CN109897849A - 多糖多酚植物基因组dna提取ctab方法的技术改进 - Google Patents
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Abstract
本发明实现了一种多糖多酚类植物中DNA提取的方法改进。这种改进方法,在提取多糖多酚植物组织DNA的时候,会首先使用含有聚乙烯吡咯烷酮PVP K‑90的CTAB缓冲液浸泡多糖多酚的植物组织,然后在植物组织DNA通过碱性氧化铝的柱子的时候,先利用氯化钙溶液浸泡碱性氧化铝柱子,最后一步沉淀洗涤的时候,再用含有聚乙烯吡咯烷酮PVP K‑90的乙醇溶液沉淀浸洗提取的DNA,去除其它杂质。通过这些处理步骤提高了利用CTAB方法在多糖多酚植物中DNA提取的浓度和效率。
Description
技术领域
本发明涉及到一种CTAB的DNA提取方法,尤其是在多糖多酚植物中怎么样改善DNA提取效率的方法
背景技术
提取DNA是很多分子生物学实验技术的基础,是很多有关分子生物学实验的基础,怎么样能够高效率从样品中提取DNA,一直是分子生物学技术人员非常关心的话题。
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。大体上CTAB方法提取植物DNA的整个过程是,先采用机械破碎植物细胞,然后加入CTAB分离缓冲液将DNA溶解出来,再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质,最后得到DNA。
在提取DNA的过程中,多糖多酚类的物质会严重的阻扰DNA的提取。该类多糖多酚类物质主要是植物体内的复杂酚类次生代谢物,具有多元酚结构,主要存在于植物的皮、根、叶、果中。在植物中的含量仅次于纤维素。酚类是植物特有的一种次生代谢产物,是非常容易被氧化成为褐色的醌类次生代谢产物。某些植物和植物的某些特异组织含有较高量的酚类物质。植物多糖,又称植物多聚糖,是植物细胞代谢产生的聚合度超过10个的聚糖。而糖类也是植物次生代谢的重要产物,由于核酸都是由多糖类物质构成,提取的多糖成分经常混合在DNA提取的终产物的过程中,干扰核酸的提取纯化。
在提取DNA的过程中,多糖多酚类物质会结合到DNA中,有的甚至形成不可逆的结合,并且难以去除,严重影响了DNA的浓度。而在一些植物中,多糖多酚类物质的含量高,在针对这些植物基因组DNA的提取过程中,传统DNA提取方法多糖多酚类物质会一直存续在溶液中,妨碍了DNA提取质量和纯度的提高。
传统的CTAB提取方法所需要提供的其它各种试剂和作用:Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;NaCl提供一个高盐环境,使DNA充分溶解,存在于液相中;β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除。
本实验室在传统的CTAB的DNA提取方法再进行了一些改进。通过比对传统的DNA提取方法,依据我们这些改进的方法,能够较高效的在植物基因组中进行多糖多酚类植物组织材料的DNA提取,对下一步的分子生物学实验非常有帮助。
发明内容
目的是为了提取多糖多酚植物中基因组DNA,通过改进方法和步骤能够高效的通过CTAB方法,获取植物的基因组DNA结果
附图说明
为了测定改进后DNA的提取效果,利用超微量分光光度计进行核酸浓度和纯度的检测。举例提取的基因组DNA为玉米,西瓜,葡萄,苹果多糖多酚植物基因组DNA。此样品含有大量的多糖多酚,会经常干扰 DNA的提取效果。
在超微量分光光度计中测定核酸浓度和比值,得到结果如表。在0.8%的琼脂糖凝胶EB电泳中加入通过传统CTAB方法和改进CTAB方法纯化得到的基因组DNA进行比对电泳,同时点加利用此方法纯化DNA所得到的PCR扩增内参片段的DNA电泳样进行分析判断,结果如图。
图1为提取DNA电泳图,1原始西瓜DNA提取电泳结果,2原始苹果DNA提取电泳结果,基因组DNA 降解严重,3原始玉米DNA提取电泳结果,4原始葡萄DNA提取电泳结果,5改进西瓜DNA提取电泳结果, 6改进苹果DNA提取电泳结果,7改进玉米DNA提取电泳结果,8改进葡萄DNA提取电泳结果。比对传统的CTAB多糖多酚植物基因组DNA的提取方法,改进后的CTAB提取方法,能够极大的增加植物DNA提取时的获得率。其获得DNA的量,还有纯度都有很大的提高。
提取DNA OD值表
具体实施方式
我们推荐的方法步骤:
提取之前,将碱性氧化铝称取5克,置于一个5ml过滤式亲和离心柱中。提取时,称取2g左右的多糖多酚植物样品,置于预冷的离心管中,加入液氮混合石英砂少许快速匀浆碾磨成粉。使用用乙醇70%的乙醇配制的聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90 25%溶液,将其加入CTAB缓冲液中预先混合,使得聚乙烯吡咯烷酮 PVP K-90在CTAB缓冲液中的终浓度含量为5%左右。
加入65度的预热的2×CTAB提取缓冲液,不断进行震荡摇动10分钟左右。再加入等体积的氯仿/异戊醇的混合液,颠倒离心管混匀,4度低温下离心12000r/min离心10分钟。转移上层水相到一个充满碱性氧化铝的柱子中,用碱性氧化铝的柱子吸附之前提取的核酸混合液。碱性氧化铝的柱子在吸附核酸前,需要经过3%氯化钙浸泡饱和至少5分钟。然后再加入30%氯化钙冲洗碱性氧化铝的柱子,同时也将核酸溶液冲洗下来。利用微量的分光光度计,随时记录每个柱子中的OD值,将最大OD值的管子拿出来下一步使用。碱性氧化铝的柱子不用时,也需要至于3%的叠氮钠中长期保存。
转移冲洗后的过滤液体到新的离心管中,加入一倍体积的异丙醇混匀,室温下放置30分钟。然后再将混合液4000r/min离心5-10min,去上清,这时候会有沉淀形成。将得到的沉淀使用聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90 5%清洗一遍,然后4000r/min离心5-10min,去上清。再加70%的乙醇混匀清洗一遍,然后离心 4000r/min离心5min,去除上清乙醇。最后将试管中的留存沉淀风干。风干的溶液加入40μl的TE缓冲液进行保存。
在传统提取的过程中,将PVP K-90在CTAB缓冲液中,能够更好的辅助裂解细胞,得到更好的分散性。将DNA通过一次碱性氧化铝柱,该碱性氧化铝柱可以吸附碱性的核糖核酸,而一般的多糖类物质,不呈现碱性,通过此方法,可以极大量的去除溶液中的多糖类物质,利于下一步的实验纯化。而且,在碱性氧化铝柱子吸附溶液中的核酸的之前,先用3%的氯化钙浸泡柱子,发现能够显著的提高DNA的产量。使用终浓度含有5%的聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90的70%乙醇溶液沉淀清洗提取的DNA溶液,可以使得更多的残留多糖多酚类物质在溶液中,而不是最终的沉淀中。
Claims (4)
1.一种改进的CTAB多糖多酚类植物DNA的提取方法,加入70%的乙醇配制的聚乙烯吡咯烷酮PVP K-9025%溶液配制溶液CTAB缓冲液来裂解细胞提取DNA,CTAB缓冲液中聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90终浓度为5%。
2.根据权利书1的要求,该方法在提取DNA的过程中,对多糖多酚植物的DNA样品在提取前进行含有聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90的CTAB缓冲液65度的预热浸泡震荡处理10分钟,然后再进行提取。
3.根据权利书2的要求,该方法在提取DNA的过程。提取的DNA溶液将会通过碱性氧化铝柱,推荐在过柱前,先对柱子进行3%氯化钙浸泡,以提高柱子对DNA的吸附能力。
4.根据权利书3的要求,该方法在提取DNA过程的最后,使用70%的乙醇配制聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90,使得聚乙烯吡咯烷酮PVP K-90在70%乙醇中终浓度为5%,再利用这种溶液沉淀清洗提取的DNA溶液以得到更高质量的DNA。
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CN114015681A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-02-08 | 深圳市人民医院 | 一种改进的多糖多酚植物ctab的提取方法 |
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- 2017-12-07 CN CN201711343588.0A patent/CN109897849A/zh active Pending
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