CN115876935B - 一种用于检测血液中11-脱氢血栓烷b2的液相色谱-串联质谱方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测血液中11‑脱氢血栓烷B2(11dhTxB2)的液相色谱‑串联质谱方法，步骤如下：血液样本加入酸化剂调节pH后孵育一段时间，再加入内标，然后经特异性固相萃取柱对11dhTxB2进行除杂、纯化和富集，使用液相色谱‑串联质谱(LC‑MS/MS)对样本提取液进行分析，以保留时间和离子丰度比为定性依据，采用同位素内标法建立校准曲线进行定量，实现对血液中11dhTxB2浓度的精准检测。本发明还公开了一种用于检测血液中11‑脱氢血栓烷B2(11dhTxB2)的试剂盒，包括特异性固相萃取柱、内标液、校准液、稀释液、酸化剂、活化液、平衡液、淋洗液1和2、洗脱液和质控样本。
Description
技术领域
本发明属于医学检验分析技术领域，具体地说是一种用于检测血液中11-脱氢血栓烷B2的液相色谱-串联质谱方法和试剂盒。
技术背景
11-脱氢血栓烷B2(11-dehydro-thromboxane B2，11dhTXB2)是血栓烷素A2(thromboxane A2，TXA2)的终末代谢产物，主要经肾排出。血栓烷素A2(TXA2)是一种前列腺素的代谢产物，在止血和心血管疾病的发生过程中均起到重要作用。TXA2有强烈的缩血管作用，还可通过结合血栓烷素血小板受体(TPR)激活血小板，促进其聚集，从而发挥促血栓形成作用。但是TXA2高度不稳定，会迅速被水解为较稳定的血栓烷素B2(thromboxane B2，TXB2)。TXB2随后在肝中被转化为半衰期更长的11-脱氢血栓烷素B2(11dhTXB2)，并经尿液排出。体外血小板激活会明显影响血清TXB2的测定结果，却对血清11dhTXB2水平无影响，因而测定血液11dhTXB2的含量能更有效的反映体内TXA2的产生。
目前，已报道的11dhTXB2的检测方法有放射性免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、气相色谱-串联质谱法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。市面上的商业化试剂盒多采用ELISA法测定，包括第一代基于多克隆抗体的ELISA试剂盒和第二代基于单克隆抗体的ELISA试剂盒，但第一代试剂盒已被停用。以上方法和试剂盒主要针对尿液样本，目前无报道使用LC-MS/MS检测血液中的11dhTXB2。LC-MS/MS是一种采用液相色谱分离、质谱检测的分析技术，具有高灵敏度、高特异性和高选择性的特点。采用固相萃取法可有效去除待测物干扰物并进行富集，以提高方法灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测血液中11-脱氢血栓烷B2的液相色谱-串联质谱方法和试剂盒。该方法先加入酸化剂调节血液pH，孵育一段时间后，采用特异性固相萃取材料，高效富集血液中的11-脱氢血栓烷B2(11dhTXB2)，有效去除血液中基质的干扰，实现对11-脱氢血栓烷B2(11dhTXB2)的精准检测。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种血液中11-脱氢血栓烷B2的精准检测试剂盒，其组成为：特异性固相萃取柱、内标液、校准液、稀释液、酸化剂、活化液、平衡液、淋洗液1和2、洗脱液和质控样本。
优选的所述特异性固相萃取柱是以硅胶为基质的含有苯基或C4～C18的正构烷基的亲和材料。
优选的所述校准液为用乙腈配制的9个浓度的溶液；其浓度范围为为0.5～100ng/mL。
优选的所述内标为11dhTxB2-d4，其浓度为5～50ng/mL。
优选的所述稀释液为PBS溶液。
优选的所述酸化剂为浓度为0.1～1.0mol/L盐酸水溶液。
优选的所述活化液为甲醇、乙腈或乙醇。
优选的所述平衡液、淋洗液1、淋洗液2为水和有机试剂的混合溶液，其体积比为(60～100)％：(40～0)％；所述有机试剂为甲醇、乙腈或乙醇。
优选的所述洗脱液为按体积比计含1％～10％甲酸的乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种。
一种用于检测血液中11-脱氢血栓烷B2(11dhTxB2)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)
方法，包括以下步骤：
(1)血液样本加入酸化剂，平衡10～30min；
(2)经酸化的血液样本于25℃～45℃孵育1h～4h后，加入内标液混合；
(3)特异性固相萃取柱经过活化、平衡后，加入离心好的血液样本上清液，使用淋洗液进行淋洗，最终用洗脱液洗脱并收集；
(4)将步骤(3)得到的洗脱液采用液相色谱串联质谱分析，通过校准液建立的校准曲线计算血液样本中11-脱氢血栓烷B2的含量。
优选的，步骤(4)中的色谱条件：色谱柱：Waters，Cortecs T3；柱温：40℃；进样室温度：10℃；进样量：5μL；流动相：(A)5mmol/L甲酸铵的水溶液，(B)乙腈溶液；梯度洗脱条件：
质谱条件：离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4500V；温度：500℃；雾化气GS1：55psi；辅助雾化气GS2：55psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；
注：*为定量离子。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的前处理方法，孵育过程可有效将11-脱氢血栓烷B2开环转化为闭环形式，并去除杂质，实现对人血液11-脱氢血栓烷B2的精准检测；
2、本发明提供的测定方法，操作简单可靠，分析时间短，有利于高通量测定临床样本；
3、本发明为首个基于液质方法的固相萃取法处理血液中11-脱氢血栓烷B2检测试剂盒，准确度高、特异性强，检测范围宽，易于临床推广和应用。
附图说明
图1为血液中11dhTxB2和11dhTxB2-d4的色谱图。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1：一种用于检测血液中11-脱氢血栓烷B2的试剂盒。
一种用于检测血液中11-脱氢血栓烷B2的试剂盒，其组成见下表：
| 名称 | 成分 |
| 固相萃取柱 | 特异性固相萃取柱 |
| 校准液 | 乙腈配制的9个浓度的11dhTxB2的校准品 |
| 稀释液 | PBS溶液 |
| 酸化剂 | 0.4mol/L盐酸 |
| 活化液 | 甲醇 |
| 平衡液 | 水 |
| 淋洗液1 | 水 |
| 淋洗液2 | 10％甲醇 |
| 洗脱液 | 3％甲酸甲醇 |
| 质控样本 | 2个浓度的11dhTxB2血液样本 |
| 内标液 | 浓度为10ng/mL的11dhTxB2-d4溶液 |
其中，校准液中11dhTxB2浓度见下表：
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 浓度ng/mL | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 20 | 40 | 75 | 100 |
实施例2一种用于检测血液中11-脱氢血栓烷B2的液相色谱-串联质谱方法
该发明的检测方法主要包括以下主要步骤：
1、基于试剂盒产品的11-脱氢血栓烷B2提取过程
(1)200μL血液样本加入100μL酸化剂，平衡20min；
(2)经酸化的血液样本于35℃孵育3h，加入20μL内标液混匀，震荡5分钟；
(3)特异性固相萃取柱(固相萃取材料是以硅胶为基质的含有C18的正构烷基，规格50mg/1mL)用300μL活化液活化、300μL平衡液平衡，加入上清液样本后，用300μL淋洗液1和淋洗液2进行淋洗，最终采用100μL洗脱液洗脱，收集。
2、液质分析条件
(1)检测设备：AB SCIEX Triple Quad 4500MD液相色谱串联质谱仪
(2)色谱条件：
色谱柱：Waters，Cortecs T3；柱温：40℃；进样室温度：10℃；进样量：5μL；流动
相：(A)5mmol/L甲酸铵的水溶液，(B)乙腈溶液；梯度洗脱条件：
(3)质谱条件：
离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4500V；温度：500℃；雾化气GS1：55psi；辅助雾化气GS2：55psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；
注：*为定量离子。
3、检测结果计算
采用校准曲线法计算血液中11-脱氢血栓烷B2的浓度。取20μL校准溶液加入180μL稀释液混合，按照步骤1中“基于试剂盒产品的11-脱氢血栓烷B2提取过程”项进行样品处理后，进行液质分析。根据各物质峰面积As和相应内标峰面积Ai的比值f(f＝As/Ai)对浓度C进行权重线性回归，拟合校准曲线，权重为1/C2(C为浓度值，单位：ng/mL)。血液中11-脱氢血栓烷B2同其内标测得的峰面积之比代入校准曲线，计算血液中11-脱氢血栓烷B2的浓度。
表1.LC-MS/MS法测定11-脱氢血栓烷B2结果分析
实施例3一种用于检测血液中11-脱氢血栓烷B2的液相色谱-串联质谱方法的准确度和精密度
基于试剂盒的检测方法的准确度和精密度评价实施方案如下：
采用添加低、中、高3个浓度的混合血浆样本作为待测样本，对3个浓度样本每批次各6份进行检测，测定3个批次，测定实施过程同实施例2，分别计算准确度、批内CV和批间CV，结果显示如下表，显示该方法具有优异的准确度和精密度性能。
表2方法的准确度和精密度性能
Claims (1)
1.一种使用试剂盒检测血液样本中11-脱氢血栓烷B2(11dhTxB2)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法，其特征在于：
所述试剂盒的组成：特异性固相萃取柱、内标液、校准液、稀释液、酸化剂、活化液、平衡液、淋洗液1和2、洗脱液和质控样本；
所述血液样本为血清或血浆；
所述特异性固相萃取柱是以硅胶为基质的含有C18的正构烷基的亲和材料；
所述校准液为用乙腈配制的9个不同浓度的溶液；浓度范围为0.5～100ng/mL；
所述内标液为10ng/mL 11dhTxB2-d4；
所述稀释液为PBS溶液；
所述酸化剂为浓度0.4mol/L盐酸水溶液；
所述活化液为甲醇；
所述平衡液、淋洗液1为水；
所述淋洗液2为10%甲醇；
所述洗脱液为按体积比计含3％甲酸的甲醇；
所述检测方法包括以下步骤：
(1) 200μL血液样本加入100μL酸化剂，平衡20min；
(2) 经酸化的血液样本于35℃孵育3h，加入20μL内标液混匀，震荡5分钟；
(3) 特异性固相萃取柱用300μL活化液活化、300μL平衡液平衡，加入上清液样本后，用300μL淋洗液1和淋洗液2进行淋洗，最终采用100μL洗脱液洗脱，收集；
(4) 将步骤(3)得到的洗脱液，采用液相色谱-串联质谱进行分析，通过校准液建立的校准曲线计算血液样本中11-脱氢血栓烷B2(11dhTxB2)的含量；
其中，步骤(4)中的色谱条件：色谱柱：Waters，Cortecs T3；柱温：40℃；进样室温度：10℃；进样量：5μL；流动相：(A)5mmol/L甲酸铵的水溶液，(B)乙腈溶液；梯度洗脱条件：
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注：为定量离子。
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| CN202211708924.8A Active CN115876935B (zh) | 2022-12-29 | 2022-12-29 | 一种用于检测血液中11-脱氢血栓烷b2的液相色谱-串联质谱方法和试剂盒 |
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Non-Patent Citations (4)
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| Comprehensive ultra-performance liquid chromatographic separation and mass spectrometric analysis of eicosanoid metabolites in human samples;Yan Wang等;Journal of Chromatography A;第1359卷;60–69 * |
| Quantitative liquid chromatography–tandem mass spectrometric analysis of 11-dehydro TXB2 in urine;Naoto Suzuki 等;Prostaglandins & other Lipid Mediators;第73卷;103–110 * |
| Radioimmunoassay for 11-dehydro-TXB2: a method for monitoring thromboxane production in vivo;M Kumlin 等;Prostaglandins;第32卷(第5期);741-767 * |
| Simultaneous determination of PUFA-derived pro-resolving metabolites and pathway markers using chiral chromatography and tandem mass spectrometry;Andy Toewe 等;Analytica Chimica Acta;第1031卷;185-194 * |
Also Published As
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