CN116287478A - 用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物、试剂盒 - Google Patents

用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物、试剂盒。所述引物探针组合物中包括9组分别用于对待检测的9种呼吸道病原体进行检测的引物探针组；且所述9组分别用于对待检测的9种呼吸道病原体进行检测的引物探针组中的正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~30所示。利用包括所述引物探针组合物的试剂盒，在一张微流控芯片中，一次注样，即可对9种常见的呼吸道病原体感染进行检测，实现对多种病原体同时平行检测，具有灵敏度高，特异性强，操作简便和快速的特点，可为疾病治疗、流行病学调查提供有力的支持。

Description

用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物、试剂盒
技术领域
本申请涉及分子诊断技术领域，尤其是涉及一种用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物、试剂盒。
背景技术
呼吸道感染（Respiratory tract infection，RTI）是人类最常见的一类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发生。据统计，在急性呼吸道感染中90 %以上是由病毒引起的，大多数急性上呼吸道病毒感染具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急、以呼吸道局部免疫为主，感染后免疫力不持久等特点。
常见的呼吸道病毒有正粘病毒科的流感病毒、副粘病毒科的副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、冠状病毒、人偏肺病毒和多个亚型鼻病毒等。呼吸道病毒感染是以空气或飞沫形式传播的，传播速度快；病毒种类繁多，症状相似，临床上很难鉴别。因此，如何对常见呼吸道病毒感染进行快速准确的检测和监控一直是一项重要的研究热点。
目前对于呼吸道病毒感染的检测方法有病毒分离培养、免疫学检测、质谱检测，实时荧光PCR法等。病毒分离培养是呼吸道病毒感染诊断的金标准，但传统病毒培养存在周期长、运输和存贮过程中不易保持病毒感染性等问题，某些病毒如人偏肺病毒、鼻病毒、副流感病毒等进行细胞分离培养也较困难，病毒分离阳性率低，一般需１~２周才能观察到病变，不利于疾病早期诊断；同时病毒的分离培养对实验室环境的要求高，呼吸道病毒由于传染性强，分离培养要在BSL-3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。免疫学检测操作快速简便，且不需要保持病毒的活性，但检测需要已知特异的抗原或抗体，且容易出现假阳性和假阴性，特异性和灵敏度不高。质谱检测是近些年发展起来的可用于病原体检测的技术平台，例如美国Abbott公司的Plex-ID系统，将PCR扩增技术和电离质谱（ESI-MS）技术整合，运用特定引物进行多重PCR扩增，之后对扩增产物进行全自动的ESI-MS分析检测，质谱仪可对扩增产物进行准确至碱基构成方面的分析，试验数据与校准过的已知微生物标准数据库进行比对，便可确定所检测病原微生物的种类；Plex-ID能够快速、精确测量选定基因区域的碱基构成，但仪器的成本过高和缺乏开放的基于碱基构成的数据库，限制了这一技术平台的广泛应用。实时荧光PCR是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，对整个PCR 过程进行可视化的实时监测，使PCR反应与扩增产物的检测同时完成，与传统的检测方法相比，实时荧光PCR技术可进一步提高检测的灵敏度和准确性；而当下，多重荧光定量PCR已成为呼吸道病毒检测研究的热门，是在同一PCR反应体系内加入两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，这种方法将实时定量PCR具有的快速准确定量、灵敏度高和特异性强的优势与多重PCR可同时检测多种病毒病原的特点结合在一起，更由于减少酶、荧光染料和探针的使用量，而大大降低了检测的成本；同时荧光定量PCR全程闭管检测，避免了普通PCR需要电泳等PCR产物开盖操作而造成的污染。但是多重定量PCR，由于仪器荧光通道的限制，其多重反应能力受到一定限制，每一PCR反应管只能检测3-4个指标，对于多指标的检测，往往需要2管甚至更多管，给检测带来很大的不便。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物和包括所述引物探针组合物的基于微流控芯片结合荧光PCR探针的试剂盒，利用所述试剂盒在一张微流控芯片中，一次注样，即可对多种常见的呼吸道病原体感染进行检测，实现对多种病原体同时平行检测，具有灵敏度高，特异性强，操作简便和快速的特点，可为疾病治疗、流行病学调查提供有力的支持。
为此，本申请第一方面提供了一种用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物，所述引物探针组合物中包括9组分别用于对待检测的9种呼吸道病原体进行检测的引物探针组；且所述9组分别用于对待检测的9种呼吸道病原体进行检测的引物探针组中的正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~30所示。
本申请中，所述引物探针组合物中的正、反向引物和探针均针对各病原体的保守区域设计，保障检测结果的准确度，且通过比对分析和优化设计，确认了不同病原体间的特异性，且通过引物和探针的双重设计保障靶点识别的特异性。
本申请中，术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3’-末端提供游离3’-OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3’-OH基团，建立3’至5’磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。
本申请中，术语“正向引物”，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；术语“反向引物”，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。应理解，当正链和反链的指定发生互换时，对应的正向引物和反向引物的命名也可随之互换。也即，本申请中的正向引物和反向引物是相对而言的。
本申请中，所述待检测的9种呼吸道病原体分别为：甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体、人偏肺病毒和鼻病毒。
在一些具体实施方式中，用于检测甲型流感病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~3所示；
用于检测乙型流感病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4~6所示；
用于检测副流感病毒1型的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7~9所示；
用于检测副流感病毒3型的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10~12所示；
用于检测呼吸道合胞病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13~18所示；
用于检测腺病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:19~21所示；
用于检测肺炎支原体的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22~24所示；
用于检测人偏肺病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25~28所示；
用于检测鼻病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:29~30所示。
本申请中，所检测的呼吸道合胞病毒包括两种型别，分别为A型和B型。具体地，用于检测呼吸道合胞病毒A型的正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13~15所示；用于检测呼吸道合胞病毒B型的正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQID NO:16~18所示。
在一些实施方式中，所述引物探针组合物中还包括3组分别针对3种质控的引物探针组，所述的3种质控分别为提取质控、内参质控和扩增质控，且针对所述提取质控的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:31~33所示，针对所述内参质控的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQID NO:34~36；所示针对所述扩增质控的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:37~39所示。
本申请设置了3种质控：提取质控、扩增质控和内参质控，分别用于监测核酸提取试剂、PCR扩增试剂及样本是否合格。本申请中，提取质控和扩增质控选择与待测病原体同源性低或者完全没有同源性的基因；在一些具体实施方式中，提取质控和扩增质控选择酿酒酵母菌基因；内参质控一般选择人体内稳定表达的看家基因；在一些具体实施方式中，内参质控选择β-actin基因，且关于内参质控的引物设计采用跨内含子的方法，可以更好的监控体系的反转录效果。
本申请通过设置质控（提取质控、扩增质控和内参质控）能够检测样本提取和扩增的情况以及监测全流程的检测过程，以确保检测过程的准确性。
在一些实施方式中，所述引物探针组合物中每条探针的5’端均修饰有一个荧光报告基团，3’端均修饰有一个荧光淬灭基团。所述荧光报告基团例如可以为FAM，所述荧光淬灭基团例如可以为BHQ1。
本申请中，所述引物探针组合物中的探针为Taqman荧光探针，其5’端均修饰有一个荧光报告基团，3’端均修饰有一个荧光淬灭基团。PCR扩增时在加入一对引物（正、反向引物）的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此阳性样本扩增时会产生“S”形实时荧光扩增曲线。
本申请所述引物探针组合物覆盖了9种临床常见的呼吸道病原体，具体包括肺炎支原体和8种呼吸道病毒，覆盖范围广，可以为临床治疗的有效实施提供更为可靠的依据。
本申请第二方面提供了一种检测多重呼吸道病原体检测的试剂盒，其包括如本申请第一方面所述的引物探针组合物。
在一些实施方式中，所述试剂盒中包括微流控芯片，所述微流控芯片上设置有分别针对所述9种呼吸道病原体和3种质控的12个独立的反应池，且所述引物探针组合物中的12组引物探针组分别包埋固定于所述的12个独立的反应池中。
本申请中，所述12个独立的反应池中均包括一组针对不同待测靶标（9种呼吸道病原体和3种质控）的引物探针组。
在一些实施方式中，所述反应池中每条引物的含量为0.5~1 μM，每条探针的含量为0.1 ~0.5 μM。在一些具体实施方式中，所述反应池中每条引物的含量可以为0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM或1.0μM等，每条探针的含量可以为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM或0.5μM等。
在一些优选的实施方式中，所述反应池中每条引物的含量为0.6 μM，每条探针的含量为0.3 μM。
本申请中，核酸扩增时所采用的引物和探针的含量对扩增结果的影响较为明显，引物和探针的含量过高或过低均会对扩增结果带来负面影响。本申请通过将反应池内每条引物和探针的含量控制在上述范围内，能使得扩增效果最佳。
本申请中，所述试剂盒采用PCR荧光探针法和微流控芯片相结合的方法，所述微流控芯片上设置有分别针对所述9种呼吸道病原体和3种质控的12个独立的反应池，在一张微流控芯片中，一次注样，可以同时完成9种呼吸道病原体的检测，同时通过在检测过程中对3种质控进行同时检测，能够对检测结果进行有效把控，提升检测结果的准确性。
本申请中，所述试剂盒的原理是基于磁珠法进行核酸提取，结合微流控芯片，采用Taqman荧光探针法对呼吸道病原体进行扩增和检测。所述试剂盒适用于百康芯（天津）生物科技有限公司生产的芯片核酸扩增分析仪（Onestart-1000），该仪器将核酸提取纯化、检测等功能集于一体。
在一些实施方式中，所述微流控芯片上还设置有冻干池，所述冻干池中包括冻干的核酸扩增试剂；所述核酸扩增试剂中包括MgCl2、MMLV反转录酶、DNA聚合酶、UNG酶、dUTP、dNTPs和冻干保护剂。
本申请所述核酸扩增试剂中的各组分均可通过市售途径进行购买，各组分的用量本领域技术人员可根据实际情况进行调整。
本申请中，对样本中提取的核酸模板进行扩增时的PCR程序为本领域的常规条件，本领域技术人员可以进行常规选择。
本申请中，所述微流控芯片冻干池内包含的核酸扩增试剂为冻干试剂，通过将液体形态的核酸扩增试剂进行冻干制成冻干试剂，实现试剂盒室温（10℃~30℃）保存，与传统的核酸检测试剂相比不需要低温运输，方便使用者长途运输往来。
在一些实施方式中，所述试剂盒内还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括裂解液、核酸结合液、漂洗液和洗脱液；且所述核酸结合液、漂洗液和洗脱液分别储存于所述微流控芯片的3个储液池中。本申请中所述裂解液单独包装，用于对样本进行裂解，进而释放出样本内的核酸模板；所述核酸结合液用于使释放的核酸模板与磁珠结合，所述漂洗液用于纯化核酸，去除核酸中的杂质（蛋白质等），所述洗脱液用于将磁珠与核酸分离，进而将纯化后的核酸释放在液相中。
本申请中，所述裂解液、核酸结合液（BB）、漂洗液（CB）和洗脱液（EB）的组成为本领域的常规组成，本领域技术人员可以进行常规配制或者在市售的产品中进行常规选择。
本申请，所述试剂盒中微流控芯片的制备方法为本领域的常规方法，例如所述制备方法可以包括如下步骤：
（1）配制检测各靶标（9种病原体和3种质控）的引物探针点样液，并将检测各靶标的引物探针点样液分别点样至微流控芯片上对应的反应池内，自然晾干后封膜；
（2）配制液体形态的核酸扩增试剂，对所述液体形态的核酸扩增试剂进行冻干，获得冻干的核酸扩增试剂；将所述冻干的核酸扩增试剂装填固定于所述微流控芯片的冻干池内；
（3）配制核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括裂解液、核酸结合液、漂洗液和洗脱液；然后将所述核酸结合液、漂洗液和洗脱液分别灌装于所述微流控芯片的3个储液池中，裂解液单独包装，进而制备得到所述微流控芯片。
本申请中，配制检测扩增质控的引物探针点样液时除了需要添加相应的正、反向引物和探针外，还需加入酵母菌基因组DNA作为核酸扩增模板。
采用所述试剂盒对样本进行检测时，将裂解液与样本添加至微流控芯片上的样本池内，一次注样，可以同时完成9种呼吸道病原体的检测，将核酸提取纯化、逆转录及PCR扩增、检测等功能集于一体，产品使用方便，操作简单，节省了人工操作时间，降低了不同样本之间污染的概率。同时一张芯片可同时检测9种呼吸道病原体，通量高，整个检测流程仅需1.5h，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强等优点，与培养法相比周期更短、操作更简单；与测序法相比价格更低，更适合做临床推广使用。
本申请第三方面提供了一种如本申请第一方面所述的引物探针组合物或第二方面所述的试剂盒在对样本中的呼吸道病原体进行检测中的应用。
本申请中所述样本可以为咽拭子、肺泡灌洗液或痰液等。
本申请的有益技术效果为：本申请所提供的用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物和包括所述引物探针组合物的试剂盒，能够一次对样本中的9种呼吸道病原体（肺炎支原体和8种常见的呼吸道病毒）进行同时检测，检测通量高；整个检测过程（包括核酸的提取、反转录及荧光PCR扩增）集成在一张芯片上完成，自动化程度高，节省了人工操作时间；检测所需时间较传统荧光定量PCR缩短，整个检测流程仅需1.5h，且微流控芯片为密闭的反应系统，整个检测过程无PCR产物后处理，有效避免样本间的交叉污染和环境污染引起的假阳性，具有准确度高、特异性强等优点；同时产品质控的设计全面，每一张微流控芯片上设置了3个质控池，扩增质控用于监测PCR扩增试剂及扩增程序，提取质控用于监控提取试剂及芯片上的提取程序，选自人保守基因的内参质控用于监测样本采集是否合格，有效防止监测结果的假阴性。另外，试剂盒内的核酸扩增试剂为冻干试剂，实现试剂盒室温保存和运输，与传统的核酸检测试剂相比不需要冷链运输和-20℃保存，方便使用者长途运输往来。
附图说明
图1为实施例2中所制备的微流控芯片的PCR芯片上用于检测各靶标的反应池的排布图。
图2为实施例2中微流控芯片的结构示意图。
图3为实施例3中对样本检测时的检测步骤流程图。
图4为实施例4中对人偏肺病毒病毒阳性样本进行检测的结果图。
图5为实施例4中对鼻病毒阳性样本进行检测的结果图。
图6为实施例4中对甲型流感病毒阳性样本进行检测的结果图。
图7为实施例4中对乙型流感病毒阳性样本进行检测的结果图。
图8为实施例4中对副流感病毒1型阳性样本进行检测的结果图。
图9为实施例4中对腺病毒阳性样本进行检测的结果图。
图10为实施例4中对呼吸道合胞病毒阳性样本进行检测的结果图。
图11为实施例4中对肺炎支原体阳性样本进行检测的结果图。
图12为实施例4中对副流感病毒3型阳性样本进行检测的结果图。
图13为实施例4中对9种靶标病原体均为阴性的样本进行检测的结果图。
图14为实施例4中利用实施例2的试剂盒对浓度为1*107copies/mL的甲型流感病毒培养物的检测结果图。
图15实施例4中利用实施例2的试剂盒对浓度为1*106copies/mL的甲型流感病毒培养物的检测结果图。
图16实施例4中利用实施例2的试剂盒对浓度为1*105copies/mL的甲型流感病毒培养物的检测结果图。
图17实施例4中利用实施例2的试剂盒对浓度为1*104copies/mL的甲型流感病毒培养物的检测结果图。
图18实施例4中利用实施例2的试剂盒对浓度为1*103copies/mL的甲型流感病毒培养物的检测结果图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：引物探针组合物的设计
通过查阅文献资料，确定9种病原体检测的靶基因，然后通过NCBI的Nucleotide数据库下载大量检测指标的靶基因序列，用Clustal X软件进行序列的比对分析，选取序列保守区域，结合Primer Premier5软件进行引物探针设计。设计原则是要求引物退火温度在55~60℃，扩增产物长度在80~150bp，探针的Tm值比引物至少高5℃。同时选择酿酒酵母菌基因作为提取质控和扩增质控，选择人体内稳定表达的看家基因β-actin基因作为内参质控，并按照上述设计原则设计3种质控的引物和探针，且关于内参质控的引物设计采用跨内含子的方法，可以更好的监控体系的反转录效果。最终设计的用于检测9种病原体和3种质控的引物探针组合物中引物和探针的核苷酸序列如表1所示。设计好的引物和探针交给有合成资质的公司合成，其中探针5’端均标记FAM荧光报告基团，3’端均标记BHQ1淬灭基团。
表1：引物探针组合物中各引物和探针的核苷酸序列
Figure SMS_1
Figure SMS_2
实施例2：试剂盒的制备
1. 微流控芯片的制备
（1）PCR芯片中引物探针组合物的点制
微流控芯片的PCR芯片上设置有12个独立的反应池，用于检测各靶标的反应池在微流控芯片的PCR芯片上的排布图如图1所示。
将实施例1中合成的引物和探针干粉用无RNase水溶解，溶解后用紫外分光光度计ND5000测定引物/探针的浓度，定量成10uM的储存液。按照表2配制除扩增质控PC外的各靶标的引物探针点样液；按照表3配制扩增质控PC的引物探针点样液，其在配制时加入1uL浓度为E7copies/mL的酿酒酵母基因组DNA。
表2
Figure SMS_3
表3
Figure SMS_4
在10万级洁净车间内，按照图1中所示各靶标在PCR芯片中的排布，进行各靶标的点样，用移液器分别吸取10uL点样液，点至靶标对应的反应池中，自然晾干后封膜，获得PCR芯片。反应池内每条引物的含量为0.6 uM、每条探针的含量为0.3 uM。
（2）冻干的核酸扩增试剂的配制
配制液体形态的核酸扩增试剂，液体形态的核酸扩增试剂中含有MgCl2、MMLV反转录酶、Taq聚合酶、UNG酶、dUTP、dNTPs和冻干保护剂。
将配制好的液体形态的核酸扩增试剂，按照259 uL /桶分装进冻干桶中，然后进行冻干，获得冻干的核酸扩增试剂。
（3）组装
将冻干的核酸扩增试剂装填固定于微流控芯片的冻干池内，将核酸结合液BB（醋酸钠 2.5M、曲拉通20%和异丙醇60%），漂洗液CB（盐酸胍3M、Tris-HCl 1M和异丙醇 40%）及洗脱液EB（10mM Tris-HCl和1mM EDTA， PH=8.0）分别灌装在微流控芯片的3个储液池中，然后进行PCR芯片组装，制得微流控芯片。微流控芯片的结构示意图如图2所示。
2. 裂解液的制备
配制裂解液，裂解液中含有磷酸一氢钾1.5M、磷酸二氢钾 2.0M、EDTA-2Na100mM、氯化钠3M、胍盐5M和曲拉通-100 50mL/L。将制得的裂解液进行单独包装。
实施例3：检测流程
微流控芯片与百康芯（天津）生物科技有限公司生产的芯片核酸扩增分析仪（Onestart-1000）配套使用，检测步骤流程如图3所示，具体如下：
1. 芯片加样
（1）将实施例2中制备的微流控芯片从包装盒内取出，沿撕裂口将铝箔袋撕开取出微流控芯片；
（2）掀开微流控芯片上的样本池盖，先吸取800μL裂解液加入样本池中，然后吸取300μL含拭子样本的病毒保存液加入样本池中，之后再将样本池盖盖紧（建议加样时将吸头直接插到样本池底部再将样本推出，避免加样口产生泡沫影响样本加入及盖盖等操作）。
2.核酸扩增及结果判读
（1）核酸扩增
a.启动芯片核酸扩增分析仪（Onestart-1000）和计算机工作站，打开并登录配套软件；
b.点击“开仓”，将述微流控芯片插入仪器中并推送到位；
c.点击“关仓”，输入试剂盒信息及样本信息；
d.点击“开始”按钮，仪器开始工作，检测过程中，可查看检测进度和实时曲线。扩增反应程序如表4所示。
e.检测完成后，仪器将自动进行数据分析，显示反应过程曲线及检测结果。
表4
Figure SMS_5
（2）结果判读
检测完成后，仪器软件将自动对结果进行分析处理，并生成检测报告。
3.检验结果的解释
（1）有效检测结果：扩增质控、提取质控和内参质控均为阳性，否则无效。本试剂盒的每张微流控芯片内均设有1个扩增质控池、1个提取质控池、1个内参质控池。其中，扩增质控池含有酵母基因组、正反向引物和探针的组合，检测结果应为阳性，用以质控扩增试剂和扩增程序。提取质控池内含有与待测病原体无关的酿酒酵母正反向引物和探针，并在微流控芯片的样本池内预包埋模板，其参与样本的提取及检测的全过程，检测结果应为阳性，用以质控提取过程是否正常。内参质控池含有检测人保守基因β-actin的正反向引物和探针，检测人源样本时为阳性，若内质控检测结果为阴性，说明样本中无人源核酸或含量较少，存在样本采集、储运不合格的风险，建议重新采集样本进行检测。
对于有效检测结果，软件界面右侧列“结果”栏显示“+”，表明样本中检测到该病原体，且Ct值小于或等于对应指标的阳性判断值，检测报告单中会提示该靶标阳性；界面右侧列表中检测结果“-”表明样本中未检测到该病原体，或Ct值大于对应指标的阳性判断值，检测报告单中会提示该靶标阴性。
（2）对于无效检测结果，检测报告单中会提示质控异常，需要进行复检。若复检后，质控结果仍为异常，需重新采集样本进行检测。
实施例4：试剂盒性能检测
1.准确性检测
为验证本试剂盒检测的准确性，采用实施例2制备的试剂盒和实施例3的检测流程对收集的10例临床咽拭子样本进行验证，10例临床咽拭子样本分别为：人偏肺病毒病毒（HMPV）阳性样本、鼻病毒（RHV）阳性样本、甲型流感病毒（FluA）阳性样本、乙型流感病毒（FluB）阳性样本、副流感病毒1型（Hpiv1）阳性样本、腺病毒（ADV）阳性样本、吸道合胞病毒（RSV）阳性样本、肺炎支原体（MPN）阳性样本、副流感病毒3型（Hpiv3）阳性样本、9种靶标病原体均为阴性的样本。10例临床咽拭子样本的检测结果分别如图4-图13所示。
从图4-图13可知，采用上述试剂盒进行检测的结果与实际相符，人偏肺病毒、鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒3型、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体都能正确检出，EC和IC（IC通常情况下Ct≤36）阳性表明采集的样本合格且核酸提取成功，PC阳性表明扩增体系正常。
2. 特异性检测
采用实施例2制备的试剂盒对试剂盒检测范围外，采样部位正常寄生的微生物，或与检测病原体引起相似/相同临床症状的病原体进行检测，这些微生物和病原体包括博卡病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型、水痘带状疱疹病毒、EB病毒、百日咳杆菌、肺炎衣原体、棒状杆菌属、流感嗜血杆菌、嗜乳酸杆菌、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、唾液链球菌、副流感病毒2型和副流感病毒4型。
结果显示实施例2制备的试剂盒能准确区分试剂盒检测范围内的9种病原体靶标，但对试剂盒检测范围外的上述23种微生物和病原体均无非特异性反应，说明本申请的试剂盒的检测特异性强。
3. 灵敏度检测
采用实施例2制备的试剂盒对系列浓度（1*107copies/mL~1*103copies/mL）的人偏肺病毒、鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒3型、腺病毒、呼吸道合胞病毒和肺炎支原体的培养物进行检测，进而对试剂盒的灵敏度进行检测。
结果表明，实施例2的试剂盒对上述9种病原体的最低检测限均可以达到1000copies/mL，其中利用实施例2的试剂盒对系列浓度（1*107copies/mL~1*103copies/mL）甲型流感病毒培养物的检测结果如图14-18所示，说明本申请的试剂盒的灵敏度高。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中包括9组分别用于对待检测的9种呼吸道病原体进行检测的引物探针组；且所述9组分别用于对待检测的9种呼吸道病原体进行检测的引物探针组中的正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~30所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述待检测的9种呼吸道病原体分别为：甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体、人偏肺病毒和鼻病毒。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，用于检测甲型流感病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~3所示；
用于检测乙型流感病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQID NO:4~6所示；
用于检测副流感病毒1型的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQID NO:7~9所示；
用于检测副流感病毒3型的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQID NO:10~12所示；
用于检测呼吸道合胞病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13~18所示；
用于检测腺病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19~21所示；
用于检测肺炎支原体的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:22~24所示；
用于检测人偏肺病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:25~28所示；
用于检测鼻病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:29~30所示。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中还包括3组分别针对3种质控的引物探针组，所述的3种质控分别为提取质控、内参质控和扩增质控，且针对所述提取质控的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:31~33所示，针对所述内参质控的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:34~36；所示针对所述扩增质控的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:37~39所示。
5.根据权利要求4所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中每条探针的5’端均修饰有一个荧光报告基团，3’端均修饰有一个荧光淬灭基团。
6.一种用于多重呼吸道病原体检测的试剂盒，其包括如权利要求1-5中任意一项所述的引物探针组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括微流控芯片，所述微流控芯片上设置有分别针对所述9种呼吸道病原体和3种质控的12个独立的反应池，且所述引物探针组合物中的12组引物探针组分别包埋固定于所述的12个独立的反应池中；
所述反应池中每条引物的含量为0.5~1μM，每条探针的含量为0.1~0.5 μM。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片上还设置有冻干池，所述冻干池中包括冻干的核酸扩增试剂；所述核酸扩增试剂中包括MgCl2、MMLV反转录酶、DNA聚合酶、UNG酶、dUTP、dNTPs和冻干保护剂。
9.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括裂解液、核酸结合液、漂洗液和洗脱液；且所述核酸结合液、漂洗液和洗脱液分别储存于所述微流控芯片的3个储液池中。
10.一种如权利要求1-5中任意一项所述的引物探针组合物或权利要求6-9中任意一项所述的试剂盒在对样本中的呼吸道病原体进行检测中的应用。
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