CN116064927A - 一种用于呼吸道病原体检测的引物探针组合物及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种用于呼吸道病原体检测的引物探针组合物及应用。所述引物探针组合物包括一条通用标签引物和24组分别用于对待检测的呼吸道病原体进行检测的引物探针组；其中每组所述的引物探针组中均包括一条上游引物、一条下游引物和一条探针，且所述上游引物和下游引物的5’端均连接有所述通用标签引物的核苷酸序列，所述通用标签引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:76所示。利用所述引物探针组合物或包含所述引物探针组合物的试剂盒能够实现23种呼吸道病原体的单管、同时检测，且检测准确性高、灵敏度和特异性好，同时全部检测过程能利用全自动设备自动实现。

Description

一种用于呼吸道病原体检测的引物探针组合物及应用
技术领域
本申请涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种用于呼吸道病原体检测的引物探针组合物及应用。
背景技术
呼吸道病原体感染是世界范围内常见的疾病之一，导致呼吸道感染的病原体包括多种病毒、细菌，以及肺炎支原体、肺炎衣原体等其他的病原体。而且多种病原体导致的呼吸道感染症状类似，甚至新型冠状病毒感染的症状也类似于其他呼吸道病原体的感染。而不同类型的病原体的感染，治疗方式和效果存在差异，因此，从临床应用角度来讲，非常有必要针对导致类似症状的呼吸道病原体进行并行的排查检测，以准确定位导致感染的病原体种类，便于后续的精准治疗。
DRG(Diagnosis Related Groups，按疾病诊断相关分组)是将患者患病情况进行综合分析后纳入不同的诊断组打包治疗，实现治疗流程的规范化以及治疗费用的可控。一句话概括就是：医保支付方式从“按项目付费”转变到“按病种付费”。
症候群(Syndrome)，指在某些疾病出现时，经常会同时出现的临床特称、症状、现象，然而实际的病原无法确知。因此，医师为了确认病因，一般会将多种病原的检测联合使用，或者是进行逐一排查。在DRG推行的背景下，累积的高收费限制了多种检测项目的联合使用；而逐一排查则会延长疾病的治疗期，也会有悖于DRG实施的初衷。
症候群多联检，即把导致相同或相似临床症状的病原体组合在一个检测单元，一次检测即可以得到相关病原体的全部检测结果，即不用因等待单一病原体的依次排查结果而导致治疗周期延长，也不用因同时检测多个项目导致累积费用增加，是可以同时满足临床诊断和控费需求的直接、有效的解决方案。相关现有技术中指出，根据其研究结果发现，新型冠状病毒的感染常伴随有其他呼吸道病原体的感染，甄别感染病原体的种类对于治疗的有效实施具有重要的指导作用。基于呼吸道病原体感染治疗的需求以及国家政策的导向，迫切需要一种可以一次检测实现多种病原体区分的方法。
目前临床用于病原体检测方法主要有：培养和分离鉴定、免疫学检测和核酸检测。其中，分离培养需要的周期长，不满足临床急性感染的治疗需求；便捷快速的免疫学检测目前是单品种病原体检测的主要方法，其灵敏度较低，无法使用于早期诊断，且抗原抗体的交叉反应也容易导致假阳性的问题；除了操作层面以及本身特性导致的问题外，上述两种方法也无法用于较多病原体的多联检。与上述两种方法相比，核酸检测不仅由于引物探针的特异性可以避免设计层面的假阳性问题，基因芯片、多重融解曲线法也可以实现较多种病原体的多联检，因此，其在呼吸道感染的症候群检测方面，技术优势明显。与芯片法相比，多重融解曲线法仍然存在实时荧光PCR固有的荧光通道对于重数限制的问题，可以提升的空间有限，仍然需要借助于分孔实现较多重数的检测，因此，分孔带来的成本上升仍然难以回避。现有的基因芯片技术由于灵敏度的限制，主要用在对灵敏度要求不高的方面的筛查，在对于灵敏度有较高要求的病原体检测方面，应用较少。
微流控芯片技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。有着体积轻巧、使用样品及试剂量少，且反应速度快、可大量平行处理及可即用即弃等优点的微流控芯片，在生物、化学、医学等领域有着的巨大潜力。
Biofire公司的FilmArray系统是分子诊断领域症候群多联检的代表性产品，其早在2011年即取得了FDA(Food and Drug Administration，美国食品药品监督管理局)认证，可检测能够引起呼吸道感染的多种病原体靶标。但高额的成本限制了其在国内的应用，迄今为止仍无法通过NMPA(National Medical Products Administration，国家药品监督管理局)的注册来实现推广。取得NMPA认证的多联检产品的代表是宁波海尔施基因科技有限公司的13种呼吸道病原体多重检测试剂盒(PCR毛细电泳片段分析法)，但其操作的复杂性限制了其在临床应用上的拓展。杭州优思达生物技术有限公司的新型冠状病毒2019- nCoV核酸检测试剂盒(恒温扩增-实时荧光法)实现了检测全流程的自动化，但难以实现多联检，所能覆盖病原体的种类受限。
由于现有产品不能兼顾多种病原体的多联检、操作及要求简单(可基层化)、灵敏度及特异性高，而随着医疗机构和需求的进一步下沉，迫切需要一种操作简单(全自动、无人工介入)，涵盖呼吸道感染相关症状的多种病原体，灵敏度、准确度和特异性高，成本可控的综合性能优势明显的产品来满足市场的需要。
发明内容
为了解决现有产品不能兼顾多种病原体的多联检、操作及要求简单、灵敏度及特异性高的缺陷，本申请提供一种新的用于呼吸道病原体检测的引物探针组合物和包括所述引物探针组合物的实现全自动检测的微流控芯片技术平台和配套的试剂盒，利用所述引物探针组合物或试剂盒能够实现23种呼吸道病原体的单管多重联检，足够覆盖症候群相关病原体，且检测准确性高、灵敏度和特异性好，同时全部检测过程能利用全自动设备自动实现；配合设备可实现检测全过程的自动化，即使基层人员也可以使用；通过多种技术的组合应用保障了操作便捷性、灵敏度、准确度和特异性；且该系统具备产业化转化的能力，成本可控。
为此，本申请第一方面提供了一种用于呼吸道病原体检测的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括一条通用标签引物和24组分别用于对待检测的呼吸道病原体进行检测的引物探针组；其中每组所述的引物探针组中均包括一条上游引物、一条下游引物和一条探针，且所述上游引物和下游引物的5’端均连接有所述通用标签引物的核苷酸序列，所述通用标签引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:76所示。
在一些实施方式中，所述通用标签引物的5’端修饰有生物素(biotin)。
对于多重体系来说，控制不同引物间的竞争干扰，以及抑制引物二聚体的形成是需要克服的重点内容。前人的研究已经证实，通过引入通用引物的方式，可以较大程度上控制不同引物间的竞争干扰，从而有效提高多重体系的扩增效率和灵敏度。相关技术中公布了一种检测18种呼吸道病原体的方法，该方法中采用的是传统的多重体系的设计，并未引入通用引物，根据最终的展示结果，灵敏度只达到了500 拷贝/反应，折算到原始样本中，以0.2mL样本为例，核酸提取洗脱体积为50μL，即使假设核酸提取效率为100％，则基于原始样本的灵敏度也只能达到25000拷贝/mL，仍然处于较低的水平。对于通用引物的设计，现有的文献和专利中多采用通用引物对的方式，通过在正、反向特异性引物的5’端分别加入一段通用序列，而且一般设计的通用引物的Tm值会高于特异性引物，然后利用两段式扩增实现降低多重引物间的竞争干扰。该方法仍然考验通用引物对的扩增效率，而且通用引物对之间仍然存在由于引物二聚体导致的扩增效率不理想的情况。
现有的文献报道了一种采用单条标签降低引物二聚体的方法，相关的现有专利中也采用了单条通用引物(GTACGACTCACTATAGGGA)，实现了16种呼吸道病原体的同时检测，其灵敏度可以达到 1000拷贝/mL，比未采用通用引物的检测灵敏度高了1个数量级。但对该通用引物分析发现，该引物仍然存在形成二聚体的风险，如下所示。
Figure BDA0003733760630000021
Figure BDA0003733760630000022
因此，针对上述情况，本申请重新设计了一段通用标签引物(Tag)，其核苷酸序列为 ATACGACTCACTCTTGCGA(SEQ ID NO:76)，该序列不与人源基因组、检测范围内的呼吸道病原体以及测试验证的交叉病原体的基因组序列结合，且该序列与之前报道的相比，更不容易形成二聚体，如下所示，进而更有利于多重体系的扩增。
Figure BDA0003733760630000023
将该序列连接到设计完成的正反向特异性引物的5’端，形成标记的特异性引物。其中，标记有Tag的特异性引物用PAGE纯化，Tag的5’端标记biotin，HPLC纯化。检测结果表明，使用了该通用标签引物后的检测效果，与常规方法的低重荧光PCR平台的产品相比，尽管本申请的病原体覆盖种类更多，但检测效果更好。
在一些实施方式中，所述24组分别用于对待检测的呼吸道病原体进行检测的引物探针组中的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～72所示。
值得注意的是，本申请所请求保护的上述上、下游引物和探针的核苷酸序列不限于上述范围。引物和探针前后挪动几个碱基位置和或错配几个碱基也在本申请的保护范围内。
本申请中，术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发” DNA合成，即例如寡核苷酸的3’-末端提供游离3’-OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3’-OH基团，建立3’至5’磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。
本申请中，术语“上游引物”，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；术语“下游引物”，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。应理解，当正链和反链的指定发生互换时，对应的上游引物和下游引物的命名也可随之互换。也即，本申请中的上游引物和下游引物是相对而言的。
本申请中，所述所述引物探针组中的上、下游引物和探针均针对各病原体的保守区域设计，保障了病原体内的包容性和准确度，且通过比对分析和优化设计，确认了不同病原体间的特异性，且通过引物和探针的双重设计保障靶点识别的特异性。进一步地，本申请所述引物探针组中的上、下游引物均采用通用标签引物进行了修饰，利用同一标签的作用降低多重体系中引物间的竞争抑制以及引物二聚体的影响，提高扩增效率和检测灵敏度。
在一些实施方式中，所述探针的5’端上均修饰有氨基(NH2)。
在一些实施方式中，所述引物探针组合物中还包括一组针对内参基因的引物探针组，其包括一条针对内参基因的上游引物、一条针对内参基因的下游引物和一条针内参基因的探针。
本申请中，通过设置内参基因可以监测采样情况以及监测全流程的检测过程，以确保检测过程的准确性。本申请中，所选用的内参基因为RnaseP。
在一些实施方式中，所述针对内参基因的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:73～75所示。
在一些实施方式中，所述针对内参基因的探针的5’端修饰有氨基(NH2)。
需要注意的是，本申请中只是通用标签引物上修饰有生物素，而针对内参基因和待检测的呼吸道病原体的25对上、下游引物均无需修饰生物素。
本申请中，所述待检测的呼吸道病原体包括23种病原体，分别为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、呼吸道感染的肠道病毒/鼻病毒(肠道病毒/鼻病毒)、偏肺病毒、冠状病毒 229E、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒HKU1、博卡病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、百日咳鲍特菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和副百日咳鲍特菌。
本申请所述引物探针组合物能够同时对上述23种呼吸道病原体进行检测，其中针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、呼吸道感染的肠道病毒/鼻病毒(肠道病毒/鼻病毒)、偏肺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒 OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒HKU1、博卡病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、百日咳鲍特菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和副百日咳鲍特菌分别设置了一组特异型性的引物探针组，针对新型冠状病毒设置了两组特异性的引物探针组，其中一组用于检测新型冠状病毒的ORF1ab基因，另一组用于检测新型冠状病毒的N基因。
本申请所述引物探针组合物覆盖了上述23种呼吸道病原体，涵盖了导致呼吸道感染症状的常见病毒、细菌以及肺炎支原体和衣原体，覆盖范围广，可以为临床治疗的有效实施提供更为可靠的依据。
本申请第二方面提供了一种用于呼吸道病原体检测的全自动检测试剂盒，其包括如本申请第一方面所述的引物探针组合物。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括核酸提取试剂、扩增试剂和杂交显色试剂。
本申请中，所述核酸提取试剂用于提取待测样本中的核酸，所述扩增试剂中含有所述引物探针组合物中的所有引物(通用标签引物和25对上、下游引物)，用于对待测样本中的核酸进行多重PCR扩增。所述杂交显色试剂中含有所述引物探针组合物中的所有探针，所述探针用于捕获多重PCR扩增产物中的靶标序列，进而将扩增产物中的靶标序列固定于杂交膜的特定位点上，并用于后续显色。
在一些实施方式中，所述试剂盒中还包括阳性质控品和阴性质控品。
本申请利用上述阳性质控品和阴性质控品能够对检测结果进行有效质控，避免检测过程中假阳性和假阴性的出现，进一步确保检测结果的准确性。
在一些实施方式中，所述核酸提取试剂包括裂解液、裂解助剂、核酸助沉剂、磁珠、结合液、漂洗液和洗脱液。
本申请中，所述核酸提取试剂用于获取样本中的目标核酸。其中，所述裂解液用于破坏待测样本中病原体的结构，进而充分释放出样本内的核酸；所述裂解助剂和核酸助沉剂用于辅助裂解液，提高裂解效率和核酸得率；所述磁珠用于吸附裂解释放的核酸；所述结合液用于促进所释放的核酸与磁珠的结合；所述漂洗液用于纯化核酸，去除核酸中的杂质(蛋白质等)；所述洗脱液用于将所述磁珠与核酸分离，进而将纯化后的核酸释放，进而溶解在液相(如水)中。
在一些实施方式中，所述裂解液中包括胍盐、表面活性剂和第一缓冲盐；所述裂解助剂为蛋白酶 K；所述核酸助沉剂为Carrier RNA；所述磁珠为硅羟基磁珠；所述结合液为异丙醇；所述漂洗液中包括第二缓冲盐和有机醇；所述洗脱液为水(例如纯化水)。
在一些具体实施方式中，所述胍盐为异硫氰酸胍，所述异硫氰酸胍在所述裂解液中的浓度为2～8M；所述表面活性剂为Triton X-100，所述Triton X-100在所述裂解液中的浓度为1～10wt％；所述第一缓冲盐为MOPS(3-吗啉丙磺酸)，所述MOPS在所述裂解液中的浓度为20～100mM。
在一些优选的具体实施方式中，所述裂解液中含有5M的异硫氰酸胍、4wt％的Triton X-100和 100mM的MOPS。
在一些具体实施方式中，所述第二缓冲盐为MOPS，所述MOPS在所述漂洗液中的浓度为 5～20mM；所述有机醇为乙醇，所述乙醇的体积浓度为40～70％。
在一些优选的具体实施方式中，所述漂洗液为含有10mM MOPS的70v/v％乙醇溶液。
本申请通过采用上述组成的核酸提取试剂能够有效获取待测样本中的目标核酸。
在一些实施方式中，所述扩增试剂包括逆转录酶、Taq酶、UNG酶、dNTPs、特异性引物和通用标签引物；其中，所述特异性引物为所述引物探针组合物中的针对内参基因和待检测的呼吸道病原体的 25条上游引物和25条下游引物。
本申请中，所述扩增试剂用于对裂解获得的目标核酸进行多重PCR扩增，进而对目标核酸中相应的标靶序列进行放大。
在一些实施方式中，所述扩增试剂中逆转录酶的含量为1～10U；Taq酶的含量为1～4U，UNG酶的含量为0.03～1U，dNTPS的含量为0.2～0.3mM，特异性引物中每条引物的含量各自独立地为0.005～5μ M，通用标签引物的含量为0.1～5μM。
本申请中，所述逆转录酶为依赖RNA的DNA聚合酶，其以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补的DNA(cDNA)；所述Taq酶为一种具有热稳定性的DNA聚合酶；UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，其作用是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA 链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。为了配合逆转录反应的进行，本体系中选择的UNG酶为热敏感UNG酶，其可以在50℃失去活性。由于本申请所述试剂盒用于检测的病原体中包括RNA病毒，因此所述扩增试剂中添加了逆转录酶，用于对RNA病毒的核酸进行有效扩增；同时本申请通过采用Taq酶和UNG酶，能够保证PCR结果的准确性，预防非特异性PCR扩增和污染。
本申请实现降低多重扩增体系的竞争干扰和引物二聚体的作用主要是通过降低特异性引物的用量和提高通用标签引物的用量来实现的。因此，在设计多重体系时，所述扩增试剂中特异性引物中每条引物的含量为0.005～5μM，通用标签引物的含量为0.1～5μM。通过将扩增试剂中通用标签引物的含量和特异性引物中每条引物的含量控制在上述范围内，能够明显降低多重扩增体系的竞争干扰和引物二聚体的作用，提升扩增效果。
在一些具体实施方式中，所述扩增试剂中逆转录酶的含量为5U，Taq酶的含量为2U，UNG酶的含量为0.1U，dNTPS的含量为0.3mM，特异性引物中每条引物的含量为0.01μM，通用标签引物的含量为2μM。
本申请通过将扩增试剂中各组分的含量控制在上述范围内，能够使扩增效果最佳。
在一些实施方式中，所述杂交显色试剂包括杂交膜、杂交漂洗液、酶结合液和显色液，其中所述杂交膜上固定有所述引物探针组合物中针对内参基因和待检测的呼吸道病原体的25条探针。
本申请，所述杂交显色试剂用于对多重PCR扩增产物进行杂交显色。其中，杂交膜上固定有特异性探针，所述探针能够与扩增产物中相应的靶标序列特异性结合进而将所述靶标序列固定于所述杂交膜的特定位点上；所述杂交漂洗液用于提供杂交环境以及去除扩增产物中的非特异性物质的干扰；所述酶结合液中含有的酶能够通过生物素-链霉亲和素的结合固定于靶标序列上；所述显色液能够与酶结合液中的酶反应，进而对靶标序列进行显色。
在一些实施方式中，所述杂交膜上每条探针的含量为0.2～50μM，优选为50μM。
本申请中，所述探针可以通过纳升点膜技术点到杂交膜上。通过单管扩增的多重产物，与涵盖所检测病原体的杂交膜进行杂交，实现23种呼吸道病原体的单管、同时检测。
在一些实施方式中，所述杂交膜为尼龙膜；所述杂交漂洗液中包括十二烷基硫酸钠和第三缓冲盐；所述酶结合液中包括链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶；所述显色液中包括过氧化脲、第四缓冲盐和四甲基联苯胺。
在一些具体实施方式中，所述杂交漂洗液中所述十二烷基硫酸钠的浓度为5～15wt％；所述第三缓冲盐为磷酸盐，所述磷酸盐在所述杂交漂洗液中的浓度10～100mM；所述酶结合液中所述链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)的浓度为(0.1～1)μg/mL；所述显色液中氧化脲的浓度为0.01～0.1wt％；所述第四缓冲盐为柠檬酸盐，所述柠檬酸盐在所述显色液中的浓度5～50mM；所述显色液中四甲基联苯胺(TMB)的浓度为0.01～0.05wt％。
在一些优选的具体实施方式中，所述杂交漂洗液中含有10wt％的SDS，10mM的磷酸盐；所述酶结合液中含有0.4μg/mL的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶；所述显色液中含有0.03wt％的过氧化脲、 5mM的柠檬酸盐和0.015wt％的TMB。
在一些实施方式中，所述杂交膜上还固定有显色质控探针(SP探针)；优选地，所述杂交膜上显色质控探针的含量为0.2～50μM。在一些具体实施方式中，所述杂交膜的三个定位点上固定有显色质控探针。
本申请所述SP探针用于对杂交显色结果进行质控，以确保检测结果的准确性。另外，所述SP探针除了作为显色质控外，还用作软件自动识别和判读的定位点，通过3个定位点的设计，实现从人工肉眼判读到软件自动识别的转变。实验结束后，自动判读软件搜索位置固定的三个定位点(SP点)进行定位，并以此确定其他斑点出现的位置；再通过SP点大小设定一个模拟圆圈的范围，统计模拟圆圈内像素点的灰度平均值作为斑点亮度信息，统计斑点附近四个位置区域灰度均值作为背景亮度，点亮度与背景亮度的灰度差异即为该点的对比度读值。斑点显色越深，则斑点位置与周围区域的灰度差异就越大，继而对比度读值就越高，因此可以通过对比度读值情况反映斑点的检出结果。
在一些实施方式中，所述阳性质控品为检测结果为甲型流感病毒和乙型流感病毒均为阳性的甲型流感病毒和乙型流感病毒的假病毒；所述阴性质控品为检测结果为所述待检测的呼吸道病原体均为阴性的含有HEK293细胞的样本保存液。
本申请中，利用上述试剂盒对待检测的呼吸道病原体进行检测的原理属于核酸提取-扩增-反向斑点杂交法，具体为：利用核酸提取试剂，从样本中获得目标核酸；利用扩增试剂实现靶序列的放大；通过杂交将扩增后产物结合到杂交膜的探针上。由于引物中有biotin修饰，结合到杂交膜上的产物上也带有 biotin修饰。通过生物素亲和素的相互作用，扩增产物可以结合修饰有链霉亲和素的HRP。然后利用HRP催化过氧化氢以及TMB的显色反应，实现目视化检测结果的呈现。如果样本中含有靶标，则该靶标经过提取扩增后富集放大的产物会结合到含有特异性探针的杂交膜上，继而会通过HRP-TMB的显色作用，在该探针位置呈现有蓝色斑点。
本申请所述试剂盒将各呼吸道病原体的特异性探针以及内标探针通过纳升点膜技术固定在杂交膜上，因此利用本申请所述试剂盒能够一次实现对23种呼吸道病原体的检测，根据杂交膜上的各探针位置的显色情况判断样本中是否含相应的呼吸道病原体。同时所述试剂盒结合图2-3所示的设备、如图4-5所示的芯片配套使用，能够实现全检测过程的自动化，避免了人工介入引入的操作误差或者污染，重复性好，稳定性高，适用于基层机构的筛查与检测。
本申请第三方面提供了一种利用如本申请第二方面所述的试剂盒对呼吸道病原体进行检测的方法。
在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
S1，采用所述核酸提取试剂获取待测样本中的目标核酸；
S2，将所述目标核酸与所述扩增试剂混合后进行多重PCR扩增，获得扩增产物；
S3，采用所述杂交显色试剂对所述扩增产物进行杂交显色，并对显色结果进行判读。
本申请中，步骤S1中待测样本中目标核酸的获取是通过磁珠法实现的，样本经过裂解液裂解后，释放的核酸被磁珠捕获，经过洗涤和洗脱后，得到纯化的目标核酸。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述多重PCR扩增在单管中完成。
在一些具体实施方式中，所述多重PCR扩增的条件为：
35℃5min；
50℃10min；
95℃2min；
95℃15s，55℃20s，72℃20s，45个循环；
72℃3min。
在一些具体实施方式中，步骤S3的具体操作为：将所述扩增产物与杂交膜在30℃～50℃下杂交 10～15min，加入杂交漂洗液对杂交膜清洗后加入酶结合液，30～37℃反应10～15min，然后加入显色液 (过氧化脲+TMB)，反应5～10min进行显色，并对显色结果进行判读。
在一些实施方式中，所述方法通过全自动化设备自动完成。
本申请所述方法能够通过全自动化设备自动完成，实现了全过程的无人工介入，进而避免了人工介入引入的操作误差或者污染，重复性好，稳定性高，适用于基层机构的筛查与检测。在一些具体实施方式中，所述全自动化设备可以使用申请人公司的微流控核酸芯片检测设备。
具体地，本申请所述的检测方法与其他方法的特点比对分析如表1所示。
表1
Figure BDA0003733760630000061
通过表1可知，与现行产品相比，本申请在病原体种类覆盖与分型能力、自动化程度上综合优势明显。与国内的多联检产品相比，除了病原体种类覆盖更多更全外，自动化功能的实现避免了人工操作介入的污染的可能。与国外多联检的龙头企业相比，除了病原体种类覆盖的更全面，在成本控制上，比其更有优势。
本申请包括以下至少一种有益技术效果：
(1)灵敏度：本申请经过优化后的单管多重检测体系的灵敏度与常规实时荧光PCR一致，或者是稍高于实时荧光PCR，说明采用本申请中的方法进行检测，不仅单次检测可以覆盖的病原体种类更广，而且在灵敏度上并没有由于多重的实现导致较为明显的损失，可以最大程度上解放操作人员和令患者受益。
(2)准确性：本申请所述方法与常规实时荧光PCR进行检测对比，结果表明，本申请的单管式多重检测与常规实时荧光PCR的检测结果阳性符合率和阴性符合率均为100％，说明采用本申请的方法进行检测，不仅单次检测可以覆盖的病原体种类更广，且准确性高。
(3)特异性：采用本申请的试剂盒检测非检测靶标范围的病原体(如，水痘带状疱疹病毒、EB 病毒、大肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、唾液链球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、隐球菌、粘质沙雷菌、柠檬酸杆菌、烟曲霉和黄曲霉)，结果均为阴性，进一步确认了本申请所述试剂盒具备高度的特异性。
(4)干扰物质耐受性：采用假病毒和灭活的病原体培养物作为样本，使用5倍的检测限浓度，进行干扰物质耐受度的测试。干扰物质包含：鼻腔喷雾剂或滴鼻剂(生理性海水鼻腔护理喷雾，60mg/L)，鼻用皮肤类固醇(曲安奈德益康唑乳膏，100mg/L)，润喉片及口服麻醉剂和镇痛剂(复方薄荷脑软膏， 1.7mg/mL)，抗病毒药物(利巴韦林颗粒，100mg/L)，抗生素与鼻用软膏(莫匹罗星软膏，500mg/L)。结果表明，在标识范围内，上述药物对检测结果不存在干扰。
(5)操作便捷性：在检测实施过程中，本申请涉及的操作只是将样本加入到检测芯片对应的样本池，其他操作全部由设备完成，从而降低了人工介入导致的污染，进一步提高了准确性。与涉及到大量操作的非自动化产品相比，本产品具备更好的用户友好度。
附图说明
图1为实施例2中针对各呼吸道病原体以及内参基因的检测探针和显色质控探针在杂交膜上的点阵分布图；其中图中各标识的意义如下：
SP：显色质控探针；内参IC：针对内参基因的检测探针；其他为针对各呼吸道病原体的检测探针，其中新型冠状病毒设置了ORF1ab和N两个检测靶点；
各标识判读时的使用规则为：(1)试剂盒内的阳性质控品须判读软件显示为甲型流感病毒阳性、乙型流感病毒阳性(在甲型流感病毒、乙型流感病毒，内参IC及SP位置处均出现阳性斑点)，否则实验无效； (2)试剂盒内的阴性质控须判读软件显示为阴性(仅在内参IC及SP位置处出现阳性斑点)，其他位置均不能出现阳性斑点，否则实验无效。
图2为实施例3中所采用的自动化设备的外观图。
图3为实施例3中所采用的自动化设备的内部结构图。
图4为实施例3中所述设备内安装的芯片的正面图。
图5为实施例3中所述设备内安装的芯片的反面图。
图6为实施例1中利用三种不同的引物在同等条件下进行扩增的扩增产物电泳结果条带图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。除非另外指出，本申请的核酸序列按照5’到3’的方向从左到右写出。
实施例1：引物探针组合物的设计
从NCBI数据库中分别下载新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒 2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、偏肺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒HKU1、肠道病毒/鼻病毒、博卡病毒、百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌的基因组序列，进行序列比对，然后分别以新型冠状病毒的ORF1ab和N基因、上述其他病原体的保守基因区域设计引物和探针。初步设计完成后，分析引物间的相互作用，去除彼此间3’端存在5个碱基及以上匹配的设计，分析探针与各靶点扩增产物间相互作用，去除可能存在连续多碱基以上的匹配的设计。
然后将上述设计的引物和探针与拟定研究的交叉反应的病原体进行分析，从设计层面排除存在交叉假阳性的可能性。本申请中验证的交叉反应的病原体包括：水痘带状疱疹病毒、EB病毒、大肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、唾液链球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、隐球菌、粘质沙雷菌、柠檬酸杆菌、烟曲霉和黄曲霉。经比对分析，本设计与上述病原体不存在交叉反应。
同时为了控制多重体系中不同引物间的竞争干扰，以及抑制引物二聚体的形成，本申请中设计了一段新的通用标签引物(Tag)，其核苷酸序列为ATACGACTCACTCTTGCGA(SEQID NO:76)，该序列不与人源基因组、检测范围内的呼吸道病原体以及验证的交叉反应的病原体的基因组序列结合，且该序列与之前报道的相比，更不容易形成二聚体，继而更有利于多重体系的扩增。将该序列连接到设计完成的正反向特异性引物的5’端，形成标记的特异性引物，能够明显降低多重体系中不同引物间的竞争干扰，提升扩增效率。其中，标记有Tag的特异性引物用PAGE纯化，Tag的5’端标记biotin，HPLC纯化。
为了进一步验证本申请中所设计的通用标签引物(Tag)对扩增效率的改进，使用非tag标记的引物，现有的单条通用引物(GTACGACTCACTATAGGGA)标记的引物，和本申请中所设计的通用标签引物标记的引物在同等条件下进行扩增效率的比较，结果如图6所示。图6中A为采用现有的单条通用引物所标记的引物的扩增产物电泳结果条带，B为采用本申请的通用标签引物所标记的引物的扩增产物电泳结果条带，C为采用非tag标记的引物的扩增产物电泳结果条带。从图6的3组扩增产物电泳条带的结果可以看出，与无Tag标记的常规引物相比，A、B两组Tag标记的引物均可提高扩增效率，且本申请提供的Tag对扩增效率的改进更优。
本申请中选择RnaseP作为检测的内参基因(内标)，用于监测采样情况以及监测全流程的检测过程。
经过理论分析和实验验证后，本申请中最终选择的引物和探针的核苷酸序列如表2所示。
表2：本申请所述引物探针组合物中的引物和探针的核苷酸序列
Figure BDA0003733760630000081
Figure BDA0003733760630000091
Figure BDA0003733760630000101
实施例2：多重检测体系的设计
1.核酸提取的条件
本申请中，核酸提取是通过磁珠法实现的，样品经过裂解液裂解后，释放的核酸被磁珠捕获，经过洗涤和洗脱后，得到纯化的核酸。
本实施例中，优选的核酸提取条件为：加入0.2mL样本，用0.2mL含4％Triton X-100、5M异硫氰酸胍、100mM MOPS的裂解液、0.2mg蛋白酶k，6μg carrierRNA，56℃裂解10min；然后加入0.2mL 异丙醇、0.2mg硅羟基磁珠，结合10min；吸附磁珠，然后用含有10mMMOPS的70v/v％乙醇清洗磁珠；然后加入纯化水，56℃加热5min洗脱核酸。
2.扩增体系
本申请中，利用1条Tag的标记实现降低多重扩增体系的竞争干扰和引物二聚体的作用主要是通过降低特异性引物和提高Tag的用量来实现的。因此，在设计多重体系的扩增体系时，每条特异性引物的含量为0.005-0.5μM，Tag的含量为0.1-5μM。
本实施例中，优选的扩增体系中每条特异性引物的含量为0.01μM，Tag的含量为1μM，逆转录酶的含量为5U，taq酶的含量为2U，dNTPS的含量为0.3mM，UNG酶的含量为0.1U。
使用实施例1中所设计的引物，根据本实施例中的扩增体系各组分的含量配制扩增体系，使用提取的核酸进行单管多重PCR扩增。
其中，扩增条件为：35℃5min；50℃10min；95℃2min；(95℃15s，55℃20s，72℃20s)， 45个循环；72℃3min。
3.杂交体系
本申请中，将所检测病原体的探针通过纳升点膜技术点到杂交膜上，各病原体以及内参基因的检测探针、显色质控探针在杂交膜上的点阵分布图如图1所示。通过单管扩增的多重产物，与涵盖所检测病原体的杂交膜进行杂交，实现多种病原体的单管、同时检测。
本实施例中，优选的杂交体系为：杂交膜上的每条靶点探针的浓度为50μM；杂交漂洗液中SDS 的浓度10wt％，缓冲盐为磷酸盐，浓度10mM；酶结合液中HPR浓度为0.4μg/mL；显色液中过氧化脲浓度为0.03wt％；缓冲盐为柠檬酸盐，浓度5mM；TMB浓度为0.015％，缓冲盐为柠檬酸盐，浓度5mM。
扩增完成后，扩增产物与杂交膜在45℃杂交15min，加入杂交漂洗液对杂交膜清洗后加后加入酶结合液，37℃反应10min，然后加入显色液(过氧化脲+TMB)，反应5min。根据加入模板的不同，可以在杂交膜上看到不同位置的显色斑点。
实施例3：23种呼吸道病原体的检测
采用各呼吸道病原体人工合成的假病毒和灭活的病原体培养物配制成各个呼吸道病原体的模拟样品，将该模拟样品稀释至1000拷贝/mL，其中，新型冠状病毒假病毒稀释至500拷贝/mL，根据实施例2的条件对上述模拟样品进行核酸提取、扩增和杂交，检测结果如表3所示。
上述检测过程采用的自动化设备自动进行。所采用的自动化设备为北京博晖创新生物技术集团股份有限公司生产的核酸芯片检测仪，其外观和内部结构图分别如图2和3所示；设备内安装的芯片的正面和反面图如图4和5所示。本实施例中所配套使用的芯片已获得专利授权(CN201110235199.2， CN201110235234.0，CN201210121023.9，CN201220175387.0)。
表3：本申请的多重体系对于23中呼吸道病原体的检出情况
Figure BDA0003733760630000111
Figure BDA0003733760630000121
从表3可知，本申请对各病原体均可正常检出，即，本体系可以实现1000拷贝/mL(新型冠状病毒500 拷贝/mL)的灵敏度水平。
实施例4：性能评价
本实施例中所采用的自动化设备同实施例3。
1.准确性检测
对临床剩余样本(40例)，进行实时荧光PCR(qPCR)和本申请所述方法(采用实施例2中确定的试剂盒体系结合自动化设备)的并行比对检测，结果如表4所示。本实施例中所采用的自动化设备为北京博晖创新生物技术集团股份有限公司生产的核酸芯片检测仪，其外观和内部结构图分别如图2和3所示；设备内安装的芯片的正面和反面图如图4和5所示。本实施例中所配套使用的芯片已获得专利授权 (CN201110235199.2，CN201110235234.0，CN201210121023.9，CN201220175387.0)。
表4：本申请所述方法与实时荧光PCR比对结果
Figure BDA0003733760630000122
Figure BDA0003733760630000131
Figure BDA0003733760630000141
从表4可知，本申请的单管式多重检测与常规实时荧光PCR的检测结果阳性符合率和阴性符合率均为 100％，表明本申请所述检测方法的准确性高。
2.灵敏度检测
对上述40例临床剩余样本中的5例进行梯度稀释，然后进行实时荧光PCR(qPCR)和本申请所述方法 (采用实施例2中确定的试剂盒体系结合自动化设备)的并行比对检测，结果如表5所示。
表5：本申请所述方法与实时荧光PCR比对结果
Figure BDA0003733760630000142
Figure BDA0003733760630000151
3.干扰物质耐受度验证
采用假病毒和灭活的病原体培养物作为样本，使用5倍的检测限浓度，采用实施例2中确定的体系结合自动化设备，进行干扰物质耐受度的测试。干扰物质包含：鼻腔喷雾剂或滴鼻剂(生理性海水鼻腔护理喷雾，60mg/L)，鼻用皮肤类固醇(曲安奈德益康唑乳膏，100mg/L)，润喉片及口服麻醉剂和镇痛剂(复方薄荷脑软膏，1.7mg/mL)，抗病毒药物(利巴韦林颗粒，100mg/L)，抗生素与鼻用软膏(莫匹罗星软膏， 500mg/L)。结果如表6所示。
表6：干扰物质耐受度检测结果
Figure BDA0003733760630000152
Figure BDA0003733760630000161
从表6可知，在标识范围内，上述罗列的药物对检测结果不存在干扰，说明本申请所述方法对干扰物质耐受度较好。
4.特异性检测
采用实施例2中确定的体系结合自动化设备，测试本申请非检测靶标范围的病原体(痘带状疱疹病毒、 EB病毒、大肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、唾液链球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、隐球菌、粘质沙雷菌、柠檬酸杆菌、烟曲霉和黄曲霉)的交叉干扰影响，结果如表7所示。
表7：特异性检测结果
Figure BDA0003733760630000162
从表7可知，采用本申请的方法检测非检测靶标范围的病原体，结果均为阴性。表明上述非检测靶标范围的病原体对检测结果无干扰，本申请所述检测方法具备良好的特异性。
综上可知，本申请在实现了病原体多覆盖、全自动化检测的前提下，并未损失性能，在灵敏度、准确度、特异性以及干扰耐受程度上均优于常规平台的产品。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (15)

1.一种用于呼吸道病原体检测的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括一条通用标签引物和24组分别用于对待检测的呼吸道病原体进行检测的引物探针组；其中每组所述的引物探针组中均包括一条上游引物、一条下游引物和一条探针，且所述上游引物和下游引物的5’端均连接有所述通用标签引物的核苷酸序列，所述通用标签引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:76所示；优选地，所述通用标签引物的5’端修饰有生物素。
2. 根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述24组分别用于对待检测的呼吸道病原体进行检测的引物探针组中的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~72所示；优选地，所述探针的5’端均修饰有氨基。
3. 根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中还包括一组针对内参基因的引物探针组，其包括一条针对内参基因的上游引物、一条针对内参基因的下游引物和一条针内参基因的探针；优选地，所述针对内参基因的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:73~75所示；进一步优选地，所述针对内参基因的探针的5’端修饰有氨基。
4.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述待检测的呼吸道病原体包括23种病原体，分别为新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、呼吸道感染的肠道病毒/鼻病毒、偏肺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒HKU1、博卡病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、百日咳鲍特菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和副百日咳鲍特菌。
5.一种用于呼吸道病原体检测的全自动检测试剂盒，其包括如权利要求1-4中任意一项所述的引物探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸提取试剂、扩增试剂和杂交显色试剂；优选地，所述试剂盒中还包括阳性质控品和阴性质控品。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂包括裂解液、裂解助剂、核酸助沉剂、磁珠、结合液、漂洗液和洗脱液；
优选地，所述裂解液中包括胍盐、表面活性剂和第一缓冲盐；所述裂解助剂为蛋白酶K；所述核酸助沉剂为Carrier RNA；所述磁珠为硅羟基磁珠；所述结合液为异丙醇；所述漂洗液中包括第二缓冲盐和有机醇；所述洗脱液为水；
进一步优选地，所述胍盐为异硫氰酸胍，所述异硫氰酸胍在所述裂解液中的浓度为2~8M；所述表面活性剂为Triton X-100，所述Triton X-100在所述裂解液中的浓度为1~10wt%；所述第一缓冲盐为MOPS，所述MOPS在所述裂解液中的浓度为20~100mM；
更进一步优选地，所述第二缓冲盐为MOPS，所述MOPS在所述漂洗液中的浓度为5~20mM；所述有机醇为乙醇，所述乙醇的体积浓度为40~70%。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂包括逆转录酶、Taq酶、UNG酶、dNTPs、特异性引物和通用标签引物；其中，所述特异性引物为所述引物探针组合物中的针对内参基因和待检测的呼吸道病原体的25条上游引物和25条下游引物；
优选地，所述扩增试剂中逆转录酶的含量为1~10U ；Taq酶的含量为1~4U，UNG酶的含量为0.03~1U，dNTPS的含量为0.2~0.3mM，特异性引物中每条引物的含量各自独立地为0.005~5μM，通用标签引物的含量为0.1~5μM。
9.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交显色试剂包括杂交膜、杂交漂洗液、酶结合液和显色液，其中所述杂交膜上固定有所述引物探针组合物中针对内参基因和待检测的呼吸道病原体的25条探针；优选地，所述杂交膜上每条探针的含量为0.2~50μM；
优选地，所述杂交膜为尼龙膜；所述杂交漂洗液中包括十二烷基硫酸钠和第三缓冲盐；所述酶结合液中包括链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶；所述显色液中包括过氧化脲、第四缓冲盐和四甲基联苯胺；
进一步优选地，所述杂交漂洗液中所述十二烷基硫酸钠的浓度为5~15wt%；所述第三缓冲盐为磷酸盐，所述磷酸盐在所述杂交漂洗液中的浓度10~100mM；所述酶结合液中所述链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶的浓度为（0.1~1）μg /mL；所述显色液中氧化脲的浓度为0.01~0.1wt%；所述第四缓冲盐为柠檬酸盐，所述柠檬酸盐在所述显色液中的浓度5~50mM；所述显色液中四甲基联苯胺的浓度为0.01~0.05wt%。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交膜上还固定有显色质控探针；优选地，所述杂交膜上显色质控探针的含量为0.2~50μM。
11.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为检测结果为甲型流感病毒和乙型流感病毒均为阳性的甲型流感病毒和乙型流感病毒的假病毒；所述阴性质控品为检测结果为所述待检测的呼吸道病原体均为阴性的含有HEK293细胞的样本保存液。
12.一种利用如权利要求6-11中任意一项所述的试剂盒对呼吸道病原体进行检测的方法。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1，采用所述核酸提取试剂获取待测样本中的目标核酸；
S2，将所述目标核酸与所述扩增试剂混合后进行多重PCR扩增，获得扩增产物；
S3，采用所述杂交显色试剂对所述扩增产物进行杂交显色，并对显色结果进行判读。
14.根据权利要求13所述的方法，步骤S2中，所述多重PCR扩增在单管中完成。
15.根据权利要求12-14中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法通过全自动化设备自动完成。
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