CN111074001B - 9种呼吸道病原体核酸协同多重pcr检测 - Google Patents

9种呼吸道病原体核酸协同多重pcr检测 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同四重实时荧光PCR检测方法，用于检测样品中甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(Cpn)、腺病毒(ADV)、人鼻病毒(HRV)和人偏肺病毒(hMPV)。本方法操作快速、一步协同完成，灵敏度高。另外，本发明还涉及上述PCR方法中所涉及的试剂，用于上述方法的检测试剂盒和该检测试剂盒的制备应用等。

Description

9种呼吸道病原体核酸协同多重PCR检测
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，本发明涉及能同时对甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(Cpn)、腺病毒(ADV)、人鼻病毒(HRV)、人偏肺病毒(hMPV)、管家基因(β-actin)九种呼吸道病原体和一种内参基因进行检测的多重实时PCR方法，其快速、超敏且一步完成。另外，本发明还涉及上述PCR方法中所涉及的试剂，如互不相干绕的引物、探针等，以及用于上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。
背景技术
流感病毒(Flu)包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型则极少引起流行；呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是副粘病毒科成员，为RNA病毒，在电镜下与人副流感病毒类似，病毒颗粒较人副流感病毒稍小，是儿童下呼吸道感染最常见的病因；副流感病毒(PIV)归副粘病毒科(paramyxiviridae)，副粘病毒亚科(paranyxivirinae)，可引起各年龄阶段人群发病，尤其以婴幼儿易感，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)；人偏肺病毒(Human metapneumovirus，hMPV)是五岁以下婴幼儿急性呼吸道感染的重要病原体，通常可与RSV、流感病毒等共感染，导致儿童的临床症状加重；腺病毒(Adenoviruses，ADV)是腺病毒科哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)的一种，可感染呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱、眼和肝脏等，并引起广泛的临床症状；人鼻病毒(Humanrhinovirus，HRV)是小核糖核酸病毒科中的一种RNA病毒，感染人群主要为老年人和5岁以下儿童，尤其多发于1岁以下儿童；肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是介于细菌与病毒之间，无细胞壁的一类原核细胞型生物，是引起儿童气管炎、支气管炎、原发性不典型肺炎的重要病原体；肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae，Cpn)是一种细胞内寄生的革蓝染色呈阴性的微生物，可引起哮喘、肺炎以及急性支气管炎等疾病。以上这些病原体引起的上呼吸道感染和下呼吸道感染的临床症状类似，尤其是对难以准确描述自己病况的幼儿和儿童来说，准确诊断更为低效。
对于甲型流感病毒(Influenza A virus，FluA)、乙型流感病毒(Influenza Bvirus，FluB)、副流感病毒(Parainfluenza virus，PIV)、呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytial virus，RSV)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae，Cpn)Cpn、腺病毒(Adenovirus，ADV)、人鼻病毒(Humanrhinovirus，HRV)、人偏肺病毒(Human metapneumovirus，hMPV)这9种病原体以及更多的病原体来说，中国专利申请CN110468234A公开了用于19种人呼吸道病毒检测的多重荧光定量PCR试剂盒，然而从其PCR的检测图谱来看，其结果曲线无法清晰区分；中国专利申请CN109355437A公开了一种呼吸道病原体多重检测试剂盒，同时检测16种呼吸道病原体，然而，该方法依赖于颜色补偿，难以在现有荧光PCR检测平台上使用，需要更新设备；CN107365876A公开了用于检测10项呼吸道感染病原体的试剂盒及其使用方法，其中没有引物和探针的配比被充分公开，尽管声称能够同时检测10种常见呼吸道感染病原体，但是提供的附图中最多仅同时检测出3种不清楚病原体种类的病原体。
本申请人实际上更早地提出了多重检测样品中靶核酸的实时PCR方法，例如，中国专利CN104212914B公开了埃博拉五重荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用，中国专利CN102888464B公开了五重荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用，中国专利CN105886665B公开了B19、HTLV和HEV的四重荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用，中国专利CN104120195B公开了单管辨别优生优育检查中四种病原体的PCR方法及试剂盒。
本发明人没有受限于包括自己在内的在先研究，没有对这9种病原体检测开发九重荧光PCR检测方法，而是出人意料地提出了协同多重PCR检测，并且在没有关于如何设计互不干扰的引物对和探针的提示的情况下，设计出协同三重互不干扰的引物对和探针，对于混合病原体样品来说，增强了各检测曲线能有效区分的清晰度和分辨度，使得检测灵敏度达到了超敏级。
发明内容
本发明的要解决的问题在于提供新的协同四重实时荧光PCR检测方法，用3个PCR反应管协同检测样品中甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(Cpn)、腺病毒(ADV)、人鼻病毒(HRV)和人偏肺病毒(hMPV)的靶核酸，通过互相干扰程度在实时PCR检测中可接受的引物对和探针，并任选优化探针浓度和核酸提取的过程，可以同时高特异性、高灵敏度和高重复性地分辨出样品中是否存在来自上述病原体的靶核酸，尤其是检测灵敏度达到了超敏级。另外，本发明还涉及提供上述方法的检测试剂盒和应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同四重实时荧光PCR检测方法，其中，所述靶核酸来自甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(Cpn)、腺病毒(ADV)、人鼻病毒(HRV)和人偏肺病毒(hMPV)，所述检测方法包括：
(1)不重复选择引物对和探针组地在每个PCR反应管中混合核酸提取液、DNA聚合酶、逆转录酶、任选的RNA保护剂、dNTP、以及选自以下三组之一的引物对和探针，每个PCR反应管中的四种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且每个PCR反应管中的四种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
组一，其中引物对包括
CATGGAATGGCTAAAGACA
GCGTGAACACAAATCCTA
TGGTCTCAGCTATGAACAC
GTTGCTTTGCAGCTCTTC
CCTCGATCCTGATTCTGTAC
GCCTTTCAGTCCCACAAA
AAATCTGGCACCACACCTTC
AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
ACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGG
CGTCTTCTCCTTTTCCCATTCCATTCA
AACCGTACCGCCATTGACCGC
AAGATGACCCAGGTGAGTGG；
组二，其中引物对包括
CAGCAAATACACCATCCAA
GCTTGTTGATGTGTTTCTG
TGTGCTCACTTTGAGTCC
CACGGACACCCAAAGTAG
GGAGCTTCTAATGGTTACATTA
GGTAGTTCATTTGCATTTACAG
AAATCTGGCACCACACCTTC
AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
TGTCAATGCTGTCTCCTGTGCTCC
CCTGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGC
AACTCTACAGCGTTCAATCTCGTTGGT
AAGATGACCCAGGTGAGTGG；和
组三，其中引物对包括
TTCCGTTGCTGATGTTTC
TGTGGTAAGGATTGTAGGTTA
GAGCTGAAAGAATTTGTGAG
GCACAACATTTAGGAATCTTC
CTCACACAATTAATAGAGAAGTCA
GTCTGCATGGTGAATAGC
AAATCTGGCACCACACCTTC
AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
AGGTACTTCCGCTTCGCTATCGTT
TGACAGCCATCTTCAGATCAGCAATG
TGTTCTCGCATATCTGAGCCAATTCCTG
AAGATGACCCAGGTGAGTGG；
(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；
(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。
可以对核酸提取液进行直接检测，但是优选对样品进行处理后获得核酸提取液后再进行检测。所以，优选核酸提取液是提取样品中的核酸而获得的提取液，如是采用磁珠提取法提取的。非特异性的磁珠提取法采用表面涂有非特异性核酸吸附类物质的顺磁性颗粒，在低pH(如，pH值5～7)和高盐浓度的情况下核酸可以吸附到顺磁性颗粒表面，在进行磁分离和充分洗涤后，在高pH(如，pH值8～9)、低盐浓度的条件下可将核酸洗脱下来，由此富集了核酸(如靶核酸)的样品可用于PCR试验；另外还可以采用特异性吸附(如杂交吸附和免疫吸附)的磁珠提取法。这些处理过程对于本领域技术人员来说是熟知的，也可参见郑秀芬等，模板DNA磁珠提取法.中国法医学杂志，18(3)：107-108；中国专利200610030229.5、200710118802.2和201110105181.0等。
在本文中，术语“任选”具有其词典意义，表示选择或者不选择的可选方式。例如，PCR反应管包括任选的RNA保护剂表示PCR反应管包括了RNA保护剂或者PCR反应管没有包括RNA保护剂。
在本文中，术语“不重复选择引物对和探针组地”表示所述3个PCR反应管或预装容器中装有的引物对和探针的组别互不相同。例如，第一个PCR反应管装有组一的引物对和探针，第二个PCR反应管装有组二的引物对和探针，而第三个PCR反应管只能装有组三的引物对和探针，否则就与第一个PCR反应管或第二个PCR反应管“重复选择”了。
在第二方面，本发明提供了用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同检测方法，其中，所述靶核酸来自甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(Cpn)、腺病毒(ADV)、人鼻病毒(HRV)和人偏肺病毒(hMPV)，所述检测方法包括：
(A)提取样品中的核酸，获得核酸提取液；
(B)对核酸提取液实施本发明的第一方面的协同四重实时荧光PCR检测方法。
优选在本发明第二方面的方法中，提取样品中的核酸是采用磁珠提取法提取的。
更优选在本发明第二方面的方法中，提取样品中的核酸的过程是：向样品加入核酸萃取液(优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl))，保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤(优选洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优选其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇)，并洗脱(优选洗脱所用的洗脱液包含pH缓冲液(如，Tris-HCl))。
在本文中，所检测的“样品”是潜在可能含有靶核酸或病毒的离体样品，如咽拭子、鼻咽拭子等。本发明的方法优选不是诊断方法，如可用于公共卫生领域的咽拭子样品检测，其检测目的是在公共环境中病原体的存在性。本发明的方法优选仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸或病毒的存在性与否。即使对于利用本发明的检测方法检测人或动物的咽拭子样品中病原体(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于咽拭子中的病原体还是取样时不慎污染的病原体，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况；即使靶核酸来自于咽拭子中的病原体，也只能说明相应人或动物是相应病原体的携带者，还需要有经验的医生根据相应人或动物的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出是否会造成疾病或对健康状况有影响。
在本文中，“协同”指所述实时PCR方法在技术上是在同一时间上同时在多个容器中以相同的PCR反应条件进行的。最优选其中所述容器是PCR反应管，其它可以进行PCR反应并可进行实时荧光检测的容器也在本发明的保护范围内。在本发明第一方面的检测方法中，在3个容器中就可以完成PCR扩增和实时检测的步骤，整个过程不必更换容器，因而方便了操作者。操作者只需要向3个容器中分别加入样品与各种试剂即可，就可以通过市售的普通实时荧光PCR仪来自动完成，整个过程操作者只需添加样品和试剂即可，非常方便。尤其是，整个过程只需添加样品和试剂的步骤干预，便于实现全自动操作，如使用中国专利申请2007100030261公开的自动微量加液系统(即，吸取和分配实验液体的移液装置及带有该装置的PCR仪)，即可完成本发明检测方法的全过程自动化，从而节约了人力成本并最大程度降低了人为失误的可能性，因此本发明的检测方法便于自动化所带来的成本和可靠性优势是可以预期的。
在本文中，“9种病原体靶核酸”检测指的是同时检测的甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(Cpn)、腺病毒(ADV)、人鼻病毒(HRV)和人偏肺病毒(hMPV)。在实时荧光PCR反应中，Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达实时荧光PCR仪所默认设定的阈值时所经历的循环数，其具有良好的再现性，因此可以用于作为判读结果的优良指标。在本发明的第一方面的方法中，对于步骤(3)，其中一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值<45，则这种靶核酸存在于样品中；一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值>45，则这种靶核酸不存在于样品中。通过本发明的针对内参基因的引物对和探针，配合我们经过长期大量试验摸索出来的检测指标，可靠性和重复性俱佳。
本发明人发现，如果提高探针的浓度，可以进一步提高本发明的第一方面的方法的检测灵敏度。所以，优选在本发明的第一方面的方法中，每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应管中的浓度大于5pmol/ml，优选为6～12pmol/ml，更优选为7～10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。另外，优选在本发明的第一方面的方法中，在步骤(1)中所述单个PCR反应管中还进一步混合有PCR反应所需的其他试剂，如盐。还优选了甘油浓度，用以延长PCR条件下酶活耐久力。在本发明的具体实施方式中，盐优选是Mg盐。本领域技术人员还可以容易地选择出其他pH缓冲剂(如磷酸缓冲液等)来调节到合适的pH，也可以容易地选择出其他可溶性盐(如KCl等)来调节离子强度。另外，还可以进一步混合有抗氧化剂(还原剂)、蛋白(酶)保护剂(如，牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等)。这些成分的选择对于本领域技术人员来说都是熟知的。
在本文中，核酸按照本领域所常用的表示方法表示，其序列如未特别指出，均为5’端到3’端方向。其中，探针上标记有荧光标记物。荧光标记物可以位于探针的5’端、内部和/或3’端，优选位于5’端和/或3’端。在本发明的第一方面的方法中，不同种探针(之间所标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，这样能够同时或快速地顺序扫描不同的检测波长，分别记录下各种荧光基团的荧光变化，从而能够进行同时检测。在本文中，探针具有本领域技术人员所熟知的含义，其由为能与扩增出的靶核酸单链结合的单链DNA。通常，在每种探针的核苷酸序列的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。优选其中各种探针标记有不同的荧光基团。优选荧光基团及其淬灭基团是市售的，如可以采用FAMTM/
Figure BDA0002325264270000081
Green I、
Figure BDA0002325264270000082
/JOE/HEX、NEDTM/TAMRATM/
Figure BDA0002325264270000083
ROXTM/Texas
Figure BDA0002325264270000084
和
Figure BDA0002325264270000085
等常规产品，它们的检测波长互不相同，也可以委托公司合成标记有荧光标记的探针。在本发明的具体实施方式中，其中采用的标记有不同检测波长的荧光标记的探针都是委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成的，纯度达到HPLC纯，不含杂带。优选在本发明的第一方面的方法中，各种探针标记有不同的荧光基团。在本发明的具体实施方式中，优选的荧光基团是FAM、、VIC、ROX和CY5。
对于本发明的协同四重检测，为了平衡不同种核酸的扩增条件，本发明人经过长期摸索，优化出的条件为：PCR反应的每个循环的条件为94℃10秒、55℃15秒以及65℃45秒。在本发明的具体实施方式中，PCR反应优选先25℃保温5分钟42℃反转录35分钟并94℃变性10分钟，然后进行上述条件的45个循环。
在第三方面，本发明提供了用于用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同四重实时荧光PCR检测方法的检测试剂盒，其中，所述靶核酸来自甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(Cpn)、腺病毒(ADV)、人鼻病毒(HRV)和人偏肺病毒(hMPV)，所述检测试剂盒包括3个预装容器，每个预装容器中不重复选择引物对和探针组地混合有以及选自以下三组之一的引物对和探针，每个预装容器中的四种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且每个预装容器中的四种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
组一，其中引物对包括
CATGGAATGGCTAAAGACA
GCGTGAACACAAATCCTA
TGGTCTCAGCTATGAACAC
GTTGCTTTGCAGCTCTTC
CCTCGATCCTGATTCTGTAC
GCCTTTCAGTCCCACAAA
AAATCTGGCACCACACCTTC
AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
ACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGG
CGTCTTCTCCTTTTCCCATTCCATTCA
AACCGTACCGCCATTGACCGC
AAGATGACCCAGGTGAGTGG；
组二，其中引物对包括
CAGCAAATACACCATCCAA
GCTTGTTGATGTGTTTCTG，
TGTGCTCACTTTGAGTCC
CACGGACACCCAAAGTAG
GGAGCTTCTAATGGTTACATTA
GGTAGTTCATTTGCATTTACAG
AAATCTGGCACCACACCTTC
AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
TGTCAATGCTGTCTCCTGTGCTCC
CCTGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGC
AACTCTACAGCGTTCAATCTCGTTGGT
AAGATGACCCAGGTGAGTGG；和
组三，其中引物对包括
TTCCGTTGCTGATGTTTC
TGTGGTAAGGATTGTAGGTTA
GAGCTGAAAGAATTTGTGAG
GCACAACATTTAGGAATCTTC
CTCACACAATTAATAGAGAAGTCA
GTCTGCATGGTGAATAGC
AAATCTGGCACCACACCTTC
AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
AGGTACTTCCGCTTCGCTATCGTT
TGACAGCCATCTTCAGATCAGCAATG
TGTTCTCGCATATCTGAGCCAATTCCTG
AAGATGACCCAGGTGAGTGG。
在本文中，术语“预装容器”指的是适于装有选自以上三组之一的引物对和探针的容器。本发明的预装容器可以是PCR反应管，这样不用再加入引物对和探针，只需要再加入其它PCR反应样品和试剂即可实施。
在试剂盒中，不同的试剂可以分装在不同容器中，也可以选择几种长期保存而不发生化学反应的试剂合并保存在相同的容器中。容器可以是瓶、盒、注射器等能容纳上述试剂的容器，例如常规用于装PCR、酶或核酸试剂的容器。检测试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示按照本发明第一方面所述方法进行操作。标签可以贴在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供独立的说明书。根据需要，如方便运输、存放的需要，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。
优选本发明第三方面的检测试剂盒还包括DNA聚合酶、逆转录酶、任选的RNA保护剂和dNTP。
对于本发明第三方面的检测试剂盒，其中优选的各成分如本发明第一方面所述的那样优选。优选诸如，其中各种探针标记有不同的荧光基团，更优选荧光基团是FAM、VIC、ROX和CY5；其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应管中的浓度大于5pmol/ml，优选为6～12pmol/ml，更优选为7～10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。
在第四方面，本发明提供了本发明第三方面所述的试剂盒在制备用于用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同四重实时荧光PCR检测方法的检测试剂产品中的应用，优选提供了本发明第三方面所述的检测试剂盒在制备用于本发明第一方面所述方法的检测试剂产品中的应用。在本文中，检测试剂产品可以是检测试剂盒本身，也可以是合并装有多个检测试剂盒的更大包装产品。根据前文所述，本领域技术人员很容易理解其中检测试剂盒的成分以及其中方法的流程。
试剂盒中还可以包含提取样品中的核酸获得核酸提取液所用的试剂。因此，在第五方面，本发明提供用于用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同检测方法的检测试剂盒，其中，所述靶核酸来自甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(Cpn)、腺病毒(ADV)、人鼻病毒(HRV)和人偏肺病毒(hMPV)，所述试剂盒包括包括本发明的第三方面的试剂盒和磁珠提取法所需试剂。
优选其中磁珠提取法所需试剂包括，
核酸萃取液，优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl)；
第一次洗涤所用的洗涤液，优选其包含高氯酸钠和乙醇；
第二次洗涤所用的洗涤液，优选其包含乙醇；
洗脱所用的洗脱液，优选其包含pH缓冲液(如，Tris-HCl)。
相应地，在第六方面，本发明提供了本发明第五方面所述的试剂盒在制备用于用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同检测方法的检测试剂中的应用。
在第七方面，本发明提供了互不干扰实时PCR的核酸混合物，其是选自以下三组之一的引物对和探针的混合物，其中，
组一，其中引物对包括
CATGGAATGGCTAAAGACA
GCGTGAACACAAATCCTA
TGGTCTCAGCTATGAACAC
GTTGCTTTGCAGCTCTTC
CCTCGATCCTGATTCTGTAC
GCCTTTCAGTCCCACAAA
AAATCTGGCACCACACCTTC
AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
ACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGG
CGTCTTCTCCTTTTCCCATTCCATTCA
AACCGTACCGCCATTGACCGC
AAGATGACCCAGGTGAGTGG；
组二，其中引物对包括
CAGCAAATACACCATCCAA
GCTTGTTGATGTGTTTCTG
TGTGCTCACTTTGAGTCC
CACGGACACCCAAAGTAG
GGAGCTTCTAATGGTTACATTA
GGTAGTTCATTTGCATTTACAG
AAATCTGGCACCACACCTTC
AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
TGTCAATGCTGTCTCCTGTGCTCC
CCTGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGC
AACTCTACAGCGTTCAATCTCGTTGGT
AAGATGACCCAGGTGAGTGG；和
组三，其中引物对包括
TTCCGTTGCTGATGTTTC
TGTGGTAAGGATTGTAGGTTA
GAGCTGAAAGAATTTGTGAG
GCACAACATTTAGGAATCTTC
CTCACACAATTAATAGAGAAGTCA
GTCTGCATGGTGAATAGC
AAATCTGGCACCACACCTTC
AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
AGGTACTTCCGCTTCGCTATCGTT
TGACAGCCATCTTCAGATCAGCAATG
TGTTCTCGCATATCTGAGCCAATTCCTG
AAGATGACCCAGGTGAGTGG。
该混合物可以用于本发明的第一方面的方法中，也可以用于制备本发明第三和/或第五方面的试剂盒。
本发明的有益效果在于：用3个PCR反应管协同检测样品中甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(Cpn)、腺病毒(ADV)、人鼻病毒(HRV)和人偏肺病毒(hMPV)的靶核酸，保证了的准确性、可靠性、特异性、灵敏度和重复性，尤其是检测灵敏度达到了超敏级；3组四重引物/探针无交叉污染及干扰，，而且使用目前常规的市售实时荧光PCR设备，无需改造，操作方便并节省成本，进一步节约了成本。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1显示了示例性的本发明实施例中对甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、肺炎支原体(MP)和内参基因(β-actin)进行1个PCR反应管四重实时PCR的检测图谱，其结果曲线能够清晰区分，但已经达到极限。
图2显示了示例性的本发明实施例中对呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎衣原体(Cpn)、人鼻病毒(HRV)和内参基因(β-actin)进行1个PCR反应管四重实时PCR的检测图谱，其结果曲线能够清晰区分，但已经达到极限。
图3显示了示例性的本发明实施例中对副流感病毒(PIV)、腺病毒(ADV)、人偏肺病毒(hMPV)和内参基因(β-actin)进行1个PCR反应管四重实时PCR的检测图谱，其结果曲线能够清晰区分，但已经达到极限。
图4显示了示例性的本发明实施例中对甲型流感病毒(FluA)单一病原体进行灵敏度测试的检测图谱，最低检测限为5个拷贝数/ML。
图5显示了示例性的本发明实施例中对甲型流感病毒(FluA)混合病原体进行灵敏度测试的检测图谱，最低检测限为10个拷贝数/ML。
图6显示了示例性的本发明实施例中对腺病毒(ADV)单一病原体进行灵敏度测试的检测图谱，最低检测限为5个拷贝数/ML。
图7显示了示例性的本发明实施例中对腺病毒(ADV)混合病原体进行灵敏度测试的检测图谱，最低检测限为10个拷贝数/ML。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社,北京,中国,2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社,北京,中国,1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例1核酸的提取
甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(Cpn)、腺病毒(ADV)、人鼻病毒(HRV)、人偏肺病毒(hMPV)在许可条件下可购自国家卫生部临检中心，均为标准品，供核酸提取。
核酸的提取按照常规磁珠提取法进行提取，为了同时适应上述四种病毒的核酸提取，改进如下：向1uL标准品加入90uL核酸萃取液(配方及终浓度为：异硫氰酸胍1.2M、乙二胺四乙酸钠(pH8.0)10mM、吐温-20 2％(W/W)、高氯酸钠1M、乙醇40％(V/V)、Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，然后加入10uL
Figure BDA0002325264270000151
D-Beads DNA磁珠悬浮液(50mg/mL，可购自北京艾比根生物技术有限公司)，振荡混合均匀后，套在磁架上施加磁场，弃去其中液体，然后加入200uL洗涤液A(配方及终浓度为：高氯酸钠1M、乙醇30％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液A，再加入200uL洗涤液B(配方及终浓度为：乙醇70％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液B，最后加入洗脱液(配方及终浓度为：Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，吸出并保留液体，即为核酸提取液。
合并各病毒标准品的核酸提取液，并稀释供以下步骤测试。
实施例2 3个PCR反应管协同四重实时PCR测试
1，引物及探针序列和分组
委托合成如下引物对和探针并根据研究而分组(每组针对3种病原体)：
组1：
检测甲型流感病毒(FluA)的引物对：
FluA L：CATGGAATGGCTAAAGACA
FluA R：GCGTGAACACAAATCCTA
检测甲型流感病毒(FluA)的探针：
FluA P：ACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGG，
检测乙型流感病毒(FluB)的引物对：
FluB L：TGGTCTCAGCTATGAACAC
FluB R：GTTGCTTTGCAGCTCTTC
检测乙型流感病毒(FluB)的探针：
FluB P：CGTCTTCTCCTTTTCCCATTCCATTCA，
检测肺炎支原体(MP)的引物对：
MP L:CCTCGATCCTGATTCTGTAC
MP R:GCCTTTCAGTCCCACAAA
检测肺炎支原体(MP)的探针：
MP P:AACCGTACCGCCATTGACCGC；
组2：
检测呼吸道合胞病毒(RSV)的引物对：
RSV L:CAGCAAATACACCATCCAA
RSV R:GCTTGTTGATGTGTTTCTG，
检测呼吸道合胞病毒(RSV)的探针：
RSV P:TGTCAATGCTGTCTCCTGTGCTCC；
检测人鼻病毒(HRV)的引物对：
HRV L:TGTGCTCACTTTGAGTCC
HRV R:CACGGACACCCAAAGTAG，
检测人鼻病毒(HRV)的探针：
HRV P:CCTGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGC；
检测肺炎衣原体(Cpn)的引物对：
Cpn L:GGAGCTTCTAATGGTTACATTA
Cpn R:GGTAGTTCATTTGCATTTACAG，
检测肺炎衣原体(Cpn)的探针：
Cpn P:AACTCTACAGCGTTCAATCTCGTTGGT；
组3：
检测腺病毒(ADV)的引物对：
ADV L:TTCCGTTGCTGATGTTTC
ADV R:TGTGGTAAGGATTGTAGGTTA，
检测腺病毒(ADV)的探针：
ADV P:AGGTACTTCCGCTTCGCTATCGTT；
检测人偏肺病毒(hMPV)的引物对：
hMPV L:GAGCTGAAAGAATTTGTGAG
hMPV R:GCACAACATTTAGGAATCTTC，
检测人偏肺病毒(hMPV)的探针：
hMPV P：TGACAGCCATCTTCAGATCAGCAATG；
检测副流感病毒(PIV)的引物对：
PIV L:CTCACACAATTAATAGAGAAGTCA
PIV R:GTCTGCATGGTGAATAGC，
检测副流感病毒(PIV)的探针：
PIV P：TGTTCTCGCATATCTGAGCCAATTCCTG；
另外设计了如下内参：
检测管家基因(β-actin)的引物对：
β-actin L：AAATCTGGCACCACACCTTC
β-actin R：AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
检测管家基因(β-actin)的探针：
β-actin P：AAGATGACCCAGGTGAGTGG。
2，荧光标记
在上述探针FluA P、HRV P和PIV P的5’端均委托合成标记荧光标记FAM，并在3’端标记相应的淬灭基团；FluB P、RSV P和ADV P的5’端均委托合成标记荧光标记ROX，并在3’端标记相应的淬灭基团；MP P、Cpn P和hMPV P的5’端均委托合成标记荧光标记CY5，并在3’端标记相应的淬灭基团；β-actin P的5’端委托合成标记荧光标记VIC。
3，PCR反应条件
PCR反应体系总体积为20μl，其中各组分的终浓度分别为：核酸提取液(100倍稀释)1uL，上述一组中的3对引物对和内参的1对引物对中的每一种引物含量为15pmol/ml，该组和内参的共4种探针中的每一种含量为8pmol/ml，Mg2+(MgCl2)浓度为3.75mmol/ml，dNTP浓度各为0.2mmol/ml，UNG酶含量为0.05U，2×PCR buffer(可购自TaKaRa公司，pH8.3，无Mg2+)为10ul，Taq DNA聚合酶为2U，逆转录酶为15U，甘油15％(V/V)，余量为去离子水。
针对相同的样品(核酸提取液)，协同进行三组PCR，每组不重复地如上选用上述三组中的一组引物对和探针，完成对这9种病原体的检测。
反应热循环条件如下：
Figure BDA0002325264270000171
使用ABI 7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM、VIC、ROX和CY5检测波长。
4，结果判断
基线和阈值设定为ABI 7500荧光仪默认自动设定。如果各荧光(FAM、VIC、ROX或CY5)层Ct值大于45，则判定为相应病毒的核酸检测阴性，如果小于等于45，则判定相应病毒的核酸检测阳性。如图1-3所示，本发明的方法能够检测极底浓度的上述病毒的靶核酸，而且检测互相不干扰，达到了超敏的检测灵敏度，但是还是存在略微的干扰，已经达到设计极限。
对仅含一种病原体的样品和同时包含所有九种病原体的样品，采用本发明的方法的检测灵敏度如下表所示：
Figure BDA0002325264270000181
以上结果表明，本发明的方法无论是对仅含一种病原体的样品，还是对同时包含所有九种病原体的样品，检测灵敏度均达到了超敏级别。
采用临床确诊了的包括这9种病原体至少一种的患者样品32例，和健康人的样品20例，通过本发明的方法检测，不但完全符合，而且还检测出3例患者样品和1例健康样品中有在前未检测出的病原体(混合)感染，经两种方法复检，确认本发明的方法结果正确。
对32例患者样品与20例健康人样品采用本发明的方法检测结果如下表所示：
Figure BDA0002325264270000191
Figure BDA0002325264270000201
Figure BDA0002325264270000211
Figure BDA0002325264270000221
Figure BDA0002325264270000231
Figure BDA0002325264270000241
Figure BDA0002325264270000251
序列表
<110> 苏州华益美生物科技有限公司
<120> 9种呼吸道病原体核酸协同多重PCR检测
<130> 中国申请
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CATGGAATGGCTAAAGACA 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
GCGTGAACACAAATCCTA 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
TGGTCTCAGCTATGAACAC 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GTTGCTTTGCAGCTCTTC 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
CCTCGATCCTGATTCTGTAC 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
GCCTTTCAGTCCCACAAA 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
CAGCAAATACACCATCCAA 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
GCTTGTTGATGTGTTTCTG 19
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
TGTGCTCACTTTGAGTCC 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
CACGGACACCCAAAGTAG 18
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
GGAGCTTCTAATGGTTACATTA 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
GGTAGTTCATTTGCATTTACAG 22
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
TTCCGTTGCTGATGTTTC 18
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
TGTGGTAAGGATTGTAGGTTA 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
GAGCTGAAAGAATTTGTGAG 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
GCACAACATTTAGGAATCTTC 21
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
CTCACACAATTAATAGAGAAGTCA 24
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
GTCTGCATGGTGAATAGC 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
AAATCTGGCACCACACCTTC 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
AACGGCAGAAGAGAGAACCA 20
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGG 26
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
CGTCTTCTCCTTTTCCCATTCCATTCA 27
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
AACCGTACCGCCATTGACCGC 21
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
TGTCAATGCTGTCTCCTGTGCTCC 24
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
CCTGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGC 27
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
AACTCTACAGCGTTCAATCTCGTTGGT 27
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
AGGTACTTCCGCTTCGCTATCGTT 24
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
TGACAGCCATCTTCAGATCAGCAATG 26
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
TGTTCTCGCATATCTGAGCCAATTCCTG 28
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
AAGATGACCCAGGTGAGTGG 20

Claims (34)

1.用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同四重实时荧光PCR检测方法，其是非诊断方法，其中，所述靶核酸来自甲型流感病毒FluA、乙型流感病毒FluB、副流感病毒PIV、呼吸道合胞病毒RSV、肺炎支原体MP、肺炎衣原体Cpn、腺病毒ADV、人鼻病毒HRV和人偏肺病毒hMPV，所述检测方法包括：
(1)不重复选择引物对和探针组地在每个PCR反应管中混合核酸提取液、DNA聚合酶、逆转录酶、任选的RNA保护剂、dNTP、以及选自以下三组之一的引物对和探针，每个PCR反应管中的四种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且每个PCR反应管中的四种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
组一，其中引物对包括
FluA L：CATGGAATGGCTAAAGACA，
FluA R：GCGTGAACACAAATCCTA，
FluB L：TGGTCTCAGCTATGAACAC，
FluB R：GTTGCTTTGCAGCTCTTC，
MP L:CCTCGATCCTGATTCTGTAC，
MP R:GCCTTTCAGTCCCACAAA，
β-actin L：AAATCTGGCACCACACCTTC，
β-actin R：AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
FluA P：ACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGG，
FluB P：CGTCTTCTCCTTTTCCCATTCCATTCA，
MP P:AACCGTACCGCCATTGACCGC，
β-actin P：AAGATGACCCAGGTGAGTGG；
组二，其中引物对包括
RSV L:CAGCAAATACACCATCCAA，
RSV R:GCTTGTTGATGTGTTTCTG，
HRV L:TGTGCTCACTTTGAGTCC，
HRV R:CACGGACACCCAAAGTAG，
Cpn L:GGAGCTTCTAATGGTTACATTA，
Cpn R:GGTAGTTCATTTGCATTTACAG，
β-actin L：AAATCTGGCACCACACCTTC，
β-actin R：AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
RSV P:TGTCAATGCTGTCTCCTGTGCTCC，
HRV P:CCTGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGC，
Cpn P:AACTCTACAGCGTTCAATCTCGTTGGT，
β-actin P：AAGATGACCCAGGTGAGTGG；和
组三，其中引物对包括
ADV L:TTCCGTTGCTGATGTTTC，
ADV R:TGTGGTAAGGATTGTAGGTTA，
hMPV L:GAGCTGAAAGAATTTGTGAG，
hMPV R:GCACAACATTTAGGAATCTTC，
PIV L:CTCACACAATTAATAGAGAAGTCA，
PIV R:GTCTGCATGGTGAATAGC，
β-actin L：AAATCTGGCACCACACCTTC，
β-actin R：AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
ADV P:AGGTACTTCCGCTTCGCTATCGTT，
hMPV P：TGACAGCCATCTTCAGATCAGCAATG，
PIV P：TGTTCTCGCATATCTGAGCCAATTCCTG，
β-actin P：AAGATGACCCAGGTGAGTGG；
(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；
(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。
2.用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同检测方法，其是非诊断方法，其中，所述靶核酸来自甲型流感病毒FluA、乙型流感病毒FluB、副流感病毒PIV、呼吸道合胞病毒RSV、肺炎支原体MP、肺炎衣原体Cpn、腺病毒ADV、人鼻病毒HRV和人偏肺病毒hMPV，所述检测方法包括：
(A)提取样品中的核酸，获得核酸提取液；
(B)对核酸提取液实施权利要求1所述的协同四重实时荧光PCR检测方法。
3.权利要求1所述的方法，其中，每个PCR反应管中的四种探针标记有不同的荧光基团。
4.权利要求3所述的方法，其中，荧光基团是FAM、VIC、ROX或CY5。
5.权利要求1所述的方法，其中PCR反应的每个循环的条件为94℃10秒、55℃15秒以及65℃45秒。
6.权利要求1所述的方法，其中，每种探针在所述PCR反应管中的浓度大于5pmol/ml。
7.权利要求6所述的方法，其中，每种探针在所述PCR反应管中的浓度为6～12pmol/ml。
8.权利要求7所述的方法，其中，每种探针在所述PCR反应管中的浓度为7～10pmol/ml。
9.权利要求8所述的方法，其中，每种探针在所述PCR反应管中的浓度为8pmol/ml。
10.权利要求2所述的方法，其中提取样品中的核酸是采用磁珠提取法提取的。
11.权利要求10所述的方法，其中提样试品中的核酸的过程是：向样品加入核酸萃取液，保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤，并洗脱。
12.权利要求11所述的方法，其中，核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液。
13.权利要求12所述的方法，其中，pH缓冲液是Tris-HCl。
14.权利要求11所述的方法，其中，洗涤是洗涤两次。
15.权利要求14所述的方法，其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇。
16.权利要求14所述的方法，其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇。
17.权利要求11所述的方法，其中，洗脱所用的洗脱液包含pH缓冲液。
18.权利要求17所述的方法，其中，pH缓冲液是Tris-HCl。
19.用于用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同四重实时荧光PCR检测方法的检测试剂盒，其中，所述靶核酸来自甲型流感病毒FluA、乙型流感病毒FluB、副流感病毒PIV、呼吸道合胞病毒RSV、肺炎支原体MP、肺炎衣原体Cpn、腺病毒ADV、人鼻病毒HRV和人偏肺病毒hMPV，所述检测试剂盒包括3个预装容器，每个预装容器中不重复选择引物对和探针组地混合有选自以下三组之一的引物对和探针，每个预装容器中的四种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且每个预装容器中的四种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
组一，其中引物对包括FluA L：CATGGAATGGCTAAAGACA，FluA R：GCGTGAACACAAATCCTA，FluB L：TGGTCTCAGCTATGAACAC，FluB R：GTTGCTTTGCAGCTCTTC，MP L:CCTCGATCCTGATTCTGTAC，MP R:GCCTTTCAGTCCCACAAA，β-actin L：AAATCTGGCACCACACCTTC，β-actin R：AACGGCAGAAGAGAGAACCA，而且其中探针包括FluA P：ACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGG，FluB P：CGTCTTCTCCTTTTCCCATTCCATTCA，MP P:AACCGTACCGCCATTGACCGC，β-actin P：AAGATGACCCAGGTGAGTGG；
组二，其中引物对包括RSV L:CAGCAAATACACCATCCAA，RSV R:GCTTGTTGATGTGTTTCTG，HRV L:TGTGCTCACTTTGAGTCC，HRV R:CACGGACACCCAAAGTAG，Cpn L:GGAGCTTCTAATGGTTACATTA，Cpn R:GGTAGTTCATTTGCATTTACAG，β-actin L：AAATCTGGCACCACACCTTC，β-actin R：AACGGCAGAAGAGAGAACCA，而且其中探针包括RSV P:TGTCAATGCTGTCTCCTGTGCTCC，HRV P:CCTGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGC，Cpn P:AACTCTACAGCGTTCAATCTCGTTGGT，β-actin P：AAGATGACCCAGGTGAGTGG；和
组三，其中引物对包括ADV L:TTCCGTTGCTGATGTTTC，ADV R:TGTGGTAAGGATTGTAGGTTA，hMPV L:GAGCTGAAAGAATTTGTGAG，
hMPV R:GCACAACATTTAGGAATCTTC，
PIV L:CTCACACAATTAATAGAGAAGTCA，
PIV R:GTCTGCATGGTGAATAGC，
β-actin L：AAATCTGGCACCACACCTTC，
β-actin R：AACGGCAGAAGAGAGAACCA，
而且其中探针包括
ADV P:AGGTACTTCCGCTTCGCTATCGTT，
hMPV P：TGACAGCCATCTTCAGATCAGCAATG，
PIV P：TGTTCTCGCATATCTGAGCCAATTCCTG，
β-actin P：AAGATGACCCAGGTGAGTGG。
20.权利要求19所述的试剂盒，其中每个预装容器中的四种探针标记有不同的荧光基团。
21.权利要求20所述的试剂盒，其中荧光基团是FAM、VIC、ROX或CY5。
22.权利要求19所述的试剂盒，其还包括DNA聚合酶、逆转录酶、任选的RNA保护剂和dNTP。
23.用于用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同检测方法的检测试剂盒，其中，所述靶核酸来自甲型流感病毒FluA、乙型流感病毒FluB、副流感病毒PIV、呼吸道合胞病毒RSV、肺炎支原体MP、肺炎衣原体Cpn、腺病毒ADV、人鼻病毒HRV和人偏肺病毒hMPV，所述试剂盒包括权利要求19～22之任一所述的试剂盒和磁珠提取法所需试剂。
24.权利要求23所述的试剂盒，其中磁珠提取法所需试剂包括，
核酸萃取液；
第一次洗涤所用的洗涤液；
第二次洗涤所用的洗涤液；
洗脱所用的洗脱液。
25.权利要求24所述的试剂盒，其中，核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液。
26.权利要求25所述的试剂盒，其中，pH缓冲液是Tris-HCl。
27.权利要求24所述的试剂盒，其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇。
28.权利要求24所述的试剂盒，其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇。
29.权利要求24所述的试剂盒，其中，洗脱所用的洗脱液包含pH缓冲液。
30.权利要求29所述的试剂盒，其中，pH缓冲液是Tris-HCl。
31.权利要求19～22之任一所述的试剂盒在制备用于用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同四重实时荧光PCR检测方法的检测试剂产品中的应用，其中，所述靶核酸来自甲型流感病毒FluA、乙型流感病毒FluB、副流感病毒PIV、呼吸道合胞病毒RSV、肺炎支原体MP、肺炎衣原体Cpn、腺病毒ADV、人鼻病毒HRV和人偏肺病毒hMPV。
32.权利要求31所述的应用，其中，用于用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同四重实时荧光PCR检测方法的检测试剂产品是用于权利要求1～18之任一所述的方法的检测试剂产品。
33.权利要求23～30之任一所述的试剂盒在制备用于用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同检测方法的检测试剂中的应用，其中，所述靶核酸来自甲型流感病毒FluA、乙型流感病毒FluB、副流感病毒PIV、呼吸道合胞病毒RSV、肺炎支原体MP、肺炎衣原体Cpn、腺病毒ADV、人鼻病毒HRV和人偏肺病毒hMPV。
34.权利要求33所述的应用，其中，用于用3个PCR反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同四重实时荧光PCR检测方法的检测试剂产品是用于权利要求2和10～18之任一所述的方法的检测试剂产品。
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