CN111595956B - 一种血清中激素和神经递质的检测方法 - Google Patents

一种血清中激素和神经递质的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血清中激素和神经递质的检测方法。本发明对传统血清检测方法进行改进，前处理时在血清中加入20μL 100ppb同位素内标，加入400μL 90v/v％乙腈水，乙腈水含0.1v/v％甲酸；涡旋1min，在4℃下静置20min；4℃、15000rpm下离心10min，取上清液加入20mg PSA(N‑丙基乙二胺)，10mg中性Al2O3以及10mg C18；涡旋1min，混匀后在4℃、15000rpm下离心10min，取上清液氮气吹干，并用200μL 5v/v％乙腈水复溶，乙腈水含0.1v/v％甲酸。复溶后涡旋1min，过0.22μm滤膜。采用液质联用技术上样同时定量分析血清中的多种神经递质和激素。本方法在较好除杂的同时降低物质的损失，解决了蛋白质沉淀法造成的基质效应过高、样品洁净度差、对仪器污染大等缺点。

Description

一种血清中激素和神经递质的检测方法
技术领域
本发明属于血液检测领域，尤其涉及一种通过改进传统血清前处理方法，并且利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC/ESI-MS/MS)对血清中多种神经递质和激素进行高通量同时检测的方法。
背景技术
激素是内分泌细胞产生的一类具有高效能信息传递作用的化学物质。激素的种类较多而数量极微(多数为毫微克甚至微微克水平)，它们不直接参与物质或能量的转换，只是直接或间接地促进或减慢体内原有的代谢过程。如生长和发育都是人体原有的代谢过程，生长激素或其他相关激素增加，可加快这一进程，减少则使生长发育迟缓。激素对人类的繁殖、生长、发育、各种其他生理功能、行为变化以及适应内外环境等，都能发挥重要的调节作用。一旦激素分泌失衡，便会给人体带来各种疾病。
神经传递是神经元之间沟通的基础，对大脑发育、行为、情感和生命维持起到至关重要的作用。神经传递系统包括神经递质及其前体物质和代谢物质。神经递质是一类化学物质，在神经元、肌细胞、感受器的突触传递中起信使作用，对生理功能起着很大的作用。按照神经传递系统的不同，神经递质可分为血清素能、胆碱能、儿茶酚胺能、肾上腺素能类。神经递质改变可引起抑郁症、帕金森病和精神分裂等病，如帕金森病的主要表现是体内多巴胺含量的下降，对此在治疗过程中会使用多巴胺的前体物质左旋多巴。
因此，血液中激素和神经递质的水平是身体健康状况的重要指示指标。目前，很多疾病的诊断和治疗需要对血液中的激素和神经递质进行检测，血液中的激素和神经递质水平已经成为临床医学检测的重要指标。目前，检测血液(血清)中激素和神经递质常用的方法包括酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和高效液相色谱法。ELISA无法同时检测样品中的多种指标且由于样品中的其他内源性抗原易吸附固相载体，发生交叉反应，难免造成假阳性或假阴性，而且操作复杂。高效液相色谱法能够同时分析多种目标待测物且具有较高的敏感性和特异性，逐渐成为在医学检测中广泛应用的可靠技术。然而，在使用高效液相色谱法检测血液(血清)样品中的激素和神经递质的过程中，一般需要对样品进行前处理，目前应用的前处理方法主要有固相萃取法(SPE)和蛋白质沉淀法(PPT)。这些方法或是对目标化合物的提取效率低，损失大，或是杂质去除效率低，基质效应高，对检测仪器损害大，均存在明显不足之处，很难满足临床检测上高通量、高准确度的要求。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种全新的血清前处理技术，并通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC/ESI-MS/MS)对血清中的多种激素和神经递质进行同时检测。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，包括以下步骤：
(1)血清样品的前处理：取100μL血清于1.5mL离心管中，加入20μL 100ppb同位素内标，加入400μL 90v/v％乙腈水，乙腈水含0.1v/v％甲酸；涡旋1min，在4℃下静置20min；4℃、15000rpm下离心10min，取上清液加入20mg PSA(N-丙基乙二胺)，10mg中性Al2O3以及10mg C18；涡旋1min，混匀后在4℃、15000rpm下离心10min，取上清液氮吹干，并用200μL 5v/v％乙腈水复溶，乙腈水含0.1v/v％甲酸。复溶后涡旋1min，过0.22μm滤膜，上样。
(2)液质联用技术同时定量分析血清中神经递质和激素：分析用的是Waters BEHC18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，并在前端串联一根VanGuardTM保护柱(C18柱，2.1mm×50mm，1.7μm)。流动相用二元洗脱液，A路乙腈，B路水，均添加0.1v/v％的甲酸，流速为0.2mL/min，进样量为10μL。设置的梯度是0min，5v/v％A；3min，6v/v％B；5min，25v/v％B；7min，95v/v％A；11min，5v/v％A。质谱使用选择反应监测(selected reaction monitoring，SRM)模式。毛细管电压为1.07kV。氮气用作脱溶剂气，气体的温度和流速分别为350℃和800L/h。氩气为碰撞气。
进一步地，所述同位素内标配置如下：
(1)用50v/v％乙腈水溶液配置浓度为1000ppm的各神经递质同位素母液，将单标分步稀释至100ppm、10ppm；
(2)用纯乙腈配置浓度为1000ppm的各激素同位素母液，将单标分步稀释至100ppm、10ppm；
(3)同位素内标：每种10ppm同位素单标各取100μL混合于离心管中，用5v/v％乙腈水溶液配置成10mL浓度为100ppb的同位素内标。
进一步地，所述神经递质包括：乙酰胆碱、血清素、多巴胺、左旋多巴、去甲肾上腺素和去甲变肾上腺素。所述激素包括：醛固酮、雄烯二酮、雄酮、肾上腺酮、皮质醇、11﹣脱氧皮质醇、雌二醇、雌酮、17α﹣羟基孕酮、孕酮、睾酮、孕烯醇酮、甲状腺素、3,3,5﹣三碘甲状腺原氨酸、肾上腺素、褪黑素、后叶加压素、血管紧张素、前列腺素D2、前列腺素E2、前列腺素F1α和血栓素B2。
本发明的有益效果是：本发明的前处理方法相比于传统的蛋白质沉淀法仅多了一步简便的纯化步骤，能够满足在减少损失的基础上对样品进行净化，解决了蛋白质沉淀法造成的基质效应过高、样品洁净度差、对仪器污染大等缺点。同时，以同位素内标来跟踪和校正样品分析过程中目标化合物的损失，确保结果的准确性。
附图说明
图1为28种生物标志物质谱图。
具体实施方式
选取血清中胆碱能、羟色胺能、儿茶酚胺能、肾上腺素能中的神经递质和类固醇类激素、氨基酸衍生物类激素、脂肪酸衍生物类激素作为待测指标，采用更高效的前处理方式，它们在血清中的浓度可使用超高效液相色谱-电喷雾电离-三重四级杆串联质谱仪实现定量分析，该方法具有省时、省力、省财的优点并且可以实现高灵敏度、高准确性和高通量。
实施例1样品分析过程
1.1血清中生物标志物的选择
激素和神经递质的选择：结合外界胁迫引起生物体内激素和神经递质的差异表达，以及在医学检测中通常涉及的激素和神经递质种类，挑选不同类型的激素(包括类固醇类、氨基酸衍生物类、脂肪酸衍生物类等)和神经递质作为检测的目标化合物。本实施例中选取结果如下表1和表2所示。
表1 激素生物标志物及分类
Figure BDA0002463584510000031
Figure BDA0002463584510000041
表2 神经递质生物标志物及分类
类别 神经递质名称 英文全称 简称
胆碱能 乙酰胆碱 acetylcholine Ach
血清素能 血清素 serotonin 5-HT
儿茶酚胺能 多巴胺 dopamine DA
左旋多巴 3,4-dihydroxyphenylalanine L-DOPA
肾上腺素能 去甲肾上腺素 norepinephrine NE
去甲变肾上腺素 normetanephrine MNE
1.2血清样品的前处理
取100μL血清于1.5mL离心管中，加入20μL100ppb同位素内标，加入400μL 90v/v％乙腈水，乙腈水含0.1v/v％甲酸；涡旋1min，在4℃下静置20min；4℃、15000rpm下离心10min，取上清液加入20mg PSA(N-丙基乙二胺)，10mg中性Al2O3以及10mg C18；涡旋1min，混匀后在4℃、15000rpm下离心10min，取上清液氮吹干，并用200μL 5v/v％乙腈水复溶，乙腈水含0.1v/v％甲酸。复溶后涡旋1min，过0.22μm滤膜，上样。
其中，同位素内标的配置如下：
(1)用50v/v％乙腈水溶液配置浓度为1000ppm的各神经递质同位素母液，具体如表2所示，将单标分步稀释至100ppm、10ppm；
(2)用纯乙腈配置浓度为1000ppm的激素同位素母液，具体如表1所示，将单标分步稀释至100ppm、10ppm；
(3)同位素内标：每种10ppm同位素单标各取100μL混合于离心管中，用5v/v％乙腈水溶液配置成10mL浓度为100ppb的同位素内标。
1.3血清中生物标志物的UPLC/ESI-MS/MS分析
血清中生物标志物经前处理后需要进行离子对的选择。标准品通过调谐优化确定每种生物标志物的定量离子对、碰撞能量等参数见表3。
表3 待测激素和神经递质的离子对
Figure BDA0002463584510000051
Figure BDA0002463584510000061
Figure BDA0002463584510000071
其中，*表示定量离子对。
离子对确定后，用UPLC/ESI-MS/MS进行定量分析。分析用的是Waters BEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，并在前端串联一根VanGuardTM保护柱(C18柱，2.1mm×50mm，1.7μm)。流动相用二元洗脱液，A路乙腈，B路水，均添加0.1v/v％的甲酸，流速为0.2mL/min，进样量为10μL。设置的梯度是0min，5v/v％A；3min，6v/v％B；5min，25v/v％B；7min，95v/v％A；11min，5v/v％A。质谱使用选择反应监测(selected reaction monitoring，SRM)模式。毛细管电压为1.07kV。氮气用作脱溶剂气，气体的温度和流速分别为350℃和800L/h。氩气作为碰撞气。
测试结果如图1所示。
实施例2方法可靠性评价
2.1溶液配制
同位素内标配置如上所述。
混标配置如下：
(1)用50v/v％乙腈水溶液配置浓度为1000ppm的神经递质母液(表2)，将单标分步稀释至100ppm、10ppm；
(2)用纯乙腈配置浓度为1000ppm的激素母液(表1)，将单标分步稀释至100ppm、10ppm；
(3)高浓度标液：100ppm单标各取50各取于离心管中，用5v/v％乙腈水溶液配置成10mL浓度为500ppb的混合标液。
(4)低浓度标液：10ppm单标各取50各取于离心管中，用5v/v％乙腈水溶液配置成10mL浓度为50ppb的混合标液。50ppb混合标液再稀释至5ppb用于直接进样检测。
2.2方法评价实验
配置浓度为5ppb(低浓度)和50ppb(高浓度)的混标直接进样得到响应值(峰面积)S0
(1)相对回收率实验：
空白基质：取100μL血清于1.5mL离心管中，不加混标和同位素内标，经上述前处理后用200μL 5v/v％乙腈水溶液(含0.1v/v％甲酸)复溶，进样得到响应值(峰面积)S1。
取100μL血清于1.5mL离心管中，加入20μL 50ppb/500ppb混标，20μL 100ppb同位素内标，经上述前处理后用200μL 5v/v％乙腈水溶液(含0.1v/v％甲酸)复溶，进样得到响应值(峰面积)S2。
S2-S1的差值代入基质匹配的标准曲线得到浓度C
Figure BDA0002463584510000081
(2)基质效应实验：
取100μL血清于1.5mL离心管中，不加混标和同位素内标，经上述前处理后用200μL5ppb/50ppb混标复溶，进样得到响应值(峰面积)S3。
Figure BDA0002463584510000082
(3)精确度评价
仪器检测限(instrument detection limit,IDL)采用EPA推荐方法计算：
配置浓度分别为0.1，1，10，100ppb的混标，每个浓度连续进样5次，计算出仪器响应的平均值(mean peak area,m)和相对标准偏差(standard deviation,SD)。
Figure BDA0002463584510000083
其中α为0.01，a1-a5为连续测定五次同种浓度溶液的5个峰面积值，c为相对应混标浓度。
方法检测限(method detection limit,MDL)通过下式计算：
Figure BDA0002463584510000084
其中0.2mL为定容体积，0.1mL为样品量。
方法定量限(method quantification limit,MQL)通过下式计算：
MQL＝3*MDL
2.3方法评价结果
计算得出生物标志物的仪器检测限、方法检测限和方法定量限，数据如表4所示。
表4 激素和神经递质的精确度评价
Figure BDA0002463584510000085
Figure BDA0002463584510000091
上述数据说明本发明方法的测试结果满足血液样品的分析要求。
计算得出血清中生物标志物的回收率、基质效应，每种激素和神经递质的相对回收率和基质效应如表5、表6所示。
表5 激素和神经递质的相对回收率
Figure BDA0002463584510000092
Figure BDA0002463584510000101
表6 激素和神经递质的基质效应
Figure BDA0002463584510000102
Figure BDA0002463584510000111
由于大部分物质回收率和基质效应均在80％～120％之间，所有物质回收率和基质效应均在60％以上，由此可以判断该前处理方法具有可靠性。

Claims (2)

1.一种血清中激素和神经递质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）血清样品的前处理：取100 µL血清于1.5 mL离心管中，加入20µL 100ppb同位素内标，加入400 µL 90 v/v %乙腈水，乙腈水含0.1v/v%甲酸；涡旋1 min，在4℃下静置20 min；4℃、15000 rpm下离心10 min，取上清液加入20 mg PSA，10 mg中性Al2O3以及10 mg C18；涡旋1min，混匀后在4℃、15000 rpm下离心10 min，取上清液氮吹干，并用200 µL 5 v/v %乙腈水复溶，乙腈水含0.1v/v%甲酸；复溶后涡旋1 min，过0.22 µm滤膜，上样；
（2）液质联用技术同时定量分析血清中的多种神经递质和激素：分析用的是WatersBEH C18柱，并在前端串联一根VanGuardTM保护柱；流动相用二元洗脱液，A路乙腈，B路水，均添加0.1 v/v %的甲酸，流速为0.2 mL/min，进样量为10 μL；设置的梯度是0 min，5 v/v %A；3 min，6 v/v %B；5 min，25 v/v %B；7 min，95 v/v %A；11 min，5 v/v %A；质谱使用选择反应监测模式；毛细管电压为1.07kV；脱溶剂气采用氮气，气体的温度和流速分别为350℃和800L/h；碰撞气采用氩气；
其中，所述神经递质为乙酰胆碱、血清素、多巴胺、左旋多巴、去甲肾上腺素和去甲变肾上腺素；所述激素为醛固酮、雄烯二酮、雄酮、肾上腺酮、皮质醇、11﹣脱氧皮质醇、雌二醇、雌酮、17α﹣羟基孕酮、孕酮、睾酮、孕烯醇酮、甲状腺素、3,3,5﹣三碘甲状腺原氨酸、肾上腺素、褪黑素、后叶加压素、血管紧张素、前列腺素D2、前列腺素E2、前列腺素F1α和血栓素B2。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述同位素内标配置如下：
（1）用50 v/v %乙腈水溶液配置浓度为1000ppm的各神经递质同位素母液，将单标分步稀释至100ppm、10ppm；
（2）用纯乙腈配置浓度为1000ppm的各激素同位素母液，将单标分步稀释至100ppm、10ppm；
（3）同位素内标：每种10ppm同位素单标各取100µL混合于离心管中，用5 v/v %乙腈水溶液配置成10mL浓度为100ppb的同位素内标。
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