CN112280776A - 一种野生树舌灵芝rna提取方法 - Google Patents

一种野生树舌灵芝rna提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112280776A
CN112280776A CN202011223934.3A CN202011223934A CN112280776A CN 112280776 A CN112280776 A CN 112280776A CN 202011223934 A CN202011223934 A CN 202011223934A CN 112280776 A CN112280776 A CN 112280776A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ganoderma applanatum
extracting rna
rna
supernatant
pectinase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011223934.3A
Other languages
English (en)
Inventor
巫桂芬
农万廷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Normal University for Nationalities
Original Assignee
Guangxi Normal University for Nationalities
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Normal University for Nationalities filed Critical Guangxi Normal University for Nationalities
Priority to CN202011223934.3A priority Critical patent/CN112280776A/zh
Publication of CN112280776A publication Critical patent/CN112280776A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种野生树舌灵芝RNA提取方法，包括：采用磁珠、活性炭、β‑巯基乙醇及4M异硫氰酸胍等对树舌灵芝子实体进行破碎裂解，再对RNA进行抽提和纯化；采用本发明提取的RNA完整性好、纯度高、浓度高，完全可以满足建库要求。

Description

一种野生树舌灵芝RNA提取方法
技术领域
本发明涉及RNA提取方法技术领域，尤其是一种野生树舌灵芝RNA提取方法。
背景技术
树舌灵芝又称树舌扁灵芝、老母菌、枫树菌，子实体大型或特大型，无柄或几乎无柄；菌盖呈半圆形、扁半球形或扁平，表面灰色，渐变褐色，有同心环纹棱，有时有瘤，皮壳胶角质，边缘较薄，是重要的木腐菌之一；其成分中包括多糖、甾体化合物、三萜、脂类、氨基酸、多肽、蛋白质类、生物碱类、酚类、内酯、香豆素类和甙类以及微量元素等。
树舌灵芝是大自然赏赐给人类的重要药材资源，作为一种药用真菌，它为人类治疗疾病发挥着重要作用。在中国和日本民间作为抗癌药物，除此之外，还可以治疗风湿性肺结核，有止痛、清热、化积、止血、化痰之功效，其药用价值越来越受到人们的关注。
树舌灵芝，在真菌界属于大型真菌，其体积硕大，形状千姿百态，不加雕琢，就可以成为人们的欣赏对象。树舌灵芝的菌管口面，在新鲜时一般呈灰白色，如果细心保护，就是艺术创作的天然的画布。趁着新鲜直接进行的艺术描绘，因其菌丝体的褐色，显得非常古朴、自然，树舌灵芝干燥以后，依然可以净如白纸，在这里进行的彩色描绘，也会得心应手，巧夺天工，达到大自然的美和艺术的美的完美结合，是艺术创作的又一奇葩。
由于其特殊的药用价值及艺术价值，因此对树舌灵芝的转录组进行分析，对于了解该真菌的药用机理及其特有的艺术形态将有着重要的意义。
发明内容
本发明公开了一种野生树舌灵芝RNA提取方法，提取的RNA完整性好、纯度高、浓度高，完全可以满足建库要求。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种野生树舌灵芝RNA提取方法，包括以下步骤：
S1. 将树舌灵芝子实体用无菌水清洗干净，用滤纸吸干表面的水，切成块后称取菌肉，加入磁珠和活性炭，再加入菌肉重量3%~6%PVPP，在液氮中迅速研磨成粉末，转移到离心管中，分别加入β-巯基乙醇及4M异硫氰酸胍，立即涡旋剧烈震荡混匀，静置1~5min后加入Trizol混匀，菌肉、β-巯基乙醇、异硫氰酸胍和Trizol的质量体积比为1g:50~70μL:400~600μL:1~3mL；
S2. 离心，吸取上清液至新的RNase-Free的离心管中；
S3. 缓慢加入与上清液等体积的无水乙醇和1/4~1/6体积3M醋酸钠水溶液，混匀，待出现白色沉淀完全；
S4. 离心，弃上清液，用75vol.%乙醇洗涤1-2次，加入TE缓冲液溶解，再加入DNase I混匀，离心，倒掉上清液后，加入TE缓冲液，第一次加入的TE缓冲液、DNase I、第二次加入的TE缓冲液按照每1g菌肉计算，分别为4~6ml、80~150 μL和2~5ml；
S5. 加入与步骤S4第二次加入的TE缓冲液等体积的氯仿和异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为20~25:1，混匀，室温放置10~20 min，离心，弃去上清液，取沉淀物；
S6. 沉淀物用75 vol.%乙醇洗涤，在超净工作台上风干，溶于灭菌水或TE中，于-20℃保存。
优选的，所述步骤S1中，涡旋剧烈震荡混匀后，加入纤维素酶和果胶酶的混合液静置4~5min；所述纤维素酶和果胶酶分别溶解于0.1mol/L的醋酸钠水溶液中再混合得纤维素酶和果胶酶的混合液。更优选的，菌肉与纤维素酶和果胶酶的混合液的质量体积比为1g:3mL，纤维素酶的质量浓度为20g/L，果胶酶的质量浓度为20g/L。
优选的，所述步骤S1中，菌肉、β-巯基乙醇、异硫氰酸胍和Trizol的质量体积比为1g:60μL:500 μL:2mL。
优选的，所述步骤S2中，离心转速为12000 rpm，时间为8min。
优选的，所述步骤S3中，3M醋酸钠加入量为乙醇体积的1/5。
优选的，所述步骤S4中，第一次离心转速为12000 rpm，时间为1min；第二次离心转速为12000 rpm，时间为30s。
优选的，所述步骤S4中，第一次加入的TE缓冲液、DNase I、第二次加入的TE缓冲液按照每1g菌肉计算，分别为5ml、100 μL和3ml。
优选的，所述步骤S5中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
优选的，所述步骤S5中，离心转速为12000 rpm，时间为15s。
以上所述的野生树舌灵芝RNA提取方法，具有以下优点：
1、树舌灵芝质地较硬且皮壳胶角质，较难破壁，还容易受杂质影响，本发明加入了磁珠增强破壁效果，加入了活性炭去除杂质和吸附颜色，降低干扰，同时采用β-巯基乙醇及异硫氰酸胍的结合作为破碎剂，使得树舌灵芝子实体组织内含物被充分破碎，提高RNA的提取率。
2、本发明还进一步在加入了破碎剂之后，在提取RNA之前，还加入了酶混合液对树舌灵芝进行酶解，破坏其纤维组织，使得RNA的提取率更进一步的提高。
3、本发明以醋酸钠和乙醇的结合进行RNA的分离沉淀，减低多糖、蛋白质和胞外细胞对RNA分离的影响，对RNA选择性沉淀效果好，大大减少了无效沉淀对RNA产物的干扰，纯度得到有效提高。
4、本发明选择加入氯仿和异戊醇混合液来沉淀RNA，氯仿和异戊醇沉淀能力较强，能够从混合物中把较低浓度的核酸快速沉淀下来，加快提取速度，但是，由于非脂溶性的杂质也会被氯仿和异戊醇沉淀下来，因此最后用75%的乙醇来洗掉非脂溶性的杂质，且乙醇最终也更容易干燥，也有利于加快提取的速度。
5、本发明最终提取的RNA样品中，RIN值（RNA完整值）均在8.6~8.8之间，OD260/280为1.92~2.01；OD260/230为2.29~2.37，其完整性好、纯度高、浓度高，完全可以满足建库要求。
附图说明
图1是实施例1的样品RNA完整性检测图谱。
图2是实施例2的样品RNA完整性检测图谱。
图3是对比例1的样品RNA完整性检测图谱。
图4是对比例2的样品RNA完整性检测图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
实施例1
一种野生树舌灵芝RNA提取方法，包括以下步骤：
S1. 将树舌灵芝子实体用无菌水清洗2遍，用滤纸吸干表面的水，切成块后称取1g菌肉放入研钵中，加入磁珠和0.5g活性炭，磁珠直径为2μm，再加入菌肉重量5%PVPP，在液氮中迅速研磨成粉末，转移到离心管中，分别加入60μLβ-巯基乙醇及500 μL 4M异硫氰酸胍，立即涡旋剧烈震荡混匀，静置2min后加入2mL Trizol混匀；
S2. 离心，吸取上清液至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀；
S3. 缓慢加入与上清液等体积的无水乙醇和1/5体积3M醋酸钠水溶液，混匀，待出现白色沉淀完全；
S4. 12000 rpm离心1 min，弃上清液，用75vol.%乙醇洗涤2次，洗涤后弃去上清，再加入5mL TE缓冲液溶解，再加入100μL DNase I轻柔混匀，12000 rpm离心30 s，倒掉上清液后，加入3mL TE缓冲液；
S5. 加入3mL体积的氯仿和异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，轻轻混匀，室温放置15 min，12000 rpm离心15s，弃去上清液；
S6. 用75 vol.%乙醇洗涤2次，在超净工作台上风干，溶于灭菌水或TE中，于-20℃保存。
实施例2
实施例2与实施例1基本相同，但在步骤S1中，涡旋剧烈震荡混匀后，加入3mL20g/L纤维素酶和20g/L果胶酶的混合液静置5min，然后再加入2mL Trizol混匀。
其中，纤维素酶和果胶酶分别溶解于0.1mol/L的醋酸钠水溶液中再混合得纤维素酶和果胶酶的混合液。
对比例1
对比例1与实施例1基本相同，但在步骤S1中，没有加入磁珠和活性炭。
对比例2
对比例2与实施例1基本相同，但在步骤S1中，没有加入异硫氰酸胍。
采用NanoDrop 2000C超微量分光光度计测量RNA的浓度和纯度，包括OD260/280、OD260/230 ，采用Caliper LabChip GX检测RNA的完整性，实施例1、2和对比例1、2的GX检测谱图如图1-4所示。其他相关试验数据见表1：
表1 树舌灵芝RAN提取试验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
对比例1~2在破碎组织时采用的工艺条件有所改变，使得其OD260/280和OD260/230也有所下降，说明本发明的方法可以有效的破碎组织、裂解细胞，使得RNA充分的暴露出来，同时，还可以降低多糖、蛋白及胞外细胞等对RNA提取的影响。

Claims (10)

1.一种野生树舌灵芝RNA提取方法，其特征在于包括以下步骤：
S1. 将树舌灵芝子实体用无菌水清洗干净，用滤纸吸干表面的水，切成块后称取菌肉，加入磁珠和活性炭，再加入菌肉重量3%~6%PVPP，在液氮中迅速研磨成粉末，转移到离心管中，分别加入β-巯基乙醇及4M异硫氰酸胍，立即涡旋剧烈震荡混匀，静置1~5min后加入Trizol混匀，菌肉、β-巯基乙醇、异硫氰酸胍和Trizol的质量体积比为1g:50~70μL:400~600μL:1~3mL；
S2. 离心，吸取上清液至新的RNase-Free的离心管中；
S3. 缓慢加入与上清液等体积的无水乙醇和1/4~1/6体积3M醋酸钠水溶液，混匀，待出现白色沉淀完全；
S4. 离心，弃上清液，用75vol.%乙醇洗涤1-2次，加入TE缓冲液溶解，再加入DNase I混匀，离心，倒掉上清液后，加入TE缓冲液，第一次加入的TE缓冲液、DNase I、第二次加入的TE缓冲液按照每1g菌肉计算，分别为4~6ml、80~150 μL和2~5ml；
S5. 加入与步骤S4第二次加入的TE缓冲液等体积的氯仿和异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为20~25:1，混匀，室温放置10~20 min，离心，弃去上清液，取沉淀物；
S6. 沉淀物用75 vol.%乙醇洗涤，在超净工作台上风干，溶于灭菌水或TE中，于-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的野生树舌灵芝RNA提取方法，其特征在于：
所述步骤S1中，涡旋剧烈震荡混匀后，加入纤维素酶和果胶酶的混合液静置4~5min；所述纤维素酶和果胶酶分别溶解于0.1mol/L的醋酸钠水溶液中再混合得纤维素酶和果胶酶的混合液。
3.根据权利要求2所述的野生树舌灵芝RNA提取方法，其特征在于：
菌肉与纤维素酶和果胶酶的混合液的质量体积比为1g:3mL，纤维素酶的质量浓度为20g/L，果胶酶的质量浓度为20g/L。
4.根据权利要求1所述的野生树舌灵芝RNA提取方法，其特征在于：
所述步骤S1中，菌肉、β-巯基乙醇、异硫氰酸胍和Trizol的质量体积比为1g:60μL:500μL:2mL。
5.根据权利要求1所述的野生树舌灵芝RNA提取方法，其特征在于：
所述步骤S2中，离心转速为12000 rpm，时间为8min。
6.根据权利要求1所述的野生树舌灵芝RNA提取方法，其特征在于：
所述步骤S3中，3M醋酸钠加入量为乙醇体积的1/5。
7.根据权利要求1所述的野生树舌灵芝RNA提取方法，其特征在于：
所述步骤S4中，第一次离心转速为12000 rpm，时间为1min；第二次离心转速为12000rpm，时间为30s。
8.根据权利要求1所述的野生树舌灵芝RNA提取方法，其特征在于：
所述步骤S4中，第一次加入的TE缓冲液、DNase I、第二次加入的TE缓冲液按照每1g菌肉计算，分别为5ml、100 μL和3ml。
9.根据权利要求1所述的野生树舌灵芝RNA提取方法，其特征在于：
所述步骤S5中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
10.根据权利要求1所述的野生树舌灵芝RNA提取方法，其特征在于：
所述步骤S5中，离心转速为12000 rpm，时间为15s。
CN202011223934.3A 2020-11-05 2020-11-05 一种野生树舌灵芝rna提取方法 Pending CN112280776A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011223934.3A CN112280776A (zh) 2020-11-05 2020-11-05 一种野生树舌灵芝rna提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011223934.3A CN112280776A (zh) 2020-11-05 2020-11-05 一种野生树舌灵芝rna提取方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112280776A true CN112280776A (zh) 2021-01-29

Family

ID=74351560

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011223934.3A Pending CN112280776A (zh) 2020-11-05 2020-11-05 一种野生树舌灵芝rna提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112280776A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114875027A (zh) * 2022-05-11 2022-08-09 澳门科技大学 双链rna分子及其医药用途

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101514368A (zh) * 2008-12-12 2009-08-26 上海市农业科学院 树舌种菌株或子实体特异性分子标记及其获得方法与应用
CN102690806A (zh) * 2012-05-02 2012-09-26 江苏大学 一种简单、快速提取柳枝稷组织总rna的方法
CN102757953A (zh) * 2012-06-21 2012-10-31 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 荒漠植物红砂rna的提取方法
CN103627702A (zh) * 2013-12-04 2014-03-12 上海市农业科学院 一种提取食用菌dna的方法
CN105018472A (zh) * 2015-08-17 2015-11-04 齐鲁工业大学 一种高效提取食用菌菌丝体营养生长阶段rna的方法
CN106191039A (zh) * 2016-08-18 2016-12-07 江苏省农业科学院 从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法及其试剂盒
CN106434640A (zh) * 2016-12-23 2017-02-22 安徽科技学院 一种利用常规试剂提取rna的方法
CN109055361A (zh) * 2018-09-20 2018-12-21 福建农林大学 一种提取灵芝总dna的试剂及其应用
CN109666670A (zh) * 2019-01-18 2019-04-23 青岛农业大学 一种青岛百合花器官组织总rna提取方法
US20200248171A1 (en) * 2015-10-28 2020-08-06 Mirnagreen S.R.L. Methods for extracting bioactive small rnas from plants and mushrooms

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101514368A (zh) * 2008-12-12 2009-08-26 上海市农业科学院 树舌种菌株或子实体特异性分子标记及其获得方法与应用
CN102690806A (zh) * 2012-05-02 2012-09-26 江苏大学 一种简单、快速提取柳枝稷组织总rna的方法
CN102757953A (zh) * 2012-06-21 2012-10-31 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 荒漠植物红砂rna的提取方法
CN103627702A (zh) * 2013-12-04 2014-03-12 上海市农业科学院 一种提取食用菌dna的方法
CN105018472A (zh) * 2015-08-17 2015-11-04 齐鲁工业大学 一种高效提取食用菌菌丝体营养生长阶段rna的方法
US20200248171A1 (en) * 2015-10-28 2020-08-06 Mirnagreen S.R.L. Methods for extracting bioactive small rnas from plants and mushrooms
CN106191039A (zh) * 2016-08-18 2016-12-07 江苏省农业科学院 从富含多糖类的真菌中提取mRNA的方法及其试剂盒
CN106434640A (zh) * 2016-12-23 2017-02-22 安徽科技学院 一种利用常规试剂提取rna的方法
CN109055361A (zh) * 2018-09-20 2018-12-21 福建农林大学 一种提取灵芝总dna的试剂及其应用
CN109666670A (zh) * 2019-01-18 2019-04-23 青岛农业大学 一种青岛百合花器官组织总rna提取方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONALD C. RIO ET AL.: "Purification of RNA using TRIzol（TRI reagent）", 《COLD SPRING HARB PROTOC》 *
孙颉等: "活性炭脱色对灵芝水提液活性成分的影响", 《化学工业与工程技术》 *
徐杰等: "异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA时某些操作技术的改进", 《生物学杂志》 *
胡文军: "灵芝中总RNA的提取", 《药物生物技术》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114875027A (zh) * 2022-05-11 2022-08-09 澳门科技大学 双链rna分子及其医药用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102321189B (zh) 一种木耳多糖的综合提取工艺
CN105273094B (zh) 一种川芎多糖快速分离的方法
KR101489751B1 (ko) 고수율, 고순도 후코이단 제조방법
KR100496418B1 (ko) 흑미삼 제조방법 및 그를 이용하여 제조된 흑미삼
CN104710541A (zh) 一种从海带中制备海带多糖的方法
CN112940145A (zh) 一种动物用灵芝多糖的提取制备方法
CN108359022B (zh) 一种香菇多糖的制备方法
CN112280776A (zh) 一种野生树舌灵芝rna提取方法
CN1859921A (zh) 药用人参的加工方法及组合物
CN115028750B (zh) 泡叶藻岩藻多糖及其制备方法和应用
CN106749735A (zh) 一种葛根多糖提取工艺
CN106749724A (zh) 一种提取木耳多糖的方法
CN110156903A (zh) 一种莼菜多糖的提取方法
CN104223122B (zh) 金柚膳食纤维及其制备方法
CN106188329B (zh) 一种扇贝多糖的提取方法和制品
Sreenath et al. Degradation of a washed carrot preparation by cellulases and pectinases
CN110642958B (zh) 一种桑黄多糖的提取方法及应用
CN102887961A (zh) 一种青蛤多糖提取物的提取方法与应用
CN112898444B (zh) 一种利用灵芝孢子粉萃余物制备胞壁多糖的方法及其产品与应用
CN110693985B (zh) 一种无矾半夏的加工方法及其制备方法
CN114468176A (zh) 一种产蛋末期中草药添加剂及其应用
CN107095893A (zh) 一种太白三七活性物质的提取方法及其应用
CN1157399C (zh) 水苏糖提取方法
CN1231925A (zh) 灵芝孢子的破壁方法
CN113317377A (zh) 一种具有抑制α糖苷酶活性的沙棘叶茶的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210129