CN110907577A - 同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了同时检测血液中视黄醇和α‑生育酚含量的方法，该方法包括：基于特定的液相条件，利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，各标准溶液中均含有浓度已知的视黄醇和α‑生育酚的标准品及内标物；根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到视黄醇和α‑生育酚的标准曲线方程；将混合内标工作液添加到经处理至少0.2mL待检测血液而得到的血液样本中，经样本前处理以得到待测样本；同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和各个标准曲线方程，计算血液样本中视黄醇和α‑生育酚的含量。本发明能够更加快速的同时检测血液中视黄醇和α‑生育酚的含量。

Description

同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法
技术领域
本发明涉及临床化学技术领域，特别涉及同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法。
背景技术
视黄醇又称维生素A(vitaminA)或抗干眼病因子，是一个具有脂环的不饱和一元醇，属于脂溶性维生素，是构成视觉细胞中感受弱光的视紫红质的组成成分。维生素A可维持人体正常视觉功能和骨骼正常生长发育、维护上皮组织细胞的健康和促进免疫球蛋白的合成、促进生长和生殖等。人体维生素A缺乏时，会出现皮肤干燥、脱屑和脱发等症状，严重缺乏时会产生夜盲症、并通过破坏成骨细胞与破骨细胞间的平衡，或使骨质过度增殖，或使已形成的骨质不吸收，从而影响骨骼的正常生长发育，孕妇如果缺乏维生素A时会直接影响胎儿发育，甚至发生死胎。
α-生育酚是自然界中分布最广泛、含量最丰富、活性最高的维生素E形式，同样是一种脂溶性维生素，它通过促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加，使女子雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产。维生素E缺乏时会出现睾丸萎缩、上皮细胞变性，孕育异常等症状。因此，临床上常用维生素E治疗先兆流产和习惯性流产，对防治男性不育症也有一定帮助。同时，α-生育酚保护T淋巴细胞、抗自由基氧化、抑制血小板聚集，从而降低心肌梗死和脑梗塞的危险性。另外，α-生育酚在烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面也有很好的疗效。尽管维生素E对人体有诸多好处，但也不能随意服用，研究显示，长期大剂量应用维生素E可能出现唇炎、恶心、呕吐、眩晕、视力模糊、胃肠功能及性腺功能紊乱等症状，如果长期服用300～600毫克的大剂量，可诱发血栓性静脉炎、肺栓塞、下肢水肿、使机体免疫功能下降，引发各种疾病，产生严重的毒副作用。因此，及时准确的监测人体内α-生育酚的含量对于维持人类健康具有非常重要的作用。
由于视黄醇和α-生育酚缺乏常见于婴幼儿及孕产妇，而对于婴幼儿，特别是新生儿以及其他存在静脉穿刺的人群来说，末梢采血就显得尤为重要。但末梢采血采集血样量相对较少，样本量一般不能满足临床检测要求。
目前，有关视黄醇、α-生育酚的测定方法主要有分析时间长等缺点。比如，液相色谱串联质谱测定血清中维生素A和E的方法，公开号为CN108107133A，该方法中，视黄醇的出峰时间在1.97min，维生素E(α-生育酚)的出峰时间在2.58min，分析时间为4.5min。再比如，一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，公开号为CN106442754A，该方法中，视黄醇的出峰时间在0.5～0.6min，维生素E(α-生育酚)的出峰时间在2.1～2.4min，分析时间为4.0min。
为克服上述技术的不足，有必要找到一种能够更加快速的同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法。
发明内容
本发明提供了同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法，能够更加快速的同时检测血液中视黄醇和α-生育酚的含量。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供了同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法，包括：
利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的视黄醇的标准品及内标物、α-生育酚的标准品及内标物，不同标准溶液中同一标准品的浓度不同；
根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到视黄醇的标准曲线方程和α-生育酚的标准曲线方程；
将一定量的混合内标工作液添加到一定量的血液样本中，并进行样本前处理以得到待测样本；其中，所述血液样本经处理至少0.2mL待检测血液而得到，所述混合内标工作液中含有浓度已知的视黄醇的内标物和α-生育酚的内标物；
利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样本，得到待测样本的色谱图；
根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算所述血液样本中视黄醇和α-生育酚的含量；
其中，所述检测条件中的液相条件包括：Poroshell 120EC-C8色谱柱，色谱柱的长度为30mm、内径为2.1mm、填料粒径为2.7μm，流动相A为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸的水，流动相B为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸的甲醇，分析时间为2.0-3.0min，柱温为25-35℃，进样量为0.1-30μL，流速为0.35-0.45mL/min。
优选地，所述液相条件包括：流动相A为含体积比为0.1％的甲酸的水，流动相B为含体积比为0.1％的甲酸的甲醇；洗脱方式为梯度洗脱；洗脱过程包括：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.00 15 85
0.01 5 95
0.80 5 95
0.81 15 85
2.50 15 85
。
优选地，所述液相条件包括：柱温为28℃，进样量为5μL，流速为0.4mL/min。
优选地，所述检测条件中的串联质谱条件包括：采用ESI(Electron SprayIonization，电喷雾离子源)，正离子扫描模式，MRM模式(multiple reaction monitoring，多反应监测)，气帘气流速为10-30psi，碰撞气流速为3-9psi，电喷雾电压为3000-5500V，离子源温度为350-750℃，雾化气流速为30-70psi，辅助加热气流速为30-70psi，去簇电压为40-100V，入口电压为5-15V，碰撞池出口电压为7V。
其中，气帘气，即CUR(Curtain Gas)；碰撞气，即CAD(Collision Gas)；电喷雾电压，即IS(Ion Spray Voltage)；离子源温度，即TEM(Temperature)；雾化气，即GS1(IonSource Gas1)；辅助加热气，即GS2(Ion Source Gas2)；去簇电压，即DP(DeclusteringPotential)；入口电压，即EP(Entrance Potential)；碰撞池出口电压，即CXP(CollisionCell Exit Potential)。
优选地，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：
制备至少三个标准工作液，标准工作液中含有浓度已知的视黄醇标准品和α-生育酚标准品，且视黄醇标准品的浓度在0.0039-1.00mg/L中，α-生育酚标准品的浓度在0.039-10.00mg/L中；
利用移液器移取90μL标准工作液、10μL所述混合内标工作液置于离心管中；
将该离心管在1500-2000rpm的转速下涡旋混匀0.5-2min后，移取上清液以得到标准溶液；
其中，所述至少三个标准工作液中，视黄醇标准品的浓度为0.0039mg/L、0.0078mg/L、0.0156mg/L、0.0312mg/L、0.0625mg/L、0.125mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L中的至少三个，α-生育酚标准品的浓度为0.039mg/L、0.078mg/L、0.156mg/L、0.312mg/L、0.625mg/L、1.25mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L中的至少三个。
优选地，所述至少三个标准工作液的个数为9。
本发明提供了同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法，该方法包括：基于特定的液相条件，利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，各标准溶液中均含有浓度已知的视黄醇和α-生育酚的标准品及内标物；根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到视黄醇和α-生育酚的标准曲线方程；将混合内标工作液添加到经处理至少0.2mL待检测血液而得到的血液样本中，经样本前处理以得到待测样本；同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和各个标准曲线方程，计算血液样本中视黄醇和α-生育酚的含量。本发明能够更加快速的同时检测血液中视黄醇和α-生育酚的含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的一种同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法的流程图；
图2是本发明一实施例提供的视黄醇的化学结构式；
图3是本发明一实施例提供的α-生育酚的化学结构式；
图4是本发明一实施例提供的一标准溶液中视黄醇标准品的色谱图；
图5是本发明一实施例提供的一标准溶液中视黄醇的同位素内标物的色谱图；
图6是本发明一实施例提供的一待测样本中视黄醇的色谱图；
图7是本发明一实施例提供的一待测样本中视黄醇的同位素内标物的色谱图；
图8是本发明一实施例提供的一标准溶液中α-生育酚标准品的色谱图；
图9是本发明一实施例提供的一标准溶液中α-生育酚的同位素内标物的色谱图；
图10是本发明一实施例提供的一待测样本中α-生育酚的色谱图；
图11是本发明一实施例提供的一待测样本中α-生育酚的同位素内标物的色谱图；
图12是本发明一实施例提供的视黄醇的线性关系图；
图13是本发明一实施例提供的α-生育酚的线性关系图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明实施例提供了一种同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法，可以包括以下步骤：
步骤101：利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的视黄醇的标准品及内标物、α-生育酚的标准品及内标物，不同标准溶液中同一标准品的浓度不同。
本发明实施例中，所述检测条件中的液相条件包括：Poroshell 120EC-C8色谱柱，色谱柱的长度为30mm、内径为2.1mm、填料粒径为2.7μm，流动相A为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸的水，流动相B为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸的甲醇，分析时间为2.0-3.0min，柱温为25-35℃，进样量为0.1-30μL，流速为0.35-0.45mL/min。
比如，流动相A和流动相B中，甲酸的体积比的取值均可以为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25；分析时间的取值可以为2.0、2.2、2.4、2.5、2.6、2.8或3.0；柱温的取值可以为25、27、29、30、31、33、35；进样量的取值可以为0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30；流速的取值可以为0.35、0.37、0.39、0.40、0.41、0.43、0.45。
步骤102：根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到视黄醇的标准曲线方程和α-生育酚的标准曲线方程。
步骤103：将一定量的混合内标工作液添加到一定量的血液样本中，并进行样本前处理以得到待测样本；其中，所述血液样本经处理至少0.2mL待检测血液而得到，所述混合内标工作液中含有浓度已知的视黄醇的内标物和α-生育酚的内标物。
步骤104：利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样本，得到待测样本的色谱图。
步骤105：根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算所述血液样本中视黄醇和α-生育酚的含量。
本发明实施例中，通过选择小的色谱柱粒径，可以使涡流扩散相减小，柱效增大，从而具有峰宽变窄、峰型变高、峰信噪比提高等优点；通过选择较小的色谱柱柱长，可以在保证分离效果的前提下，使分析时间缩短。
本发明实施例利用高效液相质谱联用法来实现检测，考虑到同位素内标物能避免质谱的基质效应，故优选地，上述内标物可以为同位素内标物。
请参考图2和图3，图2示出了视黄醇的化学结构式，图3示出了α-生育酚的化学结构式。
通常情况下，标准曲线方程的建立至少需要三个坐标点，以保证所建立方程的准确性，故需要预先配制至少三个标准溶液，从而可以根据各个标准溶液检测所得到的色谱图，拟合出视黄醇的标准曲线方程和α-生育酚的标准曲线方程。
详细地，以视黄醇为例，拟合得到的视黄醇的标准曲线方程通常可以为y＝k×x+b。其中，x、y这两个变量，分别可以为各个标准溶液的色谱图中，视黄醇的标准品与相应内标物的峰面积比值，以及，各个标准溶液中，视黄醇的标准品与相应内标物的浓度比值。如此，根据待测样本的色谱图中，视黄醇与其内标物的峰面积比值，以及待测样本中该内标物的浓度，代入标准曲线方程即可计算出待测样本中视黄醇的浓度。据此，可相应获得血液样本中视黄醇的浓度。当然，这一实现方式同样适用于α-生育酚。
本发明实施例中，利用高效液相质谱联用法，来检测血液中视黄醇和α-生育酚的含量，结合人体血液中视黄醇和α-生育酚的含量变化区间，通常仅需较少量的血液即可实现检测，比如待检测血液的用量通常可以低至0.2mL。因此，待检测血液可以取自人体的静脉血或末梢血。由于血液需求量较少，故本发明实施例中的应用场景和应用对象均有所拓展，比如可以适应于婴儿、老人等体内血量较少的特殊群体，以便采样末梢血，以及可以适用于已有静脉血或静脉血经使用后剩余量不多的应用场景。比如，已有静脉血时，即无需重复采样末梢血。
通常情况下，取至少0.2mL待检测血液后，通过对待检测血液进行处理，比如在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得到血清或血浆，即得到上述血液样本。血清或血浆样本置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。
在本发明一个实施例中，样本前处理的实现过程可以包括：
(1)用移液枪移取10μL混合内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入5-50μL血液样本，加入一定量的稀释液，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合0.5-1.5min；
(2)加入一定量的沉淀蛋白试剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合0.5-2min；
(3)加入一定量的萃取剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合3-10min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min；
(4)移取一定量的离心后上清液至干净的1.5mL离心管中，将盛有上清液的1.5mL离心管转移至氮气吹干装置上，将上清液吹干；
(5)移取一定量的复溶液至上清吹干的1.5mL离心管中，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合0.5-1.5min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，移取上清液即为待测样本。
比如，可以移取80μL的上清液作为待测样本。
优选地，样本前处理中，稀释液为纯水，稀释液的量为50-200μL；沉淀蛋白试剂为乙醇，蛋白沉淀剂的量为100-300μL；萃取试剂为正己烷，萃取试剂的量为300-800μL；复溶液为甲醇，复溶液的量为50-200μL。
详细地，采用85％或者更低比例的有机相等度洗脱，通常可以将视黄醇和α-生育酚洗脱出来，与干扰物质的分离度良好，但会大大延长目标物的保留时间，使分析时间扩大。而完全使用有机相通常也可将目标物洗脱出来，保留时间通常较短，但通常不能将目标物与干扰物分离，造成准确度差。
基于此，综合考虑目标物与干扰物的分离度以及尽可能短的分析时间，在本发明一个实施例中，优选地，所述液相条件包括：流动相A为含体积比为0.1％的甲酸的水，流动相B为含体积比为0.1％的甲酸的甲醇；洗脱方式为梯度洗脱；洗脱过程包括：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.00 15 85
0.01 5 95
0.80 5 95
0.81 15 85
2.50 15 85
。
基于上述洗脱方式，不仅可以保证目标物与干扰物的分离度，又使分析时间缩短，同时增加冲洗色谱柱及平衡色谱柱程序，既降低了强保留物质的干扰，又保证了前后多批样本的色谱柱进样状态一致，使样本检测准确度更高，重现性更好。
在本发明一个实施例中，所述液相条件包括：柱温为28℃，进样量为5μL，流速为0.4mL/min。
在本发明一个实施例中，所述检测条件中的串联质谱条件包括：采用ESI，正离子扫描模式，MRM模式，气帘气流速为10-30psi，碰撞气流速为3-9psi，电喷雾电压为3000-5500V，离子源温度为350-750℃，雾化气流速为30-70psi，辅助加热气流速为30-70psi，去簇电压为40-100V，入口电压为5-15V，碰撞池出口电压为7V。
举例来说，气帘气流速的取值可以为10、15、20、25或30；碰撞气流速的取值可以为3、4、5、6、7、8或9，电喷雾电压的取值可以为3000、3500、4000、4500、5000或5500，离子源温度的取值可以为350、400、450、500、550、600、650、700或750，雾化气流速的取值可以为30、40、50、60或70，辅助加热气流速的取值可以为30、40、50、60或70，去簇电压的取值可以为40、50、60、70、80、90或100，入口电压的取值可以为5、7、10、12或15。
在本发明一个实施例中，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：
制备至少三个标准工作液，标准工作液中含有浓度已知的视黄醇标准品和α-生育酚标准品，且视黄醇标准品的浓度在0.0039-1.00mg/L中，α-生育酚标准品的浓度在0.039-10.00mg/L中；
利用移液器移取90μL标准工作液、10μL所述混合内标工作液置于离心管中；
将该离心管在1500-2000rpm的转速下涡旋混匀0.5-2min后，移取上清液以得到标准溶液；
其中，所述至少三个标准工作液中，视黄醇标准品的浓度为0.0039mg/L、0.0078mg/L、0.0156mg/L、0.0312mg/L、0.0625mg/L、0.125mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L中的至少三个，α-生育酚标准品的浓度为0.039mg/L、0.078mg/L、0.156mg/L、0.312mg/L、0.625mg/L、1.25mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L中的至少三个。
详细地，根据不同血液中视黄醇和α-生育酚的含量浮动情况，可以设置标准工作液的浓度范围，以使血液中视黄醇和α-生育酚的含量可以适用于这一浓度范围。
在本发明一个实施例中，所述至少三个标准工作液的个数为9。
综上所述，本发明实施例提供的这一同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法，是将内标法与高效液相色谱质谱联用法相结合，使干扰因素大大减少，且特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，同时分析时间缩短。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明并不仅限于下述实施例。
实施例1
本发明实施例用于获取标准曲线方程。
1.1标准储备液的配制
标准储备液A：精确称取视黄醇标准品10mg置于10mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液A，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月。标准储备液A的浓度临用前校正。
标准储备液B：精确称取α-生育酚标准品10mg，置于10mL容量瓶，用无水乙醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液B，-80℃保存，有效期6个月。标准储备液B的浓度临用前校正。
1.2内标储备液的配制
内标储备液C：取视黄醇-d3标准品2mg置于10mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解，并定容至10mL，得到内标储备液C，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月。
内标储备液D：用2mL无水乙醇溶解α-生育酚-d6标准品(共1mg)，得到标准储备液D，-80℃保存，有效期3个月。
1.3检测用仪器
SCIEX Jasper HPLC MS TRIPLE QUAD 4500MD高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪。
1.4质谱条件
采用ESI，正离子扫描模式，多反应监测模式，气帘气流速：20.0psi；碰撞气流速：6psi；电喷雾电压：5500.0V；离子源温度：550℃；雾化气流速：50psi；辅助加热气流速：50psi；去簇电压：70V；入口电压：10V；碰撞池出口电压：7V。
考虑到自然界中存在两种母离子和子离子均一致的类似物的干扰，而在定量方面为行业金标准的LC-MS/MS属于低分辨质谱，通常不能排除不同化合物产生同一种质荷比的情况，故可增加一种子离子作为定性，以期在保证定量准确性的同时，将干扰降到最低。
基于此，质谱条件的其他参数请参考下述表1。
表1
物质名称 保留时间/min 母离子 子离子 Dwell DP CE EP
视黄醇(定量) 1.12 269.20 213.20 100 70 17.0 10
视黄醇(定性) 1.12 269.20 107.20 100 70 14.0 10
视黄醇-d3 1.12 272.20 216.20 100 70 17.0 10
α-生育酚(定量) 1.69 431.40 165.10 100 70 20.0 10
α-生育酚(定性) 1.69 431.40 137.11 100 70 30 10
α-生育酚-d6 1.69 437.40 171.10 100 70 20.0 10
对于生物样本而言，由于存在复杂的内源性物质的干扰，故通过增加定性离子，使干扰降到最低，同时也避免了个体间差异，特异性强，准确度高。
1.5液相条件
1.5.1色谱柱
色谱柱为安捷伦公司的Poroshell 120EC-C8色谱柱，色谱柱的长度为30mm、内径为2.1mm、填料粒径为2.7μm。
1.5.2流动相
流动相A：含体积比为0.1％的甲酸的水；
流动相B：含体积比为0.1％的甲酸的甲醇。
1.5.3洗脱方式
采用梯度洗脱，洗脱过程如下述表2所示：
表2
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.00 15 85
0.01 5 95
0.80 5 95
0.81 15 85
2.50 15 85
1.5.4其他
分析时间为2.5min；柱温为28℃；进样量为5μL；流速为0.40mL/min。
1.6标准工作液的配制
标准工作液：取适量标准储备液A、标准储备液B，用无水乙醇进行稀释混合，得到含有0.0039-1mg/L视黄醇、0.039-10mg/Lα-生育酚的九个标准工作液，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月。
本发明实施例中，九个标准工作液中，视黄醇标准品的浓度分别为0.0039mg/L、0.0078mg/L、0.0156mg/L、0.0312mg/L、0.0625mg/L、0.125mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L；α-生育酚标准品的浓度分别为0.039mg/L、0.078mg/L、0.156mg/L、0.312mg/L、0.625mg/L、1.25mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L。
可见，这九个标准工作液中，各个标准品的浓度不同且依次递增，视黄醇标准品的浓度最低可达到0.0039mg/L，α-生育酚标准品的浓度最低可达到0.039mg/L。
1.7混合内标工作液的配制
混合内标工作液：取适量内标储备液C和内标储备液D，用无水乙醇进行稀释，得到含0.1125mg/L的视黄醇-d3、1.125mg/L的α-生育酚-d6的混合内标工作液，-80℃保存，避光，有效期3个月。
1.8标准溶液的配制
对于每一个标准工作液，用移液器移取90μL标准工作液和10μL混合内标工作液分别置于离心管中，然后在2000rpm的转速下涡旋混匀1min后，取上清液作为待检测的标准溶液。
如此，针对九个标准工作液，可以得到九个标准溶液。
1.9检测标准溶液，生成标准曲线方程
得到各个标准溶液后，即可利用高效液相串联质谱仪对九个标准溶液分别进行检测，对应得到各个标准溶液的色谱图。
请参考图4、图5、图8和图9，图4示出了一标准溶液中视黄醇标准品的色谱图，图5示出了一标准溶液中视黄醇的同位素内标物(即上述视黄醇-d3标准品)的色谱图；图8示出了一标准溶液中α-生育酚标准品的色谱图，图9示出了一标准溶液中α-生育酚的同位素内标物(即上述α-生育酚-d6标准品)的色谱图。
从标准溶液的色谱图中，可以得到视黄醇标准品、α-生育酚标准品的色谱峰面积和各个内标物的色谱峰面积，然后结合各个标准溶液中标准品和内标物的已知浓度，即可得到视黄醇的标准曲线方程和α-生育酚的标准曲线方程。
请参考图12和图13，图12示出了得到的视黄醇线性关系图，图13示出了得到的α-生育酚线性关系图。根据线性关系图，可以得到下述表3。
表3
Figure BDA0002296668630000141
由表3可知，视黄醇在0.0035-0.9mg/L的线性范围内，相关系数R2＞0.9900，表示线性关系良好；α-生育酚在0.035-9.0mg/L的线性范围内，相关系数R2＞0.9900，表示线性关系良好。基于这两个标准曲线方程来计算血液中视黄醇和α-生育酚含量时，准确性高，误差小。
此外，由于视黄醇在人体内的含量差异较大，有2％-4.6％的临床检测样本体内，视黄醇含量位于0.0035-0.1mg/L之间，而这部分样本由于视黄醇含量低，通常不能被准确定量。请参考上述表3，上述视黄醇的标准曲线方程线性关系良好，且线性范围为0.0035-0.9mg/L，故可以基于此，对含有低浓度视黄醇的样本进行检测，以对其中视黄醇的含量作准确定量。
同理，基于上述α-生育酚的标准曲线方程，针对α-生育酚含量较低的样本，可以对这部分样本中α-生育酚的含量作准确定量。
得到标准曲线方程后，即可对血液样本作前处理，以得到待测样本，进而在相同检测条件下，对待测样本进行检测，结合得到的标准曲线方程，即可得到血液样本中视黄醇和α-生育酚的含量。
实施例2
本发明实施例用于检测末梢血中视黄醇和α-生育酚的含量。
2.1获取血液样本
血液样本经处理至少0.2mL待检测血液而得到。得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。
2.2血液样本前处理
用移液枪移取10μL混合内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入10μL血液样本，加入100μL的纯水，在2000rpm的转速下涡旋混合1min后，再加入200μL的无水乙醇，在2000rpm的转速下涡旋混合1min后，加入400μL的正己烷，在2000rpm的转速下涡旋混合5min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，移取350μL离心后上清液至干净的1.5mL离心管中，将盛有上清液的1.5mL离心管转移至氮气吹干装置上，将上清液吹干，移取100μL的甲醇至上清吹干的1.5mL离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合1min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min，移取80μL上清液即为待测样本。
2.3待测样本检测
在实施例1的检测条件下，使用同一高效液相串联质谱仪对待测样本进行检测，得到待测样本的色谱图中。
请参考图6、图7、图10和图11，图6示出了待测样本中视黄醇的色谱图，图7示出了待测样本中视黄醇的同位素内标物(即上述视黄醇-d3标准品)的色谱图，图10示出了待测样本中α-生育酚的色谱图，图11示出了待测样本中α-生育酚的同位素内标物(即上述α-生育酚-d6标准品)的色谱图。
请参考图4至图7，待测样本中视黄醇的保留时间与标准溶液中视黄醇标准品的保留时间相一致，以视黄醇的同位素标记物为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。
请参考图8至图11，待测样本中α-生育酚的保留时间与标准溶液中α-生育酚标准品的保留时间相一致，以α-生育酚的同位素标记物为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜、特异性强、准确度和灵敏度高。
2.4待测样本中视黄醇和α-生育酚含量的计算
根据待测样本的色谱图中，视黄醇、α-生育酚和各个内标物的色谱峰面积，以及待测样本中各个内标物的已知浓度，对应代入上述2个标准曲线方程，即可计算出待测样本中视黄醇和α-生育酚的含量。
实施例3
本发明实施例用于测定定量限和检测限。
选择低浓度的质控样本，用生理盐水做不同程度的稀释，从而制备得到不同浓度的血液样本稀释液，并按实施例2中的血液样本前处理方式及测定条件，对这些血液样本稀释液进行测定。经检测发现，视黄醇、α-生育酚的检测限和定量限如下所示：
视黄醇
(1)检测限(LOD)：0.013mg/L，S/N＝3。
(2)定量限(LOQ)：0.042mg/L，S/N＝10。
α-生育酚
(1)检测限(LOD)：0.0009mg/L，S/N＝3。
(2)定量限(LOQ)：0.003mg/L，S/N＝10。
由本实施例可知，视黄醇的检测限及定量限均小于0.042mg/L，α-生育酚的检测限及定量限均小于0.003mg/L，灵敏度很高，对视黄醇或α-生育酚含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。
实施例4
本发明实施例用于测定回收率和精密度。
分别取含视黄醇和α-生育酚的标准工作液，配制成高、中、低3种浓度，进行加样回收率和精密度实验，按实施例2中的检测方法进行测定，分析测定3批次，视黄醇、α-生育酚的回收率和精密度如表4所示。
表4
Figure BDA0002296668630000171
可以看出，α-生育酚、视黄醇在低、中、高的3个添加水平范围内，平均回收率为91.23％～107.28％，重现性良好，加样回收率良好，精密度为0.84％～11.81％，检测结果的准确度较高，可消除系统误差。
对比例1
一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，公开号为CN106442754A。
一、液相分析
本发明实施例中，可以使用安捷伦公司的Poroshell 120EC-C8色谱，色谱柱的长度为30mm、内径为2.1mm、填料粒径为2.7μm，梯度洗脱的洗脱方式如上述表2所示。请参考图4和图6，视黄醇的出峰时间在1.12min，α-生育酚的出峰时间在1.69min，分析时间为2.5min，两出峰时间均在整个分析过程中的偏中间位置，且峰型较窄，基本无杂质。
此外，本发明实施例基于优化的洗脱方式，既保证了目标物与干扰物的分离度，又使分析时间缩短，同时增加冲洗色谱柱及平衡色谱柱程序，既降低了强保留物质的干扰，又保证了前后多批样本的色谱柱进样状态一致，使样本检测准确度更高，重现性更好。
而在对比文件1中，使用安捷伦公司的ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为2.1mm、填料粒径为5μm，梯度洗脱的洗脱方式包括：流动相A为含体积比为0.1％的甲酸的甲醇，流动相B为含体积比为0.1％的甲酸的水，流动相A和流动相B的百分比在0.31～2.00min内为95:5，其他时间为85:15，分析时间为4min。视黄醇的出峰时间基本在0.55min，α-生育酚的出峰时间基本在2.20min，视黄醇出峰较早，且峰型相对略宽。
可见，本发明实施例分析时间显著缩短，且出峰效果更好。
二、质谱分析
本发明实施例中，不仅有定量离子，还可以增加一种子离子作为定性，以使干扰降到最低，同时也保证了定量的准确性。
而对比文件1中，仅有定量离子，故存在不能排除不同化合物产生同一种质荷比的情况。
对于生物样本而言，由于存在复杂的内源性物质的干扰，本发明实施例通过增加定性离子，使干扰降到最低，同时也避免了个体间差异，相较于对比文件1来说，本发明实施例所用检测方法的特异性更强，准确度更高。
三、检测对象及检测效果
本发明实施例中，标准曲线方程涉及到九个标准工作液，对于这九个标准工作液，视黄醇的浓度区间为0.0039～1.00mg/L；α-生育酚的浓度区间为0.039～10.00mg/L；且两者在相应线性范围内线性关系良好。此外，视黄醇的检测限可低至0.013mg/L，定量限可低至0.042mg/L，α-生育酚的检测限可低至0.0009mg/L，定量限可低至0.003mg/L。
而对比文件1中，标准曲线方程涉及到九个标准工作液，对于这九个标准工作液，视黄醇的浓度区间为0.014～0.90μg/mL(mg/L)；α-生育酚的浓度区间为0.14～9.00μg/mL；且两者在相应线性范围内线性关系良好。此外，视黄醇的检测限可低至0.20mg/L，定量限可低至0.60mg/L，α-生育酚的检测限可低至0.02mg/L，定量限可低至0.06mg/L。
可见，本发明实施例中，浓度区间的浓度下限远小于对比文件1中的相应浓度下限，如此可以应用于视黄醇和/或α-生育酚的含量较低的血液样本，能够准确检测该类血液样本中视黄醇和α-生育酚的含量。
举例来说，视黄醇在人体内的含量差异较大，有2％-4.6％的临床检测样本体内视黄醇含量位于0.0035-0.01mg/L之间。对于这类样本，可以采用本发明实施例所提供的检测方法进行检测，且检测准确率高。
对比例2
液相色谱串联质谱测定血清中维生素A和E的方法，公开号为CN108107133A。
一、液相分析
如上所述，本发明实施例中，分析时间为2.5min，且出峰效果好。
而在对比文件2中，洗脱方式与本发明实施例中不同，分析时间为4.5min，视黄醇的出峰时间基本在1.97min，α-生育酚的出峰时间基本在2.58min。
可见，本发明实施例分析时间显著缩短。
二、检测对象及检测效果
如上所述，本发明实施例中，视黄醇的浓度区间为0.0039～1.00mg/L；α-生育酚的浓度区间为0.039～10.00mg/L。
而对比文件2中，视黄醇的浓度区间为0.05～6.22μg/mL(mg/L)；α-生育酚的浓度区间为0.37～47.1mg/L。
可见，本发明实施例中，浓度区间的浓度下限远小于对比文件2中的相应浓度下限，如此可以应用于视黄醇和/或α-生育酚的含量较低的血液样本，能够准确检测该类血液样本中视黄醇和α-生育酚的含量。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法，其特征在于，包括：
利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的视黄醇的标准品及内标物、α-生育酚的标准品及内标物，不同标准溶液中同一标准品的浓度不同；
根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到视黄醇的标准曲线方程和α-生育酚的标准曲线方程；
将一定量的混合内标工作液添加到一定量的血液样本中，并进行样本前处理以得到待测样本；其中，所述血液样本经处理至少0.2mL待检测血液而得到，所述混合内标工作液中含有浓度已知的视黄醇的内标物和α-生育酚的内标物；
利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样本，得到待测样本的色谱图；
根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算所述血液样本中视黄醇和α-生育酚的含量；
其中，所述检测条件中的液相条件包括：Poroshell 120EC-C8色谱柱，色谱柱的长度为30mm、内径为2.1mm、填料粒径为2.7μm，流动相A为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸的水，流动相B为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸的甲醇，分析时间为2.0-3.0min，柱温为25-35℃，进样量为0.1-30μL，流速为0.35-0.45mL/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述液相条件包括：
流动相A为含体积比为0.1％的甲酸的水，流动相B为含体积比为0.1％的甲酸的甲醇；
洗脱方式为梯度洗脱；
洗脱过程包括：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0.00 15 85 0.01 5 95 0.80 5 95 0.81 15 85 2.50 15 85
。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述液相条件包括：柱温为28℃，进样量为5μL，流速为0.4mL/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述检测条件中的串联质谱条件包括：采用电喷雾离子源ESI，正离子扫描模式，多反应监测MRM模式，气帘气流速为10-30psi，碰撞气流速为3-9psi，电喷雾电压为3000-5500V，离子源温度为350-750℃，雾化气流速为30-70psi，辅助加热气流速为30-70psi，去簇电压为40-100V，入口电压为5-15V，碰撞池出口电压为7V。
5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于，
在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：
制备至少三个标准工作液，标准工作液中含有浓度已知的视黄醇标准品和α-生育酚标准品，且视黄醇标准品的浓度在0.0039-1.00mg/L中，α-生育酚标准品的浓度在0.039-10.00mg/L中；
利用移液器移取90μL标准工作液、10μL所述混合内标工作液置于离心管中；
将该离心管在1500-2000rpm的转速下涡旋混匀0.5-2min后，移取上清液以得到标准溶液；
其中，所述至少三个标准工作液中，视黄醇标准品的浓度为0.0039mg/L、0.0078mg/L、0.0156mg/L、0.0312mg/L、0.0625mg/L、0.125mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L中的至少三个，α-生育酚标准品的浓度为0.039mg/L、0.078mg/L、0.156mg/L、0.312mg/L、0.625mg/L、1.25mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L中的至少三个。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述至少三个标准工作液的个数为9。
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