CN111830161A - 一种检测血清中15种胆汁酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测血清中15种胆汁酸的方法，属于分析技术领域。该方法具体是：取预处理的血清，先利用超高效液相色谱将待测胆汁酸与血清基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱得到待测胆汁酸与其对应同位素内标物的质荷比，使用同位素内标法定量，即可分别计算出15种胆汁酸的含量。采用本发明的检测方法，样本无需衍生化处理，前处理简单，样本用量小，灵敏度高，特异性强，检测种类较多，6.5分钟之内可同时检测15种胆汁酸，可用于临床上血清胆汁酸的诊断及健康评估。

Description

一种检测血清中15种胆汁酸的方法
技术领域
本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中15种胆汁酸的方法。
背景技术
胆汁酸是胆汁中的主要成分，是一类24碳胆烷酸羟基衍生物的总称，是胆固醇经肝组织代谢的最终产物，当肝脏循环被破坏，则胆汁酸不能被重复利用。胆汁酸按结构可分为游离型胆汁酸和结合型胆汁酸。人体中的游离胆汁酸按其生成部位及结构不同又可分为初级和次级胆汁酸。初级胆汁酸由肝内胆固醇转变而来，通过一系列反应，最终生成胆酸(Cholic acid，CA)和鹅脱氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)。初级胆汁酸在肝细胞合成后，在肝细胞毛细胆管膜一系列转运蛋白以胆盐形式进入毛细胆管，存储于胆囊，进食后胆囊收缩，胆囊排空，胆汁酸进入肠道。在肠道中受细菌作用，初级胆汁酸经过水解、氧化和核羟基的差向异构生成的胆汁酸，称为次级胆汁酸，包括脱氧胆酸(Deoxycholic acid，DCA)、石胆酸(Lithocolic acid，LCA)和熊脱氧胆酸(Ursodeoxycholic acid，UDCA)。游离型胆汁酸是胆固醇的代谢产物，体内存在多种复杂机制调节游离型胆汁酸的代谢。游离型胆汁酸在脂肪代谢中起着重要作用。游离型胆汁酸主要存在于肝肠循环系统，并通过再循环以达到对人体机体的保护作用。结合胆汁酸又分为牛磺结合型胆汁酸和甘氨结合型胆汁酸。牛磺结合型胆汁酸是指胆汁酸以酰胺键(简称肽键)与牛磺酸结合，成为牛磺结合型胆汁酸，包括牛磺胆酸(Taurocholic acid，TGA)、牛磺鹅脱氧胆酸(Taurochenodeoxycholicacid sodium salt，TCDCA)、牛磺石胆酸(Taurolithocholic acid，TLCA)、牛磺脱氧胆酸(Taurodeoxycholic acid sodium salt，TDCA)和牛磺熊脱氧胆酸(Tauroursodeoxycholicacid sodium salt，TUDCA)。甘氨结合型胆汁酸是指胆汁酸以酰胺键(简称肽键)与甘氨酸结合，成为甘氨结合型胆汁酸，包括甘氨胆酸(Glycocholic acid，GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(Glycochenodeoxycholic acid，GCDCA)、甘氨石胆酸(Lithocholylglycine，GLCA)、甘氨脱氧胆酸(Glycodeoxycholic acid sodium salt，GDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(Glycoursodeoxycholic acid,GUDCA)。
血清胆汁酸可以反映肝细胞的合成代谢摄取和排泌状态；胆汁酸的生成、代谢与肝脏关系非常密切，当肝细胞发生病变，血清中的总胆汁酸会随之变化。人内源性胆汁酸以疏水性胆汁酸为主，当胆汁酸排泄发生障碍后，疏水性胆汁酸和脂肪高度亲和，溶解破坏细胞膜和线粒体膜结构，致使细胞凋亡或者死亡，加重肝脏的损伤。但亲水胆汁酸可以促进内源性胆汁酸的代谢，提高胆汁中胆汁酸和磷脂的含量，改变胆盐的成分，减轻疏水性到胆汁酸的毒性，起到保护细胞膜和利胆的作用。然而，血清中总胆汁酸(TBA)对不同疾病诊断的特异性差，检测结果对疾病诊断和治疗指导作用非常有限。总胆汁酸水平(TBA)除了在部分如妊娠合并肝内胆管淤积症(ICP)等疾病中有一定的意义，其他的临床意义非常有限。所以分离和定量多种亚型胆汁酸可以满足临床诊断和疾病治疗指有非常重要的意义。
现有技术中有基于LC-MS/MS的检测多种亚型胆汁酸的方法。CN 106841492 A公开了一种高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，其方法有一定的缺陷，如只能检测5种游离胆汁酸，其对于疾病诊断和临床意义有限，且前处理进过蛋白沉淀后，上清液需要经过离心浓缩冷冻系统冻干后复溶，前处理方法复杂，上机检测时间达12.5分钟，在临床检测中难以应用。CN 107356694 A公开了一种高效检测血液中15种胆汁酸的方法，虽然该方法可以同时检测15种胆汁酸，但也存在一定的缺陷，比如前处理使用全血样本滴加在滤纸上，需要过滤风干3小时以上，在所得的干血片上打孔取样，再经过液液萃取、氮吹浓缩的方法提取，该方法使用的样本量比较大，前处理时间过长、方法复杂，在临床应用比较受限，且上机检测时间达10分钟，在临床检测中难以应用。CN 110596295 A公开了一种检测胆汁酸的方法，利用高效液相色谱串联质谱法同时检测38种游离脂肪酸，该方法虽然可以检测38种游离脂肪酸，涉及血清、粪便、肝脏样本中的脂肪酸，但是血清和肝脏样本来自小鼠和黄颡鱼，在血清、粪便和肝脏基质中检测出的种类数也不同，同时未说明不同基质中各胆汁酸的生物参考区间，临床参考意义未知；人体样本为粪便样本，粪便样本不如血液样本常见，不容易获得，且样本前处理方法较为复杂，在临床应用比较受限。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种简单、高效且可靠的血样中15种胆汁酸的检测方法，更能满足临床应用的需求。
一种检测血清中15种胆汁酸的方法，取预处理的血清，先利用超高效液相色谱将待测胆汁酸与血清基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱得到待测胆汁酸与其对应同位素内标物的质荷比(m/z)，使用同位素内标法定量，即可分别计算出15种胆汁酸的含量；
所述预处理的血清按照如下方法制备：取待测血清样品，向其中加入混合内标工作液，混合后加入蛋白沉淀剂，离心后取上清液，即为预处理的血清；
所述15种胆汁酸分别为：胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、石胆酸、甘氨石胆酸、牛磺石胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸和牛磺熊脱氧胆酸；
上述15种胆汁酸对应的同位素内标物分别为：胆酸-d4、甘氨胆酸-d5、牛磺胆酸-d5、石胆酸-d4、甘氨石胆-d4、牛磺石胆酸-d5、脱氧胆酸-d4、甘氨脱氧胆酸-d5、牛磺脱氧胆酸-d4、鹅脱氧胆酸-d4、甘氨鹅脱氧胆酸-d4、牛磺鹅脱氧胆酸-d5、熊脱氧胆酸-d4、甘氨熊脱氧胆酸-d4和牛磺熊脱氧胆酸-d4。
进一步地，所述超高效液相色谱的色谱条件如下：
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18；
柱温为35～45℃；
流速为0.3～0.5mL/min；
进样体积为0.5～5μL；
流动相A为0.01～0.1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱过程为：在0-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至2:98，在4.0-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98，在4.5-6.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为40:60。
优选地，所述流动相A为0.01％甲酸水溶液，流速为0.4mL/min；柱温为40℃；进样体积为1μL。
进一步地，所述质谱的色谱条件为：在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行负离子扫描；喷雾电压为2.5kV(ESI-)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h。
进一步地，所述混合内标工作液中胆酸-d4、甘氨胆酸-d5、牛磺胆酸-d5、石胆酸-d4、甘氨石胆-d4、牛磺石胆酸-d5、脱氧胆酸-d4、甘氨脱氧胆酸-d5、牛磺脱氧胆酸-d4、鹅脱氧胆酸-d4、甘氨鹅脱氧胆酸-d4、牛磺鹅脱氧胆酸-d5、熊脱氧胆酸-d4、甘氨熊脱氧胆酸-d4和牛磺熊脱氧胆酸-d4的浓度分别为：50ng/mL胆酸-d4、50ng/mL甘氨胆酸-d5、5ng/mL牛磺胆酸-d5、2.5ng/mL石胆酸-d4、2.5ng/mL甘氨石胆酸-d4、0.5ng/mL牛磺石胆酸-d5、50ng/mL脱氧胆酸-d4、25ng/mL甘氨脱氧胆酸-d5、5ng/mL牛磺脱氧胆酸-d4、75ng/mL鹅脱氧胆酸-d4、100ng/mL甘氨鹅脱氧胆酸-d4、25ng/mL牛磺鹅脱氧胆酸-d5、25ng/mL熊脱氧胆酸-d4、25ng/mL甘氨熊脱氧胆酸-d4和1ng/mL牛磺熊脱氧胆酸-d4。
进一步地，所述蛋白沉淀剂为甲醇。
进一步地，所述预处理的血清按照如下方法制备：取50μL待测血清样品，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后加入180μL甲醇，振荡4～10min后，12000～15000r/min、10～20℃离心4～10min后，取70μL上清液，即为预处理的血清。
采用本发明的方法检测血清中的胆汁酸，将待测血清样本与所有待测胆汁酸的混合内标溶液直接混合，样本无需衍生化处理，前处理简单，只需一步蛋白沉淀处理，样本用量小，灵敏度高，特异性强，检测种类较多，6.5分钟之内即可同时检测15种胆汁酸，可用于临床上血清胆汁酸的诊断及健康评估。
附图说明
图1为实施例1中15种胆汁酸标准品的选择离子流色谱图。
图2为实施例1的血清样本中15种胆汁酸的选择离子流色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中15种胆汁酸的方法，具体是：取预处理的血清，利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测目标物与其对应同位素内标的质荷比(m/z)，使用同位素内标法定量，分别计算出15种胆汁酸的含量。
所述15种胆汁酸分别为：胆酸(CA)、甘氨胆酸(GCA)、牛磺胆酸(TCA)、石胆酸(LCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、脱氧胆酸(DCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用胆酸-d4(CA-d4)、甘氨胆酸-d5(GCA-d5)、牛磺胆酸-d5(TCA-d5)、石胆酸-d4(LCA-d4)、甘氨石胆-d4(GLCA-d4)、牛磺石胆酸-d5(TLCA-d5)、脱氧胆酸-d4(DCA-d4)、甘氨脱氧胆酸-d5(GDCA-d5)、牛磺脱氧胆酸-d4(TDCA-d4)、鹅脱氧胆酸-d4(CDCA-d4)、甘氨鹅脱氧胆酸-d4(GCDCA-d4)、牛磺鹅脱氧胆酸-d5(TCDCA-d5)、熊脱氧胆酸-d4(UDCA-d4)、甘氨熊脱氧胆酸-d4(GUDCA-d4)和牛磺熊脱氧胆酸-d4(TUDCA-d4)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中胆汁酸时的重现性、准确度均较好。
在本发明采用的超高效液相色谱串联质谱技术中，具体的色谱条件如下：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.01～0.1％甲酸-水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm,1.7μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：所述梯度洗脱过程如下：在0-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至2:98；在4.0-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在4.5-6.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为40:60；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行负离子扫描；喷雾电压为2.5kV(ESI-)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了15种胆汁酸及其对应同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标待测物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测胆汁酸的灵敏度更高，前处理简单，只需一步蛋白沉淀处理，样本用量小，检测种类较多，6.5分钟之内可同时检测15种胆汁酸。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.01～0.1％甲酸-水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.01％甲酸-水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求为：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.01～0.1％甲酸-水溶液和甲醇作为流动相，色谱柱型号：ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×50mm,1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，6.5min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。
在一种方案中，流速为0.3～0.5mL/min，优选为0.4mL/min。
进一步地，柱温为35～45℃，优选为40℃。
更进一步地，进样体积为0.5～5μL，优选为1μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中15种胆汁酸时，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.01％甲酸-水溶液溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm,1.7μm)；
采用梯度洗脱的方式，见表1；流速为0.4mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
表1流动相梯度洗脱参数
时间 流速(mL/min) ％A ％B Curve
0.0 0.4 60 40 -
4.0 0.4 2 98 6
4.5 0.4 2 98 6
6.5 0.4 60 40 1
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行负离子扫描；喷雾电压为2.5kV(ESI-)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了15种胆汁酸及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表2。
表2胆汁酸质谱参数
化合物 母离子(m/z) 子离子(m/z) 锥孔电压(V) 碰撞电压(V)
CA 407.3 407.3 40 4
CA-d4 411.3 411.3 40 4
GCA 464.3 73.95 40 38
GCA-d5 469.3 73.95 40 38
TCA 514.35 80.01 40 60
TCA-d5 519.3 79.9 40 60
LCA 375.3 375.3 40 4
LCA-d4 379.3 379.3 40 4
GLCA 432.3 73.95 40 34
GLCA-d4 437.1 73.95 40 34
TLCA 482.3 80.01 40 54
TLCA-d5 487.3 79.9 40 62
DCA 391.3 391.3 40 4
DCA-d4 395.3 395.3 40 4
GDCA 448.3 73.95 40 34
GDCA-d5 453.3 73.95 40 34
TDCA 498.3 80.1 40 55
TDCA-d4 502.3 80.1 40 55
CDCA 391.3 391.3 40 4
CDCA-d4 395.3 395.3 40 4
GCDCA 448.3 73.95 40 34
GCDCA-d4 452.3 73.95 40 34
TCDCA 498.3 80.1 40 55
TCDCA-d5 503.3 79.9 40 60
UDCA 391.3 391.3 40 4
UDCA-d4 395.3 395.3 40 4
GUDCA 448.3 73.95 40 34
GUDCA-d4 452.3 73.95 40 34
TUDCA 498.3 80.1 40 55
CA 407.3 407.3 40 4
本发明提及的血清为人或动物血清。
所述预处理的血清按照如下方法制备：向待测血清加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再涡旋离心后取上清液；其中，蛋白质沉淀剂为甲醇。
在一种优选方案中，预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作，涡旋后加入180μL甲醇，振荡4～10min后，12000～15000r/min，10～20℃离心4～10min，取70μL上清液。
在一种更优选方案中，预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作，然后涡旋5s；加入180μL甲醇，高速振荡(最大振速)5min；在转速14000r/min，15℃离心5min；取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量1μL。
混合内标工作液按照如下方法制备：
(1)称取各同位素内标物，胆酸-d4、甘氨胆酸-d5、牛磺胆酸-d5、石胆酸-d4、甘氨石胆酸-d4、牛磺石胆酸-d5、脱氧胆酸-d4、甘氨脱氧胆酸-d5、牛磺脱氧胆酸-d4、鹅脱氧胆酸-d4、甘氨鹅脱氧胆酸-d4、牛磺鹅脱氧胆酸-d5、熊脱氧胆酸-d4、甘氨熊脱氧胆酸-d4和牛磺熊脱氧胆酸-d4，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为5mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、5mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL和1mg/mL的同位素内标母液；
(2)上述各同位素内标母液再以纯甲醇配制成包含有500ng/mL胆酸-d4、500ng/mL甘氨胆酸-d5、50ng/mL牛磺胆酸-d5、25ng/mL石胆酸-d4、25ng/mL甘氨石胆酸-d4、5ng/mL牛磺石胆酸-d5、500ng/mL脱氧胆酸-d4、250ng/mL甘氨脱氧胆酸-d5、50ng/mL牛磺脱氧胆酸-d4、750ng/mL鹅脱氧胆酸-d4、1000ng/mL甘氨鹅脱氧胆酸-d4、250ng/mL牛磺鹅脱氧胆酸-d5、250ng/mL熊脱氧胆酸-d4、250ng/mL甘氨熊脱氧胆酸-d4和10ng/mL和牛磺熊脱氧胆酸-d4的同位素内标SI溶液；
(3)取100μL SI溶液，加入900μL甲醇-水溶液，混合均匀得混合内标工作液。
在制备混合内标工作液时，采用的甲醇-水溶液为80～95％甲醇-水溶液；优选为80％甲醇-水溶液。
在一种优选方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：
准确称量3-5mg各同位素内标物于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成下表中同位素内标母液浓度，再将各使用浓度用甲醇溶液配制成同位素混合内标SI溶液(详见表3)，最后取100μL SI溶液，加入900μL80％甲醇-水溶液，混合均匀得混合内标工作液。
表3同位素混合内标SI溶液的配制
Figure BDA0002593970560000081
在本发明的方案中，采用的标准品溶液按照如下方法制备：
(1)称取各待测物标准品，包括胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、石胆酸、甘氨石胆酸、牛磺石胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为5.00mg/mL、5.00mg/mL、5.00mg/mL、5.00mg/mL、4.00mg/mL、4.00mg/mL、5.00mg/mL、4.00mg/mL、5.00mg/mL、5.00mg/mL、2.00mg/mL、5.00mg/mL、5.00mg/mL、5.00mg/mL和10.00mg/mL的标准品母液；
(2)上述各标准品母液再以纯甲醇配制成包含有20000ng/mL胆酸、20000ng/mL甘氨胆酸、2000ng/mL牛磺胆酸、1000ng/mL石胆酸、1000ng/mL甘氨石胆酸、200ng/mL牛磺石胆酸、20000ng/mL脱氧胆酸、10000ng/mL甘氨脱氧胆酸、2000ng/mL牛磺脱氧胆酸、30000ng/mL鹅脱氧胆酸、40000ng/mL甘氨鹅脱氧胆酸、10000ng/mL牛磺鹅脱氧胆酸、10000ng/mL熊脱氧胆酸、10000ng/mL甘氨熊脱氧胆酸、400ng/mL牛磺熊脱氧胆酸的混合标准S0溶液；
将上述混合标准S0溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
牛磺石胆酸的浓度依次为0.08ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL；
牛磺熊脱氧胆酸的浓度依次为0.16ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；
石胆酸和甘氨石胆酸的浓度相同依次为0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL；
胆酸、甘氨胆酸和脱氧胆酸的浓度相同，依次为8ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；
牛磺胆酸和牛磺脱氧胆酸的浓度相同，依次为0.8ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL；
甘氨脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸和甘氨熊脱氧胆酸的浓度相同，依次为4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL；
鹅脱氧胆酸的浓度依次为12ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、150ng/mL、300ng/mL、750ng/mL、1500ng/mL；
甘氨鹅脱氧胆酸的浓度依次为16ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL。
胆汁酸是内源性物质，目前无法获得商品化的不含胆汁酸空白血清，人血清中主要成分为血清蛋白，牛血清白蛋白是最常用的人空白血清替代基质，因此本研究采用牛血清白蛋白(BSA)作为人空白血清，制备标准品溶液时，空白血清基质为1～10％BSA水溶液；优选为5％BSA水溶液。
在一种优选方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
准确称量3-5mg各待测标准品粉末于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成下表中标准品母液浓度，再将各使用浓度用甲醇溶液配制成混合标准S0溶液(详见表4)，混合均匀备用。
表4混合标准液S0的配制
Figure BDA0002593970560000091
Figure BDA0002593970560000101
取20μL混合标准品储备液S0加入至380μL 5％BSA中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积5％BSA稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第七高值浓度点。
绘制标准曲线时，每个浓度点样品取50μL，向其中加入20μL混合内标工作，然后涡旋5s；加入180μL甲醇，高速振荡(最大振速)5min；在转速14000r/min，15℃离心5min；取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量1μL。
本发明提及的甲醇-水溶液的浓度一般指体积浓度。
本发明还包括制备质控品，所述质控品为含有15种胆汁酸的空白血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。其中，QC(L)为上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至1000倍；QC(M)为上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至200倍；QC(H)为上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至20倍。
在一种方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准S0溶液以1-10％BSA配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。
在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准S0溶液以5％BSA配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。
QC(L)中包含：20ng/mL胆酸(CA)、20ng/mL甘氨胆酸(GCA)、2ng/mL牛磺胆酸(TCA)、1ng/mL石胆酸(LCA)、1ng/mL甘氨石胆酸(GLCA)、0.2ng/mL牛磺石胆酸(TLCA)、20ng/mL脱氧胆酸(DCA)、10ng/mL甘氨脱氧胆酸(GDCA)、2ng/mL牛磺脱氧胆酸(TDCA)、30ng/mL鹅脱氧胆酸(CDCA)、40ng/mL甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、10ng/mL牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、10ng/mL熊脱氧胆酸(UDCA)、10ng/mL甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、0.4ng/mL牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)；
QC(M)中包含：100ng/mL胆酸(CA)、100ng/mL甘氨胆酸(GCA)、10ng/mL牛磺胆酸(TCA)、5ng/mL石胆酸(LCA)、5ng/mL甘氨石胆酸(GLCA)、1ng/mL牛磺石胆酸(TLCA)、100ng/mL脱氧胆酸(DCA)、50ng/mL甘氨脱氧胆酸(GDCA)、10ng/mL牛磺脱氧胆酸(TDCA)、150ng/mL鹅脱氧胆酸(CDCA)、200ng/mL甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、50ng/mL牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、50ng/mL熊脱氧胆酸(UDCA)、50ng/mL甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、2ng/mL牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)；
QC(H)中包含：400ng/mL胆酸(CA)、400ng/mL甘氨胆酸(GCA)、40ng/mL牛磺胆酸(TCA)、20ng/mL石胆酸(LCA)、20ng/mL甘氨石胆酸(GLCA)、4ng/mL牛磺石胆酸(TLCA)、400ng/mL脱氧胆酸(DCA)、200ng/mL甘氨脱氧胆酸(GDCA)、40ng/mL牛磺脱氧胆酸(TDCA)、600ng/mL鹅脱氧胆酸(CDCA)、800ng/mL甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、200ng/mL牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、200ng/mL熊脱氧胆酸(UDCA)、200ng/mL甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、8ng/mL牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明
实施例1
一、实验材料与仪器
1.材料
方法学研究实验的样本来自于武汉亚洲心脏病医院2018年7月份门诊收集的血清样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱型号ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm,1.7μm)(美国Waters公司)。
(3)标准品：胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、石胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸购自百灵威公司；甘氨石胆酸、牛磺石胆酸购自TRC公司；胆酸-d4、甘氨胆酸-d5、牛磺胆酸-d5、石胆酸-d4、牛磺石胆酸-d5、甘氨脱氧胆酸-d5、鹅脱氧胆酸-d4、牛磺鹅脱氧胆酸-d5、熊脱氧胆酸-d4购自TRC公司；脱氧胆酸-d4、甘氨石胆酸-d4、牛磺脱氧胆酸-d4、甘氨熊脱氧胆酸-d4、牛磺熊脱氧胆酸-d4购自Sigma公司；甘氨鹅脱氧胆酸-d4购自CIL公司。
(4)质控品：含有15种胆汁酸的空白血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.01％甲酸-水溶液；流动相B：甲醇。色谱柱型号：ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×50mm,1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.4mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行负离子扫描；喷雾电压为2.5kV(ESI-)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了15种胆汁酸及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表2。
三、实验过程
(1)标准品配制：
准确称量3-5mg各待测标准品粉末于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成下表中标准品母液浓度，再将各使用浓度用纯甲醇溶液配制成混合标准S0溶液(详见表4)，混合均匀备用。
将上述混合标准S0溶液以空白血清基质(5％BSA)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取20μL混合标准品储备液S0加入至380μL 5％BSA中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积5％BSA稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第七高值浓度点。
所述校准品溶液的七个浓度点为：
牛磺石胆酸的浓度依次为0.08ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL；
牛磺熊脱氧胆酸的浓度依次为0.16ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；
石胆酸和甘氨石胆酸的浓度相同依次为0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL；
胆酸、甘氨胆酸和脱氧胆酸的浓度相同，依次为8ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；
牛磺胆酸和牛磺脱氧胆酸的浓度相同，依次为0.8ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL；
甘氨脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸和甘氨熊脱氧胆酸的浓度相同，依次为4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL；
鹅脱氧胆酸的浓度依次为12ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、150ng/mL、300ng/mL、750ng/mL、1500ng/mL；
甘氨鹅脱氧胆酸的浓度依次为16ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL。
(2)混合内标工作液配制
准确称量3-5mg各同位素内标物于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成下表中同位素内标母液浓度，再将各使用浓度用纯甲醇溶液配制成同位素混合内标SI溶液(详见表3)，最后取100μL SI溶液，加入900μL80％甲醇-水溶液，混合均匀得混合内标工作液。
(3)质控品配制：
取上述混合标准S0溶液以5％BSA配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。
QC(L)中包含：20ng/mL胆酸(CA)、20ng/mL甘氨胆酸(GCA)、2ng/mL牛磺胆酸(TCA)、1ng/mL石胆酸(LCA)、1ng/mL甘氨石胆酸(GLCA)、0.2ng/mL牛磺石胆酸(TLCA)、20ng/mL脱氧胆酸(DCA)、10ng/mL甘氨脱氧胆酸(GDCA)、2ng/mL牛磺脱氧胆酸(TDCA)、30ng/mL鹅脱氧胆酸(CDCA)、40ng/mL甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、10ng/mL牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、10ng/mL熊脱氧胆酸(UDCA)、10ng/mL甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、0.4ng/mL牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)。
QC(M)中包含：100ng/mL胆酸(CA)、100ng/mL甘氨胆酸(GCA)、10ng/mL牛磺胆酸(TCA)、5ng/mL石胆酸(LCA)、5ng/mL甘氨石胆酸(GLCA)、1ng/mL牛磺石胆酸(TLCA)、100ng/mL脱氧胆酸(DCA)、50ng/mL甘氨脱氧胆酸(GDCA)、10ng/mL牛磺脱氧胆酸(TDCA)、150ng/mL鹅脱氧胆酸(CDCA)、200ng/mL甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、50ng/mL牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、50ng/mL熊脱氧胆酸(UDCA)、50ng/mL甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、2ng/mL牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)。
QC(H)中包含：400ng/mL胆酸(CA)、400ng/mL甘氨胆酸(GCA)、40ng/mL牛磺胆酸(TCA)、20ng/mL石胆酸(LCA)、20ng/mL甘氨石胆酸(GLCA)、4ng/mL牛磺石胆酸(TLCA)、400ng/mL脱氧胆酸(DCA)、200ng/mL甘氨脱氧胆酸(GDCA)、40ng/mL牛磺脱氧胆酸(TDCA)、600ng/mL鹅脱氧胆酸(CDCA)、800ng/mL甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、200ng/mL牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、200ng/mL熊脱氧胆酸(UDCA)、200ng/mL甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、8ng/mL牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)。
(4)样品处理
1)标准品前处理：每个浓度点样品取50μL，向其中加入20μL混合内标工作，然后涡旋5s；加入180μL甲醇，高速振荡(最大振速)5min；在转速14000r/min，15℃离心5min；取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量1μL。
2)血清样品前处理：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作，然后涡旋5s；加入180μL甲醇，高速振荡(最大振速)5min；在转速14000r/min，15℃离心5min；取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量1μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
四、方法验证
本发明的检测方法中，15种胆汁酸的标准品与血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为15种胆汁酸标准品的选择离子流色谱图；图2为血清样本中15种胆汁酸的选择离子流色谱图。
1.标准曲线：
采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中胆汁酸待测物的浓度。15种胆汁酸在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，详见表5。
表5 15种胆汁酸的保留时间及线性范围
Figure BDA0002593970560000141
Figure BDA0002593970560000151
2.最低定量限
最低定量限(LLOQ)作为标曲线性范围的最低点，也反映方法的灵敏度。部分胆汁酸在人体含量低，对方法的灵敏度和特异性要求较高，对方法进行优化和考察，目前最低定量限(LLOQ)基本满足15种胆汁酸同时检测的灵敏度要求，LLOQ的浓度具体见表6。
表6方法定量下限数据表
Figure BDA0002593970560000152
3.加标回收率考察：随机选取一例人血清样品，其中1个不加标准品，其它3个分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，计算回收率结果，见表7。结果显示，血清中15种胆汁酸的加标回收率结果在85.72％-114.54％之间，5次重复试验的RSD在7.17％-13.12％范围，均满足要求。
表7血清中15种胆汁酸的加标回收率结果(单位ng/mL)
Figure BDA0002593970560000161
Figure BDA0002593970560000171
4.精密度试验：取血清质控样本一天内重复处理6批，处理3天，以同位素内标法定量测定15种胆汁酸的浓度，计算批内精密度为0.8-15.15％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.94-13.70％，批间精密度结果见表8。
表8批内、批间精密度试验结果(单位ng/mL)
Figure BDA0002593970560000172
Figure BDA0002593970560000181
Figure BDA0002593970560000191
本发明采用UPLC-MS/MS方法测定了人体血清中的15种胆汁酸，同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，特异性强。与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。
考察了15种胆汁酸在血清中加标回收率，均在85％-115％，符合要求。
方法的重现性结果表明，血清中的15种胆汁酸的日内精密度，日间精密度，方法的重现性良好。
本方法较其他LC-MS/MS方法灵敏度更高，前处理简单，只需一步蛋白沉淀处理，样本用量小，检测种类较多，6.5分钟之内可同时检测15种胆汁酸，可用于临床上血清中胆汁酸的诊断及健康评估。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种检测血清中15种胆汁酸的方法，其特征在于：取预处理的血清，先利用超高效液相色谱将待测胆汁酸与血清基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱得到待测胆汁酸与其对应同位素内标物的质荷比，使用同位素内标法定量，即可分别计算出15种胆汁酸的含量；
所述15种胆汁酸分别为：胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、石胆酸、甘氨石胆酸、牛磺石胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸和牛磺熊脱氧胆酸；
上述15种胆汁酸对应的同位素内标物分别为：胆酸-d4、甘氨胆酸-d5、牛磺胆酸-d5、石胆酸-d4、甘氨石胆-d4、牛磺石胆酸-d5、脱氧胆酸-d4、甘氨脱氧胆酸-d5、牛磺脱氧胆酸-d4、鹅脱氧胆酸-d4、甘氨鹅脱氧胆酸-d4、牛磺鹅脱氧胆酸-d5、熊脱氧胆酸-d4、甘氨熊脱氧胆酸-d4和牛磺熊脱氧胆酸-d4；
所述预处理的血清按照如下方法制备：取待测血清样品，向其中加入混合内标工作液，混合后加入蛋白沉淀剂，离心后取上清液，即为预处理的血清。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述超高效液相色谱的色谱条件如下：
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18；
柱温为35~45℃；
流速为0.3~0.5 mL/min；
进样体积为0.5~5 µL；
流动相A为0.01~0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱过程为：在0-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至2:98，在4.0-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98，在4.5-6.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为40:60。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述流动相A为0.01%甲酸水溶液；流速为0.4 mL/min，柱温为40℃，进样体积为1 µL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述质谱的色谱条件为：在电喷雾电离模式下，采用多反应监测进行负离子扫描；喷雾电压为2.5 kV；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800 L/h，锥孔气流速为150 L/h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述混合内标工作液中胆酸-d4、甘氨胆酸-d5、牛磺胆酸-d5、石胆酸-d4、甘氨石胆-d4、牛磺石胆酸-d5、脱氧胆酸-d4、甘氨脱氧胆酸-d5、牛磺脱氧胆酸-d4、鹅脱氧胆酸-d4、甘氨鹅脱氧胆酸-d4、牛磺鹅脱氧胆酸-d5、熊脱氧胆酸-d4、甘氨熊脱氧胆酸-d4和牛磺熊脱氧胆酸-d4的浓度分别为：50ng/mL胆酸-d4、50ng/mL甘氨胆酸-d5、5ng/mL牛磺胆酸-d5、2.5ng/mL石胆酸-d4、2.5ng/mL甘氨石胆酸-d4、0.5ng/mL牛磺石胆酸-d5、50ng/mL脱氧胆酸-d4、25ng/mL甘氨脱氧胆酸-d5、5ng/mL牛磺脱氧胆酸-d4、75ng/mL鹅脱氧胆酸-d4、100ng/mL甘氨鹅脱氧胆酸-d4、25ng/mL牛磺鹅脱氧胆酸-d5、25ng/mL熊脱氧胆酸-d4、25ng/mL甘氨熊脱氧胆酸-d4和1ng/mL牛磺熊脱氧胆酸-d4。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白沉淀剂为甲醇。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述预处理的血清按照如下方法制备：取50μL待测血清样品，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后加入180 μL甲醇，振荡4~10min后，12000~15000 r/min、10~20℃离心4~10min后，取70 μL上清液，即为预处理的血清。
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