CN117368347A - 一种同时测定血浆中原发性醛固酮增多症分型标志物的液相色谱-串联质谱法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时测定血浆中原发性醛固酮增多症分型标志物的液相色谱‑串联质谱法。所述标志物包括18‑羟皮质醇、18‑羟皮质酮和18‑氧皮质醇同时测定，该方法具体包括：对样品进行预处理，包括加入含有硫酸锌的沉淀剂和磷酸水溶液；样本中加入同位素内标，校正质谱检测中的离子增强或抑制；样品经固相萃取；萃取获得的样品进行液相色谱串联质谱分析，计算得到18‑羟皮质醇、18‑羟皮质酮和18‑氧皮质醇的含量。本发明方法操作简单，便于大规模操作，具有高通量、高灵敏度、高准确度和高特异性的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时测定血浆中原发性醛固酮增多症分型标志物的液相色谱-串联质谱法，属于生物医学检测技术领域。
背景技术
中国高血压患者总人数已突破3.3亿，按病因可分为原发性和继发性高血压。其中原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism，PA)是继发性高血压中最常见的病因，在年轻高血压人群中约占10％。PA临床表现为高血压和(或)低血钾的临床综合征，其作为一种“可治愈的高血压”，若能早期诊断，可通过手术或药物治疗使血压回到正常水平，可降低患者心血管事件的发生率，改善患者预后。然而，PA的诊断是一个十分漫长的过程，包括三个步骤：筛查、确诊和亚型诊断，包括计算机断层扫描(CT)扫描和肾上腺静脉采血(AVS)。对于可手术治愈的单侧醛固酮腺瘤(APA)与特发性醛固酮增多症(IHA)的鉴别诊断，AVS是唯一可靠的方法。但是AVS非常昂贵、耗时且费力，对患者而言有造成肾上腺出血的危险。因此，需要一种更简单、非侵入性和更经济的方法。
18-羟基皮质酮(18-OHB)是醛固酮生物合成的中间体前体，主要来源于18-羟化酶对于皮质酮的转化。研究表明，血浆中18-OHB含量的高低可用于IHA和APA的鉴别诊断，因为APA的18-OHB浓度升高。18-羟基皮质醇(18-OHF)和18-氧皮质醇(18-OXOF)被称为混合类固醇。这里的“混合”是指它们的混合分子结构，兼具球状带(18-羟基化和18-氧化)和束状带(17-羟基化)代谢的特征。18-OHF和18-OXOF的浓度在糖皮质激素可抑制性醛固酮增多症中高度升高。此外，在PA患者中这两个指标同样升高，特别是在APA患者中。
与传统的免疫学方法相比，质谱方法避免了结构类似物对甾体激素检测的干扰，因而具有更好的准确度和特异性。2015年，通过质谱法确定的类固醇激素浓度被认为是美国唯一临床可接受的结果。目前，缺乏同时检测三种生物标志物的质谱方法。
综上分析，尽管液质联用技术具有多重反应监测模式具有强大的定量检测功能，具有特异性好，灵敏度高的优点，但目前却还没有同时检测血浆中18-OHB、18-OHF、18-OXOF的报道。这主要是基于这两个化合物在体内的含量极低，样品往往存在干扰，且检测模式不同(正离子和负离子)，对前处理和LC-MS/MS方法的要求严格。
发明内容
本发明专利旨在建立质谱检测方法同时检测18-OHB、18-OHF、18-OXOF的方法，并结合多重反应监测技术，利用质谱平台的高敏感性和高特异性准确定量PRA，早期快速鉴别诊断PA亚型，从而更好地为临床提供有效、准确的信息，为快速鉴别PA创造条件，为手术有效治疗APA提供关键临床循证医学依据。
为了实现上述目的，本发明提供一种同时测定血浆中原发性醛固酮增多症分型标志物18-羟皮质醇、18-羟皮质酮和18-氧皮质醇的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：收集血浆样品，加入同位素内标；
步骤2：对加内标后的血浆样品进行预处理，包括加入含有硫酸锌的沉淀剂和磷酸水溶液；
步骤3：对预处理后的样品进行固相萃取；
步骤4：萃取得到的样品进行液相色谱串联质谱分析，检测血浆中18-羟皮质醇、18-羟皮质酮和18-氧皮质醇。
上述步骤1中使用了18-OHB和18-OHF的稳定同位素内标进行校正，可用于校正前处理、离子化过程中的离子抑制或增强。
优选地，所述步骤3中固相萃取采用的是HLB SPE小柱或具有反相和离子交换功能的离子交换SPE柱。
优选地，所述步骤4中采用的分析仪器为XevoTMTQS MS ACQUITY/>或与其性能等同的液质联用仪，色谱柱为ACQUITY UPLC HSS PFP column(100mm×2.1mm，1.8μm)或与其性能相同的色谱柱，流动相为0.1％v/v的甲酸水溶液和乙腈。
优选地，所述步骤4中分析时采用梯度洗脱，所述梯度洗脱具体为：0 0.5min，流动相A体积分数保持80％，流动相B体积分数保持20％；0.52.5min，流动相A体积分数由80％下降至65％，流动相B体积分数由20％上升至35％；2.53.2min，流动相A体积分数由65％下降至5％，流动相B体积分数由35％上升至95％；3.23.7min，流动相A体积分数保持5％，流动相B体积分数保持95％；3.74.5min，流动相A体积分数由5％上升至80％，流动相B体积分数由95％下降至20％；其中，所述流动相A为0.1％v/v的甲酸水溶液，流动相B为乙腈。
优选地，所述步骤4中18-羟皮质醇和18-氧皮质醇使用正离子模式进行分析，18-羟皮质酮使用负离子模式进行分析；具体的质谱条件如下所示：
自动进样器温度：10℃；
毛细管电压：3.56kV；
锥孔电压：50V；
离子源温度：150℃；
去溶剂温度：600℃；
锥孔气流速度：150L/h；
去溶剂气体流速：1000L/；
碰撞气体流速：0.15mL/min。
优选地，所述步骤4中的检测包括定性检测和定量检测，其中，各标志物的定性、定量检测的离子对如下所示：
18-羟皮质酮定量离子对：361.2>189.0，定性离子对：361.2>283.2；
18-羟皮质醇定量离子对：379.2>267.2，定性离子对：379.2>285.2；
18-氧皮质醇定量离子对：377.4>313.2，定性离子对：377.4>341.2。
优选地，所述定量检测采用内标定量法，以各标志物标准品和内标的色谱面积比为纵坐标Y轴，以各标志物标准品和内标的浓度比为横坐标X轴，分别建立各标志物的标准曲线，待测样品通过液相色谱串联质谱分析得到各标志物的色谱峰面积，将色谱峰面积代入各自的标准曲线计算出待测样品中各标志物的浓度。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
1.采用本发明来处理血浆样品，采用蛋白沉淀和固相萃取技术联合进行预处理，祛除了大部分干扰质谱离子化的杂质，降低了对于仪器灵敏度的要求，且该方法手动操作可大大提高检测通量；如能配合自动化的样品前处理仪器，该方法可直接转移，样品通量会进一步的显著提高；
2.生物样品中的18-OHB、18-OHF、18-OXOF，其生理浓度极微，而且生物样品中存在许多的结构类似的代谢物及较多的内源性干扰物质，造成了测定的困难；传统的免疫测定方式一次测定只能测定一个分析物，且仍有灵敏度和特异性的问题；LC-MS/MS方法，同时结合了样品前处理、色谱分离和质谱选择性采集的特性，拥有更好的选择性和特异性；本发明在保证方法灵敏度和特异性的基础上，实现了原发性醛固酮增多症鉴别诊断三个关键指标的同时检测，大大简少了临床样品用量，减少了样品重复处理可能引入的偏差，如污染、取样准确度等；本发明建立的LC-MS/MS方法直接测定目标物本身，同时检测两对离子对，特异性强，灵敏度高，有望成为未来的主流检测方法。
附图说明
图1为18-羟皮质醇、18-羟皮质酮和18-氧皮质醇的色谱图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例18-OHB、18-OHF、18-OXOF的检测方法
(1)试剂配制
标准曲线工作液和内标储备液(共三个批次)：将18-OHB、18-OHF和18-OXOF的每种储备溶液与浓度为100ng/mL的甲醇混合。这些溶液首先用甲醇/H2O(1:1，v/v)稀释，得到浓度为20、30、100、300、1000、2000和3000pg/mL的18-OHB和18-OHF工作溶液，以及浓度为5、20、30、100、300、1000、2000和3000pg/mL的18-OXOF。18-OHB-d4的初始内标(IS)浓度为1mg/mL，18-OHF-d4的初始浓度为100μg/ml，其中，18-OXOF与18-OHF的检测均以18-OHF-d4作为内标，由于未购买到18-OXOF的同位素内标，故采用结构类似物作为内标。此外，为了获得10μg/mL储备溶液，将100μL 18-OHF-d4和10μL 18-OHB-d4添加到890μL甲醇中。之后，将100μL储备液加入到50mL甲醇中，得到浓度为20ng/mL的IS(内标)工作溶液。
其他试剂配制：电子天平秤量1.435g硫酸锌，加入50mL 50％v/v甲醇水溶液得到0.1mol/L硫酸锌溶液，25μL磷酸加入50ml水得0.05％磷酸水溶液。10ml乙腈加入190ml去离子水，得到5％乙腈水溶液，20ml乙腈加入80mL去离子水，得到20％乙腈水溶液。
(2)样品前处理
1.血浆样本准备：
①加入250μL血浆和25μL内标混合；
②加入200μL 0.1M ZnSO4；
③加入450μL 0.05％磷酸(50mL水+25μL磷酸)；
④旋震荡1min，14000g离心5min；
2.标准品准备：
①加入225μL无激素血浆、25μL标准品和25μL内标混合；
②加入200μL 0.1M ZnSO4；
③加入450μL 0.05％磷酸(50mL水+25μL磷酸)；
④旋震荡1min，14000g离心5min；
3.固相萃取：
⑤将800μL上清液加入Oasis PRiME HLBμElution plate固相萃取小柱；
⑥使用200μL 5％乙腈水溶液洗柱；
⑦使用200μL正己烷洗柱；
⑧更换收集板，使用40μL乙腈洗脱；
⑨负压抽干；
⑩使用80μL20％乙腈水溶液复溶；
最终洗脱液混匀之后，取20μL进样，分析SPE全程注意流速，特别是洗脱环节。微量加液，可将枪头抵至SPE上筛板操作。最终使用负压固相萃取设备进行洗脱液的吹干，加入80μL 20％乙腈水溶液复溶进行复溶，匹配起始流动相比例。
(3)液相色谱质谱条件
使用XevoTMTQS MS ACQUITY/>(Waters，美国)或性能等同的其他品牌液质联用仪进行检测，色谱柱为ACQUITY UPLC HSS PFP column(100mm×2.1mm,1.8μm)或其他性能相同的其他品牌色谱柱，流动相为0.1％v/v的甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脱(如表1所示)，总分析时间为4.5分钟。
表1梯度洗脱表(％表示体积比)
| 步骤 | 时间(分钟 | 流速(mL/min) | A％(0.1％甲酸水溶液) | B％(乙腈) |
| 1 | 0 | 0.4 | 80 | 20 |
| 2 | 0.5 | 0.4 | 80 | 20 |
| 3 | 2.5 | 0.4 | 65 | 35 |
| 4 | 3.2 | 0.4 | 5 | 95 |
| 5 | 3.7 | 0.4 | 5 | 95 |
| 6 | 4.5 | 0.4 | 80 | 20 |
质谱采用电喷雾电离(ESI)模式，正负切换分段扫描，前2.5分钟使用正离子模式，后2分钟使用负离子模式。自动进样器温度：10℃，毛细管电压：3.56kV，锥孔电压：50 V，离子源温度：150℃，去溶剂温度：600℃，锥孔气流速度：150 L/h，去溶剂气体流速：1000 L/h，碰撞气体流速：0.15 mL/min。定量和定性离子对如表2所示。
表2 18-OHB、18-OHF、18-OXOF的离子对信息
(4)检测结果
根据检测结果拟合线性回归方程，如表3所示，线性回归方程中，x代表标准品浓度与内标物浓度的比值，y代表二者峰面积比值；18-OHB的定量下限为20pg/mL，线性范围为20-3000pg/mL，18-OHF的定量下限为20pg/mL，线性范围为20-3000pg/mL，18-OXOF的定量下限为5pg/mL，线性范围为5-3000pg/mL。在该范围内，无论是正常水平还是异常样品均可被定量检测到。
表3 18-OHB、18-OHF和18-OXOF的线性回归方程，三个分析批次
| 分析物 | 线性回归方程 | 相关系数 | 批次 |
| 18-OHB | y＝0.00546247x+0.000984768 | 0.997 | 第一批次 |
| 18-OHB | y＝0.00547124x+0.000994467 | 0.998 | 第二批次 |
| 18-OHB | y＝0.00548249x+0.000985787 | 0.998 | 第三批次 |
| 18-OHF | y＝0.000783259x+0.00171219 | 0.997 | 第一批次 |
| 18-OHF | y＝0.000783345x+0.00175793 | 0.998 | 第二批次 |
| 18-OHF | y＝0.000784123x+0.00176234 | 0.999 | 第三批次 |
| 18-OXOF | y＝0.000483695x+0.00154234 | 0.999 | 第一批次 |
| 18-OXOF | y＝0.000484123x+0.00154156 | 0.999 | 第二批次 |
| 18-OXOF | y＝0.000485632x+0.00153892 | 0.999 | 第三批次 |
通过配制一定浓度的质控样品来检测该方法的日内和日间精密度，结果如表4所示，结果表明日内和日间精密度CV值均小于9.7％。
表4不同浓度样品的日内和日间精密度结果以及加标回收率
通过加标回收率试验，考察方法的准确度，结果如表4所示，加标回收率18-OHB为80-109.0％，18-OHF为86-109.0％，18-OXOF为90-108.0％。方法的特异性和不同来源的血清基质效应如表5所示。
表5方法特异性和基质效应评估
综上所述，本发明采用固相萃取来进行样品前处理，无需复杂的净化提纯步骤，结合LC-MS/MS，可以一次性进行同时定量分析检测18-OHB、18-OHF和18-OXOF，能很好服务于临床样品的检验。该检测方式检验特异性好，灵敏度高，并且整个流程时间短，通量高，能极大的节约耗材和时间成本。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种同时测定血浆中原发性醛固酮增多症分型标志物18-羟皮质醇、18-羟皮质酮和18-氧皮质醇的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：收集血浆样品，加入同位素内标；
步骤2：对加内标后的血浆样品进行预处理，包括加入含有硫酸锌的沉淀剂和磷酸水溶液；
步骤3：对预处理后的样品进行固相萃取；
步骤4：萃取得到的样品进行液相色谱串联质谱分析，检测血浆中18-羟皮质醇、18-羟皮质酮和18-氧皮质醇。
上述步骤1中使用了18-OHB和18-OHF的稳定同位素内标进行校正，可用于校正前处理、离子化过程中的离子抑制或增强。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中固相萃取采用的是HLB SPE小柱或具有反相和离子交换功能的离子交换SPE柱。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中采用的分析仪器为XevoTMTQS MS ACQUITY/>或与其性能等同的液质联用仪，色谱柱为ACQUITY UPLC HSSPFP column(100mm×2.1mm，1.8μm)或与其性能相同的色谱柱，流动相为0.1％v/v的甲酸水溶液和乙腈。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤4中分析时采用梯度洗脱，所述梯度洗脱具体为：00.5min，流动相A体积分数保持80％，流动相B体积分数保持20％；0.52.5min，流动相A体积分数由80％下降至65％，流动相B体积分数由20％上升至35％；2.53.2min，流动相A体积分数由65％下降至5％，流动相B体积分数由35％上升至95％；3.23.7min，流动相A体积分数保持5％，流动相B体积分数保持95％；3.74.5min，流动相A体积分数由5％上升至80％，流动相B体积分数由95％下降至20％；其中，所述流动相A为0.1％v/v的甲酸水溶液，流动相B为乙腈。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中18-羟皮质醇和18-氧皮质醇使用正离子模式进行分析，18-羟皮质酮使用负离子模式进行分析；具体的质谱条件如下所示：
自动进样器温度：10℃；
毛细管电压：3.56kV；
锥孔电压：50V；
离子源温度：150℃；
去溶剂温度：600℃；
锥孔气流速度：150L/h；
去溶剂气体流速：1000L/；
碰撞气体流速：0.15mL/min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中的检测包括定性检测和定量检测，其中，各标志物的定性、定量检测的离子对如下所示：
18-羟皮质酮定量离子对：361.2>189.0，定性离子对：361.2>283.2；
18-羟皮质醇定量离子对：379.2>267.2，定性离子对：379.2>285.2；
18-氧皮质醇定量离子对：377.4>313.2，定性离子对：377.4>341.2。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述定量检测采用内标定量法，以各标志物标准品和内标的色谱面积比为纵坐标Y轴，以各标志物标准品和内标的浓度比为横坐标X轴，分别建立各标志物的标准曲线，待测样品通过液相色谱串联质谱分析得到各标志物的色谱峰面积，将色谱峰面积代入各自的标准曲线计算出待测样品中各标志物的浓度。
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