CN114509516B - 同时检测血液中芳香-支链氨基酸浓度的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测血液中芳香‑支链氨基酸浓度(缬氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸)的方法及应用，该方法采用微量血浆收集卡收集血浆，经蛋白沉淀预处理，得到样本上清液，使用液相色谱串联质谱(LC‑MS/MS)对目标物进行分析，通过内标法建立标准曲线计算血样中芳香‑支链氨基酸的浓度，可实现同时测定血液中芳香‑支链氨基酸的浓度。本方法需要样本量小，同时具有高通量、简便快捷，提取回收率高的优点，满足多种质谱设备的定量需求，可应用于临床上芳香‑支链氨基酸浓度的检测。

Description

同时检测血液中芳香-支链氨基酸浓度的方法及应用
技术领域
本发明属于检验分析技术领域，具体涉及缬氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸的检测方法，以及该方法于临床上的应用。
背景技术
氨基酸是蛋白质的重要组成成分，氨基酸谱分析是研究生物体内代谢的重要手段。其中，色氨酸(tryptophan,Typ)，酪氨酸(tyro-sine,Tyr)和苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)称为芳香族氨基酸(aromatic amino acids,AAA)；亮氨酸(leucine Leu)、异亮氨酸(isoleuine,Ile)和缬氨酸(valine,Val)称为支链氨基酸(branched-chain aminoacids,BCAA)。近年来,随着各种氨基酸代谢疾病早期诊断的需要，血浆中支链与芳香族氨基酸浓度比值(BCAA/AAA)作为慢性肝病诊断指标的提出，以及氨酸输液疗法的开展，临床上迫切需要对血浆及其它体液的游离氨基酸进行定量分析(王自勉,汤秀玉,王征宇,等.血浆游离氨基酸与支/芳比值DNS荧光法测定[J].氨基酸和生物资源,1984(01):70)。
2011年Harder U等人采用LC-MS/MS测定血浆中22种氨基酸(Harder U，KoletzkoB,Peissner W.Quantification of 22plasma amino acids combining derivatizationand ion-pair LC-MS/MS[J].Journal of chromatography.B,Analytical technologiesin the biomedical and life sciences,2011,879(7-8):495-504.)；2013年李鹏飞等人基于LC-MS/MS同时检测人体内30种氨基酸(李鹏飞,陶蓓蓓,张绪得,等.高效液相色谱-串联质谱法测定人体内30种氨基酸[J].分析化学,2013(9):1347-1352)，然而这两篇报道中均使用的为衍生化方法的前处理方式，时间长，操作复杂，不利于临床大通量检测。因此迫切需要开发一种操作简单、兼具准确度和高效性的氨基酸检测方法。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明从临床实际需求出发，建立一种适用于临床高样本量的氨基酸检测方法，该方法利用微量血浆收集卡，可实现对6种芳香-支链氨基酸的同时检测，LC-MS/MS分析时间仅为4.0min，极大的增加了检测通量；同时该发明符合“生物样品定量分析方法验证指导原则(中国药典2015年版四部)”和《液相色谱-质谱临床应用建议(指南与共识)》(中华检验医学杂志,2017,40(10):770-779)中的方法学要求，提取回收率高，灵敏度高，可满足多个型号质谱检测设备的定量需求，广泛适用于临床样本的氨基酸检测。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种血样中芳香-支链氨基酸检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)芳香-支链氨基酸的预处理：
采用微量血浆收集卡，收集血浆，然后加入内标溶液，混匀放置15分钟后，加入120μL沉淀剂，涡旋混匀5分钟。15000g 4℃离心5min后，取上清液进行检测；
(2)芳香-支链氨基酸的检测：
将步骤(1)中得到的上清液于高效液相色谱串联质谱进行分析，计算药物和内标峰面积比值，通过内标法建立标准曲线计算血样中芳香-支链氨基酸的浓度。
在一种实施方式中，所述血样为血清、血浆、全血等。
在一种实施方式中，所述的芳香-支链氨基酸为缬氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸。
在一种实施方式中，步骤(1)中，血样体积为2～30μL。
在一种实施方式中，步骤(1)中，所述沉淀剂溶液选自三氯乙酸溶液，质量分数为3％。
在一种实施方式中，步骤(1)中，所述甲酸体积分数为0.1％～2％。
在一种实施方式中，步骤(2)中，其中液相色谱条件：色谱柱：X Select Hss T32.5μm 2.1×100mm；柱温40℃；进样器温度10℃；流动相A为水(含0.1％甲酸)，B为乙腈(含0.1％甲酸)，梯度洗脱(0-0.8min，流动相B为4％；0.8-0.9min，流动相B由4％升高到55％；0.9-2.9min，流动相B为55％；2.9-4.0min，流动相B为4％)；流速为0.3mL/min；进样量1μL。
在一种实施方式中，步骤(2)中，其中质谱参数为：离子化模式：ESI+；喷雾电压：4500V；温度：500℃；雾化器(GS1)：50psi；辅助雾化气(GS2)：50psi；Curtain Gas：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)。
在一种实施方式中，步骤(2)中，所述标准曲线各药物浓度范围为：缬氨酸在40-4000μmol/L线性范围内，酪氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸在10-1000μmol/L线性范围内，亮氨酸在20-2000μmol/L线性范围内，色氨酸在5-500μmol/L线性范围内；血样中内标甲硫氨酸-d3浓度为100μmol/L，酪氨酸-d4浓度为50μmol/L，色氨酸-d5浓度为40μmol/L，亮氨酸-d3浓度为100μmol/L。
本发明的第二方面，提供了前述方法在芳香-支链氨基酸检测中的应用。
本发明相对于现有技术获得了如下有益的效果：
(1)本发明从临床实际需求出发，首次实现将芳香族和支链两种结构类型的氨基酸同时检测，可将多种氨基酸同时定性定量，有利于检测标准的统一，节约实验资源；
(2)本发明每次仅需2μL血浆，即可同时检测出血浆中的芳香-支链氨基酸，极大的减轻了对患者的血液的需求，并且能够减小基质效应，具有良好的灵敏度，可适用于多种质谱设备的检测需求；
(3)本发明可用于检测异亮氨酸和亮氨酸(同分异构体)，液质分析时间仅为4min，即可达到基线分离，极大的增加了临床实验室的检测通量；
(4)本发明的检测方法符合验证要求，预处理简单、便捷，缩短了预处理的时间，更符合临床的需求。
附图说明
图1为芳香-支链氨基酸化学结构式，从前至后依次为缬氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸；
图2为血浆中芳香-支链氨基酸的MRM色谱图，从前至后依次为：色氨酸、色氨酸-d5、酪氨酸、酪氨酸-d4、亮氨酸、亮氨酸-d3、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸，甲硫氨酸-d3；
图3为同一来源的微量血浆收集卡和血浆中缬氨酸的Passing-Bablok回归曲线；
图4为同一来源的微量血浆收集卡和血浆中酪氨酸的Passing-Bablok回归曲线；
图5为同一来源的微量血浆收集卡和血浆中异亮氨酸的Passing-Bablok回归曲线；
图6为同一来源的微量血浆收集卡和血浆中亮氨酸的Passing-Bablok回归曲线；
图7为同一来源的微量血浆收集卡和血浆中苯丙氨酸的Passing-Bablok回归曲线；
图8为同一来源的微量血浆收集卡和血浆中色氨酸的Passing-Bablok回归曲线；
图9为提取条件1芳香-支链氨基酸的色谱图，从前至后依次为：色氨酸、甲硫氨酸-d3、酪氨酸、酪氨酸-2、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸；
图10为梯度1芳香-支链氨基酸的MRM色谱图，从前至后依次为：色氨酸、甲硫氨酸-d3、酪氨酸、酪氨酸-2、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸；
图11为梯度3芳香-支链氨基酸的MRM色谱图，从前至后依次为：酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1：血浆中芳香-支链氨基酸检测方法的建立和验证
1、材料与试剂
异亮氨酸和色氨酸(Solarbio，纯度≥98％)、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸(源叶生物，纯度≥99％)、D3-甲硫氨酸(剑桥CIL，纯度>98％)、D5-色氨酸(TRC，纯度98％)、D4-亮氨酸和D4-酪氨酸(Bepure，纯度是99％)；甲酸(HPLC级，纯度≥96％，sigma)、三氯乙酸(HPLC级，光复)、乙腈、甲醇(色谱纯，纯度99.9％，Merck)、水(自制超纯水)。
2、仪器和设备
AB SCIEX 4500MD高效液相色谱-串联质谱仪，检测器为三重四极杆串联质谱；万分之一电子分析天平；MiliQ纯水仪；涡旋混合仪。
3、标准曲线血浆样本和质控血浆样本的制备：
取90μL空白血浆，加入10μL各系列质控工作溶液，涡旋混匀30S，制得各种不同浓度的标准曲线血浆样本和质控样本。最终，标准曲线血浆药物浓度和质控血浆浓度如下表1所示：
表1.标准曲线和质控血浆样本的最终浓度
4、血浆、标准曲线血浆样本、质控血浆样本中芳香-支链氨基酸预处理过程：
取2μL血浆(标准曲线或质控血浆，如是全血样本的话则需要25μL全血，如是血清样本的话则需要2μL血清)样本于1.5mL管中，加入2μL内标溶液(D3-甲硫氨酸为100μmol/L，D4-酪氨酸浓度为50μmol/L，D3-亮氨酸浓度为100μmol/L，D5-色氨酸浓度为40μmol/L)，涡旋混匀放置15分钟。加入120μL沉淀剂，涡旋混匀5分钟。15000g 4℃离心5min后，取上清液进行检测；
5、芳香-支链氨基酸的检测：本实验使用以下的色谱、质谱条件：
A.液相色谱条件：色谱柱：X Select Hss T32.5μm 2.1×100mm；柱温40℃；进样器温度10℃；流动相A为水(含0.1％甲酸)，B为乙腈(含0.1％甲酸)，梯度洗脱(0-0.8min，流动相B为4％；0.8-0.9min，流动相B由4％升高到55％；0.9-2.9min，流动相B为55％；2.9-4.0min，流动相B为4％)；流速为0.3mL/min；进样量1μL
B.质谱参数为：离子化模式：ESI+；喷雾电压：4500V；温度：500℃；雾化器(GS1)：50psi；辅助雾化气(GS2)：50psi；Curtain Gas：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；
表2
6、方法学评价
根据“生物样品定量分析方法验证指导原则(中国药典2015年版四部)”和《液相色谱-质谱临床应用建议(指南与共识)》(中华检验医学杂志,2017,40(10):770-779)对本发明进行验证：包括特异性、干扰、线性范围、灵敏度、精密度、准确度(加标回收率)、基质效应和稳定性
(1)特异性考察
6个不同来源的空白血浆样本按照“4、血浆、标准曲线血浆样本、质控血浆样本中芳香-支链氨基酸预处理过程”项进行处理后，进行LC-MS/MS分析，结果显示在本实验条件下，各个待测物和内标峰形良好，具有较高的特异性。
(2)干扰
芳香-支链氨基酸按照“4、血浆、标准曲线血浆样本、质控血浆样本中芳香-支链氨基酸预处理过程”项进行处理后，干扰结果见表3；血浆样本处理后，与血浆样本加入干扰物质处理后的测定结果的相对偏差均<15％，结果表明，溶血，脂血，黄疸对检测结果没有影响。
表3.干扰测定结果
(3)线性范围
将标准曲线血浆样本按照前述步骤4中所述“芳香-支链氨基酸预处理过程”进行处理后，进行LC-MS/MS分析，根据各个药物峰面积As和内标峰面积Ai的比值Y(Y＝As/Ai)对药物浓度X进行权重线性回归，拟合标准曲线，权重为1/X2(X为浓度值)，以Y＝斜率*X+截距表示的标准曲线见表4。
表4.各个药物标准曲线和线性范围
(4)精密度和准确度
对质控样本按照前述步骤4中所述“芳香-支链氨基酸预处理过程”进行处理后，进行HPLC-MS/MS分析，每批每个浓度平行做6份，连续做三天，每天一批。将药物峰面积As和内标峰面积Ai的比值Y(Y＝As/Ai)代入当天随行标曲计算样品浓度，由此计算批内/批间精密度(CV<15％为合格)和准确度(85％～115％为合格)，各个药物精密度和准确度数据见表5。
表5.精密度和准确度
(5)基质效应
纯溶液样本配制：取1.5mL EP管，取溶液WS QC L 40μL，加入50％甲醇水溶液360μL，涡旋30秒。按照“样本前处理”过程操作，取上清液进行液相色谱-串联质谱分析。平行做6份。求算纯溶液样本中待测物和内标响应值的比值均值ys。
血浆样本配制：取1.5mL EP管，取6个不同人源血浆200μL。按照“样本前处理”过程操作，取上清液进行液相色谱-串联质谱分析。求算血浆样本中待测物和内标响应值的比值均值yx。
血浆：纯溶液混合物(1:1，v/v)配制：取1.5mL EP管，分别取上述两种样本各200μL，涡旋振荡30秒。按照“样本前处理”过程操作，取上清液进行液相色谱-串联质谱分析。求算混合物样本中待测物和内标响应值的比值均值ys+x。
将各组对应的yx，ys及ys+x代入公式：偏差(％)＝|1-(2*ys+x)/(yx+ys)|×100％，计算求得待测物的相对基质效应偏差。结果显示见表6：
表6.基质效应
(6)稳定性考察
采用低、高浓度的QC血浆样本，每一浓度4个平行样本，样本分析后代入当天随行标曲计算各药物浓度，分别考察样本室温放置24h稳定性、4℃放置10天稳定性、冻融三次循环稳定性和样本处理后自动进样器10℃放置36h稳定性，结果见表7；
表7.稳定性
以上各项符合“生物样品定量分析方法验证指导原则(中国药典2015年版四部)”和《液相色谱-质谱临床应用建议(指南与共识)》(中华检验医学杂志,2017,40(10):770-779)的各项要求，可应用于芳香-支链氨基酸的检测工作中。
实施例2：同一来源的微量血浆收集卡和血浆中芳香-支链氨基酸的浓度对比
选取36份不同来源的微量血浆收集卡(产品名：微量血浆收集卡；厂家：万承生物；货号：48001-100)，另取相对应患者的EDTA抗凝剂的紫帽采血管中的血浆，同一患者即为同一来源。二者均按照实施例1“步骤4)和5)”进行样品配制，并进行样品分析。将同一来源的微量血浆收集卡和采血管中的血浆中的芳香-支链氨基酸进行Passing-Bablok回归，其中，缬氨酸回归方程为y＝2.614+0.985x，斜率的95％CI为0.9668～1.0021，结果见附图3；酪氨酸回归方程为y＝-4.312+1.077x，斜率的95％CI为1.0136～1.1726，结果见附图4；异亮氨酸回归方程为y＝2.286+0.959x，斜率的95％CI为0.8931～1.0299，结果见附图5；亮氨酸回归方程为y＝-1.027+1.011x，斜率的95％CI为0.9743～1.0596，结果见附图6；苯丙氨酸回归方程为y＝0.876+0.981x，斜率的95％CI为0.9195～1.0290，结果见附图7；色氨酸回归方程为y＝1.313+0.954x，斜率的95％CI为0.8191～1.0506，结果见附图8。由结果可见，同一来源的微量血浆收集卡和血浆中芳香-支链氨基酸的浓度无明显差异，检测结果均在线性范围内，该方法可用于临床测定微量血浆收集卡中的芳香-支链氨基酸的浓度。
实施例3：芳香-支链氨基酸前处理提取条件的对比
1、材料与试剂
异亮氨酸和色氨酸(Solarbio，纯度≥98％)、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸(源叶生物，纯度≥99％)、D3-甲硫氨酸(剑桥CIL，纯度>98％)；甲酸(HPLC级，纯度≥96％，sigma)、三氯乙酸(HPLC级，光复)、乙腈、甲醇(色谱纯，纯度99.9％，Merck)、水(自制超纯水)。
2、仪器和设备
AB SCIEX 4500MD高效液相色谱-串联质谱仪，检测器为三重四极杆串联质谱；万分之一电子分析天平；MiliQ纯水仪；涡旋混合仪。
3、标准曲线血浆样本和质控血浆样本的制备：
取90μL空白血浆，加入10μL各系列质控工作溶液，涡旋混匀30S，制得各种不同浓度的标准曲线血浆样本和质控样本。最终，标准曲线血浆药物浓度和质控血浆浓度如下表8所示：
表8.标准曲线和质控血浆样本的最终浓度
4、血浆、标准曲线血浆样本、质控血浆样本中芳香-支链氨基酸预处理过程：
取2μL血浆(标准曲线或质控血浆)样本于1.5mL管中，加入2μL内标溶液(D3-甲硫氨酸为100μmol/L)，涡旋混匀放置15分钟。加入120μL沉淀剂，涡旋混匀5分钟。15000g 4℃离心5min后，取上清液进行检测；
5、芳香-支链氨基酸的检测：本实验使用以下的色谱、质谱条件：
A.液相色谱条件：色谱柱：X Select Hss T32.5μm 2.1×100mm；柱温40℃；进样器温度10℃；流动相A为水(含0.1％甲酸)，B为乙腈(含0.1％甲酸)，梯度洗脱(0-0.8min，流动相B为4％；0.8-0.9min，流动相B由4％升高到55％；0.9-2.9min，流动相B为55％；2.9-4.0min，流动相B为4％)；流速为0.3mL/min；进样量1μL
B.质谱参数为：离子化模式：ESI+；喷雾电压：4500V；温度：500℃；雾化器(GS1)：50psi；辅助雾化气(GS2)：50psi；Curtain Gas：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；
表9
6、芳香-支链氨基酸色谱提取条件的对比
(1)条件1：取2μL血浆(标准曲线或质控血浆)样本于1.5mL管中，加入2μL内标溶液(D3-甲硫氨酸为100μmol/L)，涡旋混匀放置15分钟。加入120μL 10％TCA，涡旋混匀5分钟。15000g 4℃离心5min后，取上清液进行检测(见图9)
(2)条件2：取2μL血浆(标准曲线或质控血浆)样本于1.5mL管中，加入2μL内标溶液(D3-甲硫氨酸为100μmol/L)，涡旋混匀放置15分钟。加入120μL 3％TCA，涡旋混匀5分钟。15000g 4℃离心5min后，取上清液进行检测(见图2)
(3)条件3：取2μL血浆(标准曲线或质控血浆)样本于1.5mL管中，加入2μL内标溶液(D3-甲硫氨酸为100μmol/L)，涡旋混匀放置15分钟。加入120μL 2.5％TCA，涡旋混匀5分钟。15000g 4℃离心5min后，取上清液进行检测(见表7)。
7、结果分析
对比3种不同的提取条件，结果显示，条件110％TCA酸度太高，高通量，长时间，会导致柱效降低，峰型变差；条件32.5％TCA加标回收率偏低(见表10)；条件2的峰型和提取回收率均符合要求。
表10加标回收率
实施例4：芳香-支链氨基酸色谱梯度条件的对比
1、材料与试剂
异亮氨酸和色氨酸(Solarbio，纯度≥98％)、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸(源叶生物，纯度≥99％)、D3-甲硫氨酸(剑桥CIL，纯度>98％)、D5-色氨酸(TRC，纯度98％)、D4-亮氨酸和D4-酪氨酸(Bepure，纯度是99％)；甲酸(HPLC级，纯度≥96％，sigma)、三氯乙酸(HPLC级，光复)、乙腈、甲醇(色谱纯，纯度99.9％，Merck)、水(自制超纯水)。
2、仪器和设备
AB SCIEX 4500MD高效液相色谱-串联质谱仪，检测器为三重四极杆串联质谱；万分之一电子分析天平；MiliQ纯水仪；涡旋混合仪。
3、标准曲线血浆样本和质控血浆样本的制备：
取90μL空白血浆，加入10μL各系列质控工作溶液，涡旋混匀30S，制得各种不同浓度的标准曲线血浆样本和质控样本。最终，标准曲线血浆药物浓度和质控血浆浓度如下表11所示：
表11.标准曲线和质控血浆样本的最终浓度
4、血浆、标准曲线血浆样本、质控血浆样本中芳香-支链氨基酸预处理过程：
取2μL血浆(标准曲线或质控血浆)样本于1.5mL管中，加入2μL内标溶液(D3-甲硫氨酸为100μmol/L)，涡旋混匀放置15分钟。加入120μL沉淀剂，涡旋混匀5分钟。15000g 4℃离心5min后，取上清液进行检测；
5、芳香-支链氨基酸的检测：本实验使用以下的色谱、质谱条件：
A.液相色谱条件：色谱柱：X Select Hss T32.5μm 2.1×100mm；柱温40℃；进样器温度10℃；流动相A为水(含0.1％甲酸)，B为乙腈(含0.1％甲酸)；流速为0.3mL/min；进样量1μL；
B.质谱参数为：离子化模式：ESI+；喷雾电压：4500V；温度：500℃；雾化器(GS1)：50psi；辅助雾化气(GS2)：50psi；Curtain Gas：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；
表12
6、芳香-支链氨基酸色谱梯度条件的对比
(1)梯度1：0-0.8min，流动相B为5％；0.8-0.9min，流动相B由4％升高到60％；0.9-2.9min，流动相B为60％；2.9-4.0min，流动相B为4％(见图10)；
(2)梯度2：0-0.8min，流动相B为4％；0.8-0.9min，流动相B由4％升高到55％；0.9-2.9min，流动相B为55％；2.9-4.0min，流动相B为4％(见图2)；
(3)梯度3：0-0.5min，流动相B为5％；0.5-0.6min，流动相B由5％升高到40％；0.6-2.4min，流动相B为60％；2.4-3.2min，流动相B为5％(见图11)；
其余液相和质谱条件均与实例1一致
7、结果分析
对比3种不同的梯度条件，结果显示，梯度1显示，流动相B由4％升高到60％时，亮氨酸会与2.53min杂质峰无法基线分离；梯度3显示，异亮氨酸通道下，异亮氨酸不能与亮氨酸(异亮氨酸的同分异构体)达到基线分离。因此，梯度2为优选的流动梯度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种血样中芳香-支链氨基酸的富集检测方法，其特征在于，所述检测方法为先采用微量血浆收集卡收集血样，经蛋白沉淀预处理，再联合高效液相色谱串联质谱进行检测，所述芳香-支链氨基酸为缬氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸和色氨酸，所述方法具体包括以下步骤：
（1）芳香-支链氨基酸的预处理：
用微量血浆收集卡收集血浆，加入内标溶液，混匀放置15分钟后，加入沉淀剂，涡旋混匀5-分钟，15000g 4℃ 离心5 min后，取上清液进行检测；所述沉淀剂为三氯乙酸溶液，质量分数为3%；
（2）芳香-支链氨基酸的检测：
将步骤（1）中得到的上清液于高效液相色谱串联质谱进行分析，计算药物和内标峰面积比值，通过内标法建立标准曲线计算血样中芳香-支链氨基酸的浓度；
其中，液相色谱串联质谱条件为：
色谱柱：X Select Hss T3 2.5μm 2.1×100mm；柱温40℃；进样器温度10℃；流动相A为含甲酸的水，B为含甲酸的乙腈，梯度洗脱条件为0-0.8min，流动相B为4%；0.8-0.9min，流动相B由4%升高到55%；0.9-2.9min，流动相B为 55%；2.9-4.0min，流动相B为4%；流速为0.3mL/min；进样量1μL；
其中，液相色谱串联质谱参数为：
离子化模式：ESI+；喷雾电压：4500V；温度：500℃；雾化器（GS1）：50psi；辅助雾化气（GS2）：50psi；Curtain Gas：30psi；扫描方式：多反应检测（MRM）；各氨基酸测定条件如下表所示：
。
2.根据权利要求1所述的富集检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述血样为2~30μL的血清、血浆或全血。
3.根据权利要求1所述的富集检测方法，其特征在于，所述甲酸体积分数为0.1%~2%。
4.根据权利要求1所述的富集检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述标准曲线的各个芳香-支链氨基酸浓度范围为：缬氨酸在40-4000 μmol/L线性范围内，酪氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸在10-1000 μmol/L线性范围内，亮氨酸在20-2000 μmol/L线性范围内，色氨酸在5-500 μmol/L线性范围内；血样中内标甲硫氨酸-d3浓度为100 μmol/L，酪氨酸-d4浓度为50μmol/L，色氨酸-d5浓度为40 μmol/L，亮氨酸-d3浓度为100 μmol/L。
5.权利要求1-4中任意一项所述方法在芳香-支链氨基酸检测方法中的应用。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105403637A (zh) * 2015-12-18 2016-03-16 广东中科康仪生物技术有限公司 一种高通量检测人体血浆中多种氨基酸的质谱方法
CN106442758A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 陈大为 非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法
CN106526007A (zh) * 2016-10-26 2017-03-22 上海万承生物科技有限公司 一种检测血浆活性成分方法及应用该方法的血浆卡
CN112730723A (zh) * 2020-12-30 2021-04-30 申友基因组研究院(南京)有限公司 一种超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸的方法
CN113030293A (zh) * 2021-02-05 2021-06-25 申友基因组研究院(南京)有限公司 一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法
CN113419007A (zh) * 2021-06-23 2021-09-21 江苏豪思睦可生物科技有限公司 一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法及其检测试剂盒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210407269A1 (en) * 2007-06-29 2021-12-30 Quest Diagnostics Investment Incorporated Analysis of amino acids in body fluid by liquid chromotography-mass spectrometry
CN106226527B (zh) * 2011-07-21 2018-05-04 和光纯药工业株式会社 血浆中氨基酸分析用内标液、内标物质及血浆中氨基酸的定量方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105403637A (zh) * 2015-12-18 2016-03-16 广东中科康仪生物技术有限公司 一种高通量检测人体血浆中多种氨基酸的质谱方法
CN106442758A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 陈大为 非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法
CN106526007A (zh) * 2016-10-26 2017-03-22 上海万承生物科技有限公司 一种检测血浆活性成分方法及应用该方法的血浆卡
CN112730723A (zh) * 2020-12-30 2021-04-30 申友基因组研究院(南京)有限公司 一种超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸的方法
CN113030293A (zh) * 2021-02-05 2021-06-25 申友基因组研究院(南京)有限公司 一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法
CN113419007A (zh) * 2021-06-23 2021-09-21 江苏豪思睦可生物科技有限公司 一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法及其检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
串联质谱法测定血清中20种游离氨基酸含量;张轶雯;倪君君;相婷;高慧媛;李玮;吴立军;;检验医学与临床;7(19);第2051-2053页 *

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