CN117630212A - 一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法 - Google Patents

一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117630212A
CN117630212A CN202311602663.6A CN202311602663A CN117630212A CN 117630212 A CN117630212 A CN 117630212A CN 202311602663 A CN202311602663 A CN 202311602663A CN 117630212 A CN117630212 A CN 117630212A
Authority
CN
China
Prior art keywords
standard
metabolites
catecholamine
internal standard
substances
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311602663.6A
Other languages
English (en)
Inventor
李龙
黄金昌
赵可辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bezhi Shanghai Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Bezhi Shanghai Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bezhi Shanghai Medical Technology Co ltd filed Critical Bezhi Shanghai Medical Technology Co ltd
Priority to CN202311602663.6A priority Critical patent/CN117630212A/zh
Publication of CN117630212A publication Critical patent/CN117630212A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/89—Inverse chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法，检测步骤包括：步骤101：制备至少三种浓度的混合标准溶液；步骤102：利用液相色谱‑质谱联用仪检测至少三种浓度的混合标准溶液，获得第一检测结果；步骤103：拟合标准曲线方程；步骤104：向待测样本中加入与混合标准溶液中相同量的内标物，取离心处理后的上清液作为待检样本；步骤105、利用液相色谱‑质谱联用仪检测待检样本，获得第二检测结果；步骤106、基于拟合的各个标准曲线方程和第二检测结果，计算获得待检样本中8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度。本发明能够更快速、更准确的检测各种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度。

Description

一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法
技术领域
本发明涉及一种含量检测方法，尤其涉及一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法。
背景技术
儿茶酚胺(CAs)类物质主要包括肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)。CAs是由肾上腺髓质、肾上腺神经元以及肾上腺外嗜铬体合成与分泌的单胺类神经递质，是具有较强的生理学活性的内源性物质，在大脑和神经信号传导中起着重要的作用。血浆和尿液中CAs及其代谢物水平与人体多种生理、病理现象有密切关系，不仅对人体的心血管系统、神经系统、内分泌系统、肾脏、平滑肌组织等的生理活动起着广泛的调节作用，还同时影响人体的代谢。
儿茶酚胺的代谢物主要包含甲氧基肾上腺素(Metanphrine，MN)、甲氧基去甲肾上腺素(Normetanephrine，NMN)、香草扁桃酸(Vanillylmandelic acid，VMA)和高香草酸(Homovanillic acid，HVA)。
MN及NMN(合称MNs)是E和NE的中间代谢产物，它们仅在肾上腺髓质和嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(pheochromocytoma and paraganglioma，PPGL)内代谢生成并且以高浓度水平持续存在，故是PPGL的特异性标记物。香草扁桃酸(vanillylmandelicacid，VMA)，为肾上腺素、去甲肾上腺素的主要终末代谢产物。嗜铬细胞瘤患者能够分泌大量的肾上腺素和去甲肾上腺素，其中大约60％将最终转化为VMA，随尿液排出体外。高香草酸(homovanillicacid，HVA)与VMA结构相似是体内单胺类神经递质多巴胺的终末代谢产物。
神经母细胞瘤患者体内可同时分泌过量的肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺，其代谢产物VMA和HVA通过肾脏排泄，在疾病早期即可升高。同时检测尿中VMA、HVA不仅可以间接反映体内儿茶酚胺的排泌情况，而且对嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤等中枢神经系统疾病的早期辅助诊断及鉴别有重要的意义。
目前随着研究的深入，人们对儿茶酚胺类物质和其代谢产物的代谢、调节及其生理功能和病理作用的关注度得到提高，如何建立一种快速、准确的各种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的测定方法具有非常重要的研究价值和临床意义。
发明内容
为了解决上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法。
为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：一种检测儿茶氨酚类物质及其代谢产物含量的方法，所检测的儿茶酚胺类物质和其代谢产物包括8种，分别为：多巴胺DA、肾上腺素E、去甲肾上腺素NE、甲养基肾上腺素MN、甲氧基去甲肾上腺素NMN、3-甲氧酪胺3-MT、高香草酸HVA、香草扁桃酸VMA；
检测步骤包括：
步骤101：制备至少三种浓度的混合标准溶液，混合标准溶液指的是具有上述8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物与内标物的混合溶液，即每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物制备至少三种浓度的混合标准溶液；至少三种浓度的混合标准溶液中内标物的浓度需保持相同；
步骤102：利用液相色谱-质谱联用仪在预设的检测条件下，分别检测每一种混合标准溶液，获得至少三种浓度的混合标准溶液分别对应的第一检测结果；
步骤103：根据各个第一检测结果、混合标准溶液中的内标物与各种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度，分别拟合每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物分别对应的标准曲线方程；
步骤104：向待测样本中加入与混合标准溶液中相同量的内标物，混合均匀后高速离心处理，取离心处理后的上清液作为待检样本；
步骤105、利用液相色谱-质谱联用仪在步骤102相同的检测条件下检测待检样本，获得待检样本对应的第二检测结果；
步骤106、基于拟合的各个标准曲线方程和第二检测结果，计算获得待检样本中8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度。
优选地，选用的内标物为：DA对应的内标物为DA-D4、E对应的内标物为E D5、NE对应的内标物为NE D4、MN对应的内标物为MN D4、NMN对应的内标物为NMN D5、3-MT对应的内标物为3-MT D4、HVA对应的内标物为HVA D4、VMA对应的内标物为VMA D4。
优选地，液相色谱-质谱联用仪检测条件中的色谱条件，包括：
采用C18反相色谱柱，柱温为35-60℃，流速为0.2-0.6mL/min；
采用梯度洗脱，流动相A相为5-10mmol/L乙酸铵水溶液，B相为甲醇：乙腈＝1:1(v/v)，梯度洗脱程序为：
初始时，流动相A与流动相B的体积比为95:5；
0.6min时，流动相A与流动相B的体积比为95:5；
2.0min时，流动相A与流动相B的体积比为40:60；
2.5min时，流动相A与流动相B的体积比为1:99；
3.5min时，流动相A与流动相B的体积比为1:99；
3.6min时，流动相A与流动相B的体积比为95:5。
优选地，液相色谱-质谱联用仪检测条件中的质谱条件，包括：
采用大气压电喷雾电离源ESI，正负离子扫描模式，多反应监测，离子源温度为100-150℃，雾化气温度为250-500℃，雾化气流速为500-1000L/h，锥孔气为0-40L/h。
优选地，制备至少三种浓度的混合标准溶液的过程包括：
1.1)分别称取8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的标准品，并分别利用甲醇溶解，得到每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物分别对应的目标物标准储备液；
1.2)按照不同的比例混合8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的标准储备液，并分别利用稀释液进行稀释，得到至少三种不同浓度的标曲混合工作液；
1.3)分别称取8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物对应的内标物的标准品，并利用甲醇溶解，得到内标物的内标标准储备液；
1.4)移取内标标准储备液，利用稀释液对移取的所述内标标准储备液进行稀释，得到内标工作液；
1.5)分别移取相同体积的每一种标曲混合工作液，向移取的每一种标曲混合工作液中加入相同量的内标工作液和稀释液，并分别在1500-2000rpm转速下涡旋混匀5-20min，将涡旋后的上清液作为混合标准溶液。
优选地，稀释液包括：5％的甲醇-乙腈和95％的5-10mmol/L乙酸铵水溶液，其中，甲醇-乙腈的体积比为1：1；具体地，可将洗脱溶剂的A相和B相的洗脱初始浓度作为稀释目标物标准储备液以及内标标准储备液的稀释液，以减少干扰。
优选地，在向待测血液或者尿样样本中加入与混合标准溶液中相同量的内标物之后，再进行高速离心处理，取离心处理后的上清液作为待检样本之前，对待检样本进行了处理，具体有：
2.1)向待测血液或者尿样样本中加入沉淀蛋白试剂；
2.2)进行高速离心处理，取离心处理后的上清液作为待检样本，包括：在1500-2000rpm的转速下涡旋混合2-10min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，移取离心后的上清液，作为待检样本。
优选地，沉淀蛋白试剂采用乙腈，乙腈与待测血液样本的体积比为3:1-10:1。
优选地，每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物分别对应的标准曲线方程均具有两个变量，分别为：儿茶酚胺类物质及其代谢产物的色谱峰面积与儿茶酚胺类物质和其代谢产物对应的内标物的色谱峰面积的比值，以及儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度。
本发明公开了一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法，提供了检测血液或者尿液中儿茶酚胺类物质和其代谢产物含量的方法，将内标法与高效液相色谱串联质谱联用法相结合，该方法以蛋白沉淀进行前处理，前处理方法简单，缩短了样品处理时间，同时利用质谱技术多反应监测的优势，使干扰因素大大减少，特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，同时分析时间短。
附图说明
图1为本发明的检测方法流程示意图。
图2为实施例中混合标准溶液中8种儿茶酚胺类物质及其代谢产物的图谱。
图3为实施例中混合标准溶液中内标物的图谱。
图4为实施例中待测样本中8种儿茶酚胺类物质及其代谢产物的图谱。
图5为实施例中待测样本中内标物的图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明将内标法与高效液相色谱串联质谱联用法相结合，实现检测样本(血液或尿液)中8种儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的测定，所能够检测的8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物包括：多巴胺DA、肾上腺素E、去甲肾上腺素NE、甲养基肾上腺素MN、甲氧基去甲肾上腺素NMN、3-甲氧酪胺3-MT、高香草酸HVA、香草扁桃酸VMA。
优选地，对应上述8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的内标物选择包括但不限于：DA对应的内标物为DA-D4、E对应的内标物为E D5、NE对应的内标物为NE D4、MN对应的内标物为MN D4、NMN对应的内标物为NMN D5、3-MT对应的内标物为3-MT D4、HVA对应的内标物为HVA D4、VMA对应的内标物为VMA D4。
如图1所所示，为本发明实施例所提供的检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法，检测步骤包括：
步骤101：制备至少三种浓度的混合标准溶液，混合标准溶液指的是具有上述8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物与内标物的混合溶液，即每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物制备至少三种浓度的混合标准溶液；至少三种浓度的混合标准溶液中内标物的浓度需保持相同；
步骤102：利用液相色谱-质谱联用仪在预设的检测条件下，分别检测每一种混合标准溶液，获得至少三种浓度的混合标准溶液分别对应的第一检测结果；
步骤103：根据各个第一检测结果、混合标准溶液中的内标物与各种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度，分别拟合每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物分别对应的标准曲线方程；
步骤104：向样本(血液或尿液)中加入与混合标准溶液中相同量的内标物，混合均匀后高速离心处理，取离心处理后的上清液作为待检样本；
步骤105、利用液相色谱-质谱联用仪在步骤102相同的检测条件下检测待检样本，获得待检样本对应的第二检测结果；
步骤106、基于拟合的各个标准曲线方程和第二检测结果，计算获得待检样本中8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度。
其中，液相色谱-质谱联用仪检测条件中的色谱条件，包括：
采用C18反相色谱柱，柱温为35-60℃，流速为0.2-0.6mL/min；
采用梯度洗脱，流动相A相为5-10mmol/L乙酸铵水溶液，B相为甲醇：乙腈＝1:1(v/v)，梯度洗脱程序参数如表所示，给出了洗脱时间及对应的体积比：
时间min A相 B相
0.0 95 5
0.6 95 5
2.0 40 60
2.5 1 99
3.5 1 99
3.6 95 5
采用梯度洗脱可以更好的分离待测样本(血液或尿液)中的8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物，以便基于儿茶酚胺类物质和其代谢产物和对应的内标物的色谱峰面积及儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度，确定待测血液样本中的8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物分别对应的浓度。
优选地，液相色谱-质谱联用仪检测条件中的质谱条件，包括：
采用大气压电喷雾电离源ESI，正负离子扫描模式，多反应监测，离子源温度为100-150℃，雾化气温度为250-500℃，雾化气流速为500-1000L/h，锥孔气为0-40L/h。
需说明的是，所述的浓度范围、流速范围、温度范围等指的是数值范围区间内的任一数值。
优选地，制备至少三种浓度的混合标准溶液的过程包括：
1.1)分别称取8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的标准品，并分别利用甲醇溶解，得到每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物分别对应的目标物标准储备液；
1.2)按照不同的比例混合8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的标准储备液，并分别利用稀释液进行稀释，得到至少三种不同浓度的标曲混合工作液；
1.3)分别称取8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物对应的内标物的标准品，并利用甲醇溶解，得到内标物的内标标准储备液；
1.4)移取内标标准储备液，利用稀释液对移取的所述内标标准储备液进行稀释，得到内标工作液；
1.5)分别移取相同体积的每一种标曲混合工作液，向移取的每一种标曲混合工作液中加入相同量的内标工作液和稀释液，并分别在1500-2000rpm转速下涡旋混匀5-20min，将涡旋后的上清液作为混合标准溶液。
具体地，在分别对8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的标准品进行溶解时，可利用与8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的标准品的体积比为0.7：1-1:1的甲醇溶解，以使最大程度利用少量溶剂充分溶解8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的标准品，并且甲醇溶剂作为常规溶剂，利用甲醇溶剂作为溶解剂可简化8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的溶解操作。同样地，对于内标物的标准品来说，也可利用与内标物的标准品的体积比为0.7：1-1:1的甲醇溶解，以简化内标物的标准品的溶解操作。
为了便于计算待测血液样本中的儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度，可向各个浓度不同的标曲混合工作液中加入相同量的内标工作液和稀释液，以得到符合液质联用仪测试浓度的溶液，然后再进行涡旋处理，将上清液作为混合标准溶液，以去除内标工作液、标曲混合工作液和稀释液中的微量杂质，避免影响测试的准确性。
需要说明的是，当内标物为多种时，可利用甲醇分别对内标物的标准品进行溶解。
优选地，稀释液包括：5％的甲醇-乙腈和95％的5-10mmol/L乙酸铵水溶液，其中，甲醇-乙腈的体积比为1：1；具体地，可将洗脱溶剂的A相和B相的洗脱初始浓度作为稀释目标物标准储备液以及内标标准储备液的稀释液，以减少其他试剂的干扰。
优选地，在向待测血液或者尿样样本中加入与混合标准溶液中相同量的内标物之后，再进行高速离心处理，取离心处理后的上清液作为待检样本之前，对待检样本进行了处理，具体有：
2.1)向待测血液或者尿样样本中加入沉淀蛋白试剂；
2.2)进行高速离心处理，取离心处理后的上清液作为待检样本，包括：在1500-2000rpm的转速下涡旋混合2-10min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，移取离心后的上清液，作为待检样本。
具体地，为了避免待测用户的血液或者尿液中中的纤维蛋白原等成分影响儿茶酚胺类物质和其代谢产物测试的准确性，可先对从人体采集的血液或者尿液样本进行处理，如，先取待检测血液或者尿液至少2mL，在3500rpm转速下离心10min，将上清液作为待测血液或者尿液样本。然后再加入沉淀蛋白试剂，对待测血液或者尿液样本中的蛋白质进行沉淀。
优选地，沉淀蛋白试剂采用乙腈，乙腈与待测血液样本的体积比为3:1-10:1，以使更好地沉淀待测血液或者尿液中的蛋白质，以减少其他物质对待测血液或者尿液样本中的儿茶酚胺类物质和其代谢产物的检测。
优选地，每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物分别对应的标准曲线方程均具有两个变量(坐标X轴和Y轴)，分别为：儿茶酚胺类物质及其色谱峰面积与儿茶酚胺类物质和其代谢产物对应的内标物的色谱峰面积的比值，以及儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度。
具体地，DA对应的标准曲线方程的两个变量分别为：DA的色谱峰面积与DA对应的内标物的色谱峰面积的比值，以及DA的浓度，以此类推，其它7个不再赘述。
将待测血液或者尿样样本中目标物的色谱峰面积代入标准曲线方程中，即可计算得到待测血液或者尿液样本中目标物的浓度。
由于待测血液或者尿液样本处理过程以及检测误差，使得上述基于标准目标物的色谱峰面积与标准目标物的浓度构建出的标准曲线方程存在一定的偏差。那么，基于该标准曲线方程计算出的待测血液或尿液样本中的目标物浓度也会存在偏差。
较优选地，检测方法中使用的液相色谱质谱联用仪检测过程还可以为，以目标物的色谱峰面积和内标物的色谱峰面积的比值为第一自变量，目标物的浓度为第二自变量，通过至少三组(第一自变量和第二自变量)进行线性回归拟合标准曲线方程，再将待测血液样本内的目标物(即上述8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物)的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，代入上述标准曲线方程中，可以得到待测血液或者尿液样本中待测血液或者尿液样本的目标物浓度。上述标准目标物和待测血液样本中的目标物均为DA、E、NE、MN、NMN、3-MT、HVA、VMA。
综上可知，本发明提供了检测血液或者尿液中儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法，将内标法与高效液相色谱串联质谱联用法相结合，该方法以蛋白沉淀进行前处理，前处理方法简单，缩短了样品处理时间，同时利用质谱技术多反应监测的优势，使干扰因素大大减少，特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，同时分析时间短。
【实施例】
下面结合具体的实施操作，对本发明的检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法作进一步详细说明。
一、混合标准溶液的制备
首先分别称取8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的标准品，并分别利用甲醇溶解，得到每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物分别对应的目标标准储备液；
按照不同的比例混合8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的标准储备液，并分别利用稀释液(5％的甲醇-乙腈：95％的5mM乙酸铵水溶液)进行稀释，得到七种不同浓度的标曲混合工作液，并在-80至-20℃下保存，以备用。其中，每种标曲混合工作液中有8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的标准储备液。
分别称取所述8种内标物的标准品，并利用甲醇溶解，得到内标物的内标标准储备液，并在-4℃下保存，其中，内标物的标准品分别为DA D4、E D5、NE D4、MN D4、NMN D5、3-MTD4、HVA D5、VMA D7。
按照预设量分别移取每一种标准储备液，并用5％的甲醇-乙腈：95％的5mM乙酸铵水溶液进行稀释，得到2μg/mL内标工作液，-20℃保存待用。
针对七种不同浓度标曲混合工作液中的每一种标曲混合工作液，用移液器移取10μL的标曲混合工作液和10μL内标工作液分别置于离心管中，再移取加入80μL的5％的甲醇-乙腈：95％的5mM乙酸铵水溶液进行稀释，并在1500-2000rpm转速下涡旋混匀2-10min后，移取离心后的上清液作为混合标准溶液。
其中，8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的混合标准溶液如下述表1所示，标准曲线浓度信息如下述表2和表3所示：
表1
表2血儿茶酚胺类物质及其代谢产物的浓度(ng/mL)
名称 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7
DA 0.025 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6
E 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2
NE 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2
MN 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2
NMN 0.025 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6
3-MT 0.025 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6
HVA 10 20 40 80 160 320 640
VMA 10 20 40 80 160 320 640
表3尿儿茶酚胺类物质及其代谢产物的浓度(ng/mL)
名称 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7
DA 5 10 20 40 80 160 320
E 1 2 4 8 16 32 64
NE 1 2 4 8 16 32 64
MN 5 10 20 40 80 160 320
NMN 10 20 40 80 160 320 640
3-MT 5 10 20 40 80 160 320
HVA 500 1000 2000 4000 8000 16000 32000
VMA 500 1000 2000 4000 8000 16000 32000
利用高效液相串联质谱仪分别对七种不同浓度的混合标准溶液进行检测得到七种不同浓度的DA、E、NE、MN、NMN、3-MT、HVA、VMA和内标物的标准溶液的色谱图。
从上述每种浓度的标准溶液的色谱图中分别得到DA、E、NE、MN、NMN、3-MT、HVA、VMA的色谱峰面积和对应的内标物的色谱峰面积。
分别以上述七个不同浓度的DA、E、NE、MN、NMN、3-MT、HVA、VMA的色谱峰面积与对应的内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标yi。
以上述七个不同浓度的DA、E、NE、MN、NMN、3-MT、HVA、VMA的浓度作为标准曲线方程的横坐标xi(i＝1,2,3，……8)。
将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到DA、E、NE、MN、NMN、3-MT、HVA、VMA分别对应的标准曲线方程为yi＝ai*xi+bi(i＝1,2,3，……8，并且得系数ai和bi(i＝1,2,3，……8)，其中，ai为yi对应的标准曲线方程的斜率，bi为yi对应的标准曲线方程的截距。
二、采集的样本的预处理
取待检测血液或尿液样品知识2ml，在3500rpm转速下离心10min，取上清液作为待测血液或者尿液样本，并将待测血液或者尿液样本置于-80℃--20℃冷冻下保存至分析前备用。
三、待测样本的处理
用移液枪取20uL(一)中的内标工作液于2mL的离心管中，然后加入100-300μL(二)中的待测血液或尿液样本，再加入3倍-10倍待测血液或尿液样本的体积的沉淀蛋白试剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合2-10min后，在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，移取一定量的离心后上清液至干净的1.5mL离心管中，将上清液作为待检样本。
四、高效液相串联质谱仪对待检样本的检测
使用高效液相串联质谱仪对(三)中的待测样品进行检测，得到上述待测样品的共8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物和内标物的色谱图，从上述8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物和内标色谱图中可以得到合8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物色谱峰面积与内标物色谱峰面积，将8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物色谱峰面积与相应内标物色谱峰面积的比值yi代入(一)中对应的标准曲线方程yi＝ai*xi+bi(i＝1,2,3，……8)中，通过计算得到待检测样品中的合8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度xi(i＝1,2,3，……8)。
五、高效液相串联质谱仪的检测条件
(一)和(四)中的液相条件均为：
所采用的色谱柱：岛津公司的Shim-pack Velox SP-C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；
洗脱条件：流动相A相为5mmol/L乙酸铵水溶液；B相-甲醇：乙腈＝1：1(v/v)，梯度洗脱；
分析时间：4-10min；柱温：35-60℃；进样量：5-20μL；流速：0.4-0.6mL/min。
梯度洗脱程序如下述表4所示：
表4洗脱程序
(一)和(四)中的串联质谱条件均为：
采用大气压电喷雾电离源ESI，正负离子扫描模式，多反应监测模式，离子源温度为100-150℃，雾化气温度为250-500℃，雾化气流速为500-1000L/h，锥孔气为0-40L/h。
液相色谱-质谱联用仪中的质谱仪的参数如下述表5所示：
表5液相色谱质谱联用仪中的质谱仪的参数
六、检测的方法的线性关系和定量限
移取8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的混合标准溶液，加入20μl的内标工作液，按本实施例处理及测定条件进行测定，以定量离子色谱和内标的峰面积比-浓度作图，得到标准曲线，结果表明8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的线性范围和定量限如下表6和表7所示：
表6血儿茶酚胺类物质和其代谢产物的线性范围和定量限
表7尿儿茶酚胺类物质和其代谢产物的线性范围和定量限
七、检测方法的回收率和精密度验证
在待检样本中分别添加低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液，按本实施例方法进行测定，空白对照样本及每个浓度水平加标样本重复3个批次，进样分析，计算方法的加标回收率和精密度。结果如下述表8至表10所示，结果显示，儿茶酚胺类物质和其代谢产物回收率良好，在85％-115％以内，RSD<10％，精密度良好。
表8
表9
化合物水平2 加标量(ng/ml) 回收率％ 相对标准偏差％
DA-血 0.2 93.2 3.2
DA-尿 40 95.3 4.1
E-血 0.4 91.1 5.3
E-尿 8 101.4 3.3
NE-血 0.4 105.2 2.6
NE-尿 8 92.6 3.9
MN-血 0.4 95.3 4.4
MN-尿 40 94.3 3.2
NMN-血 0.2 93.5 5.3
NMN-尿 40 112.2 6.2
3-MT-血 0.2 105.4 4.6
3-MT-尿 40 93.2 3.5
HVA-血 80 101.3 3.7
HVA-尿 4000 94.9 3.4
VMA-血 80 102.1 4.8
VMA-尿 4000 102.3 3.7
表10
综合上述验证试验，本实施例的回收率、检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，方法同时检测人血清/血浆或者尿液中的8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。
如图2所示，为混合标准溶液中的8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物DA、E、NE、MN、NMN、3-MT、HVA、VMA的图谱。
其中，上述8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的保留时间如表11所示：
表11儿茶酚胺类物质和其代谢产物的保留时间
化合物 保留时间
DA 2.62
E 2.57
NE 2.40
MN 2.46
NMN 2.25
3-MT 2.53
HVA 1.57
VMA 1.65
图3为混合标准溶液中的内标物DA-D4、E-D5、NE-D4、MN-D4、NMN-D5、3-MT-D4、HVA-D5、VMA-D7的图谱。
其中，上述8种内标物的保留时间如表12所示：
表12内标物的保留时间
化合物 保留时间
DA-D4 2.62
E-D5 2.57
NE-D4 2.40
MN-D4 2.46
NMN-D5 2.25
3-MT-D4 2.53
HVA-D5 1.57
VMA-D7 1.65
具体地，图2至图5中的横坐标均为采集时间，纵坐标均为离子信号强度。
在本实施例中，由图2和图4可见，待测样本中的8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的保留时间与混合标准溶液中对应的儿茶酚胺类物质和其代谢产物的保留时间一致，该方法以同位素标记物为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特性强、准确度和灵敏度高。同样地，由图3和图5可见，待测样本中的8种内标物的保留时间与混和标准溶液中对应的内标物的保留时间一致。
上述实施方式并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法，其特征在于：所检测的儿茶酚胺类物质和其代谢产物包括8种，分别为：多巴胺DA、肾上腺素E、去甲肾上腺素NE、甲养基肾上腺素MN、甲氧基去甲肾上腺素NMN、3-甲氧酪胺3-MT、高香草酸HVA、香草扁桃酸VMA；
检测步骤包括：
步骤101：制备至少三种浓度的混合标准溶液，混合标准溶液指的是具有上述8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物与内标物的混合溶液，即每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物制备至少三种浓度的混合标准溶液；至少三种浓度的混合标准溶液中内标物的浓度需保持相同；
步骤102：利用液相色谱-质谱联用仪在预设的检测条件下，分别检测每一种混合标准溶液，获得至少三种浓度的混合标准溶液分别对应的第一检测结果；
步骤103：根据各个第一检测结果、混合标准溶液中的内标物与各种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度，分别拟合每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物分别对应的标准曲线方程；
步骤104：向待测样本中加入与混合标准溶液中相同量的内标物，混合均匀后高速离心处理，取离心处理后的上清液作为待检样本；
步骤105、利用液相色谱-质谱联用仪在步骤102相同的检测条件下检测待检样本，获得待检样本对应的第二检测结果；
步骤106、基于拟合的各个标准曲线方程和第二检测结果，计算获得待检样本中8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测儿茶氨酚类物质及其代谢产物含量的方法，其特征在于：选用的内标物为：DA对应的内标物为DA-D4、E对应的内标物为E D5、NE对应的内标物为NED4、MN对应的内标物为MN D4、NMN对应的内标物为NMN D5、3-MT对应的内标物为3-MT D4、HVA对应的内标物为HVA D4、VMA对应的内标物为VMA D4。
3.根据权利要求1所述的检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法，其特征在于：液相色谱-质谱联用仪检测条件中的色谱条件，包括：
采用C18反相色谱柱，柱温为35-60℃，流速为0.2-0.6mL/min；
采用梯度洗脱，流动相A相为5-10mmol/L乙酸铵水溶液，B相为甲醇：乙腈＝1:1(v/v)，梯度洗脱程序为：
初始时，流动相A与流动相B的体积比为95:5；
0.6min时，流动相A与流动相B的体积比为95:5；
2.0min时，流动相A与流动相B的体积比为40:60；
2.5min时，流动相A与流动相B的体积比为1:99；
3.5min时，流动相A与流动相B的体积比为1:99；
3.6min时，流动相A与流动相B的体积比为95:5。
4.根据权利要求3所述的检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法，其特征在于：液相色谱-质谱联用仪检测条件中的质谱条件，包括：
采用大气压电喷雾电离源ESI，正负离子扫描模式，多反应监测，离子源温度为100-150℃，雾化气温度为250-500℃，雾化气流速为500-1000L/h，锥孔气为0-40L/h。
5.根据权利要求1所述的检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法，其特征在于：制备至少三种浓度的混合标准溶液的过程包括：
1.1)分别称取8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的标准品，并分别利用甲醇溶解，得到每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物分别对应的目标物标准储备液；
1.2)按照不同的比例混合8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物的标准储备液，并分别利用稀释液进行稀释，得到至少三种不同浓度的标曲混合工作液；
1.3)分别称取8种儿茶酚胺类物质和其代谢产物对应的内标物的标准品，并利用甲醇溶解，得到内标物的内标标准储备液；
1.4)移取内标标准储备液，利用稀释液对移取的所述内标标准储备液进行稀释，得到内标工作液；
1.5)分别移取相同体积的每一种标曲混合工作液，向移取的每一种标曲混合工作液中加入相同量的内标工作液和稀释液，并分别在1500-2000rpm转速下涡旋混匀5-20min，将涡旋后的上清液作为混合标准溶液。
6.根据权利要求5所述的检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法，其特征在于：稀释液包括：5％的甲醇-乙腈和95％的5-10mmol/L乙酸铵水溶液，其中，甲醇-乙腈的体积比为1：1；具体地，可将洗脱溶剂的A相和B相的洗脱初始浓度作为稀释目标物标准储备液以及内标标准储备液的稀释液，以减少干扰。
7.根据权利要求1所述的检测儿茶氨酚类物质及其代谢产物含量的方法，其特征在于：在向待测血液或者尿样样本中加入与混合标准溶液中相同量的内标物之后，再进行高速离心处理，取离心处理后的上清液作为待检样本之前，对待检样本进行了处理，具体有：
2.1)向待测血液或者尿样样本中加入沉淀蛋白试剂；
2.2)进行高速离心处理，取离心处理后的上清液作为待检样本，包括：在1500-2000rpm的转速下涡旋混合2-10min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，移取离心后的上清液，作为待检样本。
8.根据权利要求8所述的检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法，其特征在于：所述沉淀蛋白试剂采用乙腈，乙腈与待测血液样本的体积比为3:1-10:1。
9.根据权利要求1所述的检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法，其特征在于：每一种儿茶酚胺类物质和其代谢产物分别对应的标准曲线方程均具有两个变量，分别为：儿茶酚胺类物质及其代谢产物的色谱峰面积与儿茶酚胺类物质和其代谢产物对应的内标物的色谱峰面积的比值，以及儿茶酚胺类物质和其代谢产物的浓度。
CN202311602663.6A 2023-11-28 2023-11-28 一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法 Pending CN117630212A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311602663.6A CN117630212A (zh) 2023-11-28 2023-11-28 一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311602663.6A CN117630212A (zh) 2023-11-28 2023-11-28 一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117630212A true CN117630212A (zh) 2024-03-01

Family

ID=90035147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311602663.6A Pending CN117630212A (zh) 2023-11-28 2023-11-28 一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117630212A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111175394B (zh) 一种液相色谱串联质谱检测血浆儿茶酚胺及其代谢物的方法
CN111398450A (zh) 超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中8种儿茶酚胺及其代谢物的试剂盒
CN108469479A (zh) 液相色谱-串联质谱法测定血浆中格列吡嗪浓度的方法
CN111766311A (zh) 一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗结核病药物的方法
CN112730706A (zh) 一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法
CN111458417B (zh) 联合检测待测样品中多种抗生素的方法及试剂盒
CN116773693A (zh) 液相色谱串联质谱法检测血液中11种抗高血压药物及1种代谢产物的方法及应用
CN115902048A (zh) 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法
CN113917007A (zh) 检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒及测试方法
CN113820424A (zh) 一种同时测定人血浆中14种抗抑郁药浓度的hplc-ms/ms方法
CN117250288A (zh) 一种血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法和应用
CN117368347A (zh) 一种同时测定血浆中原发性醛固酮增多症分型标志物的液相色谱-串联质谱法
CN111398448A (zh) 超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中8种儿茶酚胺及其代谢物的方法
CN111103384A (zh) 一种液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法
CN117630212A (zh) 一种检测儿茶酚胺类物质及其代谢产物含量的方法
CN116893241A (zh) 一种同时检测多种水溶性维生素的方法及方法的应用
CN114609265B (zh) 一种液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物的方法
CN112305134B (zh) 曲唑酮的检测方法
CN114624361A (zh) 同时测定人血浆中别嘌醇和氧别嘌醇浓度的方法
CN113866315A (zh) 液质联用技术检测大鼠血浆yg-18血药浓度的定量分析方法
CN114544796A (zh) 一种液相质谱联用测定血浆中司替戊醇的方法
CN113109493A (zh) 一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法
CN112213417A (zh) 一种检测干血斑中霉酚酸药物浓度的试剂盒及检测方法
CN117929585B (zh) 分步内标法检测干血斑中的神经递质
CN118501276A (zh) 一种同时检测人血浆中敌草快及其人体代谢物含量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination