CN116773693A - 液相色谱串联质谱法检测血液中11种抗高血压药物及1种代谢产物的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物检测技术领域，主要涉及一种液相色谱串联质谱法检测血液中11种抗高血压药物及1种代谢产物的方法及应用。其中，抗高血压药物及代谢产物为洛沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦、美托洛尔、比索洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔、普萘洛尔和洛沙坦羧酸；检测方法包括：制备标准曲线方程，处理得到待测样品，使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样本进行检测，将检测结果代入标准曲线方程，计算获得待测样本中抗高血压药物及代谢产物的浓度。本发明检测方法重现性良好，回收率高，检测结果准确度高，检测过程简便快速，成本低，分析时间短，适于大通量样本的检测。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测技术领域，主要涉及一种液相色谱串联质谱法检测血液中11种抗高血压药物及1种代谢产物的方法及应用。
背景技术
高血压是全世界发病率和死亡率的一个主要风险因素。人群高血压患病率随年龄增加而显著增高。
常用降压药物包括钙通道阻滞剂(CCB)、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体拮抗剂ARB、利尿剂和β受体阻滞剂五类，以及由上述药物组成的固定配比复方制剂。血管紧张素受体Ⅱ拮抗剂(ARBs)，通过拮抗1型血管紧张素II受体而发挥降压作用。此类药物包括洛沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦和坎地沙坦等。β受体阻滞剂主要通过抑制过度激活的交感神经活性、抑制心肌收缩力、减慢心率发挥降压作用，这类药物包括普萘洛尔、阿替洛尔、美托洛尔、比索洛尔、倍他洛尔等。
通过改变生活方式并服用抗高血压药物，不能实现对血压有效控制的病症，称为不受控制的高血压。不受控制的高血压，可由药物依从性差和、或药代动力学和药效学变化有关的不充分的药理治疗引起。在有关研究报告中显示，在所有高血压患者中，有23％～66％比例的患者不坚持/部分坚持服用处方药。
血清/血浆中的药物浓度分析具有较短的检测窗。药物在血清/血浆中的浓度，与降压效果密切相关。采用LC-MS/MS测量高血压患者血清/血浆中的抗高血压药物，不仅能够帮助医生判断患者的药物依从性，还能够根据服药效果及时调整方案。
发明内容
为解决抗高血压药物检测窗口短，并且能够为医生调整医治方案等技术问题，本发明提供了一种液相色谱串联质谱法检测血液中11种抗高血压药物及1种代谢产物的方法及应用。
本发明提供了一种液相色谱串联质谱法检测血液中11种抗高血压药物及1种代谢产物的方法，抗高血压药物及代谢产物为洛沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦、美托洛尔、比索洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔、普萘洛尔和洛沙坦羧酸；至少包括以下步骤：
S1、制备标准曲线方程，包括：
S11、配制梯度浓度的混合标准工作液、混合内标工作液；混合标准工作液中含有抗高血压药物和代谢产物的标准品，混合内标工作液中含有12种同位素内标的标准品；
S12、将混合标准工作液和混合内标工作液混合，进行标准工作液前处理，得到标准溶液待测液，利用高效液相色谱质谱联用仪对标准溶液待测液进行检测，获得标准曲线方程；
标准品前处理包括：混合标准工作液和混合内标工作液混合，加入水I，混匀，加入蛋白沉淀剂混匀，取混合液加入水II稀释，得到标准溶液待测液；
S2、处理待测样品，包括：取待测血液样本加入混合内标工作液，经样本前处理后得到待测样本待测液；
样本前处理包括：待测血液样本加入混合内标工作液，加入蛋白沉淀剂，混匀、离心，取上清液加入水稀释，得到待测样本待测液；
S3、检测待测样品待测液，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样本待测液进行检测，将检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中抗高血压药物及代谢产物的浓度。
本发明提供了上述方法在监测11种抗高血压药物及1种代谢产物血药浓度中的应用，抗高血压药物及代谢产物为洛沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦、美托洛尔、比索洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔、普萘洛尔和洛沙坦羧酸。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明的检测方法用于检测血液中11种抗高血压药物及1种代谢物的含量。结果显示，本方法的回收率高、重现性好，保证了检测结果的准确度。
待测样本经蛋白沉淀稀释后直接进样，无需液液萃取，氮吹复溶等繁琐操作，前处理过程简便快速，检测成本低，分析时间短，适于样本的高通量检测。
附图说明
图1为Polar C18色谱柱检测血浆样本的色谱图；
图2为T3色谱柱检测血清样本的色谱图；
图3为进样量为1μL时，阿替洛尔的色谱图；
图4为进样量为10μL时，阿替洛尔的色谱图；
图5为上清液与水的体积比为1：1时，阿替洛尔的色谱图；
图6为上清液与水的体积比为1：2时，阿替洛尔的色谱图；
图7为上清液与水的体积比为1：3时，阿替洛尔的色谱图；
图8为采用乙腈进行蛋白沉淀时，阿替洛尔的色谱图；
图9为上清液不稀释时，阿替洛尔的色谱图；
图10为上清液与水的体积比为2：1时，阿替洛尔的色谱图。
具体实施方式
为清楚地理解本发明的目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例提出一种液相色谱串联质谱法检测血液中11种抗高血压药物及1种代谢产物的方法，抗高血压药物为洛沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦、美托洛尔、比索洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔和普萘洛尔，洛沙坦的代谢产物为洛沙坦羧酸。本发明实施例可以同时对上述抗高血压药物及代谢产物进行定量检测，前处理过程简便快速，不需要液液萃取，也不需要氮吹复溶，单一样本可以在20min内完成，可以同时处理多个样本，从而显著缩短了分析时间，适于大通量样本的检测。本发明实施例在研究中发现，由于洛沙坦羧酸和缬沙坦存在离子串扰，需要实现色谱分离，因此对于流动相和梯度条件进行了优化，提出的检测方法至少包括以下步骤：
S1、制备标准曲线方程，包括：
S11、配制梯度浓度的混合标准工作液、混合内标工作液；混合标准工作液中含有抗高血压药物和代谢产物的标准品，混合内标工作液中含有12种同位素内标的标准品；
其中，抗高血压药物和代谢产物的标准品包括：洛沙坦钾、缬沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦、酒石酸美托洛尔、富马酸比索洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔、盐酸普萘洛尔和洛沙坦羧酸；12种同位素内标的标准品包括：洛沙坦-D4、缬沙坦-D9、厄贝沙坦-D4、坎地沙坦-D4、替米沙坦-D3、奥美沙坦-D4、美托洛尔-D7半酒石酸盐、倍他洛尔-D7盐酸盐、比索洛尔-D7半富马酸盐、阿替洛尔-D7和普萘洛尔-D5和洛沙坦羧酸-D4；
S12、将混合标准工作液和混合内标工作液混合，进行标准工作液前处理，得到标准溶液待测液，利用高效液相色谱质谱联用仪对标准溶液待测液进行检测，获得标准曲线方程；
S2、处理待测样品，包括：取待测血液样本加入混合内标工作液，经样品前处理后得到待测样本待测液；
S3、检测待测样品，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样本待测液进行检测，将检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中抗高血压药物及代谢产物浓度。
在本发明实施例的检测方法中，配制梯度浓度的混合标准工作液的方法可采用以下方法：
先采用各标准品配制标准品储备液，所采用的溶剂根据标准品溶解度的不同采用70％～100％的甲醇，添加酸的比例为0.05％～0.2％，例如：洛沙坦、缬沙坦、酒石酸美托洛尔、富马酸比索洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔、盐酸普萘洛尔可采用甲醇和水体积比为7：3的溶液进行储备液的配制；厄贝沙坦、坎地沙坦、洛沙坦羧酸可以采用纯甲醇进行储备液配制；替米沙坦可采用含0.1％甲酸的甲醇和水的体积比为85：15的溶液储备液配制；奥美沙坦可采用甲醇和水体积比为9：1的溶液进行储备液配制。
将上述标准品储备液混合后用体积百分比为60％～80％的甲醇水溶液进行稀释，得到混合标准工作液中间液；然后继续用体积百分比为60％～80％的甲醇水溶液进行稀释，配制成不同浓度的标曲工作液，并在-80℃条件下保存。所采用的稀释液进一步优选体积百分比为70％的甲醇水溶液。
在本发明实施例的检测方法中，内标工作液的配制可采用以下方法：
精确称量内标化合物，用适当的溶剂溶解后得到内标储备液，所用的溶剂根据标准品溶解度的不同采用70～100％的甲醇。例如：洛沙坦-D4、缬沙坦-D9、厄贝沙坦-D4、坎地沙坦-D4、奥美沙坦-D4可以采用纯甲醇进行储备液配制；替米沙坦-D3采用含0.1％甲酸的甲醇和水的体积比为85：15的溶液进行配制；美托洛尔-D7半酒石酸盐、倍他洛尔-D7盐酸盐、比索洛尔-D7半富马酸盐、阿替洛尔-D7和普萘洛尔-D5和洛沙坦羧酸-D4采用甲醇和水体积比为7：3的溶液进行储备液的配制。
取上述内标储备液用体积百分比为70％的甲醇水溶液进行稀释，所得的标准工作液中间液；然后继续用体积百分比为70％的甲醇水溶液进行稀释，配制成内标工作液，并在-80℃条件下保存。
作为本发明实施例的一种改进，标准品前处理包括以下步骤：混合标准工作液和混合内标工作液混合，加入水I，混匀，加入蛋白沉淀剂，混匀，取混合液加入水II稀释，获得用于进样的标准溶液待测液。
作为本发明实施例的一种改进，样品前处理包括以下步骤：待测血液样本加入混合内标工作液，加入蛋白沉淀剂，混匀、离心，取上清液加入水稀释，得到用于进样的待测样本待测液。
具体的，在本发明实施例中，混匀的条件可采用1500～2500rpm旋涡混合3～8min，优选采用2000rpm混匀5min。离心的条件可采用10000～14000rpm离心5～10min，优选14000rpm离心5min。
在本发明实施例的检测方法中，作为一种更优选的方式，S12中，取混合标准工作液和混合内标工作液，加入水I，混匀后加入蛋白沉淀剂后混匀。水I的体积为混合标准工作液体积的2～20倍。为了保证与待测样本的一致性，蛋白沉淀剂的添加量与S2中的添加量一致。
在某一优选的技术方案中，混合标准工作液和蛋白沉淀剂的体积比优选为1：40，混合标准工作液和混合内标工作液的体积比为1：1。
作为一种优选的技术方案，S2中，蛋白沉淀剂的体积为待测血液样本的3～5倍。经筛选实验发现，蛋白沉淀剂采用甲醇，不容易引起溶剂效应，并且，经深入研究后发现，甲醇与待测血液样本的体积比为3.5～4.5倍、进一步优选为1：4时，沉淀效果最佳。
优选的，待测血液样本和混合内标工作液的体积比为10：1。
在本发明实施例的检测方法中，作为一种更优选的方式，S12中，混合液中加入水II稀释后用于进样，混合液与稀释用水的体积比为1：2；S2中，上清液中加入水稀释后得到待测样本待测液；上清液与稀释用水的体积比为1：2。离心后上清液加水稀释后进样，优势在于可以避免溶剂效应，保证色谱峰形及定量准确性。
作为一种具体的实施方式，标准溶液的前处理条件为：取10μL混合内标工作液，取各混合标准品工作液10μL，加入90μL水，再加入400μL甲醇，旋涡混匀，得到混合液，吸取混合液100μL，再加入200μL水，混匀后进行分析。
作为一种具体的实施方式，待测样品的前处理条件为：取100μL血清或血浆待测样品，加入10μL内标工作液，加入400μL甲醇，混匀，离心，取上清液100μL加入200μL水，混匀后进行分析。
在本发明实施例的检测方法中，作为一种更优选的方式，高效液相色谱质谱联用仪中，色谱分析选用C18色谱柱。
具体的，色谱柱的粒径为2.7～3.2μm。进一步优选采用phenomenex Luna OmegaPolar C18色谱柱和Atlantis T3色谱柱，规格可采用2.1×50mm，3μm；由于阿替洛尔极性较大，在一般C18色谱上保留较弱，因此选用Polar C18色谱柱和Atlantis T3色谱柱，能够有效保留。
除以上色谱柱外，也可以采用Poroshell 120EC C18色谱柱，规格3.0mm×50mm，粒径为2.7μm；Shim-pack Velox C18色谱柱，规格2.1mm×50mm，粒径为2.7μm。
作为一种优选的技术方案，高效液相色谱质谱联用仪中，流动相中的A相为含有1～10mmol/L甲酸铵、0.02～0.2％甲酸的水，B相为含有1～10mmol/L甲酸铵、0.02～0.2％甲酸的甲醇；优选的，流动相中的A相为含有4～8mmol/L甲酸铵、0.05～0.1％甲酸的水，B相为含有4～8mmol/L甲酸铵、0.05～0.1％甲酸的甲醇。该流动相有利于提高化合物响应，改善峰形及分离，增加保留。
作为本发明实施例优选的技术方案，在高效液相色谱质谱联用仪中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.25～0.45mL/min，更优选为0.35mL/min。
作为本发明实施例优选的技术方案，在高效液相色谱质谱联用仪中，柱温为25～45℃，更优选为30℃。该柱温条件下各化合物能有效分离，进一步提高柱温后，分离效果反而略微变差。
作为本发明实施例优选的技术方案，在高效液相色谱质谱联用仪中，进样量为1～10μL，优选为2～8μL，更优选为2～5μL。采用低的进样量既能保证化合物的响应值，又不会引起溶剂效应。由于本发明实施例的前处理方法中，不仅对离心后上清液加水稀释，且进样量小，因此进入柱色谱柱内的待测成分的含量更低，对检测灵敏度提出了更高的要求。
作为本发明实施例优选的技术方案，在高效液相色谱质谱联用仪中，分析时间6min，本发明实施例的分析时间短，在该时间内能分离12种化合物。
作为本发明实施例优选的技术方案，在高效液相色谱质谱联用仪中，色谱分析的梯度洗脱条件为：
0.00～0.10min，A相从80％～90％变化至55％～60％，B相从10％～30％变化至40％～45％；
0.10～2.0min，A相从55％～60％变化至30％～45％，B相从40％～45％变化至55％～70％；
2.0～2.5min，A相保持30％～45％不变，B相保持55％～70％不变；
2.5～3.0min，A相从30％～45％变化至0～10％，B相从5％～70％变化至90％～100％；
3.0～4.0min，A相为0～10％、B相为90％～100％保持1min；
4.01～4.1min，A相从0～10％变化至80％～90％，B相90％～100％变化至10％～20％；
4.1～6.0min，A相为80％～90％、B相为10％～20％保持1.9min。
本发明实施例所采用的梯度洗脱方式能够有效实现洛沙坦羧酸和缬沙坦的分离，有效避免离子串扰，提高化合物响应及定量准确度。
进一步优选采用如表1所示的梯度洗脱条件：
表1
| 时间/分钟 | A相/％ | B相/％ |
| 0.00 | 85 | 15 |
| 0.10 | 55 | 45 |
| 2.00 | 40 | 60 |
| 2.50 | 40 | 60 |
| 3.00 | 0 | 100 |
| 4.00 | 0 | 100 |
| 4.10 | 85 | 15 |
| 6.00 | 85 | 15 |
作为本发明实施例优选的技术方案，高效液相色谱质谱联用仪的质谱检测条件为：
毛细管电压：4000～5000V，优选为5000V；
加速电压：100～300V，优选为300V；
干燥器温度：250～350℃，优选为300℃；
干燥器流量：4～8L/min，优选为5L/min；
喷嘴电压：400～500V，优选为500V；
雾化器压力：20～40Psi，优选为30Psi；
鞘气温度：300～450℃，优选为400℃；
鞘气流量：8～11L/min，优选为11L/min。
作为本发明实施例优选的技术方案，高效液相色谱质谱联用仪的质谱检测条件为：采用电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测，所采用的离子对如表2所示：
表2
本发明实施例的回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，本实施例中方法用于检测血液中11种抗高血压药物及1种代谢物含量，重现性良好，回收率高，提高了检测结果的准确度。检测过程简便快速，成本降低，分析时间短，利于大通量的样本检测。
本发明实施例还涉及上述方法在监测11种抗高血压药物及1种代谢产物血药浓度中的应用，抗高血压药物及代谢产物为洛沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦、美托洛尔、比索洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔、普萘洛尔和洛沙坦羧酸。
实施例1
本实施例用于说明检测血浆中11种抗高血压药物及1种代谢产物浓度的液相色谱质谱分析方法，包括以下步骤：
一、标准工作液的配制：
精确称量目标物，用适当的溶剂溶解后得到标准储备液；取适量标准储备液A，用70％的甲醇水溶液进行稀释，所得的标准工作液中间液；然后继续用上述甲醇水溶液进行稀释，配制成不同浓度的标曲工作液，并在-80℃条件下保存。
1、标准储备液的配制，具体如表3所示：
表3
2、标准中间液的配制具体如表4所示：
表4
3、标准品工作液的配制：1mL标准品工作液最高点配制过程如下表5所示：
表5
4、标曲稀释过程如下表6所示：
表6
| 标曲点 | 稀释过程 | 稀释液(甲醇：水7:3) |
| L7 | 取L8 500μL | 500μL |
| L6 | 取L7 500μL | 500μL |
| L5 | 取L6 400μL | 600μL |
| L4 | 取L5 300μL | 600μL |
| L3 | 取L4 400μL | 600μL |
| L2 | 取L3 500μL | 500μL |
| L1 | 取L2 500μL | 500μL |
5、标准工作液中各级别物质浓度如表7所示：
表7
二、内标工作液的配制：
精确称量内标化合物，用适当的溶剂溶解后得到内标储备液；取适量内标储备液A，用70％的甲醇水溶液进行稀释，所得的内标工作液中间液；然后继续用上述甲醇水溶液进行稀释，配制成不同浓度的内标工作液，并在-80℃条件下保存。
1、内标储备液的配制具体如表8所示：
表8
2、内标中间液的配制具体如表9所示：
表9
3、内标工作液的配制
10mL内标工作液配制过程如表10所示：
表10
三、前处理
1、标准溶液的前处理
取内标及标曲工作液，室温下放置30min，以平衡至室温；
取8支1.5mL离心管，分别编号为L8到L1、空白，取微量移液器(量程：0.5～10μL)，吸取10μL内标工作液加入到编号L8到L1；
取微量移液器(量程：2～20μL)，吸取各标准品工作液10μL，加入相应编号的离心管中，准确吸取90μL水，再准确吸取400μL甲醇到上述各离心管中，2000rpm混匀1min。
取微量移液器(量程：10～100μL)，吸取混合液100μL至96孔板中，再加入200μL水至同一96孔位中；混匀后将样本进仪器分析，进样量为5μL。
2、标准溶液的检测及标曲制备：
利用高效液相色谱质谱联用仪对上述溶液进行检测，得到八种不同浓度的11种抗高血压药物及1种代谢物和内标的标准溶液色谱质谱图，从上述标准溶液色谱图中分别得到目标物和内标物的峰面积，分别以上述八个不同浓度的目标物标准溶液的峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y，以上述目标物标准工作液中的浓度作为标准曲线方程的横坐标x，将以上检测所得的八种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出线性方程系数a、b；标准工作液为含有11种抗高血压药物及1种代谢物的溶液，内标工作液为含有12种同位素内标的溶液。
3、待测样品的前处理
用移液枪移取100μL血清或血浆待测样品，加入10μL内标工作液，准确吸取400μL甲醇到上述各离心管中，2000rpm混匀5min，14000rpm离心5min。
取微量移液器(量程：10～100μL)，吸取上清液100μL至96孔板中，再加入200μL水至同一孔位中；混匀后将样本进仪器分析，进样量为5μL。
4、待测样品的检测
使用高效液相色谱质谱联用仪对上述步骤3待测的样品进行检测，得出上述待测样品的目标物与内标的色谱图，将目标物与内标峰面积的比值代入步骤2的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物的浓度。
色谱分析所使用的色谱柱为：Phenomenex Luna Omega Polar C18(2.1×50mm，3μm)；
流动相：A相：含有4mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸的水溶液；B相：含有4mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸的甲醇溶液；梯度洗脱如表1所示；流速为0.3mL/min，柱温为30℃，进样量为4μL；分析时间6min。
质谱检测器为Agilent K6460C检测器，采用电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，多反应监测模式(MRM)，离子源参数如下：毛细管电压：5000V；加速电压：300V；干燥器温度：300℃；干燥器流量：5L/min；喷嘴电压：500V；雾化器压力：30Psi；鞘气温度：400℃；鞘气流量：11L/min。
目标物及内标的离子对信息如表2所示。
图1为血浆样本中抗高血压药物色谱图；由上至下依次为：奥美沙坦(RT＝3.221min)、阿替洛尔(RT＝0.960min)、比索洛尔(RT＝3.251min)、倍他洛尔(RT＝3.510min)、厄贝沙坦(RT＝4.655min)、砍地沙坦(RT＝4.411min)、洛沙坦(RT＝4.330min)、洛沙坦羧酸(RT＝4.411min)、美托洛尔(RT＝2.830min)、普萘洛尔(RT＝3.361min)、替米沙坦(RT＝4.752min)缬沙坦(RT＝4.673min)。
本实施例1中技术方法论证如下：
一、该方法的线性
将上述配制标准溶液，按实施例1的测定条件，按浓度由低到高进行测定，以抗高血压药物和代谢产物的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值-抗高血压药物和代谢产物的浓度与内标物的浓度的比值作图，得到标准曲线；结果表明11种抗高血压药物在如表11范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.99。线性范围如表11所示：
表11
二、该方法的灵敏度：
采用空白血浆制备不同浓度的样本，采用实施例1的方法进行测定，以S/N≥3作为检出限标准，最低检出限如表12所示：
表12
| 化合物 | 浓度(ng/mL) | S/N |
| 奥美沙坦 | 0.33 | 3.06 |
| 阿替洛尔 | 0.33 | 4.19 |
| 比索洛尔 | 0.03 | 28.80 |
| 倍他洛尔 | 0.17 | 42.29 |
| 厄贝沙坦 | 0.83 | 45.83 |
| 砍地沙坦 | 0.33 | 4.86 |
| 洛沙坦 | 0.67 | 6.86 |
| 美托洛尔 | 0.08 | 9.06 |
| 普萘洛尔 | 0.07 | 3.66 |
| 替米沙坦 | 0.08 | 5.11 |
| 缬沙坦 | 1.67 | 27.80 |
| 洛沙坦羧酸 | 1.40 | 1425.62 |
三、该方法的回收率和精密度
取空白血浆分别加入标准工作液配制成低、中、高3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定5批次，目标物回收率和精密度分别如表13所示。
表13
根据上表可知，所有化合物在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为91.7％～106.8％，相对标准偏差为0.7％～5.2％。
综合上述验证试验，本实施例的回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，本实施例中方法用于检测血液中11种抗高血压药物及1种代谢物含量，重现性良好，回收率高，提高了检测结果的准确度。血浆经蛋白沉淀再稀释后直接进样，检测过程简便快速，实验成本降低，分析时间短，利于大通量的样本检测。
实施例2
本实施例用于说明色谱柱条件对检测结果的影响：
采用Atlantis T3色谱柱(2.1×50mm，3μm)进行检测，血清样本色谱图如图2所示：由上至下依次为：奥美沙坦(RT＝3.238min)、阿替洛尔(RT＝1.211min)、比索洛尔(RT＝3.035min)、倍他洛尔(RT＝3.271min)、厄贝沙坦(RT＝4.543min)、砍地沙坦(RT＝4.454min)、洛沙坦(RT＝4.226min)、洛沙坦羧酸(RT＝4.711min)、美托洛尔(RT＝2.678min)、普萘洛尔(RT＝3.192min)、替米沙坦(RT＝4.578min)缬沙坦(RT＝4.712min)。
采用T3色谱柱与Polar C18色谱柱差异很小，两种色谱柱均有较好的分离效果。
参照实施例1中方法考察加样回收率和精密度，重复分析测定5批次，目标物回收率和精密度分别如表14所示。
表14
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根据上表可知，所有化合物采用T3色谱柱进行测试，低、中、高3个添加水平回收率为92.67％～109.10％，相对标准偏差为0.66％～5.26％。回收率和精密度均符合要求。
实施例3
本实施例用于说明柱温条件对检测结果的影响：
按照实施例1的方法进行检测，区别在于采用不同的柱温，得到的色谱图中洛沙坦羧酸和缬沙坦的保留时间如表15所示：
表15
以上结果说明，柱温从25～40℃变化，洛沙坦羧酸和缬沙坦可实现色谱分离，满足检测要求。
实施例4
本实施例用于说明进样量对检测结果的影响：
按照实施例1的方法进行检测，区别在于采用进样量为1μL、10μL，阿替洛尔的色谱图如图3和图4所示：
根据图3和图4可知，在优化后的前处理条件下，进样量1～10μL均可满足检测要求，但图4峰型出现不对称的趋势。
实施例5
本实施例用于说明上清液稀释情况对检测结果的影响：
按照实施例1的方法进行检测，区别在于采用离心后上清液与水的体积比分别为1：1(上清液100μL，加入水100μL)、1：2(上清液100μL，加入水200μL)、1：3(上清液100μL，加入水300μL)，阿替洛尔的色谱图如分别如图5、图6、图7所示；针对0.500μg/mL浓度样本，阿替洛尔的定量结果如表16所示。
表16
| 上清液与水的体积比 | 阿替洛尔的定量结果 |
| 1：1稀释 | 0.479 |
| 1：2稀释 | 0.487 |
| 1：3稀释 | 0.489 |
根据图5～图7可知，在优化后的前处理条件下，离心后上清液与水的体积比分别为1：1～3均可满足检测要求。
实施例6
本实施例用于说明流动相组成对检测结果的影响：
按照实施例1的方法进行前处理，区别仅在于：流动相条件如下：
流动相条件1、A相：含有2mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸的水溶液；B相：含有3mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸的甲醇溶液；
流动相条件2、A相：含有1mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸的水溶液；B相：含有1mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸的甲醇溶液；
流动相条件3、A相：含有10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸的水溶液；B相：含有10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸的甲醇溶液；
流动相条件4、A相：含有4mmol/L甲酸铵、0.02％甲酸的水溶液；B相：含有4mmol/L甲酸铵、0.05％甲酸的甲醇溶液；
流动相条件5、A相：含有4mmol/L甲酸铵、0.2％甲酸的水溶液；B相：含有4mmol/L甲酸铵、0.2％甲酸的甲醇溶液；
不同流动相条件下，不同化合物的保留时间如表17所示：
表17
| 目标物 | 流动相条件1 | 流动相条件2 | 流动相条件3 | 流动相条件4 | 流动相条件5 |
| 阿替洛尔 | 0.955 | 0.891 | 0.913 | 1.040 | 0.955 |
| 美托洛尔 | 2.827 | 2.785 | 2.806 | 2.870 | 2.827 |
| 奥美沙坦 | 3.217 | 3.238 | 3.238 | 3.217 | 3.238 |
| 比索洛尔 | 3.248 | 3.142 | 3.184 | 3.291 | 3.248 |
| 普萘洛尔 | 3.363 | 3.256 | 3.320 | 3.426 | 3.363 |
| 倍他洛尔 | 3.505 | 3.356 | 3.420 | 3.548 | 3.484 |
| 洛沙坦 | 4.332 | 4.290 | 4.311 | 4.311 | 4.290 |
| 砍地沙坦 | 4.411 | 4.433 | 4.411 | 4.262 | 4.411 |
| 替米沙坦 | 4.748 | 4.578 | 4.705 | 4.854 | 4.620 |
| 厄贝沙坦 | 4.650 | 4.565 | 4.629 | 4.650 | 4.586 |
| 缬沙坦 | 4.670 | 4.670 | 4.670 | 4.648 | 4.648 |
| 洛沙坦羧酸 | 4.413 | 4.434 | 4.413 | 4.264 | 4.413 |
由于缬沙坦会对洛沙坦羧酸产生离子串扰，这两种化合物必须实现色谱分离，其他化合物无需实现色谱分离，质谱分离即可。根据表17可知，在上述流动相条件下，12种化合物均能实现较好分离效果。
实施例7
本实施例用于说明洗脱条件对检测结果的影响：
按照实施例1的方法进行前处理，区别仅在于：洗脱条件如表18所示：
表18
/>
不同洗脱条件下，不同化合物的保留时间如表19所示：
表19
| 流动相组成 | 洗脱条件1 | 洗脱条件2 |
| 阿替洛尔 | 1.017 | 1.023 |
| 美托洛尔 | 2.465 | 2.849 |
| 奥美沙坦 | 2.725 | 3.196 |
| 比索洛尔 | 2.745 | 3.213 |
| 普萘洛尔 | 2.822 | 3.384 |
| 倍他洛尔 | 2.917 | 3.505 |
| 洛沙坦 | 3.568 | 4.179 |
| 砍地沙坦 | 3.621 | 4.177 |
| 替米沙坦 | 3.845 | 4.854 |
| 厄贝沙坦 | 3.780 | 4.606 |
| 缬沙坦 | 3.793 | 4.629 |
| 洛沙坦羧酸 | 3.622 | 4.268 |
由表19可知，在不同洗脱条件下，都可以实现目标物的较好分离。
实施例8
采用实施例1的方法对进行检测，区别在于采用不同的色谱柱，得到不同色谱柱下，各化合物保留时间如表20所示：
表20
对比例1
本对比例用于说明蛋白沉淀剂筛选实验：
按照实施例1的方法进行前处理，得到阿替洛尔的色谱图如图3所示。
按照实施例1的方法进行，区别仅在于：用乙腈400μL进行蛋白沉淀；得到阿替洛尔的色谱图如图8所示，左图为标准曲线，右图为样本。
根据图3和图8对比可知，采用乙腈时阿替洛尔溶剂效应明显，故选择甲醇更加合适。
对比例2
本对比例用于说明进样前稀释条件的筛选实验：
按照实施例1的方法进行前处理，区别仅在于：
D2-1、待测样本前处理过程中，甲醇沉淀蛋白后的离心液不稀释，上清液直接取样进仪器分析；阿替洛尔的色谱图如图9所示；
D2-2、待测样本前处理过程中，甲醇沉淀蛋白离心后取上清液100μL，加入50μL水，取样进仪器分析；阿替洛尔的色谱图如图10所示；针对0.500μg/mL浓度样本，阿替洛尔的定量结果如表21所示。
表21
| 编号 | 阿替洛尔的定量结果 |
| D2-1 | 0.161μg/mL |
| D2-2 | 0.327μg/mL |
根据图9和图10对比可知，进样前稀释条件对于阿替洛尔的峰型具有较大影响，溶剂效应主要影响色谱峰形，进而影响化合物定量。
对比例3
本对比例用于说明流动相的筛选实验：
按照实施例1的方法进行前处理，区别仅在于：
D3-1、A相：含有0.1％甲酸的水溶液；B相：含有0.1％甲酸的甲醇溶液；
D3-2、A相：含有4mmol/L甲酸铵的水溶液；B相：含有4mmol/L甲酸铵的甲醇溶液；
D3-3、A相：含有4mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸的水溶液；B相：含有4mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸的乙腈溶液；
各流动相组分条件下，不同化合物的保留时间如表22所示：
表22
| 流动相组成 | D3-1 | D3-2 | D3-3 |
| 阿替洛尔 | 0.806 | 1.019 | 0.716 |
| 美托洛尔 | 2.700 | 2.870 | 2.371 |
| 奥美沙坦 | 3.238 | 3.068 | 2.663 |
| 比索洛尔 | 3.057 | 3.291 | 2.686 |
| 普萘洛尔 | 3.171 | 3.426 | 2.772 |
| 倍他洛尔 | 3.271 | 3.548 | 2.879 |
| 洛沙坦 | 4.290 | 4.056 | 3.699 |
| 砍地沙坦 | 4.475 | 3.411 | 3.758 |
| 替米沙坦 | 4.301 | 4.812 | 4.011 |
| 厄贝沙坦 | 4.437 | 4.501 | 3.937 |
| 缬沙坦 | 4.691 | 4.159 | 3.952 |
| 洛沙坦羧酸 | 4.498 | 4.157 | 3.760 |
根据表21可知，D3-1条件下，是阿替洛尔在色谱柱上保留较弱，保留时间明显提前；D3-2条件下，缬沙坦和洛沙坦羧酸无法实现色谱分离。
D3-3条件下，整体分离效果较差，阿替洛尔溶剂效应增加，回收率仅有75％，难以实现准确定量。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (11)
1.一种液相色谱串联质谱法检测血液中11种抗高血压药物及1种代谢产物的方法，其特征在于，抗高血压药物及代谢产物为洛沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦、美托洛尔、比索洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔、普萘洛尔和洛沙坦羧酸；
所述方法至少包括以下步骤：
S1、制备标准曲线方程，包括：
S11、配制梯度浓度的混合标准工作液、混合内标工作液；所述混合标准工作液中含有所述抗高血压药物和代谢产物的标准品，所述混合内标工作液中含有12种同位素内标的标准品；
S12、将所述混合标准工作液和所述混合内标工作液混合，进行标准工作液前处理，得到标准溶液待测液，利用高效液相色谱质谱联用仪对所述标准溶液待测液进行检测，获得标准曲线方程；
所述标准品前处理包括：所述混合标准工作液和所述混合内标工作液混合，加入水I，混匀，加入蛋白沉淀剂混匀，取混合液加入水II稀释，得到所述标准溶液待测液；
S2、处理待测样品，包括：取待测血液样本加入所述混合内标工作液，经样本前处理后得到待测样本待测液；
所述样本前处理包括：所述待测血液样本加入所述混合内标工作液，加入蛋白沉淀剂，混匀、离心，取上清液加入水稀释，得到所述待测样本待测液；
S3、检测所述待测样品待测液，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对所述待测样本待测液进行检测，将检测结果代入所述标准曲线方程，得到所述待测样本中抗高血压药物及代谢产物的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S11中，所述混合标准工作液的配制方法为：
采用所述抗高血压药物和代谢产物的标准品分别配制各标准品储备液，然后所述标准品储备液稀释为标准工作液中间液，然后混合、稀释得到不同浓度的混合标准工作液；
配制所述各标准品储备液的溶剂分别采用70％～100％的甲醇，添加酸的比例为0.05％～0.2％；
和/或，对所述标准品储备液进行稀释的溶剂选自体积百分比为60％～80％的甲醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
S12中，所述水I的体积为所述混合标准工作液体积的2～20倍；所述蛋白沉淀剂添加体积与S2中的蛋白沉淀剂添加体积相同；
S2中，所述蛋白沉淀剂的体积为所述待测血液样本体积的3～5倍。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白沉淀剂选自甲醇或乙腈；
S12中，所述混合液加入水II稀释，所述混合液与水II的体积比为1：1～1：4；
S2中，所述上清液加入水稀释，所述上清液与水的体积比为1：1 1：4。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱质谱联用仪中，所使用的色谱柱选用C18色谱柱；优选采用Phenomenex Luna Omega Polar C18色谱柱，2.1mm×50mm，粒径为3μm；或Atlantis T3色谱柱，粒径为3μm，2.1mm×50mm。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱质谱联用仪中，流动相中的A相为含有1～10mmol/L甲酸铵、0.02％～0.2％甲酸的水，B相为含有1～10mmol/L甲酸铵、0.02～0.2％甲酸的甲醇。
7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱质谱联用仪中，流速为0.25～0.45mL/min，柱温为25～45℃，进样量为1～10μL；分析时间6min。
8.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱质谱联用仪中，色谱分析的梯度洗脱条件为：
0.00～0.10min，A相从80％～90％变化至55％～60％，B相从10％～20％变化至40％～45％；
0.10～2.0min，A相从55％～60％变化至30％～45％，B相从40％～45％变化至55％～70％；
2.0～2.5min，A相保持30％～45％不变，B相保持55％～70％不变；
2.5～3.0min，A相从30％～45％变化至0～10％，B相从55％～70％变化至90～100％；
3.0～4.0min，A相为0～10％、B相为90％～100％保持1min；
4.01～4.1min，A相从0～10％变化至80％～90％，B相90％～100％变化至10％～20％；
4.1～6.0min，A相为80％～90％、B相为10％～20％保持1.9min。
9.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱质谱联用仪的质谱检测条件为：
毛细管电压：4000～5000V；加速电压：100～300V；
干燥器温度：250～350℃；干燥器流量：4～8L/min；
喷嘴电压：400～500V；雾化器压力：20～40Psi；
鞘气温度：300～450℃；鞘气流量：8～11L/min。
10.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱质谱联用仪的质谱检测条件为：
采用电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测，所采用的离子对为：
洛沙坦的定量离子对为423.2/207.1，定性离子对为423.2/377.2；
洛沙坦羧酸的定量离子对为437.2/235.2，定性离子对为437.2/207.2；
缬沙坦的定量离子对为436.2/235.1，定性离子对为436.2/291.2；
厄贝沙坦的定量离子对为429.2/207.1，定性离子对为429.2/195.2；
坎地沙坦的定量离子对为441.2/263.2，定性离子对为441.2/235.1；
替米沙坦的定量离子对为515.2/276.2，定性离子对为515.2/497.3；
奥美沙坦的定量离子对为447.2/207.2，定性离子对为447.2/429.2；
美托洛尔的定量离子对为268.2/116.1，定性离子对为268.2/190.2；
倍他洛尔的定量离子对为308.2/116.1，定性离子对为308.2/74.1；
比索洛尔的定量离子对为326.2/116.1，定性离子对为326.2/74.1；
阿替洛尔的定量离子对为267.0/145.1，定性离子对为267.0/190.2；
普萘洛尔的定量离子对为260.2/116.1，定性离子对为260.2/183.1。
11.如权利要求1～10任一项所述的方法在监测11种抗高血压药物及1种代谢产物血药浓度中的应用，所述抗高血压药物及1种代谢产物为洛沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦、美托洛尔、比索洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔、普萘洛尔和洛沙坦羧酸。
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