CN108130325A - 一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其特征在于该纯化柱的滤芯采用平均直径小于2μm的无机纤维制成。本发明提供的这种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其相比目前采用有机材料作为滤芯的纯化柱,内部滤芯对于核糖核酸具有更高的吸附效果。根据人体血清miRNA提取实验的qPCR检测实验结果,本发明的纯化效果相比国产纯化柱提高10倍左右,而相比某进口纯化柱提高4倍左右,进一步提升了已有核糖核酸纯化柱的纯化品质。
Description
技术领域
本发明涉及一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱。
背景技术
核糖核酸纯化柱(Spin column)是目前公知的用于各种材料的RNA提取以及精制的核心装置。其具有操作简单、回收率高、性能稳定等特点,目前这种产品已经为国内外大多数实验室和公司使用。
已知的纯化柱的滤芯主要采用硅胶膜、硅基质膜或者硝化纤维等有机材料作为核糖核酸的特异性吸附材料,这类材料对其他生物材料基本不吸附,可以保障最大程度地回收样品中的DNA\RNA,同时去除其他杂质。
众所周知,分子生物学研究中MicroRNA(miRNA)是由内源基因编码、长度约21~25nt的一类非编码单链RNA分子,其主要功能是参与动植物转录后的基因表达与调控。提取纯化RNA是一个基础性的工作,各种临床检测或者基础科研中都需要提取纯化RNA。在核酸样本中低丰度的核酸检测中,纯化效率高则低丰度的核酸能获得更多,便于下游检测”等以突出该纯化柱的优势。
目前国内外提取纯化RNA的方法中较为常见的一种为Trizol法。以提取正常人体血清microRNA为例,其流程通常为先取一定量的血清样品,加入Trizol裂解液和氯仿,离心取上清液,把上清液与乙醇混一起,上纯化柱提取,最后采用无RNase水(无RNA酶的水)洗脱。
由于不同滤芯材料的纯化柱对于RNA的提取效果是不同的,因此对于提取后的RNA含量的后续检测也是评定纯化柱对于核酸吸附效果的重要环节。通常情况下,如果纯化柱的提取效果好则提取的总RNA含量高,那么在其中miRNA含量相对也高。当然现有技术中主要采取qPCR检测法,即实时PCR检测法专门检测个别miRNA的含量,如果含量高,则对应的Ct值小,说明纯化柱的提取效果好(提取物纯度高);如果含量低,则对应的Ct值大,说明纯化柱提取效果差(提取物纯度低),对于目前的纯化柱来说,在相同的提取方法及操作条件下,最后能通过Ct的大小判断核酸纯化柱,或者说核酸纯化柱的滤芯的提取吸附效果。当然,RNA要进行PCR检测,必须将RNA先转换为DNA,所以在PCR检测环节中,RNA提取之后需要通过逆转录反应将RNA转换为DNA后再进行PCR检测。
根据我们了解的情况并通过长期实践,目前以有机材料作为滤芯的纯化柱在提取效果上(miRNA含量)的提升有限,提取含量低于预期。这主要归结为现有纯化柱中滤芯材料的性能,因此为了提取得到纯度更高,量更大的核糖核酸,必须寻找更好的纯化柱滤芯替代材料。
发明内容
本发明目的是:提供一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其相比目前采用有机材料作为滤芯的纯化柱,提取效果更好。
本发明的技术方案是:一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其特征在于该纯化柱的滤芯采用平均直径小于2μm的无机纤维制成。
进一步的,本发明中所述无机纤维选用下述单一或几种物质的混合物:氧化铝纤维、硅酸铝纤维及玻璃纤维。
更进一步的,本发明中所述玻璃纤维是指C-玻璃纤维,D-玻璃纤维,E-玻璃纤维和AR玻璃纤维中的一种或几种的混合物。
进一步的,本发明中所述氧化铝纤维的组分质量百分比含量为:Al2O3 65~99%,SiO2 1~35%。
更进一步的,本发明中所述硅酸铝纤维的组分质量百分比含量为:Al2O3 30~55%,SiO2 60~35%,ZrO2 0~17%。
更进一步的,本发明中所述玻璃纤维的组分质量百分比含量为:SiO2 50~67%。Al2O3 0~16%,CaO+MgO 0~25%,R2O 0~18%,ZrO2 0~21%,B2O3 0~10%,其中R2O是指Na2O和K2O中的一种。
进一步的,本发明中所述无机纤维密度为0.2~1g/cm3。
更进一步的,本发明中所述无机纤维密度为0.3~0.5g/cm3。
本发明的优点是:
本发明提供的这种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其相比目前采用有机材料作为滤芯的纯化柱,内部滤芯对于核糖核酸具有更高的吸附效果。根据人体血清miRNA提取实验的qPCR检测实验结果,本发明的纯化效果相比国产纯化柱提高10倍左右,而相比某进口纯化柱提高4倍左右,进一步提升了已有核糖核酸纯化柱的纯化品质。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
图1为Hsa-miR-16的一组qPCR检测扩增曲线图(3个NO-1纯化柱与国产、进口纯化柱比较);
图2为Hsa-miR-16的另一组qPCR检测扩增曲线图(3个NO-2纯化柱与国产、进口纯化柱比较);
图3为Hsa-miR-16的另一组qPCR检测扩增曲线图(6个NO-3纯化柱与国产、进口纯化柱比较);
图4为Hsa-miR-16的另一组qPCR检测扩增曲线图(6个NO-3纯化柱中去除偏差最大的一个后与国产、进口纯化柱比较);
图5为Hsa-miR-16的另一组qPCR检测扩增曲线图(6个NO-3纯化柱中最好的三个与国产、进口纯化柱比较);
图6为hsa-miR-122的一组qPCR检测扩增曲线图(3个NO-1纯化柱与国产、进口纯化柱比较);
图7为hsa-miR-122的另一组qPCR检测扩增曲线图(3个NO-1纯化柱中去除偏差最大的一个后与国产、进口纯化柱比较);
图8为hsa-miR-122的另一组qPCR检测扩增曲线图(3个NO-2纯化柱与国产、进口纯化柱比较);
图9为hsa-miR-122的另一组qPCR检测扩增曲线图(6个NO-3纯化柱与国产、进口纯化柱比较);
图10为hsa-miR-122的另一组qPCR检测扩增曲线图(6个NO-3纯化柱中最好的三个与国产、进口纯化柱比较)。
具体实施方式
实施例1:纯化柱的编号NO-1,其结构参见现有技术,特殊设计点是滤芯材料选用平均直径1.8μm的氧化铝纤维,其组分质量百分比含量为:Al2O3 72%,SiO2 28%。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克,厚度2毫米、氧化铝纤维密度0.38g/cm3。
实施例2:纯化柱的编号NO-2,其结构参见现有技术,特殊设计点是滤芯材料是平均直径1.8μm的氧化铝纤维、平均直径1.2μm的C玻璃纤维和平均直径1.2μm的E玻璃纤维的混合物,它们各自质量百分含量为氧化铝纤维20%,C玻璃纤维40%,E玻璃纤维40%。其中:
氧化铝纤维,其组分质量百分比含量为Al2O372%,SiO2 28%;
C玻璃纤维,其组分质量百分比含量为SiO2 60%,Al2O3 6%,CaO+MgO 20%,Na2O10%,B2O3 4%;
E玻璃纤维,其组分质量百分比含量为SiO2 52%,Al2O3 16%,CaO+MgO 25%,K2O0.6%,B2O3 6.4%。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克,厚度2毫米,该滤芯材料密度0.38g/cm3。
实施例3:纯化柱的编号NO-3,其结构参见现有技术,特殊设计点是滤芯材料选用平均直径0.5μm的硅酸铝纤维,其组分质量百分比含量为:Al2O3 46%,SiO2 54%。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克,厚度2毫米,硅酸铝纤维密度0.42g/cm3。
作为比较例:
国产纯化柱:为目前市面上可以买到的硅胶膜滤芯纯化柱。
该硅胶膜滤芯重量0.03克,厚度2毫米,其滤芯材料密度0.38g/cm3。
进口纯化柱:某欧洲公司的217004miRNeasy Mini Kit,其中纯化柱滤芯材料为有机高分子树脂。该进口纯化柱使用滤芯重量0.03克,厚度2毫米,其滤芯材料密度0.38g/cm3。
下面通过将上述实施例的纯化柱样例与国产、进口纯化柱共同进行人体血清miRNA的提取,并且通过qPCR检测法检测总RNA中特定基因Hsa-miR-16,Hsa-miR-122两种miRNA的Ct值来评估纯化柱性能。对应纯化柱检测得到的Ct值越小,说明对应纯化柱得到的miRNA越多,则其纯化效率越高。
1.纯化柱:
2.RNA提取方法采用经典的Trizol法:
取3ml血清样品,加入Trizol裂解液裂解,再加入氯仿,离心后取上清,上清液中加入结合液,混匀后将混合液均匀加入17个纯化柱内(一定要保证每个纯化柱内加入的混合液均匀且量相等)提取RNA,之后用100ul无RNase水洗脱得到样品。
对17个纯化柱分别进行编号NO-1(1),NO-1(2),NO-1(3),NO-2(1),NO-2(2),NO-2(3),NO-3(1),NO-3(2),NO-3(3),NO-3(4),NO-3(5),NO-3(6),国产纯化柱(1),国产纯化柱(2),国产纯化柱(3),进口纯化柱(1),进口纯化柱(2)。
3.从各纯化柱中取等体积RNA样品做hsa-miR-16和hsa-miR-122的逆转录反应,之后用逆转录产物做qPCR检测。
4.结果:
而各纯化柱提取后经qPCR检测的Hsa-miR-16的Ct值见下表(对获取的每一样品均检测记录两次Ct值):
从上述表格我们可以看出:NO-1和NO-2纯化柱系中,Ct值结果偏差最大的一个是NO-1(2),其获取的样品两次检测结果为25.21544和25.25136,略大于NO-1和NO-2系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值,但仍旧小于国产和进口纯化柱获取样品检测的Ct值。
NO-3纯化柱中最好的三个是NO-3(1),NO-3(2)和NO-3(5)。而偏差最大的一个是NO-3(3),其获取的样品两次检测结果为25.62504和25.68264,略大于NO-3系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值,但仍旧小于国产和进口纯化柱获取样品检测的Ct值。
各纯化柱提取后经PCR检测的hsa-miR-122的Ct值见下表:
从上述表格我们可以看出:NO-1纯化柱中,Ct值结果偏差最大的一个是NO-1(2),其获取的样品两次检测结果为30.96686和30.98852,略大于NO-1系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值,但仍旧小于国产和进口纯化柱获取样品检测的Ct值。
NO-3纯化柱中最好的三个是NO-3(1),NO-3(2)和NO-3(4)。
而qPCR检测hsa-miR-16的扩增曲线图如图1~图5所示,而qPCR检测hsa-miR-122的扩增曲线图如图6~图10所示。
从图中我们可以看到,经本案实施例NO-1、NO-2和NO-3纯化柱提取得到的RNA中相应基因hsa-miR-16和hsa-miR-122逆转录产物的扩增曲线明显都优于国产和进口纯化柱。
从上述表格和图中我们可以得出结论:
采用本发明无机材料滤芯的NO-1、NO-2、NO-3纯化柱提取得到的hsa-miR-16d的Ct值几乎无差异,且均小于国产纯化柱和进口纯化柱的提取样品Ct值。同样NO-1、NO-2、NO-3纯化柱提取得到的hsa-miR-122的Ct值也几乎无差异,且均小于国产纯化柱和进口纯化柱的提取样品Ct值,
Ct值小,说明纯化柱对样品的提取效果好(提取物量更大,纯度更高)。这表明本发明的纯化柱其对于miRNA的纯化效果大大优越于国产纯化柱和进口纯化柱。经过长期实验对比检测,本发明的纯化柱的纯化效果比国产纯化柱效果高10倍左右,比进口纯化柱的纯化效果高4倍左右。
实施例4:纯化柱的编号NO-4,其结构参见现有技术,特殊设计点是滤芯材料选用平均直径1.2μm的氧化铝纤维,其组分质量百分比含量为:Al2O3 97%,SiO2 3%。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克,厚度2毫米,氧化铝纤维密度0.38g/cm3。
实施例5:纯化柱的编号NO-5,其结构参见现有技术,特殊设计点是滤芯材料是平均直径1.2μm的氧化铝纤维、平均直径1.1μm的C玻璃纤维的混合物,它们各自质量百分含量为氧化铝纤维20%,C玻璃纤维80%。其中:
氧化铝纤维,其组分质量百分比含量为Al2O397%,SiO2 3%;
C玻璃纤维,其组分质量百分比含量为SiO2 67%,Al2O32%,CaO+MgO 20%,Na2O8%,B2O3 3%;每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克,厚度2毫米,滤芯材料密度0.42g/cm3。
实施例6:纯化柱的编号NO-6,其结构参见现有技术,特殊设计点是滤芯材料选用平均直径0.8μm的硅酸铝纤维,其组分质量百分比含量为:Al2O3 35%,SiO2 50%,ZrO215%。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克,厚度2毫米,硅酸铝纤维密度0.38g/cm3。
作为比较例:
自制对比例1:纯化柱结构参见现有技术,滤芯材料选用平均直径5μm的氧化铝纤维,其组分质量百分比含量为:Al2O3 72%,SiO2 28%。
每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克,厚度2毫米,氧化铝纤维密度0.38g/cm3。
自制对比例2:纯化柱结构参见现有技术,滤芯材料是平均直径5μm的氧化铝纤维和平均直径2.6μm的C玻璃纤维的混合物,它们各自质量百分含量为氧化铝纤维50%,C玻璃纤维50%,其中:
氧化铝纤维,其组分质量百分比含量为Al2O372%,SiO2 28%;
C玻璃纤维,其组分质量百分比含量为SiO2 60%,Al2O3 6%,CaO+MgO 20%,Na2O10%,B2O3 4%;每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克,厚度2毫米,滤芯材料密度0.38g/cm3。
自制对比例3:纯化柱结构参见现有技术,滤芯材料选用平均直径3μm的硅酸铝纤维,其组分质量百分比含量为:Al2O3 46%,SiO2 54%。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克,厚度2毫米,硅酸铝纤维密度0.38g/cm3。
下面通过将上述实施例4~6的纯化柱样例与三个自制对比例共同进行人体血清microRNA的提取,并且通过qPCR检测法检测总RNA中特定基因Hsa-miR-16,Hsa-miR-122两种microRNA的Ct值来评估纯化柱性能。对应纯化柱检测得到的Ct值越小,说明对应纯化柱得到的miRNA越多,则其纯化效率越高。
5.纯化柱:
6.RNA提取方法采用经典的Trizol法:
取3ml血清样品,加入Trizol裂解液裂解,再加入氯仿,离心后取上清,上清液中加入结合液,混匀后将混合液均匀加入18个纯化柱内(一定要保证每个纯化柱内加入的混合液均匀且量相等)提取RNA,之后用100ul无Rnase水洗脱得到样品。
对18个纯化柱分别进行编号NO-4(1),NO-4(2),NO-4(3),NO-5(1),NO-5(2),NO-5(3),NO-6(1),NO-6(2),NO-6(3),NO-6(4),NO-6(5),NO-6(6),自制对比例1(1),自制对比例1(2),自制对比例2(1),自制对比例2(2),自制对比例3(1),自制对比例3(2)。
7.从各纯化柱中取等体积RNA样品做hsa-miR-16和hsa-miR-122的逆转录反应,之后用逆转录产物做qPCR检测。
8.结果:
而各纯化柱提取后经qPCR检测的Hsa-miR-16的Ct值见下表(对获取的每一样品均检测记录两次Ct值):
从上述表格我们可以看出:NO-4和NO-5纯化柱系中,Ct值结果偏差最大的一个是NO-4(2),其获取的样品两次检测结果为25.17644和25.23254,略大于NO-4和NO-5系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值,但仍旧小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。
NO-6纯化柱中最好的三个是NO-6(1),NO-6(2)和NO-6(5)。而偏差最大的一个是NO-6(3),其获取的样品两次检测结果为25.52504和25.63234,略大于NO-6系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值,但仍旧小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。
各纯化柱提取后经PCR检测的hsa-miR-122的CT值见下表:
从上述表格我们可以看出:NO-4、NO-5和NO-6纯化柱系中,Ct值结果偏差最大的一个是NO-6(3),其获取的样品两次检测结果为29.98688和29.96645,略大于系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值,但仍旧小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。
从上述表格我们可以得出结论:
采用本发明无机材料滤芯的NO-4、NO-5、NO-6纯化柱提取得到的hsa-miR-16d的Ct值几乎无差异,且均小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。同样NO-4、NO-5、NO-6纯化柱提取得到的hsa-miR-122的Ct值也几乎无差异,且均小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。Ct值小,说明纯化柱对样品的提取效果好(提取物量更大,纯度更高)。这表明本发明的纯化柱其对于miRNA的纯化效果大大优越于自制对比例(以平均直径>2μm的无机材料作为滤芯)的各化柱。
当然上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其特征在于该纯化柱的滤芯采用平均直径小于2μm的无机纤维制成。
2.根据权利要求1所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其特征在于所述无机纤维选用下述单一或几种物质的混合物:氧化铝纤维、硅酸铝纤维及玻璃纤维。
3.根据权利要求2所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其特征在于所述玻璃纤维是指C-玻璃纤维,D-玻璃纤维,E-玻璃纤维和AR玻璃纤维中的一种或几种的混合物。
4.根据权利要求2所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其特征在于所述氧化铝纤维的组分质量百分比含量为:Al2O3 65~99%,SiO2 1~35%。
5.根据权利要求2所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其特征在于所述硅酸铝纤维的组分质量百分比含量为:Al2O3 30~55%,SiO2 60~35%,ZrO2 0~17%。
6.根据权利要求2所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其特征在于所述玻璃纤维的组分质量百分比含量为:SiO2 50~67%。Al2O3 0~16%,CaO+MgO 0~25%,R2O 0~18%,ZrO2 0~21%,B2O3 0~10%,其中R2O是指Na2O和K2O中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其特征在于所述无机纤维密度为0.2~1g/cm3。
8.根据权利要求7所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱,其特征在于所述无机纤维密度为0.3~0.5g/cm3。
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