CN107794259A - 针对富含多糖多酚植物组织的漂洗液及漂洗方法、提取基因组dna的方法及试剂盒 - Google Patents

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方南
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Abstract

本发明公开了一种针对富含多糖多酚植物组织的漂洗液及漂洗方法、提取基因组DNA的方法及试剂盒。其中，该植物组织漂洗液包括：摩尔浓度为0.175～0.53M的D山梨醇，摩尔浓度为50～150mM的pH＝8.0Tris‑HCl缓冲液，摩尔浓度为2.5～7.5mM的EDTA，质量百分含量为0.5％～3％的PVP以及水。应用本发明的针对富含多糖多酚的植物组织漂洗液可以将植物组织中的多糖多酚有效去除，从而使后续提取的植物基因组DNA不再粘稠，纯化后可以得到更加纯净的DNA，这些DNA可以应用于二代、三代文库构建，且采用该方法具有效果好、成本低、操作简便的优点。

Description

针对富含多糖多酚植物组织的漂洗液及漂洗方法、提取基因 组DNA的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种针对富含多糖多酚植物组织的漂洗液及漂洗方法、提取基因组DNA的方法及试剂盒。
背景技术
富含多糖多酚的植物组织在使用普通的CTAB提取法或商品化的提取试剂盒提取基因组DNA时，得到的基因组DNA往往会残留较多的多糖多酚类杂质，导致基因组DNA溶液呈现粘稠、胶质状，对提取的DNAA260/280、A260/230值进行测定，测量值通常都会较低，电泳时电泳条带向上弥散；在进行下游的二代illumina、三代Pacbio文库构建磁珠纯化步骤时，磁珠会聚集在一起并呈棉絮状(正常情况下磁珠会均匀的分布在溶液中)，且磁珠无法在磁力的作用下被吸附到磁力架上，导致DNA无法被抓取回来从而导致建库失败。
我们尝试使用过天根公司的新型植物基因组提取试剂盒(货号DP320)、Qiagen公司的Plant Mini Kit(货号69104)、Mobio公司的DNA Isolation kit(货号13400-50)来提取富含多糖多酚的植物组织中的基因组DNA，但提取的DNA都很粘稠，无法进行下游的建库实验。对提取后的DNA我们也尝试过使用磁珠法、Qiagen的Pro DNA Clean-Up Kit(货号：12997-50)对提取后的DNA进行纯化，效果都十分不理想，磁珠纯化直接抓取失败，Qiagen试剂盒纯化后的DNA仍然粘稠。
发明内容
本发明旨在提供一种针对富含多糖多酚植物组织的漂洗液及漂洗方法、提取基因组DNA的方法及试剂盒，以解决现有技术中普通的CTAB提取法或商品化的植物基因组DNA提取试剂盒从富含多糖多酚的植物组织中提取的基因组DNA无法满足建库需要的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗液。该漂洗液包括：摩尔浓度为0.175～0.53M的D山梨醇，摩尔浓度为50～150mM的pH＝8.0Tris-HCl缓冲液，摩尔浓度为2.5～7.5mM的EDTA，质量百分含量为0.5％～3％的PVP以及水。
进一步地，该漂洗液包括：摩尔浓度为0.26～0.44M的D山梨醇，摩尔浓度为75～125mM的pH＝8.0Tris-HCl缓冲液，摩尔浓度为3.75～6.25mM的EDTA，质量百分含量为0.75％～2％的PVP以及水。
进一步地，该漂洗液包括：摩尔浓度为0.35M的D山梨醇，摩尔浓度为100mM的pH＝8.0Tris-HCl缓冲液，摩尔浓度为5mM的EDTA，质量百分含量为1％的PVP以及水。
根据本发明的另一个方面，提供了一种针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗方法。该漂洗方法采用上述任一种针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗液对植物组织进行漂洗。
进一步地，对富含多糖多酚的植物组织进行漂洗前还包括：将富含多糖多酚的植物组织使用液氮速冻，研磨至粉末状。
进一步地，漂洗具体步骤包括：将0.1～2g粉末状的植物组织加入1～25mL针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗液，混匀、离心、弃上清；重复上述步骤2～6次。
根据本发明的再一个方面，提供了一种提取富含多糖多酚的植物组织基因组DNA的试剂盒。该试剂盒包括上述任一种针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗液。
根据本发明的又一个方面，提供了一种提取富含多糖多酚的植物组织基因组DNA的方法。该方法包括上述任一种针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗方法。
进一步地，该方法还包括基因组DNA提取、DNA纯化、和DNA质控的步骤。
应用本发明的富含多糖多酚的植物组织漂洗液可以将植物组织中的多糖多酚去除，从而使后续提取的植物基因组DNA不再粘稠，得到更加纯净的DNA，使这些DNA可以应用于二代、三代文库构建，且采用该方法具有效果好、成本低、操作简便的优点。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明一典型实施方式提取富含多糖多酚的植物组织基因组DNA的方法的流程示意图；
图2示出了实施例2中不同方法提出的基因组DNA电泳图；以及
图3示出了实施例3中不同漂洗液处理后提出的基因组DNA电泳结果。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
富含多糖多酚的植物组织在使用普通的CTAB提取法或商品化的植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA时，存在以下问题：1)提取后的DNA纯度较差，A260/280值一般在1.7以下、A260/230一般在1以下(纯净的DNAA260/280值是在1.8-2.0之间、A260/230在2.0-2.2之间)；2)提取过程中多糖类杂质去除不干净，提取后的DNA溶液特别粘稠，而且提取后的DNA不管是用过柱纯化还是磁珠纯化都无法去除DNA中的粘稠类物质，这样的DNA在进行后续的文库构建磁珠纯化步骤时时会出现DNA无法被回收的情况导致建库失败。
针对上述技术问题，本发明提出了以下技术方案。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种富含多糖多酚的植物组织漂洗液。该漂洗液包括：摩尔浓度为0.175～0.53M的D山梨醇，摩尔浓度为50～150mM的pH＝8.0Tris-HCl缓冲液，摩尔浓度为2.5～7.5mM的EDTA，质量百分含量为0.5％～3％的PVP以及水。
应用本发明的富含多糖多酚的植物组织漂洗液可以将植物组织中的多糖多酚去除，从而使后续提取的植物基因组DNA不再粘稠，得到更加纯净的DNA，使这些DNA可以应用于二代、三代文库构建，且采用该方法具有效果好、成本低、操作简便的优点。
优选的，该漂洗液包括：摩尔浓度为0.26～0.44M的D山梨醇，摩尔浓度为75～125mM的pH＝8.0Tris-HCl缓冲液，摩尔浓度为3.75～6.25mM的EDTA，质量百分含量为0.75％～2％的PVP以及水。
更优选的，该漂洗液包括：摩尔浓度为0.35M的D山梨醇，摩尔浓度为100mM的pH＝8.0Tris-HCl缓冲液，摩尔浓度为5mM的EDTA，质量百分含量为1％的PVP以及水。其中，D山梨醇有维持细胞渗透压的作用防止细胞破裂的功能，Tris-HCl缓冲液可以维持溶液的pH稳定，EDTA可以鳌合DNA酶防止DNA降解，PVP的作用是作用主要是防止植物细胞中的多酚类物质氧化。
应用本发明的富含多糖多酚的植物组织漂洗液可以有效将植物组织中的多糖多酚去除，从而使后续提取的植物基因组DNA不再粘稠，得到更加纯净的DNA，使这些DNA可以应用于二代、三代文库构建，且采用该方法具有效果好、成本低、操作简便的优点。
本发明的针对富含多糖多酚的植物组织漂洗液、漂洗方法可以与现有的常规的CTAB、SDS提取法或商品化的植物基因组DNA提取试剂盒联合使用提取基因组DNA，理论上经过漂洗后的组织使用无论哪种提取方法或试剂盒都能得到较好的提取效果。与本发明联用的商品化的植物基因组DNA提取试剂盒可以是天根快捷型植物基因组DNA提取系统(货号DP321)、天根磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒(货号DP342)、天根植物基因组DNA提取试剂盒(货号DP305)、天根新型植物基因组提取试剂盒(货号DP320)、Qiagen DNeasy PlantMini Kit(货号69104/69106)、Qiagen MagAttract 96DNA Plant Core Kit(货号67163)、Mobio Pro DNA Isolation Kit(货号13400-50)等等。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种富含多糖多酚的植物组织的漂洗方法。该漂洗方法包括采用上述任一种富含多糖多酚的植物组织漂洗液对富含多糖多酚的植物组织进行漂洗。应用本发明的富含多糖多酚的植物组织漂洗液可以将植物组织中的多糖多酚去除，从而使后续提取的植物基因组DNA不再粘稠，得到更加纯净的DNA，使这些DNA可以应用于二代、三代文库构建，且采用该方法具有效果好、成本低、操作简便的优点。
优选的，对富含多糖多酚的植物组织进行漂洗前进一步包括：将富含多糖多酚的植物组织使用液氮速冻，研磨至粉末状。这样可以使植物组织中的多糖多酚充分释放出来，以便尽快的漂洗干净。
为了后续得到更加纯净的DNA，优选的，漂洗具体包括：将0.1～2g粉末状的植物组织加入1～25mL富含多糖多酚的植物组织漂洗液，混匀、离心、弃上清；重复上述步骤2～6次。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种提取富含多糖多酚的植物组织基因组DNA的方法。该方法包括富含多糖多酚的植物组织的漂洗方法。优选的，如图1所示，该方法包括组织研磨、组织前处理(即漂洗)、基因组DNA提取、DNA纯化和DNA质控的步骤。其中，该DNA提取、DNA纯化和DNA质控的步骤可以使用商品化的试剂盒或本领域的常规技术手段实现。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
材料：火龙果花萼、火龙果肉质茎、火龙果果肉
常规提取：将三种植物组织使用液氮速冻，分别在研钵中研磨至粉末状，然后取0.1g左右的研磨后的组织加入2mL的EP管中，使用天根公司的新型植物基因组提取试剂盒(货号DP320)从植物组织中提取基因组DNA，详细步骤见公司官网(http://www.tiangen.com/？productShow/t1/1/id/19.html)；提取后的DNA溶液呈明显的粘稠状，OD260/280在1.5-1.7之间，OD260/230在0.3-0.8之间。对提取后的DNA我们使用Qiagen的Pro DNA Clean-Up Kit(货号：12997-50)进行纯化，纯化步骤见说明书(https://mobio.com/powercleanr-pro-dna-clean-up-kit-1095.html)，纯化后的DNA仍然明显粘稠。后续我们使用这些纯化后的DNA进行Pacbio文库构建结果都失败了，失败的原因是DNA太过粘稠在用磁珠抓取回收DNA时磁珠无法被磁力架吸附导致回收失败。
本发明中的方法提取：
组织研磨：将三种植物组织使用液氮速冻，在研钵中分别研磨至粉末状。
组织漂洗：使用本发明中的植物组织漂洗液分别对三种组织进行前处理，该漂洗液的成分如表1所示：
表1
试剂名称 终浓度 母液浓度 1L漂洗液所需试剂量
D山梨醇 0.35M 固体 31.88g
Tris-HCl,pH8.0 100mM 1M 50mL
EDTA 5mM 0.5M 5mL
PVP 1％ 20％ 10g
ddH2O 补足至1L
使用配置好的漂洗液对研磨后的先进行漂洗，
植物组织漂洗的操作如下：将大约0.1克的粉末状的组织转移到2mL离心管中，加入1mL的植物组织漂洗液，手工摇匀3～5min，5700rpm离心10min，弃上清；再加入1mL的植物组织漂洗液，手工摇匀3～5min，5700rpm离心10min，弃上清；漂洗次数根据组织的多糖多酚类杂质含量而定，直至离心后的上清不再粘稠为止，这三种组织均需漂洗5次。
基因组DNA提取：使用天根公司的新型植物基因组提取试剂盒(货号DP320)从植物组织中提取基因组DNA，详细步骤见公司官网(http://www.tiangen.com/？productShow/t1/1/id/19.html)；
DNA纯化：使用Qiagen的Pro DNA Clean-Up Kit(货号：12997-50)对提取后的DNA溶液进行纯化，纯化步骤见说明书(https://mobio.com/powercleanr-pro-dna-clean-up-kit-1095.html)。
DNA质控：使用Invitrogen公司的Qubit 3.0仪器对DNA的浓度进行定量，使用Thermo公司的Nanodrop对DNA的浓度及A260/280、A260/230值进行测定，并进行琼脂糖凝胶电泳观察电泳条带。
得到的DNA溶液清澈透明，不再粘稠，OD260/280在1.8-1.9之间，OD260/230在2.0-2.2之间，电泳条带整齐无降解拖带。使用提取后的DNA进行Pacbio 20K文库构建，出库库容有1.2ug，构建好的文库在RSII测序仪上测序酶读长有15K，单个cell产出有1.5G，这些结果都是十分优秀的水平。
实施例2
材料：喜树叶片、黄麻叶片
使用常规方法和本专利中的方法同时对这两种组织进行提取，首先用液氮分别将两种组织研磨至粉末状，然后各取一半组织使用天根公司的新型植物基因组提取试剂盒(货号DP320)从植物组织中提取基因组DNA，详细步骤见公司官网(http://www.tiangen.com/？productShow/t1/1/id/19.html)；
另一半组织使用本发明中的方法进行提取，具体提取方法如下：
组织前处理：使用本发明中的植物组织漂洗液对组织进行前处理，该漂洗液的成分如表2所示：
表2
试剂名称 终浓度 母液浓度 1L漂洗液所需试剂量
D山梨醇 0.35M 固体 31.88g
Tris-HCl,pH8.0 100mM 1M 50mL
EDTA 5mM 0.5M 5mL
PVP 1％ 20％ 10g
ddH2O 补足至1L
使用配置好的漂洗液对研磨后的先进行漂洗，植物组织漂洗的操作如下：将大约0.1克的粉末状的组织转移到2mL离心管中，加入1mL的植物组织漂洗液，手工摇匀3～5min，5700rpm离心10min，弃上清；再加入1mL的植物组织漂洗液，手工摇匀3～5min，5700rpm离心10min，弃上清；漂洗次数根据组织的多糖多酚类杂质含量而定，直至离心后的上清不再粘稠为止，两种组织本次实验中都漂洗了5次。
基因组DNA提取：使用天根公司的新型植物基因组提取试剂盒(货号DP320)从植物组织中提取基因组DNA，详细步骤见公司官网(http://www.tiangen.com/？productShow/t1/1/id/19.html)；
DNA纯化：使用Qiagen的Pro DNA Clean-Up Kit(货号：12997-50)对提取后的DNA溶液进行纯化，纯化步骤见说明书(https://mobio.com/powercleanr-pro-dna-clean-up-kit-1095.html)。
两种方法提取完后的DNA同时进行质控：使用Invitrogen公司的Qubit 3.0仪器对DNA的浓度进行定量，使用Thermo公司的Nanodrop对DNA的浓度及A260/280、A260/230值进行测定，并进行琼脂糖凝胶电泳观察电泳条带。
结果见下表3，从该结果可见该发明中方法提取后的DNA纯度很高，而常规方法提取的DNA纯度较差，而且有较明显的粘稠。
表3
电泳结果见图2，从电泳图中表明常规方法提取的DNA由于残留了较多的多糖多酚类的杂带导致其电泳条带出现了明显的向上拖带的现象(胶孔A和E)，而使用实施例2中的提取方法提取的DNA电泳条带完整无拖带现象(胶孔B/C/E/F)。其中电泳图中S为电泳阳性对照，2K为全式金Trans2K Plus DNA Marker，货号BM111-01。电泳图中的A/B/C/D/E/F对应的是上表3中的编号。
提取后的DNA拿去构建Pacbio 20K文库时，使用常规试剂盒提取的DNA都建库失败了，而本发方法提取的DNA建库成功而且在RSII上测序的酶读长在13-15K，证明提取的DNA质量较高。从以上的描述中，可以看出：在使用常规方法提取时，组织中多糖多酚类杂质较难被去除，会和DNA一起被沉淀下来或被吸附到吸附柱上，用TE溶解DNA时这些多糖多酚类杂质又会和DNA一起被溶解，从而导致提取得到的DNA杂质含量较多且程粘稠状。本发明中植物组织在研磨后会将组织中多糖多酚类物质充分释放出来，使用本发明的植物组织漂洗液将这些物质溶解，通过离心从而弃去漂洗液以达到去除植物组织中的多糖多酚类杂质的目的。使用本发明中的方法提取的DNA不再粘稠，再经过一遍纯化后DNA纯度可以达到很高水平，其A260/280值可以在1.8-2.0之间、A260/230值在2.0-2.2之间，并且这些DNA在二代、三代文库构建时都效果良好，没有再出现磁珠纯化无法回收DNA的情况。并且，本方法经过大量验证，其对植物叶片、茎、果实、花朵、花萼等组织同样有效，具有适用性广的特点。
实施例3
我们尝试过使用含有不同浓度的Tris-HCl、EDTA、D山梨醇、PVP的漂洗液对粘稠的植物组织进行提取，看其提取效果。这四种组分的终浓度如下表4：
表4
漂洗液A 漂洗液B 漂洗液C 漂洗液D 漂洗液E
Tris-HCl 50mM 75mM 100mM 125mM 150mM
EDTA 2.5mM 3.75mM 5mM 6.25mM 7.5mM
D山梨醇 0.175M 0.26M 0.35M 0.44M 0.53M
PVP 0.5％ 0.75％ 1％ 2％ 3％
使用上表中五种不同浓度的漂洗液对同一植物样本进行提取，同时设置不做漂洗的对照。用液氮对植物组织进行研磨，研磨后各取0.1g左右的粉末状组织加入EP管中，其中1-5管使用上表中的五种漂洗液对对组织进行漂洗然后使用天根公司的新型植物基因组提取试剂盒(货号DP320)从植物组织中提取基因组DNA，详细步骤见公司官网(http://www.tiangen.com/？productShow/t1/1/id/19.html)，并使用Qiagen的ProDNA Clean-Up Kit(货号：12997-50)对提取后的DNA溶液进行纯化，纯化步骤见说明书(https://mobio.com/powercleanr-pro-dna-clean-up-kit-1095.html)；第6管不做漂洗处理直接使用天根公司的新型植物基因组提取试剂盒(货号DP320)从植物组织中提取基因组DNA。对提取后的DNA同时测定Qubit值、Nanodrop值、进行电泳检测。
提取结果及电泳结果见下表5和图3，从该表5结果可知1-5提取的DNA A260/280、A260/230都要明显好于6号，且3号提取的到的DNA总量最高，说明当漂洗液中组分在一定范围内变化时都能起到改善提取结果的作用，但这些组分浓度太高或太低时可能会在漂洗时导致细胞破碎影响提取得率，只有漂洗液C即本申请中最佳浓度时提取得率才最高。从图3中可以看到6号有明显的胶孔残留的情况，而且提取的DNA弥散在整个泳道。2-5提取的DNA虽然有轻微的降解但主带明显。
表5
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗液，其特征在于，包括：摩尔浓度为0.175～0.53M的D山梨醇，摩尔浓度为50～150mM的pH＝8.0 Tris-HCl缓冲液，摩尔浓度为2.5～7.5mM的EDTA，质量百分含量为0.5％～3％的PVP以及水。
2.根据权利要求1所述的针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗液，其特征在于，包括：摩尔浓度为0.26～0.44M的D山梨醇，摩尔浓度为75～125mM的pH＝8.0 Tris-HCl缓冲液，摩尔浓度为3.75～6.25mM的EDTA，质量百分含量为0.75％～2％的PVP以及水。
3.根据权利要求1所述的针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗液，其特征在于，包括：摩尔浓度为0.35M的D山梨醇，摩尔浓度为100mM的pH＝8.0 Tris-HCl缓冲液，摩尔浓度为5mM的EDTA，质量百分含量为1％的PVP以及水。
4.一种针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗方法，其特征在于，采用如权利要求1至3中任一项所述的针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗液对植物组织进行漂洗。
5.根据权利要求4所述的漂洗方法，其特征在于，对所述富含多糖多酚的植物组织进行漂洗前进一步包括：将所述富含多糖多酚的植物组织使用液氮速冻，研磨至粉末状。
6.根据权利要求5所述的漂洗方法，其特征在于，所述漂洗具体步骤包括：将0.1～2g粉末状的植物组织加入1～25mL所述针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗液，混匀、离心、弃上清；重复上述步骤2～6次。
7.一种提取富含多糖多酚的植物组织基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1至3中任一项所述的针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗液。
8.一种提取富含多糖多酚的植物组织基因组DNA的方法，其特征在于，包括如权利要求4至6中任一项所述的针对富含多糖多酚的植物组织的漂洗方法。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，进一步包括基因组DNA提取、DNA纯化、和DNA质控的步骤。
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