CN106191039A - 从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法及其试剂盒。该方法包括：以纤维素粉预制离心柱；以CTAB提取液、有机溶剂混合液去除真菌菌丝中的杂质；将mRNA吸附于纤维素粉，清洗去除杂质后，将mRNA洗脱下来，沉淀后溶解保存备用。该试剂盒包括：离心柱，离心管，纤维素粉，CTAB提取液，清洗缓冲液，洗脱缓冲液等。本发明能有效去除真菌中的多糖类物质并获得高质量mRNA，同时能显著降低提取成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法及其试剂盒，属于核酸纯化技术领域。
背景技术
据申请人所知，目前国内外提取纯化真菌mRNA的方法主要有两类：一类是异硫氰酸胍(Trizol)一步提取法，破壁后的真菌菌丝溶解在Trizol中，然后通过苯酚氯仿有机相和水相分离的方法去除蛋白、DNA等，最后将mRNA沉淀出来。另一类是通过硅胶膜吸附提取法，破壁的真菌菌丝通过苯酚氯仿抽提的方法去除蛋白，然后用硅胶膜吸附核酸，用不同的洗脱液去除DNA，最终洗脱获得mRNA。
然而，在针对含多糖较多的丝状真菌提取mRNA时，因其所含多糖不容易去除，最终容易导致DNA、多糖残留较多，严重影响提取的mRNA质量。此外，目前提取mRNA常用的Trizol试剂及硅胶膜吸附柱价格较贵，导致提取成本比较高。
经检索发现，专利号CN200610017921.4、授权公告号CN101086011B、名称《食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒及其应用》的中国发明专利，该试剂盒包含有以下药物：(1)提取缓冲液；(2)提取双链RNA的药物；(3)纯化的药物；(4)双链RNA的琼脂糖凝胶电泳检测药物。其中，在双链RNA纯化时采用了CF-11纤维素粉末。然而，由于真菌mRNA与病毒双链RNA是两种完全不同的核酸，该技术方案无法直接用于提取真菌mRNA，更不能直接用于从富含多糖类的真菌中提取mRNA。
申请号CN201410086548.2、申请公布号CN103820433A、名称《从富含脂肪的组织中提取mRNA的方法》的中国发明专利申请，括以下步骤：S1.取富含脂肪的组织，采用Trizol法获得总RNA溶液；S2.采用RNA纯化柱对总RNA溶液进行纯化，得到mRNA。但是，该技术方案不能直接用于富含多糖类的真菌，且Trizol试剂价格较贵，致使提取成本较高。
申请号201210568754.8、申请公布号CN102978105A、名称《一种mRNA快速提取试剂盒》的中国发明专利申请，试剂盒包括一套用于固、液相分离的分离装置；分离装置中至少包含一层纤维素固相载体；该试剂盒还包括下述所有成份：至少有一管为细胞或组织裂解液；至少有一管为生物素化Oligo(dT)探针；至少有一管为结合缓冲液；至少有一管为洗脱缓冲液。然而，该技术方案不能直接用于富含多糖类的真菌，同时生物素化Oligo(dT)探针价格也不低，致使提取成本较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的问题，提供一种从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法，简单方便，有效去除真菌中的多糖类物质并获得高质量mRNA，同时能显著降低提取成本。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、U1、采用离心柱，所述离心柱内具有孔径为预设数值的筛板，所述筛板将离心柱内部分为用以容纳固液混合物或离心后所剩固相物的上部空间、以及用以排出离心后通过筛板的液相物的下部空间；
U2、向离心柱中加入纤维素粉，并加入清洗缓冲液浸泡后，离心弃滤液；
U3、以清洗缓冲液进行清洗，离心弃滤液；清洗次数为至少一次；所得离心柱备用；
第二步、S1、取真菌菌丝，加液氮后研磨成粉末；将粉末转移至离心管内；
S2、向CTAB提取液中加入蛋白酶K，然后将CTAB提取液加至离心管内并混匀；将离心管于65℃±5℃水浴中孵育；
S3、向离心管中加入由苯酚、氯仿、异戊醇构成的混合液，并在振荡后离心，取上清液；
S4、向上清液中加无水乙醇，直至乙醇终浓度为体积比30-35％，即得待处理溶液；
第三步、T1、将第二步所得待处理溶液加入第一步所得离心柱内，混匀并静置后，离心弃滤液；
T2、以清洗缓冲液进行清洗，离心弃滤液；清洗次数为至少一次；
T3、向离心柱内加入洗脱缓冲液，离心并收集滤液；
T4、向所收集的滤液中加入异丙醇进行沉淀；之后，离心弃上清，洗涤沉淀后，以经DEPC处理过的H2O溶解，并保存备用，此即从真菌中提取获得的mRNA溶液；
其中，所述清洗缓冲液为含有体积比30-35％乙醇的STE缓冲液；所述洗脱缓冲液为含有体积比17-20％乙醇的STE缓冲液；所述STE缓冲液由Tris、NaCl、EDTA以及经DEPC处理过的H2O混匀而成；所述CTAB提取液由CTAB、Tris·Cl、EDTA、NaCl、β-巯基乙醇以及H2O混匀而成。
发明人经反复地深入实践研究发现，以CTAB法配合有机溶剂抽提，能有效去除富含多糖类真菌中的多糖、蛋白质、酚类等杂质，同时能最大限度地保留mRNA；在此基础上，先以纤维素粉对离心柱进行预制，再将已去除杂质、含有mRNA、且乙醇浓度为30-35％的提取液放入预制离心柱中，使mRNA被特异吸附于离心柱内的纤维素粉上，然后用乙醇浓度为30-35％的清洗缓冲液进一步洗脱去除杂质，最后用乙醇浓度为17-20％的洗脱缓冲液将mRNA从纤维素粉上洗脱下来，沉淀后即得高质量的真菌mRNA。
本发明进一步完善的技术方案如下：
优选地，第一步，U1中，所述离心柱的材质为聚丙烯，所述筛板的材质为高分子聚乙烯；
U2中，纤维素粉的加入量为至少0.1g，清洗缓冲液的加入量为至少700μl，浸泡时间为至少2小时；
U3中，清洗缓冲液的加入量为至少700μl。
采用该优选方案后，可获得更好地提取效果。
优选地，第二步，S1中，真菌菌丝取用量为至少0.2g；
S2中，加入蛋白酶K后，CTAB提取液中蛋白酶K的含量为至少100μg/ml，CTAB提取液的加入量为至少650μl，孵育时间为至少20分钟；
S3中，混合液由苯酚：氯仿：异戊醇＝体积比25±5：24±5：1混匀而成，混合液的加入量为至少10ml，于室温下振荡至少10分钟，离心转速为至少7500r/min，离心时间为10-15分钟。
采用该优选方案后，可更好地去除杂质，利于得到高质量的mRNA。
优选地，第三步，T1中，静置温度为0℃-4℃，静置时间为至少20分钟，离心转速为至少3000r/min，离心时间为至少1分钟；
T2中，清洗缓冲液的加入量为至少700μl，离心转速为至少3000r/min，离心时间为至少1分钟；
T3中，洗脱缓冲液的加入量为至少700μl，离心转速为至少3000r/min，离心时间为至少1分钟；
T4中，异丙醇的加入量为至少1000μl，沉淀温度为-20℃±5℃，沉淀时间为至少30分钟；离心温度为0℃-4℃，离心转速为至少12000r/min，离心时间为至少15分钟；洗涤沉淀采用体积比75±5％的乙醇，该乙醇于0℃-4℃预冷，该乙醇的加入量为至少200μl；经DEPC处理过的H2O的加入量为至少20μl，溶解温度为30℃±10℃；保存备用温度为-70℃±10℃。
采用该优选方案后，可实现更好地提取效果，得到质量更高的mRNA。
优选地，第三步T4中，在洗涤沉淀后且在以经DEPC处理过的H2O溶解之前，倒出残液、或以移液器吸出残液，并于超净台中风干。
优选地，第一步U1中，所述离心柱的筛板孔径为1-100μm；第二步S1中，取用真菌的新鲜菌丝，离心管为玻璃离心管或EP管；第二步S2中，采用浓度为至少20mg/ml的蛋白酶K溶液，水浴温度为65℃；第三步T1中，混匀时采用颠倒混匀。
优选地，所述STE缓冲液由10×STE缓冲液通过经DEPC处理过的H2O稀释10倍后得到；所述10×STE缓冲液由Tris、NaCl、EDTA以及经DEPC处理过的H2O混匀而成，且各组分浓度为0.5mol/L Tris、1mol/L NaCl、10mmol/L EDTA，所述10×STE缓冲液pH7.0。
优选地，所述清洗缓冲液、洗脱缓冲液分别由STE缓冲液加入无水乙醇后得到。
优选地，所述CTAB提取液中各组分浓度为质量体积比2％g/ml CTAB，100mmol/LTris·Cl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，质量体积比1％g/mlβ-巯基乙醇；所述CTAB提取液pH8.0。
本发明还提供：
一种从富含多糖类的真菌中提取mRNA的试剂盒，其特征是，由以下部分组成：
离心柱，所述离心柱内具有孔径为预设数值的筛板，所述筛板将离心柱内部分为用以容纳固液混合物或离心后所剩固相物的上部空间、以及用以排出离心后通过筛板的液相物的下部空间；
离心管；
纤维素粉；
混合液，由苯酚：氯仿：异戊醇＝体积比25±5：24±5：1混匀而成；无水乙醇；体积比75±5％的乙醇；经DEPC处理过的H2O；异丙醇；蛋白酶K溶液；
CTAB提取液；清洗缓冲液；洗脱缓冲液；
所述清洗缓冲液为含有体积比30-35％乙醇的STE缓冲液；所述洗脱缓冲液为含有体积比17-20％乙醇的STE缓冲液；所述清洗缓冲液、洗脱缓冲液分别由STE缓冲液加入无水乙醇后得到；
所述STE缓冲液由10×STE缓冲液通过经DEPC处理过的H2O稀释10倍后得到；所述10×STE缓冲液由Tris、NaCl、EDTA以及经DEPC处理过的H2O混匀而成，且各组分浓度为0.5mol/L Tris、1mol/L NaCl、10mmol/L EDTA，所述10×STE缓冲液pH7.0；
所述CTAB提取液由CTAB、Tris·Cl、EDTA、NaCl、β-巯基乙醇以及H2O混匀而成；所述CTAB提取液中各组分浓度为质量体积比2％g/ml CTAB，100mmol/L Tris·Cl，20mmol/LEDTA，1.4mol/L NaCl，质量体积比1％g/mlβ-巯基乙醇；所述CTAB提取液pH8.0。
采用该试剂盒，即能从富含多糖类的真菌中提取获得高质量mRNA。
与现有技术相比，本发明能有效去除真菌中的多糖类物质并获得高质量mRNA，同时能显著降低提取成本。
附图说明
图1是实施例1的电泳示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明，但是本发明不仅限于这些例子。本发明所涉及的试剂均为市购。下述实施例的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
本发明具体实施的从富含多糖类真菌中提取mRNA的方法，包括：
第一步、U1、采用离心柱，离心柱内具有孔径为预设数值的筛板，筛板将离心柱内部分为用以容纳固液混合物或离心后所剩固相物的上部空间、以及用以排出离心后通过筛板的液相物的下部空间；
离心柱的材质为聚丙烯，筛板的材质为高分子聚乙烯；离心柱的筛板孔径为1-100μm；
U2、向离心柱中加入纤维素粉，并加入清洗缓冲液浸泡后，离心弃滤液；
纤维素粉的加入量为至少0.1g，清洗缓冲液的加入量为至少700μl，浸泡时间为至少2小时；
U3、以清洗缓冲液进行清洗，离心弃滤液；清洗次数为至少一次；所得离心柱备用；
清洗缓冲液的加入量为至少700μl。
第二步、S1、取真菌菌丝，加液氮后研磨成粉末；将粉末转移至离心管内；
真菌菌丝取用量为至少0.2g；取用真菌的新鲜菌丝，离心管为玻璃离心管或EP管；
S2、向CTAB提取液中加入蛋白酶K，然后将CTAB提取液加至离心管内并混匀；将离心管于65℃±5℃水浴中孵育；
加入蛋白酶K后，CTAB提取液中蛋白酶K的含量为至少100μg/ml，CTAB提取液的加入量为至少650μl，孵育时间为至少20分钟；(CTAB即十六烷基三甲基溴化铵)
具体而言，采用浓度为至少20mg/ml的蛋白酶K溶液，水浴温度为65℃；
S3、向离心管中加入由苯酚、氯仿、异戊醇构成的混合液，并在振荡后离心，取上清液；
混合液由苯酚：氯仿：异戊醇＝体积比25±5：24±5：1混匀而成，混合液的加入量为至少10ml，于室温下振荡至少10分钟，离心转速为至少7500r/min，离心时间为10-15分钟；
S4、向上清液中加无水乙醇，直至乙醇终浓度为体积比30-35％，即得待处理溶液。
第三步、T1、将第二步所得待处理溶液加入第一步所得离心柱内，混匀并静置后，离心弃滤液；
混匀时采用颠倒混匀；静置温度为0℃-4℃，静置时间为至少20分钟，离心转速为至少3000r/min，离心时间为至少1分钟；
T2、以清洗缓冲液进行清洗，离心弃滤液；清洗次数为至少一次；
清洗缓冲液的加入量为至少700μl，离心转速为至少3000r/min，离心时间为至少1分钟；
T3、向离心柱内加入洗脱缓冲液，离心并收集滤液；
洗脱缓冲液的加入量为至少700μl，离心转速为至少3000r/min，离心时间为至少1分钟；
T4、向所收集的滤液中加入异丙醇进行沉淀；之后，离心弃上清，洗涤沉淀后，以经DEPC处理过的H2O溶解，并保存备用，此即从真菌中提取获得的mRNA溶液；(DEPC即焦碳酸二乙酯)
在洗涤沉淀后且在以经DEPC处理过的H2O溶解之前，倒出残液、或以移液器吸出残液，并于超净台中风干；
异丙醇的加入量为至少1000μl，沉淀温度为-20℃±5℃，沉淀时间为至少30分钟；离心温度为0℃-4℃，离心转速为至少12000r/min，离心时间为至少15分钟；洗涤沉淀采用体积比75±5％的乙醇，该乙醇于0℃-4℃预冷，该乙醇的加入量为至少200μl；经DEPC处理过的H2O的加入量为至少20μl，溶解温度为30℃±10℃；保存备用温度为-70℃±10℃。
其中，清洗缓冲液为含有体积比30-35％乙醇的STE缓冲液；洗脱缓冲液为含有体积比17-20％乙醇的STE缓冲液；清洗缓冲液、洗脱缓冲液分别由STE缓冲液加入无水乙醇后得到。
STE缓冲液由10×STE缓冲液通过经DEPC处理过的H2O稀释10倍后得到；10×STE缓冲液由Tris、NaCl、EDTA以及经DEPC处理过的H2O混匀而成，且各组分浓度为0.5mol/LTris、1mol/L NaCl、10mmol/L EDTA，10×STE缓冲液pH7.0。
CTAB提取液由CTAB、Tris·Cl、EDTA、NaCl、β-巯基乙醇以及H2O混匀而成。CTAB提取液中各组分浓度为质量体积比2％g/ml CTAB，100mmol/L Tris·Cl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，质量体积比1％g/mlβ-巯基乙醇；CTAB提取液pH8.0。
实施例1
采用上述方法从富含多糖类的禾谷丝核菌中提取mRNA。
部分外购试验材料如下：
2ml离心柱，购自深圳逗点生物技术有限公司，货号为007400。其筛板厚度1.6mm，孔径20μm。
纤维素粉，购自Sigma公司，产品编号C6288，CAS号9004-34-6。
具体提取过程为：
(1)称取0.1g纤维素粉，加入到离心柱中，加700μl清洗缓冲液浸泡2h，离心，弃滤液。加700μl清洗缓冲液，离心，弃滤液，离心柱备用。
(2)从铺有玻璃纸的平板上刮取0.2g新鲜菌丝，在研钵中加液氮研磨成粉末。转移到离心管中，加650μl CTAB提取液(用前加3.5μl蛋白酶K(20mg/ml)，终浓度100μg/ml)，轻轻混匀，于65℃水浴20min。
(3)加入苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)10ml，室温下振荡10min，7500r/min离心10-15min。
(4)取上清，加适量无水乙醇，至乙醇终浓度为30-35％。
(5)将上述溶液全部加入到制备好的离心柱中，颠倒混匀，4℃静置20min，3000r/min离心1min。
(6)加700μl清洗缓冲液，3000r/min离心1min，弃滤液；重复清洗一次。
(7)加700μl洗脱缓冲液，3000r/min离心1min，收集滤液；
(8)收集到的滤液加1000μl异丙醇，-20℃沉淀30min；4℃下12000r/min离心15min，弃上清，用200μl预冷75％乙醇洗涤沉淀，倒出残液，或用移液枪吸出残液；放超净台风干；
(9)加20μl DEPC-H2O 37℃溶解，-70℃保存备用。
对所得mRNA，进行如下检测：
(1)采用紫外可见蛋白核酸分析仪(Thermo Biomate 3S)进行检测，结果为：OD260/280＝1.81-2.04，浓度为48.4-115.2μg/ml，核酸含量很高。
(2)采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示，M为DNAMarker DL2000；mRNA为提取的真菌mRNA，有两条很明显的条带，自上而下分别为真菌28S、18S核糖体RNA，条带清晰基本无降解。
(3)采用S1核酸酶(TAKARA，货号D2410)进行酶解，结果显示，可将提取到的核酸完全消化，结合已有结果可证明提取到的是单链的mRNA。注：S1核酸酶是单链特异性的核酸内切酶，能特异性降解单链DNA或单链RNA。
实施例2
本实施例为从富含多糖类的真菌中提取mRNA的试剂盒，由以下部分组成：
离心柱，离心柱内具有孔径为预设数值的筛板，筛板将离心柱内部分为用以容纳固液混合物或离心后所剩固相物的上部空间、以及用以排出离心后通过筛板的液相物的下部空间；
离心管；
纤维素粉；
混合液，由苯酚：氯仿：异戊醇＝体积比25±5：24±5：1混匀而成；无水乙醇；体积比75±5％的乙醇；经DEPC处理过的H2O；异丙醇；蛋白酶K溶液；
CTAB提取液；清洗缓冲液；洗脱缓冲液；
清洗缓冲液为含有体积比30-35％乙醇的STE缓冲液；洗脱缓冲液为含有体积比17-20％乙醇的STE缓冲液；清洗缓冲液、洗脱缓冲液分别由STE缓冲液加入无水乙醇后得到；
STE缓冲液由10×STE缓冲液通过经DEPC处理过的H2O稀释10倍后得到；10×STE缓冲液由Tris、NaCl、EDTA以及经DEPC处理过的H2O混匀而成，且各组分浓度为0.5mol/LTris、1mol/L NaCl、10mmol/L EDTA，10×STE缓冲液pH7.0；
CTAB提取液由CTAB、Tris·Cl、EDTA、NaCl、β-巯基乙醇以及H2O混匀而成；CTAB提取液中各组分浓度为质量体积比2％g/ml CTAB，100mmol/L Tris·Cl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，质量体积比1％g/mlβ-巯基乙醇；CTAB提取液pH8.0。
本实施例试剂盒可用于从富含多糖类的真菌中提取获得高质量mRNA。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、U1、采用离心柱，所述离心柱内具有孔径为预设数值的筛板，所述筛板将离心柱内部分为用以容纳固液混合物或离心后所剩固相物的上部空间、以及用以排出离心后通过筛板的液相物的下部空间；
U2、向离心柱中加入纤维素粉，并加入清洗缓冲液浸泡后，离心弃滤液；
U3、以清洗缓冲液进行清洗，离心弃滤液；清洗次数为至少一次；所得离心柱备用；
第二步、S1、取真菌菌丝，加液氮后研磨成粉末；将粉末转移至离心管内；
S2、向CTAB提取液中加入蛋白酶K，然后将CTAB提取液加至离心管内并混匀；将离心管于65℃±5℃水浴中孵育；
S3、向离心管中加入由苯酚、氯仿、异戊醇构成的混合液，并在振荡后离心，取上清液；
S4、向上清液中加无水乙醇，直至乙醇终浓度为体积比30-35％，即得待处理溶液；
第三步、T1、将第二步所得待处理溶液加入第一步所得离心柱内，混匀并静置后，离心弃滤液；
T2、以清洗缓冲液进行清洗，离心弃滤液；清洗次数为至少一次；
T3、向离心柱内加入洗脱缓冲液，离心并收集滤液；
T4、向所收集的滤液中加入异丙醇进行沉淀；之后，离心弃上清，洗涤沉淀后，以经DEPC处理过的H2O溶解，并保存备用，此即从真菌中提取获得的mRNA溶液；
其中，所述清洗缓冲液为含有体积比30-35％乙醇的STE缓冲液；所述洗脱缓冲液为含有体积比17-20％乙醇的STE缓冲液；所述STE缓冲液由Tris、NaCl、EDTA以及经DEPC处理过的H2O混匀而成；所述CTAB提取液由CTAB、Tris·Cl、EDTA、NaCl、β-巯基乙醇以及H2O混匀而成。
2.根据权利要求1所述的从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法，其特征是，第一步，U1中，所述离心柱的材质为聚丙烯，所述筛板的材质为高分子聚乙烯；
U2中，纤维素粉的加入量为至少0.1g，清洗缓冲液的加入量为至少700μl，浸泡时间为至少2小时；
U3中，清洗缓冲液的加入量为至少700μl。
3.根据权利要求1所述的从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法，其特征是，第二步，S1中，真菌菌丝取用量为至少0.2g；
S2中，加入蛋白酶K后，CTAB提取液中蛋白酶K的含量为至少100μg/ml，CTAB提取液的加入量为至少650μl，孵育时间为至少20分钟；
S3中，混合液由苯酚：氯仿：异戊醇＝体积比25±5：24±5：1混匀而成，混合液的加入量为至少10ml，于室温下振荡至少10分钟，离心转速为至少7500r/min，离心时间为10-15分钟。
4.根据权利要求1所述的从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法，其特征是，第三步，T1中，静置温度为0℃-4℃，静置时间为至少20分钟，离心转速为至少3000r/min，离心时间为至少1分钟；
T2中，清洗缓冲液的加入量为至少700μl，离心转速为至少3000r/min，离心时间为至少1分钟；
T3中，洗脱缓冲液的加入量为至少700μl，离心转速为至少3000r/min，离心时间为至少1分钟；
T4中，异丙醇的加入量为至少1000μl，沉淀温度为-20℃±5℃，沉淀时间为至少30分钟；离心温度为0℃-4℃，离心转速为至少12000r/min，离心时间为至少15分钟；洗涤沉淀采用体积比75±5％的乙醇，该乙醇于0℃-4℃预冷，该乙醇的加入量为至少200μl；经DEPC处理过的H2O的加入量为至少20μl，溶解温度为30℃±10℃；保存备用温度为-70℃±10℃。
5.根据权利要求4所述的从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法，其特征是，第三步T4中，在洗涤沉淀后且在以经DEPC处理过的H2O溶解之前，倒出残液、或以移液器吸出残液，并于超净台中风干。
6.根据权利要求1至5任一项所述的从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法，其特征是，第一步U1中，所述离心柱的筛板孔径为1-100μm；第二步S1中，取用真菌的新鲜菌丝，离心管为玻璃离心管或EP管；第二步S2中，采用浓度为至少20mg/ml的蛋白酶K溶液，水浴温度为65℃；第三步T1中，混匀时采用颠倒混匀。
7.根据权利要求1至5任一项所述的从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法，其特征是，所述STE缓冲液由10×STE缓冲液通过经DEPC处理过的H2O稀释10倍后得到；所述10×STE缓冲液由Tris、NaCl、EDTA以及经DEPC处理过的H2O混匀而成，且各组分浓度为0.5mol/LTris、1mol/L NaCl、10mmol/L EDTA，所述10×STE缓冲液pH7.0。
8.根据权利要求1至5任一项所述的从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法，其特征是，所述清洗缓冲液、洗脱缓冲液分别由STE缓冲液加入无水乙醇后得到。
9.根据权利要求1至5任一项所述的从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法，其特征是，所述CTAB提取液中各组分浓度为质量体积比2％g/ml CTAB，100mmol/L Tris·Cl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，质量体积比1％g/mlβ-巯基乙醇；所述CTAB提取液pH8.0。
10.一种从富含多糖类的真菌中提取mRNA的试剂盒，其特征是，由以下部分组成：
离心柱，所述离心柱内具有孔径为预设数值的筛板，所述筛板将离心柱内部分为用以容纳固液混合物或离心后所剩固相物的上部空间、以及用以排出离心后通过筛板的液相物的下部空间；
离心管；
纤维素粉；
混合液，由苯酚：氯仿：异戊醇＝体积比25±5：24±5：1混匀而成；无水乙醇；体积比75±5％的乙醇；经DEPC处理过的H2O；异丙醇；蛋白酶K溶液；
CTAB提取液；清洗缓冲液；洗脱缓冲液；
所述清洗缓冲液为含有体积比30-35％乙醇的STE缓冲液；所述洗脱缓冲液为含有体积比17-20％乙醇的STE缓冲液；所述清洗缓冲液、洗脱缓冲液分别由STE缓冲液加入无水乙醇后得到；
所述STE缓冲液由10×STE缓冲液通过经DEPC处理过的H2O稀释10倍后得到；所述10×STE缓冲液由Tris、NaCl、EDTA以及经DEPC处理过的H2O混匀而成，且各组分浓度为0.5mol/LTris、1mol/L NaCl、10mmol/L EDTA，所述10×STE缓冲液pH7.0；
所述CTAB提取液由CTAB、Tris·Cl、EDTA、NaCl、β-巯基乙醇以及H2O混匀而成；所述CTAB提取液中各组分浓度为质量体积比2％g/ml CTAB，100mmol/L Tris·Cl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，质量体积比1％g/ml β-巯基乙醇；所述CTAB提取液pH8.0。
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