CN108051537A - 一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法 - Google Patents

一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种软膏中抗氧剂DL‑α‑生育酚及其干扰物的检测方法，包括以下步骤：1）供试品溶液的制备；2）对照品溶液的制备；3）检测。本发明提供的一种软膏中抗氧剂DL‑α‑生育酚及其干扰物的检测方法，采用优化条件的前处理和HPLC检测方法，能够使目标峰与干扰物峰达到有效分离，准确地测定软膏中抗氧剂DL‑α‑生育酚及其干扰物的含量，实现了对软膏中抗氧剂DL‑α‑生育酚及其干扰物的控制，从而保证了软膏的质量。

Description

一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法
技术领域
本发明属于药物成分分析检测技术领域，涉及一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，具体涉及一种采用高效液相色谱法分析测定骨化三醇软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、DL-α-生育酚醋酸酯的方法。
背景技术
DL-α-生育酚，化学名称为(±)-2,5,7,8-四甲基-2-(4′,8′,12′-三甲基十三烷基)-6-色满醇，又称维生素E醇，是主要表现出维生素E活性的一类化合物。因为其维生素活性首次在1936年针对大鼠繁殖力因素的实验中被鉴定出来，故被命名为“生育酚”。在食油、水果、蔬菜及粮食中均存在，它是脂溶性维生素，为一重要的抗氧化剂。DL-α-生育酚的同类物质有：d-α-生育酚；d-α-生育酚酯；dl-α-生育酚酯；琥珀酸氢d-α-生育酚酯；琥珀酸氢dl-α-生育酚酯；β-生育酚；γ-生育酚；δ-生育酚；生育酚油液；均具有维生素E的生理活性，其中以DL-α-生育酚的活性最大、抗氧化能力最强。
α-生育酚作为一种抗氧剂常用在食品和药品中。近年来，关于食品、奶粉、植物提取物以及乳膏中的DL-α-生育酚含量测定的方法很多，常用的有气相色谱法、反相高效液相色谱法、正相高效液相色谱法。但很少有专门针对软膏制剂中的DL-α-生育酚含量测定的高效液相色谱法，且目前报道的分析方法多存在保留时间不稳定，方法耐用性不好，保留时间容易受试剂质量的影响等不足。浙江嘉兴学院附属第二医院李旭梅公开了一种测定维生素E乳膏中的维生素E含量的反相高效液相色谱法的研究(李旭梅.反相高效液相色谱法测定维生素E乳膏中的维生素E含量.医药导报.2006年5月)；其中维生素E的检测条件为：Zorbax-SB C18柱；流动相：甲醇；检测波长284nm；流速：1.0ml·min-1。采用反相高效液相色谱法的研究较普遍；但软膏剂的基质主要为脂溶性物质，日常报道的反相HPLC法不太适用，且用反相溶剂提取软膏剂中的DL-α-生育酚操作繁琐费时，且影响最终测定结果的准确性。
中国农业大学崔亚娟等发表采用高效液相色谱法检测沙棘籽油中VE含量的文章(崔亚娟.高效液相色谱法检测沙棘籽油中VE含量.中国农业大学食品科学与营养工程学院.食品科技，2007年第8卷)。根据崔亚娟报道的方法采用纯硅胶柱进行软膏中的DL-α-生育酚含量测定，得到的色谱图显示在DL-α-生育酚主峰之前总是出现一个有干扰的肩峰，影响目标物质检测以及含量测定，对于后续的研究带来较大的困难，无法准确地表征软膏的质量情况。
软膏中主要的药物成分为骨化三醇，骨化三醇软膏中除DL-α-生育酚外，同时会添加有少量辅助抗氧剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和DL-α-生育酚醋酸酯，后两种成分对软膏中DL-α-生育酚的测定存在一定的干扰。
在现有的技术里，未见专门针对软膏中的DL-α-生育酚含量检测的分析方法，而已有的参考方法未能实现良好的液相峰型与良好分离，亦未能同时兼顾软膏提取的操作繁琐问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，采用优化条件的前处理和HPLC检测方法，能够使干扰峰和目标组分峰达到有效分离，准确地测定软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、DL-α-生育酚醋酸酯，实现了对软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、DL-α-生育酚醋酸酯含量的控制，从而保证了软膏的质量。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：称取软膏样品，加入正己烷加热溶解后冷却，定容后摇匀、过滤，取续滤液作为供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：分别取DL-α-生育酚对照品、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)对照品和DL-α-生育酚醋酸酯对照品，加入正己烷溶解并定容，摇匀，得到混合对照品溶液；
3)检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和混合对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与混合对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间和色谱峰面积，可同时确定供试品溶液中DL-α-生育酚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、DL-α-生育酚醋酸酯的含量。
优选地，步骤1)中，所述软膏为骨化三醇软膏。
优选地，步骤1)中，所述软膏加入的质量(g)与正己烷加入的体积(ml)之比为1:7～1:8。
更优选地，所述软膏加入的质量(g)与正己烷加入的体积(ml)之比为1:7。
优选地，步骤1)中，所述加热溶解条件为：加热容器：水浴；加热温度：50-70℃；加热时间：1-15min。
更优选地，所述加热溶解条件为：加热容器：电热恒温水浴仪；加热温度：60℃；加热时间：1min。
优选地，步骤1)中，所述冷却至室温。所述室温为20-25℃。
优选地，步骤1)中，所述定容为用正己烷稀释定容。
优选地，步骤1)中，所述过滤为滤膜过滤。所述滤膜过滤采用的滤膜为0.45μm滤膜。所述滤膜过滤采用针筒+PTFE材质针式滤器过滤，所述PTFE材质针式滤器的直径25mm，膜孔径0.45μm。
优选地，步骤1)中，所述续滤液是指：过滤膜时，初滤液后的溶液即为续滤液。所述初滤液丢弃量为1-3ml。
优选地，步骤2)中，所述DL-α-生育酚的CAS号为10191-41-0。所述2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的CAS号为128-37-0。所述DL-α-生育酚醋酸酯的CAS号为7695-91-2。
优选地，步骤2)中，所述对照品溶液的制备，包括以下步骤：
A)取DL-α-生育酚对照品，加入正己烷溶解并定容，配制DL-α-生育酚对照储备溶液；
B)取BHT对照品，加入正己烷溶解并定容，配制BHT对照储备溶液；
C)取DL-α-生育酚醋酸酯对照品，加入正己烷溶解并定容，配制DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液；
D)再分别取步骤A)、B)、C)中的DL-α-生育酚对照储备溶液、BHT对照储备溶液、DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液，加入正己烷稀释并定容，配制为对照品溶液。
更优选地，步骤A)中，所述DL-α-生育酚对照储备溶液中，DL-α-生育酚的浓度为12-24μg/mL。
更优选地，步骤B)中，所述BHT对照储备溶液中，BHT的浓度为120-240μg/mL。
更优选地，步骤C)中，所述DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液中，DL-α-生育酚醋酸酯的浓度为10-15μg/mL。
更优选地，步骤D)中，所述对照品溶液选自单一浓度的DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯的对照品储备溶液或一系列不同浓度的DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯的混合溶液中的一种。
进一步优选地，所述对照品溶液为单一浓度的DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯的混合溶液。
更优选地，步骤D)中，所述对照品溶液中，所述DL-α-生育酚的浓度为1.2～2.4μg/mL，所述BHT的浓度为12～24μg/mL，所述DL-α-生育酚醋酸酯的浓度为1.0～1.5μg/mL。
进一步优选地，所述对照品溶液中，所述DL-α-生育酚的浓度为1.2μg/mL，所述BHT的浓度为12μg/mL，所述DL-α-生育酚醋酸酯的浓度为1.0μg/mL。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法选用的色谱柱为以纯硅胶为填充剂的色谱柱，250mm×4.6mm，5μm。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法的色谱条件为：检测波长：285nm～292nm；流动相：正已烷-异丙醇-2,2-二甲氧基丙烷，其中，正已烷、异丙醇、2,2-二甲氧基丙烷的体积比为994:6:0～998:2:2；分析时间：10～15min；等度洗脱。
更优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：检测波长：292nm；流动相：正已烷-异丙醇-2,2-二甲氧基丙烷，其中，正已烷、异丙醇、2,2-二甲氧基丙烷的体积比为994:6:0.5～994:6:2；分析时间：15min；等度洗脱。
进一步优选地，所述正已烷、异丙醇、2,2-二甲氧基丙烷的体积比为994:6:1。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法还包括有以下色谱条件：流速：0.8～1.3ml/min，优选为1.0ml/min；柱温：室温，优选为20～25℃；进样量：50～100μl，优选为100μl。
优选地，步骤3)中，所述确定供试品溶液中DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚酯的成分含量的方法为外标法。
所述外标法是指：按各品种项下的规定，精密称取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积，按下式计算：
含量(Cx)＝Ax*CR/AR
式中：Ax为供试品的峰面积；
AR为对照品的峰面积；
Cx为供试品的浓度；
CR为对照品的浓度；
可得到相应DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚酯的含量。
如上所述，本发明提供的一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，采用优化反应条件的高效液相方法，进行DL-α-生育酚及其干扰物的检测，实现一次样品分析，同时完成定性和定量分析。包括如下有益效果：
(1)本发明提供的方法简化了软膏样品的提取操作方法，减少了传统HPLC流动相的多种组分和繁琐的工艺，检测方法简捷，能准确地分析测定软膏中的抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物含量。
(2)本发明提供的方法优化了流动相组分的配比，适用性好，使干扰物峰和目标组分峰达到有效分离，分析灵敏度高，准确的对软膏中DL-α-生育酚及其干扰物进行测定，从而实现对软膏中的抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物含量的控制。
(3)本发明提供的方法通过准确地检测抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的含量变化，可保证软膏的质量可控，有利于产品长期稳定性存放和质量监控。
附图说明
图1为流速为1.0ml/min采用本发明的方法检测软膏中DL-α-生育酚及其干扰物的HPLC色谱图。
图2为流速为1.2ml/min采用本发明的方法检测软膏中DL-α-生育酚及其干扰物的HPLC色谱图。
图3为流速为0.8ml/min采用本发明的方法检测软膏中DL-α-生育酚及其干扰物的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
骨化三醇软膏(上海通用药业股份有限公司)；正己烷(纯度95％，TEDIA公司)；DL-α-生育酚对照品(97.7％，EP公司)；BHT对照品(纯度99％，USP公司)；dl-α-生育酚酯对照品(纯度>96％，Sigma Aldrich公司)异丙醇(纯度99.8％，ACS公司)、2,2-二甲氧基丙烷(纯度99％，阿拉丁试剂公司)；纯水(纯水机自制)。
2、仪器
LC-20AD型高效液相色谱仪(SHIMADZU公司)；HWS24型电热恒温水浴仪(上海一恒科技有限公司)；硅胶色谱柱(纯硅胶柱4.6mm×250mm，5μm，CNW公司)；XP-2U型电子天平(梅特勒托利多公司)。
实施例1
1、样品前处理
供试品溶液的制备：称取软膏样品，加入正己烷，在50-70℃水浴中加热溶解1-15min，其中，软膏加入的质量(g)与正己烷加入的体积(ml)之比为1:7～1:8。冷却至室温，用正己烷稀释至刻度定容，再摇匀、过滤，取续滤液作为供试品溶液。过滤为0.45μm滤膜过滤。
对照品溶液的制备：称取DL-α-生育酚对照品，加入正己烷溶解并定容，配制DL-α-生育酚储备溶液，DL-α-生育酚储备溶液中，DL-α-生育酚的浓度为12-24μg/mL。称取BHT对照品，加入正己烷溶解并定容，配制BHT对照储备溶液，BHT对照储备溶液中，BHT的浓度为120-240μg/mL。称取DL-α-生育酚醋酸酯对照品，加入正己烷溶解并定容，配制DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液，DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液中，DL-α-生育酚醋酸酯的浓度为10-15μg/mL。再取DL-α-生育酚对照储备溶液、BHT对照储备溶液、DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液，加入正己烷溶解并定容，配成单一浓度或一系列不同浓度的对照品溶液。对照品溶液中，DL-α-生育酚的浓度为1.2～2.4μg/mL，BHT的浓度为12～24μg/mL，DL-α-生育酚醋酸酯的浓度为1.0～1.5μg/mL。
2、色谱条件
色谱柱：纯硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；
检测波长：285nm～292nm；
流速：0.8～1.3ml/min；
流动相：正已烷-异丙醇-2,2-二甲氧基丙烷，其中，正已烷、异丙醇、2,2-二甲氧基丙烷的体积比为994:6:0.5～994:6:2；
分析时间：10～15min；等度洗脱。
柱温：室温；
进样量：50～100μl。
3、测定
采用外标法，将配制的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按所述色谱条件分析，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间定性，色谱峰面积定量，即得供试品溶液中DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯成分的含量。
实施例2
1、样品前处理
供试品溶液的制备：称取软膏样品3g，置25mL棕色量瓶中，加入21mL正己烷，在60℃水浴中加热溶解1min，其中，软膏加入的质量(g)与正己烷加入的体积(ml)之比为1:7。冷却至室温，用正己烷稀释至定容至25ml，再摇匀、采用0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：称取DL-α-生育酚对照品，加入正己烷溶解并定容，配制DL-α-生育酚储备溶液，DL-α-生育酚储备溶液中，DL-α-生育酚的浓度为12μg/mL。称取BHT对照品，加入正己烷溶解并定容，配制BHT对照储备溶液，BHT对照储备溶液中，BHT的浓度为120μg/mL。称取DL-α-生育酚醋酸酯对照品，加入正己烷溶解并定容，配制DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液，DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液中，DL-α-生育酚醋酸酯的浓度为10μg/mL。再取DL-α-生育酚对照储备溶液、BHT对照储备溶液、DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液，加入正己烷溶解并定容到10ml，配成单一浓度的对照品溶液。对照品溶液中，DL-α-生育酚的浓度为1.2μg/mL，BHT的浓度为12μg/mL，DL-α-生育酚醋酸酯的浓度为1.0μg/mL。
2、色谱条件
色谱柱：纯硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；
检测波长：292nm；
流速：1.0ml/min；
流动相：正已烷-异丙醇-2,2-二甲氧基丙烷，其中，正已烷、异丙醇、2,2-二甲氧基丙烷的体积比为994:6:1；
分析时间：15min；等度洗脱。
柱温：20～25℃；
进样量：100μl。
3、测定
采用外标法，将配制的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按所述色谱条件分析，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图(具体图谱见图1)进行比较，根据相对保留时间定性，色谱峰面积定量，即得供试品溶液中DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯成分的含量。通过图1可知，10.229min为DL-α-生育酚的色谱峰，4.771min为BHT的色谱峰，7.153min为DL-α-生育酚醋酸酯的色谱峰，表明DL-α-生育酚与两种干扰物可以在同一色谱条件下完全分离，主峰出峰时间适宜。
实施例3
1、样品前处理
供试品溶液的制备：称取软膏样品3g，置25mL棕色量瓶中，加入21mL正己烷，在60℃水浴中加热溶解1min，其中，软膏加入的质量(g)与正己烷加入的体积(ml)之比为1:7。冷却至室温，用正己烷稀释至定容至25ml，再摇匀、采用0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：称取DL-α-生育酚对照品，加入正己烷溶解并定容，配制DL-α-生育酚储备溶液，DL-α-生育酚储备溶液中，DL-α-生育酚的浓度为12μg/mL。称取BHT对照品，加入正己烷溶解并定容，配制BHT对照储备溶液，BHT对照储备溶液中，BHT的浓度为120μg/mL。称取DL-α-生育酚醋酸酯对照品，加入正己烷溶解并定容，配制DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液，DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液中，DL-α-生育酚醋酸酯的浓度为10μg/mL。再取DL-α-生育酚对照储备溶液、BHT对照储备溶液、DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液，加入正己烷溶解并定容到10ml，配成单一浓度的对照品溶液。对照品溶液中，DL-α-生育酚的浓度为1.2μg/mL，BHT的浓度为12μg/mL，DL-α-生育酚醋酸酯的浓度为1.0μg/mL。
2、色谱条件
色谱柱：纯硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；
检测波长：292nm；
流速：1.2ml/min；
流动相：正已烷-异丙醇-2,2-二甲氧基丙烷，其中，正已烷、异丙醇、2,2-二甲氧基丙烷的体积比为994:6:1；
分析时间：15min；等度洗脱。
柱温：20～25℃；
进样量：100μl。
3、测定
采用外标法，将配制的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按所述色谱条件分析，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图(具体图谱见图2)进行比较，根据相对保留时间定性，色谱峰面积定量，即得供试品溶液中DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯成分的含量。通过图2可知，9.96min为DL-α-生育酚的色谱峰，4.437min为BHT的色谱峰，6.763min为DL-α-生育酚醋酸酯的色谱峰，表明DL-α-生育酚与两种干扰物可以在同一色谱条件下完全分离，主峰出峰时间适宜。
实施例4
1、样品前处理
供试品溶液的制备：称取软膏样品3g，置25mL棕色量瓶中，加入21mL正己烷，在60℃水浴中加热溶解1min，其中，软膏加入的质量(g)与正己烷加入的体积(ml)之比为1:7。冷却至室温，用正己烷稀释至定容至25ml，再摇匀、采用0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：称取DL-α-生育酚对照品，加入正己烷溶解并定容，配制DL-α-生育酚储备溶液，DL-α-生育酚储备溶液中，DL-α-生育酚的浓度为12μg/mL。称取BHT对照品，加入正己烷溶解并定容，配制BHT对照储备溶液，BHT对照储备溶液中，BHT的浓度为120μg/mL。称取DL-α-生育酚醋酸酯对照品，加入正己烷溶解并定容，配制DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液，DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液中，DL-α-生育酚醋酸酯的浓度为10μg/mL。再取DL-α-生育酚对照储备溶液、BHT对照储备溶液、DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液，加入正己烷溶解并定容到10ml，配成单一浓度的对照品溶液。对照品溶液中，DL-α-生育酚的浓度为1.2μg/mL，BHT的浓度为12μg/mL，DL-α-生育酚醋酸酯的浓度为1.0μg/mL。
2、色谱条件
色谱柱：纯硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；
检测波长：292nm；
流速：0.8ml/min；
流动相：正已烷-异丙醇-2,2-二甲氧基丙烷，其中，正已烷、异丙醇、2,2-二甲氧基丙烷的体积比为994:6:1；
分析时间：15min；等度洗脱。
柱温：20～25℃；
进样量：100μl。
3、测定
采用外标法，将配制的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按所述色谱条件分析，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图(具体图谱见图3)进行比较，根据相对保留时间定性，色谱峰面积定量，即得供试品溶液中DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯成分的含量。通过图3可知，10.485min为DL-α-生育酚的色谱峰，5.010min为BHT的色谱峰，7.453min为DL-α-生育酚醋酸酯的色谱峰，表明DL-α-生育酚与两种干扰物可以在同一色谱条件下完全分离，主峰出峰时间适宜。
实施例5
1、线性关系
精密量取上述实施例2中1一系列浓度的对照品溶液，采用本实施例中的HPLC检测条件，进行高效液相色谱仪分析，以浓度对峰面积获得对照品溶液中DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯成分的标准回归方程、相关系数和线性范围。其中DL-α-生育酚的系列浓度为：0.48μg/ml、0.96μg/ml、1.20μg/ml、1.44μg/ml、1.68μg/ml；而BHT的系列浓度为4.8μg/ml、9.6μg/ml、12.0μg/ml、14.4μg/ml、16.8μg/ml；DL-α-生育酚醋酸酯的系列浓度为：0.40μg/ml、0.80μg/ml、1.00μg/ml、1.20μg/ml、1.50μg/ml；具体结果见表1。
表1线性回归方程补充
成分名称 回归方程 R2 范围/(μg/ml)
DL-α-生育酚 A＝40.46X+0.6919 0.9996 0.48～1.68
BHT A＝7.5304X-7.5703 0.9994 4.80～16.8
DL-α-生育酚醋酸酯 A＝32.705X-1.3219 0.9995 0.40～1.80
注：A为峰面积，X为浓度
根据表1可知，标准回归方程以色谱峰面积为纵坐标(A)，成分浓度为横坐标(X)，同时，对照品溶液中DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯成分在一定浓度的线性范围内均呈良好的线性关系，其标准回归方程的R2均大于0.999。
2、回收率
精密称取3g空白软膏样品(不含DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯)于25ml容量瓶中，分别准确加入一定体积的的DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液，具体按照样品含量的40％(低)、100％(中)、120％(高)加入，每个浓度3份。并按供试品溶液的配制方法进行前处理，依本实施例2中2的色谱条件进样测定，结果见表2。
由表2可知，高、中、低三个浓度DL-α-生育酚的加样平均回收率在100.0～100.5％之间，RSD＜2.0％；BHT加样平均回收率在99.5～99.7％之间，RSD＜2.0％，DL-α-生育酚醋酸酯的加样平均回收率在100.0～100.8％之间，RSD＜2.0％；符合要求，其测定结果的回收率良好。
表2加样回收率结果
3、方法精密度
取同一批软膏样品6份(正常加有抗氧剂的样品)，按上述实施例2中1的供试品溶液前处理方法进行样品处理并进样测试，测定并计算DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯成分含量，精密度具体结果见表3。结果表明，DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯成分含量RSD均小于2.0％，含量平均值分别为9.0μg/g(相当于处方量的100.0％)、100.3μg/g(相当于处方量的100.3％)、8.0μg/g(相当于处方量的100.0％)，说明该方法的精密度良好。
表3精密度考察结果(含量单位μg/g)
4、中间精密度
不同操作人员不同天取以上同一批骨化三醇软膏样品6份，按上述实施例2中1进行供试品溶液前处理，并在上述实施例2中2的色谱条件下在不同仪器和不同色谱柱上进样分析，测定并计算DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯成分峰面积及含量，具体结果见表4。结果表明，DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯成分的相对峰面积RSD均小于2.0％，说明该方法重复性良好。
与表3相比不同操作人员和不同仪器上，DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯含量平均值按按顺序分别为9.0μg/g、100.9μg/g、8.1μg/g。不同时间和不同操作人员不同仪器DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯含量平均值差值分别为0μg/g(0％)、0.6μg/g(0.6％)、0.1μg/g(1.3％)，说明方法精密度良好。
表4中间精密度考察结果(含量单位μg/g)
5、溶液稳定性
精密称取上述实施例2中1的对照品溶液，其中DL-α-生育酚的浓度为1.20μg/ml，BHT的浓度为12.0μg/ml,DL-α-生育酚醋酸酯的浓度为1.0μg/ml。按上述色谱条件，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定，测定并计算DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯成分的峰面积，具体结果见表5。如表5可知，DL-α-生育酚、BHT、DL-α-生育酚醋酸酯成分的峰面积在24小时内的变化RSD小于1.3％，说明该样品溶液在24h内稳定性良好。
表5稳定性考察结果
时间 0h 2h 4h 8h 12h 24h 平均峰面积 RSD
DL-α-生育酚 48.5 49.0 49.3 49.0 49.0 50.0 49.1 0.9％
BHT 82.0 81.5 81.9 82.2 82.0 82.3 82.0 0.3％
DL-α-生育酚醋酸酯 31.5 31.3 31.9 31.0 32.0 32.0 31.6 1.3％
综上所述，本发明提供的一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，采用优化条件的前处理和HPLC检测方法，能够使干扰物峰和目标组分峰达到有效分离，准确地测定软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物，实现了对软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物含量的控制，从而保证了软膏的质量。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：称取软膏样品，加入正己烷加热溶解后冷却，定容后摇匀、过滤，取续滤液作为供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：分别取DL-α-生育酚对照品、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)对照品和DL-α-生育酚醋酸酯对照品，加入正己烷溶解并定容，摇匀，得到混合对照品溶液；
3)检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和混合对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与混合对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间和色谱峰面积，可同时确定供试品溶液中DL-α-生育酚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、DL-α-生育酚醋酸酯的含量。
2.根据权利要求1所述的一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述软膏加入的质量(g)与正己烷加入的体积(ml)之比为1:7～1:8。
3.根据权利要求1所述的一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述加热溶解条件为：加热容器：水浴；加热温度：50-70℃；加热时间：1-15min。
4.根据权利要求1所述的一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述对照品溶液的制备，包括以下步骤：
A)取DL-α-生育酚对照品，加入正己烷溶解并定容，配制DL-α-生育酚对照储备溶液；
B)取BHT对照品，加入正己烷溶解并定容，配制BHT对照储备溶液；
C)取DL-α-生育酚醋酸酯对照品，加入正己烷溶解并定容，配制DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液；
D)再分别取步骤A)、B)、C)中的DL-α-生育酚对照储备溶液、BHT对照储备溶液、DL-α-生育酚醋酸酯对照储备溶液，加入正己烷稀释并定容，配制为对照品溶液。
5.根据权利要求1所述的一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述高效液相色谱法选用的色谱柱为以纯硅胶为填充剂的色谱柱，250mm×4.6mm，5μm。
6.根据权利要求1所述的一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述高效液相色谱法的色谱条件为：检测波长：285nm～292nm；流动相：正已烷-异丙醇-2,2-二甲氧基丙烷，其中，正已烷、异丙醇、2,2-二甲氧基丙烷的体积比为994:6:0～998:2:2；分析时间：10～15min；等度洗脱。
7.根据权利要求6所述的一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件为：检测波长：292nm；流动相：正已烷-异丙醇-2,2-二甲氧基丙烷，其中，正已烷、异丙醇、2,2-二甲氧基丙烷的体积比为994:6:0.5～994:6:2；分析时间：15min；等度洗脱。
8.根据权利要求1所述的一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述高效液相色谱法还包括有以下色谱条件：流速：0.8～1.3ml/min；柱温：室温；进样量：50～100μl。
9.根据权利要求8所述的一种软膏中抗氧剂DL-α-生育酚及其干扰物的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法还包括有以下色谱条件：流速：1.0ml/min；柱温：20～25℃；进样量：100μl。
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