TARIFNAME KATI FAZ EKSTRAKSIYON KOLONU Teknik Alan Bulus, kan, idrar, tükürük gibi biyolojik numuneler ile gida ve çevre numunelerinde düsük derisimde bulunan analiterin, kromatografik analiz öncesinde kati faz ekstraksiyonu ile zenginlestirilmesinde kullanilmak üzere, kati faz ekstraksiyon kolonu ile ilgilidir. Teknigin Bilinen Durumu Kromatografik tekniklerinin duyarliligi, farki detektörler kullanilarak artirilsa da çevre, gida ve biyolojik matrikslerde (kan, idrar, tükürük gibi) tayini yapilmak istenen analitlerin derisimleri düsük düzeyde oldugundan (genel olarak ppb) enstrümental analiz öncesi bazi örnek hazirlama ve deristirme (zenginlestirme) tekniklerine ihtiyaç duyulmaktadir. Örnek hazirlama metotlarinin temel hedefleri; (1) analitin matriks ortamindan ayrilmasi ve (2) düsük derisimlerdeki analitin zenginlestirilmesi ve/veya (3) istenmeyen matriks bilesenlerinin uzaklastirilmasidir. Zenginlestirme için örnek hazirlama asamasinda genellikle sivi-sivi ekstraksiyon (LLE), mikro sivi-sivi ekstraksiyon (uLLE), kati faz ekstraksiyonu (SPE) ve kati faz mikroekstraksiyonu (uSPE) teknikleri kullanilmaktadir. SPE en yaygin kullanilan örnek hazirlama metodudur. SPE metodu hedef analitlerin iki farkli faza olan farkli afinitesine dayanmaktadir. SPE prosedüründe ilk olarak; adsorban analitlerin çözündügü bir çözücü veya çözücü karisimi ile sartlandirilmaktadir. Ardindan, sivi numune veya bir sivi numune ekstrakti adsorban ile etkilestirilmektedir. Genellikle, hedef analitler örnek matrisin diger bilesenleri ile birlikte adsorbana tutulmaktadir. Son olarak, analitler uygun bir çözücünün küçük bir hacmi ile desorbe edilmektedir. Adsorban bir SPE kolonuna doldurularak kullanilabilecegi gibi batch olarak da kullanilabilmektedir. Kati faz ektraksiyon metodunun çalisma prensibi Sekil 1,de özetlenmistir. Sivi kromatografi analizleri için SPE kolonlarinda adsorban olarak silika jel gibi aktif inorganik adsorbanlarin yani sira aktif kömür, silika fazlari ve polimerler kullanilmaktadir. En yaygin kullanilan adsorbanlar, ticari olarak üretilen oktadesil (C18) silika, develosil (C30) silika, polistiren-divinilbenzen kopolimerleri, HLB (hidrofiIik(N-vinilprolidon)/Iipofilik (divinil benzen)) kartuslar ve grafitlenmis karbon siyahidir (Tadeo ve ark, 2008). Kimyasal olarak modifiye edilmis çok sayida adsorban (örn. silika jel, sentetik polimerik reçineler), apolar, polar ve iyonik etkilesimler araciligi ile belli analit gruplarinin zenginlestirilmesinde kullanilmaktadir. Örnegin ters faz (C2, C8, C18, CH, PH, BP), normal faz (CN, SI, diol, alumina, florisil), anyon degisimi (SAX, DEA, NH2, PSA) ve katyon degisimi (SCX, PRS, CBA) kullanilabilir. Analitler ve adsorban fazi arasindaki etkilesimler, van der Waals kuwetleri gibi hidrofobik etkilesimleri ve dipol-dipol, hidrojen bagi ve TI'-TI' etkilesimleri gibi hidrofilik etkilesimleri içermektedir. Ekstraksiyonu optimize etmek için uygun adsorban seçilmelidir. Örnek çözücüsü (su veya organik çözücü), analit tipi (apolar, polar veya iyonize) ve iyon olusumunun gerçeklestigi kosullar (kuvvetli veya zayif asit veya baz), yöntem seçimi için yol göstermektedir. Diatoma topragi Extrelut, Chem Elut, Bond Elut Certify ve Chromabond karisik mod kolonlari dahil olmak üzere çesitli SPE kolonlari ticari olarak mevcuttur. Karisik fazli ekstraksiyon kolonlari (örnegin Bond-Elut Certify ve Chromabond) iyi geri kazanim degerlerine sahiptir ve tüm fonksiyonel gruplarin ve farkli polaritedeki analitlerin adsorplanmasina olanak saglar. C8 ve SCX'in bir karisimi olan Bond-Elut Certify, hem hidrofobik hem de iyon degistirme özelliklerine sahiptir ve bazik analitlerin ekstraksiyonu için uygundur. Hidrofilik-lipofilik dengeli (HLB) kopolimerler, N- vinilpirolidon hidrofilik polimerin suyla islanabilirligini arttirdigindan ve Iipofilik divinilbenzen (DVB) analitleri tutmak için gerekli ters faz tutmasini sagladigindan, hem polar hem de apolar olmayan bilesiklerin iyi bir sekilde tutulmasini saglar. SPE kolonlarinda kullanilacak olan adsorban türünde belirleyici olan analizi yapilmak istenen (zenginlestirilmesi hedeflenen) analitlerdir. En önemli hedef; adsorbanin tek bir SPE prosedürü (ayni akis hizi, elüsyon çözücüsü ve elüsyon hacmi vb) ile mümkün olan en fazla sayida analiti zenginlestirebilmesidir. Bu sayede kan, tükürük ve idrar gibi biyolojik örnekler ile gida ve çevre numunelerindeki çok sayida analiti tek seferde ve kromatografik analizler ile tayin edilebilir derisimlerde zenginlestirmek mümkündür. Bu hedefe ulasilmasinda belirleyici olan analitler ile adsorban arasindaki etkilesimin afinitesi ve seçiciligidir. Bu nedenle mevcut tekniklerdeki en önemli dezavantaj; tek bir adsorban ve ayni SPE prosedürü ile (ayni akis hizi, elüsyon çözücüsü ve elüsyon hacmi ile) zenginlestirilebilen analit sayisinin sinirli olmasidir. Ayrica gida, çevre, idrar, tükürük ve kan matriksinin oldukça karmasik olmasi nedeniyle, adsorban yeterli seçicilige sahip degilse, zenginlestirme öncesi ilave basamaklara ihtiyaç duyulmaktadir. Çünkü matriksin çok sayida bilesen içermesi, tayin edilmek istenen analit(ler)in adsorbana baglanmasini engellemektedir. Bu durum özellikle kan ve gida gibi karmasik matrikslerin numune olarak kullanildigi ve çok sayida analizin hizli bir sekilde yapilmasi gerektigi durumlarda önemli bir dezavantaj olmaktadir. Diger bir önemli dezavantaj ise adsorplanan analit veya analitlerin adsorbandan yüksek oranda desorbe edilememesidir. Analitlerin desorpsiyonunda da belirleyici olan yine analitlerin adsorbana olan afinitesidir. Teknigin bilinen durumuna yönelik gerçeklestirilen patent ve literatür arastirmasinda saptanan dokümanlar asagida özetlenmistir. CN110314413 A yayin numarali patent basvurusu, kati faz ekstraksiyon aparatini ve bu ekstraksiyon aparatinin örnek hazirlamada kullanildigi kati faz ekstraksiyon yöntemini açiklamaktadir. Dokümandaki adsorbanlardan biri su tutucu reçine, digeri ise polimerik malzeme içermektedir. Kullanilan polimerik malzemeler arasinda HEMA ve MA polimerleri bulunmamaktadir. EP3278100 A4 yayin numarali basvuru, bir test numunesinde bir veya daha fazla analitin varligini belirlemeye yönelik bir yöntemi konu almaktadir. Dokümanda, yeni bir kati faz ekstraksiyon adsorbani/adsorban karisimi yer almamaktadir. Sonuç olarak, yukarida anlatilan olumsuzluklardan dolayi ve mevcut çözümlerin konu hakkindaki yetersizligi nedeniyle ilgili teknik alanda bir gelistirme yapilmasi gerekli kilinmistir. Bulusun Kisa Açiklamasi Mevcut bulus, yukarida bahsedilen gereksinimleri karsilayan, tüm dezavantajlari ortadan kaldiran ve ilave bazi avantajlar getiren, kati faz ekstraksiyon kolonu ile ilgilidir. Bulusun ana amaci, hidrofilik ve hidrofobik (Iipofilik) karakterli iki polimerik adsorbanin karistirilmasi ile hazirlanan kati faz ekstraksiyon kolonu elde etmektir. Mevcut teknik alanda yer alan kati faz ekstraksiyonunda en önemli problemler ayni SPE prosedürü ile tek seferde zenginlestirilebilen analit sayisinin sinirli olmasi ve adsorbanin zenginlestirilmek istenen analit(ler)e karsi uygun (desorpsiyona da olanak saglayan) afiniteye sahip olmamasidir. Bulusa konu olan kati faz ekstraksiyon kolonu, mevcut sorunlara çözüm getirmek için hidrofilik ve hidrofobik (Iipofilik) karakterli iki polimerik adsorbanin karistirilmasi ile hazirlanmaktadir. Hidrofobik polimerik adsorban; apolar N- metakriloil-amido-L-triptofan metil ester (MA) kalintisi (Osman ve ark, 2013; Ozer ve kalintisi (Denizli ve ark, 1997; Osman ve ark, 2021) içermektedir. Hidrofobik (Iipofilik) karakterli polimer, yapisindaki MA kalintisinin hidrofobik (apolar) karakteri nedeniyle kati faz ekstraksiyon kolonunda ters faz islevi görür ve apolar analitlerin adsorplanmasini saglar. Hidrofilik karakterli polimer, yapisindaki HEMA kalintisinin hidrofilik karakteri nedeniyle polimerik yapiya su moleküllerinin girmesini ve polar analitlerin adsorplanmasini saglar. Her iki polimerik adsorban da (hidrofilik ve hidrofobik) yüksek sisme kapasitesine ve yüksek yüzey alanina sahiptir. Bu iki özellik; analit(ler) ile adsorbanin etkilesimini artirdigindan adsorpsiyon kapasitesinde artis saglamaktadir. Bu nedenle geri kazanim artmakta ve kromatografik analizde elde edilen sonuçlarin kesinlik, tekrarlanabilirlik gibi analitik performans göstergeleri de iyilesmektedir. Hazirlanan SPE kolonunda hidrofobik ve hidrofilik kalintilari içeren polimerik adsorbanlarin bir arada bulunmasi; tek seferde ve ayni SPE prosedürü ile çok sayida analitin polaritelerine göre (hidrofilik ve hidrofobik) adsorbana baglanmasini ve dolayisiyla zenginlestirilmesini saglamaktadir. Ayrica SPE kolonu iki polimerik adsorban içerdiginden ya da batch sistemde iki polimerin karisimi olarak kullanilabileceginden; polimerik adsorbanin numunede (gida, çevre veya biyolojik numune) tayini yapilmak istenen analite veya analit grubuna karsi uygun afinite saglayacak oranlarda karistirilmasi da mümkündür. Adsorban ile analitler arasindaki etkilesim zayif moleküller arasi etkilesimler ile gerçeklestiginden, desorpsiyon sirasinda kullanilan elüsyon çözücüleri ile etkilesimlerin kolayca kirilmasi ve yüksek oranda desorpsiyonun gerçeklesmesi saglanabilmektedir. Literatürde, MA polimeri (Iipofilik) ile HEMA polimerinin (hidrofilik) (iki ayri polimerik adsorban) birarada oldugu bir kati faz ekstraksiyon kolonu bulunmamaktadir. Bu anlamda bulus, teknigin bilinen durumundan farkli bir yenilik içermektedir. Bulus ile gelistirilen adsorbanin batch olarak da kullanilmasi mümkündür. Ayrica kolona doldurulan MA polimeri ve HEMA polimerlerinin farkli oranlarda karistirilmasi ile analizi yapilmak istenen analit grubu için en optimum SPE kolonunun hazirlanmasi mümkündür. Bunun yanisira, SPE kolonunun farkli çap araliginda (boyut araliklarina sahip) mikroküreler ile hazirlanmasi da mümkündür. Bu özellikler sayesinde hazirlanan tek bir SPE kolonu ve tek bir SPE prosedürü ile (ayni akis hizi, elüsyon çözücüsü ve elüsyon hacmi vb) fazla sayida analiti zenginlestirmek mümkündür. Bulus konusu SPE kolonu; biyolojik numuneler ile dogrudan ya da adsorban (MA polimeri ve HEMA polimeri karisimi) fizyolojik pH,i saglayacak tampon çözeltiler ile sartlandirildiktan sonra kullanilmalidir. Çevre örnekleri ile dogrudan ya da saf su ile sartlandirildiktan sonra, gida numuneleri ile de baslangiçta gida numunesinin ekstraksiyonunda kullanilan çözücü/çözücü sistemi ile sartlandirilarak kullanilmalidir. Elüsyon çözücüsü olarak ters faz kromatografik analizlerde kullanilan tüm çözücüler kullanilabilir. Bulusun yapisal ve karakteristik özellikleri ve tüm avantajlari asagida verilen sekiller ve bu sekillere atiflar yapilmak suretiyle yazilan detayli açiklama sayesinde daha net olarak anlasilacaktir ve bu nedenle degerlendirmenin de bu sekiller ve detayli açiklama göz önüne alinarak yapilmasi gerekmektedir. Bulusun Anlasilmasina Yardimci Olacak Sekiller Sekil 1*de kati faz ekstraksiyon metodunun sematik gösterimi (Tadeo ve ark. 2008) verilmektedir. Sekil 2ide MA polimerinin (mikrokürenin) SEM görünümü verilmektedir. Sekil 3*te HEMA polimerinin (mikrokürenin) SEM görünümü verilmektedir. Bulusun Detayli Açiklamasi Bu detayli açiklamada, bulusun tercih edilen yapilanmalari, sadece konunun daha iyi anlasilmasina yönelik olarak açiklanmaktadir. Bulus, kan, idrar, tükürük gibi biyolojik numuneler ile gida ve çevre numunelerinde düsük derisimde bulunan analitlerin, kromatografik analiz öncesinde kati faz ekstraksiyonu ile zenginlestirilmesinde kullanilmak üzere, kati faz ekstraksiyon kolonu ve üretim yöntemi ile ilgilidir. Bulus konusu yöntemde ilk olarak, L-triptofan metil ester, diklormetan içerisinde çözülmektedir. L-triptofan metil ester çözeltisine trietilendiamin ve metakriloil klorür eklenmekte ve karistirilmaktadir. Söz konusu islem adimlarinda tercihen manyetik karistirici kullanilmaktadir. Bahsedilen reaksiyon karisimina, tercihen ekstraksiyon balonunda, NaOH çözeltisi eklenmekte ve diklormetan fazi ayrilmaktadir. Bahsedilen diklormetan fazi Na2804 ile kurutulmaktadir. Bu asamada, süzgeç kagidi kullanilmaktadir. Bir sonraki islem adiminda, diklormetan fazinin buharlastirilmasi ile N-metakriloil- amido-L-triptofan metil ester monomeri (MA) elde edilmektedir. N-metakriloil-amido-L- triptofan metil ester monomeri (MA) sentezinin tercih edilen bir uygulamasinda, N- metakriloil-amido-L-triptofan metil ester (MA) monomerinin sentezi için; tercihen agirlikça % 3,08 L-triptofan metil ester cam balonda tercihen agirlikça % 82,05 diklorometan (CH2CI2) içerisinde çözülmektedir. Buz banyosunda sogutulan çözeltiye manyetik karistiricida tercihen 400 rpm karistirma hizinda tercihen agirlikça % 7,86 trietilamin yavasça ilave edilmektedir. Ardindan tercihen agirlikça % 3,3 metakriloil klorür de yavasça çözeltiye eklenmekte ve manyetik karistirici ile tercihen 2 saat buz banyosunda ve tercihen 24 saat oda sicakliginda karistirilmaktadir. Çözelti ayirma hunisine alinarak; reaksiyona girmeyen metakroil klorür, tercihen agirlikça % 3,08 NaOH ile 4 kez ekstrakte edilmektedir. Diklormetan fazi ayrilarak, susuz Na2804 içeren adi süzgeç kagindan süzülmektedir. Ardindan balona alinan diklormetan fazinin evaparatörde (tercihen uçurulmasi ile MA monomeri elde edilmektedir. Elde edilen MA monomeri, toluen, EGDMA ve AIBN tercihen ultrasonik banyoda karistirilmaktadi r. Söz konusu yöntemde, PVA polimerinin saf suda çözülmesi ile PVA çözeltisi hazirlanmaktadir. MA monomeri, toluen, EGDMA ve AIBN içeren çözelti, PVA çözeltisine eklenmekte ve polimerlestirilmektedir. Bu asamada, tercihen cam reaktör, manyetik karistirici ve sirkülasyonlu su banyosu kullanilmaktadir. Elde edilen MA polimeri süzülüp, etil alkol ve saf su ile yikanmakta ve kurutulmaktadir. Ardindan, elde edilen MA polimeri elenmekte ve farkli çap araliklarindaki polimerler gruplanmaktadir. Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, MA polimerinin hazirlanmasinda tercihen beherde karistirilarak içerisine agirlikça % 0,15 AIBN eklenmekte ve ultrasonik banyoda oda sicakliginda tercihen 15 dakika karistirilmaktadir. Sirkülasyonlu su banyosuna baglanmis bir cam reaktör manyetik karistirici üzerine yerIestiriImektedir. Sirkülasyonlu su banyosunun sicakligi tercihen 70 °Cia ayarlanmaktadir. Tercihen agirlikça % 77,7 saf su ve agirlikça % 0,31 PVA cam reaktör içerisinde, tercihen 70 °C*de 400 rpm karistirma hizinda tercihen 20 dakika karistirilarak PVA çözeltisi hazirlanmaktadir. Ardindan tercihen toluen, EGDMA, MA monomeri ve AIBN içeren çözelti cam reaktördeki PVA çözeItisine ekIenmektedir. Elde edilen karisim ilk olarak tercihen 70 oCide 400 rpm karistirma hizinda tercihen 2 saat ve ardindan tercihen 80°°C*da 400 rpm karistirma hizi ile 8 saat süre ile poIimerIestiriImektedir. Cam reaktörün sogutulmasinin ardindan karisima etil alkol eklenerek bir behere alinmakta ve oda sicakliginda tercihen 24 saat süre ile manyetik karistiricida karistirilmaktadir. Ardindan olusan MA mikroküreler tasli huni ve vakum pompasi kullanilarak süzülmekte, tercihen etil alkol ve saf su ile yikanmakta ve vakum etüvünde 50°Cida araliklarindaki eIekIer eIek sarsiciya diziImektedir. MA mikroküreler en üstte yer alan tercihen 212 um çap degerindeki eIek üzerine dökülmekte ve eIek sarsicida tercihen 8 mikroküreler SPE kolonun hazirlanmasinda kullanilmaktadir. Sekil 2,de MA polimerinin (mikrokürenin) SEM görünümü verilmektedir. Bir sonraki islem adiminda, tercihen ultrasonik banyoda HEMA monomeri, toluen, EGDMA ve AIBN karistirilmaktadir. Saf suda çözünen PVA polimeri ile PVA çözeltisi hazirlanmakta ve HEMA monomeri, toluen, EGDMA ve AIBN içeren çözeIti PVA çözeItisine eklenerek poIimerIestiriImektedir. Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, HEMA polimerinin hazirlanmasi asamasinda, tercihen agirlikça % 10,53 toluen, agirlikça % 6,39 EGDMA ve agirlikça % 6,52 HEMA monomeri beherde karistirilarak içerisine agirlikça % 0,15 AIBN ekIenmekte ve ultrasonik banyoda oda sicakliginda tercihen 15 dakika karistirilmaktadir. Sirkülasyonlu su banyosuna baglanmis bir cam reaktör manyetik karistirici üzerine yerIestiriImektedir. Sirkülasyonlu su banyosunun sicakligi tercihen 70 °Cia ayarlanmaktadir. Tercihen agirlikça % 76,1 saf su ve agirlikça % 0,3 PVA cam reaktör içerisinde, tercihen 70 oCide 400 rpm karistirma hizinda tercihen 20 dak karistirilarak PVA çözeltisi hazirlanmaktadir. Ardindan tercihen toluen, EGDMA, HEMA monomeri ve AIBN içeren çözeIti cam reaktördeki PVA çözeItisine ekIenmektedir. Elde edilen karisim ilk olarak tercihen 65 0C 'de 400 rpm karistirma hizinda tercihen 4 saat ve ardindan tercihen 80 hizi ile tercihen 2 saat süre ile polimerlestirilmektedir. Cam reaktörün sogutulmasinin ardindan karisima etil alkol eklenerek bir behere alinmakta ve oda sicakliginda tercihen 24 saat süre ile manyetik karistiricida karistirilmaktadir. Ardindan olusan HEMA mikroküreler tasli huni ve vakum pompasi kullanilarak süzülerek, tercihen etil alkol ve saf su ile yikanmakta ve vakum etüvünde 50"Clda kurutulmaktadir. Tercihen dizilmektedir. HEMA mikroküreler en üstte yer alan 212 um çap degerindeki elek üzerine dökülmekte ve elek sarsicida tercihen 8 saat süre ile bekletilmektedir. HEMA elenmektedir. Tercihen 150-180 um çap araligindaki HEMA mikroküreler SPE kolonun hazirlanmasinda kullanilmaktadir. Sekil Site HEMA polimerinin (mikrokürenin) SEM görünümü verilmektedir. Elde edilen HEMA polimeri süzülüp, etil alkol ve saf su ile yikanmakta ve kurutulmaktadir. Ardindan, HEMA polimerinin elenmesi ve farkli çap araliklarindaki polimerlerin gruplanmasina geçilmektedir. Bu asamada, tercihen elekler ve elek sarsici kullanilmaktadir. Son olarak, MA ve HEMA polimeri, SPE kolonuna homojen bir karisim halinde doldurulmaktadir. Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda kati faz ekstraksiyon kolonunun hazirlanmasi asamasinda, MA polimeri (tercihen 150-180 um çap araligi; analitik terazi ile tartilmaktadir. Bos SPE kolonu vakum manifolda yerlestirilerek dip kismina adsorbanin kolondan sizmasini engellemek için frit takilmaktadir. Ilk olarak MA polimeri ( SPE kolonu içerisine aktarilmakta ve ince bir metal çubuk ile dairesel hareketler ile 10 dakika karistirilmaktadir. Ardindan vakum uygulanarak üst frit yerlestirilmektedir. N-metakriloil-amido-L-triptofan metil ester (MA); bir amino asit monomeridir ve L- triptofan metil esterin metakriloil klorür ile reaksiyonu ile sentezlenmektedir. N- metakriloil-amido-L-triptofan metil ester apolar bir yapiya sahiptir. Polimerik yapiya dahil edildiginde, N-metakriloil-amido-L-triptofan metil ester kalintilari ile apolar moleküller sulu çözeltide hidrofobik etkilesimler ile kolayca bir araya gelirler. mi 3? I Etilen glikol dimetakrilat (EGDMA); radikalik katilma polimerizasyonunda en çok kullanilan çapraz baglayici monomerlerden biridir. Oksijen içeren gruplari sayesinde iyi bir hidrofilisiteye sahiptir. HzCâ/ WOJY 2 EGDMA monomerinin kimyasal yapisi Hidroksietil metakrilat; hidrofilik yapiya sahip bir monomerdir. Hidrofilik özelligi kimyasal yapisinda hidroksil grubunun (-OH) varligindan kaynaklanir. Polimerik bir yapiya dahil edildiginde su molekülleri ile kolayca hidrojen bagi yaparak su moleküllerinin polimerik matriks içerisine girmesini saglar. HEMA monomerinin kimyasal yapisi MA polimeri; EGDMA ve MA monomerinin radikalik katilma polimerizasyonu ile polimerlestirilmesi ile sentezlenir. Süspansiyon polimerizasyonu metodu ile hazirlandigindan mikroküre formundadir. Kati faz ekstraksiyon kolonundaki adsorbanin hidrofobik (lipofilik) bilesenidir. Polimerik yapidaki MA kalintisi hidrofobik (apolar) yapisi sayesinde kati faz ekstraksiyon kolonunda ters faz islevi görür ve örnekteki (çevre, gida, biyolojik numune) apolar analitlerin alikonmasi (tutulmasi) islevini üstlenir. Hidrofobik yapisi sayesinde özellikle apolar analitleri polaritesine bagli olarak adsorplar. HEMA polimeri; EGDMA ve HEMA polimerinin radikalik katilma polimerizasyonu ile polimerlestirilmesi ile sentezlenir. Süspansiyon polimerizasyonu metodu ile hazirlandigindan mikroküre formundadir. Kati faz ekstraksiyon kolonundaki adsorbanin hidrofilik bilesenidir. Polimerik yapidaki HEMA kalintisi hidrofilik (polar) yapisi sayesinde su molekülleri ile kolayca hidrojen bagi yaparak su moleküllerinin polimerik matriks içerisine girmesi ve polar analitlerin alikonmasi (adsorplanmasi) islevini üstlenir. Bulus konusu yöntemde tercih edilen parametre araliklari ve bu parametrelerin bulusa etkisi asagida listelenmektedir: o L-triptofan metil ester, trietilendiamin ve metakriloil klorür içeren çözeltinin oda sicakliginda karistirilma süresi; 6-24 saattir. Bu süre, monomerinin eldesi için uygulanan reaksiyon süresidir. MA monomeri MA polimerinin hammaddesidir. Fazla miktarda elde edilirse daha fazla MA polimeri elde edilebilir. 6 saatte yüksek verimle MA monomeri elde edilebilmektedir. Ancak verimi biraz daha artirmak için reaksiyon 24 saate kadar devam ettirilebilir. Ancak 6 saatte de yapilsa MA polimeri elde edilir ve bulusun çalismasini engelleyecek bir durum söz konusu degildir. o MA mikrokürelerin polimerlesme süresi; 8-10 saattir. MA polimerinin sentezi için ilk 2 saatin ardindan uygulanan reaksiyon süresidir. 8 saatte MA polimeri yeter miktarda elde edilir. Ancak elde edilen MA polimerinin miktari biraz daha artirilmak isteniyorsa süre 10 saate çikarilabilir. 8 saat MA polimerinin eldesi için yeterlidir. Bulusun çalismasini engelleyecek bir durum söz konusu degildir. o HEMA mikrokürelerin polimerlesme süresi; 6-8 saattir. Bu süre, HEMA polimerinin sentezi için uygulanan toplam reaksiyon süresidir. Toplam 6 saatte HEMA polimeri yeter miktarda elde edilir. Ancak elde edilen HEMA polimerinin miktari biraz daha artirilmak isteniyorsa süre toplam 8 (2+6) saate çikarilabilir. Toplam 6 saat HEMA polimerinin eldesi için yeterlidir. Bulusun çalismasini engelleyecek bir durum söz konusu degildir. o SPE kolonuna doldurulan adsorbanin (MA polimeri ve HEMA polimeri karisimi) miktari; 50-200 mgldir. Bulus için belirleyici özelliklerden biridir. Kolonun içerisine doldurulan toplam polimer miktaridir (MA polimeri + HEMA polimeri). Analizi yapilan bilesiklerin tayin edilebilirligini ve geri kazanim degerlerini etkiler. Kullanilacak adsorban miktari analizi yapilacak bilesiklerin sayisina ve kimyasal yapisina (polarite vb.) göre yüksek geri kazanim saglayacak kolonlarin hazirlanmasina olanak saglamaktadir. Adsorbandaki MA polimeri orani; %10-%90,dir. Bulus için belirleyici özelliklerden biridir. Oran ne olursa olsun bulus islevini yerine getirir. Ancak MA polimeri kolonun hidrofobik bilesenidir. Analizi yapilacak bilesikler hidrofilik özellikli analitler yaninda agirlikli olarak hidrofobik özellikli ise ve daha yüksek geri kazanim degerleri elde edilmek isteniyorsa kolona doldurulacak MA polimer orani yüksek HEMA polimeri orani düsük tutulabilir. Örnek çalismada en optimum durum olan % 50 + % 50 oraninda hazirlanmis SPE kolonu kullanilarak hidrofobik ve hidrofilik analitler için etkinligi kanitlanmistir. Adsorbandaki HEMA polimeri orani; %10-%90,dir. Bulus için belirleyici özelliklerden biridir. Oran ne olursa olsun bulus islevini yerine getirir. Ancak HEMA polimeri kolonun hidrofilik bilesenidir. Analizi yapilacak bilesikler hidrofobik özellikli analitler yaninda agirlikli olarak hidrofilik özellikli ise ve daha yüksek geri kazanim degerleri isteniyorsa kolona doldurulacak HEMA polimer orani yüksek MA polimeri orani düsük tutulabilir. Örnek çalismada en optimum durum olan % 50 + % 50 oraninda hazirlanmis SPE kolonu kullanilarak hidrofobik ve hidrofilik analitler için etkinligi kanitlanmistir. için belirleyici özelliklerden biridir. Adsorban boyutu analitlerin geri kazanimini etkilemektedir. Yaptigimiz çalismalarda 150-180 um çap araliginda oldukça yüksek geri kazanim degerleri elde edilmistir. Ancak farkli analitler, elüsyon çözücüleri ve ekstraksiyon parametreleri için farkli boyutlarda MA polimeri ile daha yüksek geri kazanim degerlerine ulasmak mümkün olabilir. Biyolojik, çevre ve gida numuneleri gibi binlerce olasi analitin tayininde kullanilabilecek bir kolon için tüm olasiliklarin deneysel olarak test edilmesi mümkün olmadigindan böyle bir aralik-daha küçük ve daha büyük- öngörülmüstür. Bulus için belirleyici özelliklerden biridir. Adsorban boyutu analitlerin geri kazanimini etkilemektedir. Yaptigimiz çalismalarda 150-180 um çap araliginda oldukça yüksek geri kazanim degerleri elde edilmistir. Ancak farkli analitler, elüsyon çözücüleri ve ekstraksiyon parametreleri için farkli boyutlarda HEMA polimeri ile daha yüksek geri kazanim degerlerine ulasmak mümkün olabilir. Biyolojik, çevre ve gida numuneleri gibi binlerce olasi analitin tayininde kullanilabilecek bir kolon için tüm olasiliklarin deneysel olarak test edilmesi mümkün olmadigindan böyle bir aralik-daha küçük ve daha büyük- öngörülmüstür. Bulus konusu yöntemde, hidrofilik monomerler (2-dimetilamino etil metakrilat, oligo(etilen glikol) monometil eter metakrilat, 2-hidroksipropil metakrilat, N- izopropilakrilamid, N,N-dimetilakrilamid, 2-metakriloiloksietil fosforilkolin, glisidil metakrilat) (HEMA monomerinin alternatifleri ya da genel isim olarak hidrofilik monomerler), hidrofobik monomerler (metil akrilat, metil metakrilat, stiren, bütil akrilat, vinilklorür, vinil asetat) (MA monomerinin alternatifleri ya da genel isim olarak hidrofobik monomerler) ve farkli çapraz baglayicilar (divinil benzen, trimetilolpropan trimetakrilat) (EGDMA monomerinin alternatifleri) ile hazirlanan adsorbanlarin karisimlari ile hazirlanmis olabilmektedir. Bulusta toluen yerine genel isim olarak polar ve apolar organik çözücüler kullanilabilmektedir. AIBN yerine genel isim olarak radikalik baslaticilar ayni islevi görmektedir. MA polimerinin teknik alanda sentez metodu mevcuttur. MA polimeri sentez reçetesinde farkliliklar ile bulus sahipleri tarafindan sentezlenmis ve tek basina SPE amaciyla kullanilmistir. HEMA ise ticari bir monomer olup binlerce uygulamasi vardir. HEMA polimeri de bulus sahipleri tarafindan farkli sentez reçeteleri ile sentezlenmis ve farkli amaçlar ile kullanimi açiklanmistir. Ancak SPE amaciyla HEMA polimeri hiç kullanilmamis ve açiklanmamistir. Ancak MA polimeri ve HEMA polimerlerinin bulusta belirtildigi sekilde karistirilarak SPE kolonuna doldurulmasi ve hidrofilik ve hidrofobik bilesenlerin ayni anda zenginlestirmesi için kullanimi yaklasimi yenidir. Bulusta kullanilan bilesenlerin tercih edilen kullanim oranlari ve kullanilabilir oran araliklari asagida yer alan tabloda verilmektedir. Bilesenler Kullanilabilir oran Tercih edilen araliklari kullanim oranlari L-Triptofan metil ester 3,0-3,1 3,08 Trietilamin 7,65-7,91 7,86 Metakriloil klorür 2,92-3,35 3,30 Sodyum hidroksit (NaOH) 3,0-3,1 3,08 Toplam 100 N-metakriloil-amido-L-triptofan metil ester 0,05-0,8 0,22 Azobisizobutironitril (AIBN) 0,10-0,2 0,15 Toplam 100 Hidroksietil metakrilat 4,5-8,5 6,52 Toluen 8,5-12,5 10,53 Azobisizobutironitril (AIBN) 0,10-0,2 0,15 Polivinil alkol 0,29-0,31 0,3 Toplam 100 MA polimeri 10-90 50 HEMA polimeri 10-90 50 Toplam 100 Bulus kapsaminda gerçeklestirilen örnek bir çalismada, tam kanda uyusturucu/ uyarici / ilaç etken maddeleri analizi yapilmistir. Örnek çalisma %50 MA ve % 50 HEMA polimerinin (150-180 um çap araliginda) karistirilmasi ekstraksiyon kolonu ile gerçeklestirilmistir. Numune Analizi Için Deneysel Sartlar Söz konusu örnekte adli toksikoloji vakalarinda siklikla kullanilan tam kan numunesi kullanilmaktadir. Kan örneklerindeki LC-MS/MS verileri asagidaki kosullar kullanilarak olusturulmustur. Analit konsantrasyonlari, özellikleri ve kisaltmalari, aksi belirtilmedikçe asagida verilmistir. ile hazirlanan kati LC Kosullari LC Sistemi: Shimadzu Nexera XR LC-20ADXR, Shimadzu SIL-20ACXR Dedeksiyon: LCMS-8050 Üçlü Dört Kutuplu Kütle Spektrometresi Analitik Kolon: Poroshell Mobil Faz A: % 0,1 (v/v) formik asit ve 2 mM amonyum asetat içeren saf su Mobil Faz B: % 100 Metanol(v/v) Akis Hizi: 0,6 mL/dak Analiz Süresi: 15 dak Mobil faza ait gradyan tablosu Çizelge 1*de gösterilmistir. Çizelge 1. LC-MS/MS sisteminde kullanilan mobil faz gradyani Zaman (dak) Profil 0 90 10 1,70 99 1 3,00 20 80 7,00 5 95 1 1 ,00 5 95 12,40 90 10 ,00 98 2 Kolon Sicakligi: 40 CC Numune Sicakligi: 15 CC Enjeksiyon Hacmi: 10 uL MS Kosullari MS Sistemi: LCMS-8050, ESI+ ve ESI- Desolvasyon Sicakligi: 526 CC Nebulize Gaz Akisi: 3 L/dak Arayüz Sicakligi: 300 CC Arayüz Voltaji: 4,0 kV DL Sicaklik: 250 CC MRM geçisi izlendi: Asagidaki tabloya bakin ESI tarafindan izlenen örnek MRM geçisi Çizelge 2,de gösterilmistir. Çizelge 2. Uyusturucu/Uyarici/ (Ilaç Etken Maddeleri) için Alikonma Süreleri ve MS parametreleri Analit Alikonma Oncü Urün Q1 CE Q3 Zamani Iyon Iyon (quadrupole Çarpisma (quadrupo/e (dak) m/z m/z Voltaji (V)) Enerjisi Voltaji (V)) Pyrrolidinopentiophenone) (Mephedrone, 4-MMC) FUBINACA, AMB- FUBINACA) Chminaca) THC carboxylic acid)] Uvusturucu/Uvarici/ (Ilaç Etken Maddeleri) Standartlari Standartlar Cayman Chemical ve Chiron ASiden satin alinmistir. Tekli standart stok çözeltileri (1 mg/mL) metanol, veya asetonitril içinde hazirlandi. Metanol içinde tüm bilesiklerin (10 ug/mL) karisimini içeren bir stok çözelti hazirlandi. Kalibrasyon ve kalite kontrol (QC) numuneleri, çalisma standartlarinin çesitli konsantrasyonlarda ve matriks (tam kan) içine eklenmesiyle hazirlanmistir. Kalibrasyon konsantrasyonlari, tüm analitler için 0,5-100 ng/mL araligindaydi. Kalite kontrol numuneleri, insan tam kanina 1, 10 ve 100 ng/mL'de standart karisimi eklenerek hazirlandi. Örnek hazirlama Örnekler, 100 mg MA polimeri ve 100 mg HEMA polimeri içeren kolon kombinasyonu kullanilarak ekstrakte edildi. 0,5 mL insan tam kan örnegi 4,5 mL saf su seyreltildi ve iç standartlar eklendi. 200 mg sorbent içeren kolon, 2 mL etil asetat, 2 mL metanol ve 2 mL saf su ile ön kosullandirildi. Numune kolona yüklendi. Kolon daha sonra 2 mL metanol: su (5:95) ile yikandi ve kurutuldu. Ardindan analitler 2 x 500 uL metanol ve 2x500 uL etil asetat ile kolondan elue edildi. Elusyon çözücüsü daha sonra kum banyosunda (50 °C) buharlastirildi ve kalinti ile tekrar çözüldü ve LC sistemine 10 uL hacimde enjekte edildi. Analitlere ait geri kazanim asagidaki denkleme göre hesaplandi: Fit. Gar.: hazaiiiiii = _W_...tlüü Sonuçlar Bu ekstraksiyon protokolü ile 33 adet etken maddeye ait geri kazanim degerleri insan kan numunesine üç farkli standart ekleme derisimi için degerlendirildi. Elde edilen sonuçlar Çizelge 3,de verildi. Farkli polarite ve fonksiyonel gruplara sahip toplamda 31 adet bilesik için geri kazanim saglandi. Tüm bilesikler için es zamanli yapilan çalisma ile 1, 10 ve 100 ng/mL derisimleri için genel ortalama geri kazanim degerleri sirasiyla Çizelge 3. Ekstraksiyon protokolü sonuçlari Analitler Ortalama Geri Kazanim ± BSS% (n=3) Ilave edilen standart derisimleri 100 ng/mL 10 ng/mL 1 ng/mL 4-Methylmethcathinone (Mephedrone, 4-MMC) 2,5 ± 0,8 - - TR TR TR