 마이크로 디바이스, 도 4b는 빨간색 잉크를 샘플 챔버(111)에 주입한 후, 도 4b는 회전장치로 회전한 후의 사진을 각각 나타낸다.
(4) 피세틴을 이용한 LAMP 앰플리콘의 검출
피세틴이 이중나선 DNA와 상호 작용하여 강한 형광 특성을 나타내는지를 확인하기 위하여 실험을 진행하였다. 튜브 챔버 3개를 준비하고 A, B, C로 구분하였다. 튜브 챔버 A에는 피세틴을 투입하였다. 튜브 챔버 B에는 피세틴과 LAMP 시약을 투입하였다. 튜브 챔버 C에는 피세틴과 LAMP 시약을 투입하고 65℃에서 30분간 루프-매개 등온 증폭을 수행하였다. 동일한 실험을 피세틴이 함유된 여과지에 대해서도 반복 수행하였다.
도 5에는 실험 결과를 나타내었다. 도 5a는 튜브 챔버 및 여과지의 사진이고, 도 5b는 형광 스펙트럼을 나타내는 그래프이다. 도 5a를 참조하면, 타겟 DNA가 존재하는 경우(튜브 챔버 C)에서 강한 형광 특성이 나타남을 확인할 수 있다. 반면 피세틴만 있거나 타겟 DNA가 존재하지 않는 경우(튜브 챔버 A,B)에서는 형광 특성이 나타나지 않음을 확인할 수 있다. 이와 같은 현상은 여과지에서도 마찬가지다. 즉 LAMP 앰플리콘의 존재를 피세틴을 이용하여 확인할 수 있다. 한편 도 5b를 참조하면, 타겟 DNA가 있는 경우와 없는 경우에는 형광 세기에 두드러진 차이를 보임을 알 수 있다. 타겟 DNA가 있는 경우 480nm 및 524nm에서 강한 형광 방출 세기를 보였으며, 이러한 현상은 3-하이드록시플라본 성분을 갖는 플라보노이드에서 공통적으로 나타난다. 이와 같은 실험들을 통해 피세틴 분자가 이중나선 DNA에 삽입됨으로써 강한 형광 특성을 보임을 확인할 수 있었으므로, 유전자 검출을 위한 발색염료로의 피세틴의 활용 가능성이 높음을 알 수 있었다.
(5) 마이크로 디바이스에서의 복합 검출
루프-매개 등온증폭 시약 및 프라이머를 함유하는 여과지가 반응 챔버(112)에 배치되었다. 비교를 위해 각 반응 챔버(112)를 넘버링 하고, 4개의 반응 챔버(112)에 Salmonella spp.(살모넬라 종), E.coli O157:H7(대장균), C.polykrikoides(코클로디니움 폴리크리코이데스), S.aureus(황색포도상구균)를 각각 타겟으로 하는 프라이머를 함유하는 서로 다른 여과지를 배치하였고, 대조군으로 나머지 4개의 반응 챔버(112)에는 프라이머를 함유하지 않은 여과지를 배치하였다. 이후 샘플 도입구(131)를 통해 Salmonella spp.(살모넬라 종), E.coli O157:H7(대장균), C.polykrikoides(코클로디니움 폴리크리코이데스) 및 S.aureus(황색포도상구균)을 혼합하여 제조된 샘플을 주입하였다. 이후 마이크로 디바이스를 회전시켜 샘플을 분배시키고 루프-매개 등온 증폭을 수행하였다. DNA의 증폭은 65℃에서 30분간 수행되었다. 이후 피세틴이 함유된 여과지를 각 반응 챔버(112)에 배치하고, UV를 조사하여 형광 신호를 여기시켰다.
도 6에는 실험 결과를 나타내었다. 도 6을 참조하면, 프라이머를 함유하는 여과지가 배치된 반응 챔버(112)에 해당하는 1번~4번 반응 챔버(112)에서는 형광 특성이 나타난 반면, 프라이머를 함유하지 않은 여과지가 배치된 반응 챔버(112)에 해당하는 5번~8번 반응 챔버(112)에서는 형광 특성이 나타나지 않음을 확인할 수 있다. 이를 통해 본 발명에 따른 마이크로 디바이스가 서로 다른 분석 대상을 한 번의 과정을 통해 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
(6) 마이크로 디바이스를 이용한 온-칩 분석의 수행
도 7은 마이크로 디바이스를 이용한 온-칩 분석의 수행 과정을 개략적으로 나타내는 도면이다. 도 7a는 온-칩 분석의 과정을 요약하여 나타내고, 도 7b는 샘플로부터 DNA가 정제되는 원리를 나타낸다. 도 7c는 피세틴에 의한 DNA 검출 매커니즘을 나타낸다.
본 발명에 따른 마이크로 디바이스의 상용성을 확인하기 위하여 실제 샘플을 이용하여 온-칩 분석을 수행하였다. 마이크로 디바이스에 존재하는 8개의 반응 챔버(112)를 넘버링 하고, 반응 챔버(112) 2개를 한 쌍으로 하여 Salmonella spp.(살모넬라 종: 제1 그룹 반응 챔버), E.coli O157:H7(대장균: 제2 그룹 반응 챔버), S.aureus(황색포도상구균: 제3 그룹 반응 챔버), C.polykrikoides(코클로디니움 폴리크리코이데스: 제4 그룹 반응 챔버)를 각각 타겟으로 하는 프라이머를 함유하는 서로 다른 여과지를 배치하였다. 우유를 준비하고 Salmonella spp.(살모넬라 균)를 인위적으로 투입한 후에 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 용균(lysis)을 위해 상기 우유를 90℃에서 5분간 가열하였다. 이후 마이크로 디바이스(100)의 샘플 챔버(111)에 폴리도파민이 코팅된 여과지를 배치하고, 상기 우유를 샘플 도입구(131)로 주입하였다. 이후 30분간 실온에서 방치되었다. 이는 폴리도파민이 코팅된 여과지와 샘플이 충분히 반응하도록 하기 위함이다(도 7a 참조). 이 과정에서 도 7b에 나타낸 것과 같이 샘플 내의 우유 단백질 및 세포 부산물들이 쉬프 염기 반응(Schiff base reaction) 및 킬레이션 반응(chelation reaction)을 통해 폴리도파민이 코팅된 여과지 내의 퀴논 기들과 반응하여 포집되었다. 이후 마이크로 디바이스(100)를 회전시켜 정제된 DNA를 각 반응 챔버(112)로 분배하였고, 루프-매개 등온 증폭이 65℃에서 30분간 수행되었다. 이후 피세틴이 함유된 여과지를 각 반응 챔버(112)에 배치하고, UV를 조사하여 형광 신호를 여기시켰다. 피세틴이 함유된 여과지와 증폭된 타겟 DNA의 상호작용은 도 7c에서 나타낸 것과 같다. 한편, 상술한 실험을 반복하되 우유에 투입되는 Salmonella spp.(살모넬라 균)의 농도를 달리하였다. 구체적으로 제1 시험예로는 Salmonella spp. 1.7ⅹ104 CFU(colony forming unit) mL-1, 제2 시험예로는 Salmonella spp. 1.7ⅹ103 CFU mL-1, 제3 시험예로는 Salmonella spp. 1.7ⅹ102 CFU mL-1, 제4 시험예로는 Salmonella spp. 1.7ⅹ10 CFU mL-1로 그 농도를 달리하였다.
도 8은 온-칩 분석 수행 결과를 나타낸다. 도 8a는 Salmonella spp.(살모넬라 균) 농도별로 UV 조사 후의 마이크로 디바이스를 촬영한 사진이고, 도 8b는 Salmonella spp.(살모넬라 균) 농도별 형광 세기를 나타내는 그래프이다. 도 8c는 총 분석 시간을 나타내는 표이다.
도 8을 참조하면, 도 8a에서와 같이 Salmonella spp.(살모넬라 종)을 타겟으로 하는 프라이머를 함유하는 여과지가 배치된 제1 그룹 반응 챔버(도 8a에서 1,2번 반응 챔버)에서만 형광 특성이 나타났고, 나머지 반응 챔버들에서는 형광 특성이 나타나지 않았음을 확인하였다. 즉 본 발명에 따른 마이크로 디바이스를 통해 실제 샘플(우유)에 대해 병원균을 검출할 수 있음을 확인하였다. 한편 Salmonella spp.(살모넬라 균)의 농도가 낮아질수록 형광 세기가 작아졌으나 Salmonella spp.(살모넬라 균)의 농도가 최소 1.7ⅹ102 CFU mL- 1 인 경우까지 식별 가능한 정도의 형광 세기를 보임을 확인할 수 있어(도 8a의 우측에서 2번째 사진 및 도 8b 참고), 본 발명에 따른 마이크로 디바이스의 검출 한계(limit of detection)를 검증하였다. 또한 도 8c에서와 같이 총 분석에 걸린 시간은 대략 70분 가량으로 기존 연구와 비교하였을 때(130분 이상) 분석 시간이 크게 단축되었음을 확인하였다.
이상, 본 발명의 기술적 사상을 구체적으로 설명하였다. 그러나 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 기술의 구체적 적용에 따른 단순한 설계변경, 일부 구성요소의 생략, 단순한 용도의 변경 등 본 발명을 다양하게 변형할 수 있을 것이며, 이러한 변형 역시 본 발명의 권리범위 내에 포함됨은 자명하다.
100: 마이크로 디바이스 110: 메인 플라스틱 기재
111: 샘플 챔버 112: 반응 챔버
120: 하부 실링필름 130: 상부 실링필름
131: 샘플 도입구 140: 제1 여과지
150: 제3 여과지 160: 제2 여과지

Claims (10)

  1. 분석 대상을 포함하는 샘플이 도입되는 샘플 챔버가 중앙에 형성되고, 샘플 챔버와 각각 연결되는 복수의 반응 챔버가 샘플 챔버의 원주 방향으로 배치되어 형성되는 메인 플라스틱 기재;
    메인 플라스틱 기재의 하부면을 실링시키는 하부 실링필름;
    메인 플라스틱 기재의 상부면을 실링시키는 상부 실링필름;
    반응 챔버마다 배치되는 것으로 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification) 시약과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 함유하는 제1 여과지; 및
    루프-매개 등온증폭 이후, 각 반응 챔버마다 배치되어 증폭된 타겟 유전자를 발색시키는 것으로 피세틴(Fisetin)을 함유하는 제2 여과지를 포함하는 마이크로 디바이스.
  2. 청구항 1에 있어서,
    샘플 챔버에 배치되는 것으로 도입된 샘플로부터 타겟 유전자만을 통과시키는 제3 여과지를 더 포함하는 마이크로 디바이스.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 제3 여과지는 폴리도파민(polydopamine)이 코팅된 여과지인 마이크로 디바이스.
  4. 청구항 1에 있어서,
    샘플 챔버를 기준으로 메인 플라스틱 기재를 회전시키는 회전부를 더 포함하는 마이크로 디바이스.
  5. 청구항 4에 있어서,
    루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 가열부를 더 포함하는 마이크로 디바이스.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상부 실링필름은 메인 플라스틱 기재의 상부면에 탈부착 가능하도록 접합되고, 샘플 챔버와 상응하는 영역에는 샘플 도입을 위한 샘플 도입구가 적어도 하나 이상 형성되는 마이크로 디바이스.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 샘플 챔버의 크기는 각 반응 챔버의 크기보다 크게 형성되는 마이크로 디바이스.
  8. 청구항 1에 있어서,
    각 반응 챔버에 배치되는 제1 여과지들 중 적어도 일부는 서로 다른 프라이머를 함유하는 마이크로 디바이스.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 따른 마이크로 디바이스를 이용한 병원균 검출 방법이고,
    a) 샘플 챔버에 샘플을 도입하는 단계;
    b) 샘플 챔버를 기준으로 메인 플라스틱 기재를 회전시켜 원심력에 의해 샘플을 각 반응 챔버로 분배시키는 단계;
    c) 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification)을 수행하여 타겟 유전자를 증폭시키는 단계;
    d) 상부 실링필름을 탈착한 후, 각 반응챔버에 제2 여과지를 배치하는 단계; 및
    e) 반응챔버의 형광 스펙트럼을 획득하여 타겟 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 병원균 검출 방법.
  10. 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계;
    증폭된 타겟 유전자에 피세틴(Fisetin)을 첨가하여 타겟 유전자를 발색시키는 단계; 및
    형광 신호를 통해 타겟 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 병원균 검출 방법.
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