一种牛肉产地的标志物筛选方法及其应用
技术领域
本发明涉及牛肉产地鉴定领域,具体而言,涉及一种牛肉产地的标志物筛选方法及其应用。
背景技术
近年来,在全球经济的迅速发展下,人们生活水平随之提高,同时因食品安全问题频繁发生,人们关注的生活重心从温饱问题转向了营养、健康和安全。食品作为一种商品流动于市场,利益的争夺促使一些商家不顾食品质量铤而走险,因而导致许多食品安全问题。食品安全追溯的主要作用是在食品发生安全问题时,能及时追溯到问题发生的环节;可以及时对出现问题的食品进行召回以及对一些行为进行监督和识别。
牛肉是人们最常实用的肉类之一,人均牛肉消费量的快速增长及国际肉牛生产、加工、消费产业链等的迅速发展极大促进了牛肉产业的发展。随着经济的全球化,食品贸易往来越来越频繁,各国对食品产地追溯具有不同程度的要求,食品产地溯源技术研究受到广泛关注。
目前常用的产地溯源研究方法主要有:条形码、电子标签、同位素比率分析、矿物元素含量分析、近红外光谱分析、微生物图谱、感官特性等方法。食品产地溯源是食品溯源的重要组成部分。Cosima等人已有研究采用m/z 703和m/z 706的离子丰度作为山羊奶与秒羊奶中掺杂牛奶的生物标志物,为市场上鉴别掺假提供了一种新方法。而对于牛肉产地的鉴别方法尤其是标志物筛选的方法目前还缺乏研究。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种牛肉产地的标志物筛选方法。所述的筛选方法基于非靶向脂质组学的分析,并采用化学计量学分析了差异标记物,用以此方法筛选出的标志物进行产地鉴别,具有高准确率。
本发明的第二目的在于提供一种鉴别不同国家的牛肉的方法,该方法以用上述的牛肉产地的标志物筛选方法得到的标志物进行鉴别,具有鉴别准确率高等优点。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
一种牛肉产地的标志物筛选方法,包括:
1)使用色谱-质谱联用对不同产地牛肉的脂质样品进行检测;
2)采用非靶向脂质轮廓分析以及主成分分析对检测结果进行分析;
3)对分析结果进行显著性差异分析得到所述不同产地牛肉脂质之间的差异因子;
4)将所述差异因子与脂质组学数据库对比后得到标志物。
一种鉴别不同国家的牛肉的方法,使用上述的方法得到的方法筛选得到的标志物进行鉴别。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:本发明采用色谱-质谱联用分析对不同产地的牛肉样品进行非靶向脂质组的分析,并采用化学计量学分析了差异标记物,并对部分差异化合物进行了初步的定性分析。基于定性结果,本发明初步筛选出27种PE可鉴别进口与国产牛肉的差异因子,判断可作为标志物,并构建PLS-DA模型,模型预测准确率为96.296%。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为一个实施例中的澳大利亚牛肉样本的典型总离子流谱图;
图2为一个实施例中的加拿大牛肉样本的典型总离子流谱图;
图3为一个实施例中的新西兰牛肉样本的典型总离子流谱图;
图4为一个实施例中的乌拉圭牛肉样本的典型总离子流谱图;
图5为一个实施例中的中国牛肉样本的典型总离子流谱图;
图6为一个实施例中的牛肉样本PCA主成分分析图;
图7为一个实施例中的牛肉样本PCA主成分分析得分图;
图8为一个实施例中的进口组与国产组PCA主成分分析得分图;
图9为一个实施例中的差异因子PCA主成分分析图;
图10为一个实施例中的差异因子PCA主成分分析得分图。
具体实施方式
一种牛肉产地的标志物筛选方法,包括:1)使用色谱-质谱联用对不同产地牛肉的脂质样品进行检测;2)采用非靶向脂质轮廓分析以及主成分分析对检测结果进行分析;3)对分析结果进行显著性差异分析得到所述不同产地牛肉脂质之间的差异因子;4)将所述差异因子与脂质组学数据库对比后得到标志物。
在一些实施方式中,所述产地为不同的国家。
在一些实施方式中,所述脂质样品的提取方法包括Folch溶剂提取法。
在一些实施方式中,所述Folch溶剂的组成包括甲醇和三氯甲烷,所述甲醇和三氯甲烷的体积比为1:(1.8~2.2)。在一些实施例中,所述体积比还可以为1:2、1:1.9、1:2.1等(此范围内结果基本一致)。
在一些实施方式中,所述脂质样品和所述Folch溶剂的质量体积比为1:(0.3~0.8)。在一些实施例中,所述质量体积比还可以为1:0.5、1:0.7、1:0.4等(此范围内结果基本一致)。
在一些实施方式中,所述脂质样品和所述Folch溶剂混合后,进行超声并离心取上清液以得到脂质。
在一些实施方式中,所述离心的条件为在转速为8000~12000r/min条件下离心25~35min。在一些实施例中,所述离心的条件还可以为在转速为9000r/min条件下离心32min、在转速为10000r/min条件下离心30min、在转速为11000r/min条件下离心27min等(此范围内结果基本一致)。
在一些实施方式中,所述Folch溶剂提取后还包括:脂质的纯化、浓缩和复溶。
在一些实施方式中,所述纯化的方法为用水清洗后再二次离心,所述水的体积量与所述Folch溶剂的体积量相同。
在一些实施方式中,所述二次离心的条件为在转速为4000~6000r/min条件下离心12~17min。在一些实施例中,所述离心的条件还可以为在转速为5000r/min条件下离心15min、在转速为4000r/min条件下离心17min、在转速为6000r/min条件下离心13min等(此范围内结果基本一致)。
在一些实施方式中,所述浓缩的方法为氮吹。
在一些实施方式中,所述复溶为使用Folch溶剂复溶。
在一些实施方式中,所述脂质样品的提取方法包括:取牛肉粉2g,采用Folch溶剂(三氯甲烷/甲醇2:1,1mL),超声3min,10000r/min离心30min,取上清加水1mL,5000r/min离心15min,取下层脂质,氮吹后用Folch溶剂复溶至1mL后得到所述脂质样品。优选地,所述牛肉粉为冻干牛肉粉。
在一些实施方式中,所述色谱为超高效液相色谱。
在一些实施方式中,所述超高效液相色谱使用C18色谱柱。优选地,所述C18色谱柱为3.0×150,2.7μm。
在一些实施方式中,所述超高效液相色谱以流动A和流动相B进行梯度洗脱;所述流动相A的组成为:55%~65%(v/v)乙腈水溶液、4.5mM~5.5mM乙酸铵;所述流动相B的组成为:85%~92%(v/v)异丙醇乙腈溶液、4.5mM~5.5mM乙酸铵。
所述乙腈水溶液的溶剂为水。所述55%~65%(v/v)乙腈水溶液的组成包括55%~65%的乙腈和35%~45%的水。在一些实施例中,所述流动相A的组成还可以为:60%(v/v)乙腈水溶液、5mM乙酸铵等。
所述异丙醇乙腈溶液的溶剂为乙腈。所述85%~92%(v/v)异丙醇乙腈溶液的组成包括85%~92%的异丙醇和8%~15%的乙腈。在一些实施例中,所述流动相B的组成还可以为:90%(v/v)异丙醇乙腈溶液、5mM乙酸铵等。
在一些实施方式中,所述梯度洗脱的条件包括:0~3min时,35%流动相B;3~8min时,B相从35%升至60%;8~16min时,B相从60%升至80%;16~22min时,B相从80%升至100%;22~26min时,100%流动相B;26.1min时,65%流动相A;各数值参数可在±5%的范围内波动。(在此范围内结果基本一致)
在一些实施方式中,所述质谱为四极杆飞行时间高分辨率质谱。
在一些实施方式中,所述四极杆飞行时间高分辨率质谱的条件选自a~g中的至少一个:
a.正离子扫描,碎裂电压为125V;
b.干燥气温度为225℃;
c.干燥气流速为7L/min;
d.雾化气压力为35psi;
e.鞘气温度为325℃;
f.鞘气流量为11L/min;
g.毛细管电压为3000V;
其中上述条件a~g中涉及的各个数值参数的浮动范围为该数值参数±10%。
在一些实施方式中,所述色谱-质谱联用分析为超高效液相色谱-高分辨质谱联用分析。
超高效液相色谱-高分辨质谱即UPLC-HRMS。
在一些实施方式中,步骤2)中,所述检测结果包括进行色谱峰对齐和峰提取后得到的特征色谱峰。
通过色谱-质谱联用分析,得到不同产地牛肉样品的质谱总离子流图,通过提取,找出特征离子。
在一些实施方式中,根据特征离子对样品做PCA主成分分析,初步识别不同样品的区分度。
在一些实施方式中,根据区分度,做分组调整,再进行PCA主成分分析以确认分组是否合理。
在一些实施方式中,可多次使用PCA主成分分析以检测分组是否合理,标志物是否更优。
PCA是从原始变量之间的相互关系入手,根据变异最大化的原则将其线性变换到几个独立的综合指标上(即主成分),取2~3个主成分作图,直观地描述不同组别之间的代谢模式差别和聚类结果,并通过载荷图寻找对组间分类有贡献的原始变量作为生物标志物。通常用于观察是否具有组间分类趋势和数据离群点。在组间分类趋势明显时,说明其中一定有能够分类的标志物。
在一些实施方式中,步骤3)中,所述显著性差异分析的条件包括:显著性差异p-value<0.05,Fold Change≥10,VIP>1。
在一些实施方式中,先由Profinder软件对质谱采集软件获得的数据进行特征离子色谱峰的提取,然后导入MPP(mass profiler professional)软件中,取中位数作为平均数,归一化后的数据使用t检验对两组间差异进行显著性分析,通过p值(p-value<0.05)和倍数变化(Fold Change≥10)进行过滤,继而获得具有显著性差异的化合物即差异因子。借助统计分析软件SIMCA,将差异因子数据导入到SIMCA软件中,以每两组样品为基础,建立正交偏最小二乘法模型,设置条件为VIP>1,得到不同产地牛肉脂质之间的差异因子。
在一些实施方式中,将所述差异因子与脂质组学数据库对比后得到标志物。
在一些实施方式中,步骤4)包括:通过对比数据库并借助定性软件对特征离子进行鉴别,以及将MS/MS分析的结果与数据库进行对比以确认标志物。
在一些实施方式中,所述特征离子用步骤1)中得到的m/z值表示。
在一些实施方式中,步骤4)之后,还包括将所述标志物进行判别分析。
通过匹配LipidMaps数据库,实现标记物鉴定。
在一些实施方式中,利用Masshunter定性软件与Metlin小分子代谢物数据库进行匹配,以及利用Masshunter定性软件对精确m/z值进行分子式匹配,对离子进行推断性鉴定。
在一些实施方式中,进行MS/MS分析,对得到的MS2碎片与Metlin小分子代谢物数据库中的碎片信息进行比对,从而确证化合物。
在一些实施方式中,根据数据库和质谱结果制作差异因子定性分析表。根据分析表选择最佳标志物。
在一些实施方式中,以所述差异因子做PCA主成分分析。
在一些实施方式中,将所述标志物进行判别分析。
在一些实施方式中,所述判别分析的方法为用所述标志物构建PLS-DA模型,并检验所述PLS-DA模型的准确度。
PLS-DA即偏最小二乘判别分析,是在降维的同时结合回归模型,并利用一定的判别阈值对回归结果进行判别分析。通过最大化自变量数据和应变量数据集之间的协方差来构建正交得分向量(潜变量或主成分),从而拟合自变量数据和应变量数据之间的线性。PLS-DA得分图常用来直观地展示模型的分类效果,图中两组样品分离程度越大,说明分类效果越显著。
本发明的另一方面在于提供一种鉴别不同国家的牛肉的方法,使用上述的方法筛选得到的标志物进行鉴别。
在一些实施方式中,所述标志物为磷脂酰乙醇胺。
在一些实施方式中,所述不同国家包括澳大利亚、中国、加拿大、新西兰和乌拉圭中的至少一个。
在一些实施方式中,本发明构建了基于PE类生物标志物的进口牛肉与国产牛肉鉴别方法。以磷脂酰乙醇胺(PE)为鉴别进口与国产牛肉的差异因子,构建PLS-DA模型,模型预测准确率为96.296%。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
1.样本信息
样品选择冻干牛肉粉,包括:澳大利亚样品30份、中国样品30份、加拿大样品10份、新西兰样品11份、乌拉圭样品8份。
2.样品前处理
取每份牛肉粉2g,采用Folch溶剂(三氯甲烷/甲醇2:1,1mL),超声3min,10 000r/min离心30min,取上清加水1mL,5000r/min离心15min,取下层脂质,氮吹,然后用Folch溶剂复溶至1mL后得到待测样品。
3.UPLC-HRMS
液相条件:安捷伦1290UPLC,安捷伦EC C18色谱柱(3.0×150,2.7μm);
流动相A,乙腈:水(6:4),5mM乙酸铵;流动相B,异丙醇:乙腈(9:1),5mM乙酸铵;
条件:0~3min,35%B相,3~8min,B相从35%升至60%,8~16min,B相从60%升至80%,16~22min,B相从80%升至100%,22~26min,100%B相,26.1min 65%A。
质谱条件:安捷伦6545高分辨质谱(Dual AJS ESI源);
进样量2μL,正离子扫描,碎裂电压:125V;干燥气温度:225℃;干燥气流速:7L/min;雾化气压力:35psi;鞘气温度:325℃;鞘气流量:11L/min;毛细管电压:3000V。
4.非靶向脂质轮廓分析
由各个国家的牛肉样品的质谱总离子流图(图1~5)可得,牛肉脂质主要有三大类构成,分别为脂肪酸(Fatty acids,FA)、甘油三酯类(triglycerides,TG)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)。
对上述样品进行PCA主成分分析(见图6、图7),可得国产牛肉与进口牛肉可较好的区分,但不同国家的进口牛肉之间不可区分。其原因可能是,本次实验所采用的本土牛肉主要为科尔沁牛,科尔沁牛是以西门塔尔牛为父本,蒙古牛、三河牛以及蒙古牛的杂种母牛为母本采用育成杂交方法培育而成。本次实验所采用的进口牛肉主要来自澳大利亚、新西兰、加拿大及乌拉圭,其中澳大利亚主要肉牛品种包括安格斯、海福特、夏洛来、西门塔尔和抗旱王等。新西兰肉牛的主要品种是安格斯牛,加拿大的也以夏洛列、西门托和里默辛开始被为主,乌拉圭则80%的肉用牛是海福特(Hereford)肉牛品种,10%为安格斯。进口牛肉不同国家的样品区分度较低可能是由于品种过度相近导致。
5.差异因子筛选和标记物初步鉴定
根据上述实验结果,将样品重新分离为进口组与国产组,重新分组后的PCA模型如图8所示。
数据分析,采用安捷伦Profinder对Masshunter采集软件获得的数据进行特征提取,然后导入MPP(mass profiler professional)软件中,取中位数作为平均数,归一化后的数据使用t检验对两组间差异进行显著性分析,通过p值(p-value<0.05)和倍数变化(Fold Change≥10)进行过滤,获得具有显著性差异的化合物,即得到可能的差异因子共83种,以差异因子做主成分分析,结果如图9、图10所示(红色表示进口牛肉,黄色表示国产牛肉)。接着利用Masshunter定性软件对精确m/z值进行分子式匹配,对离子进行推断性鉴别;然后进行MS/MS分析,对得到的MS2碎片与Metlin小分子代谢物数据库以及在线网络数据库Metlin(http://metlin.scripps.edu/)中的碎片信息进行比对,从而确证化合物。通过匹配LipidMaps数据库,鉴定出其中的33种即可定性部分(见表1)。
表1差异因子定性分析表
6.基于差异因子PE的判别分析
由表1结果所得,进口牛肉与国产牛肉的大部分差异物为磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)。因此采用表中27个PE作为差异因子构建PLS-DA模型,其模型预测准确率为96.296%。
采用UPLC-HRMS对澳大利亚、中国、加拿大、新西兰及乌拉圭的牛肉样品进行了基于非靶向脂质组的分析,并采用化学计量学分析了差异标记物,并对部分差异化合物进行了初步的定性分析。
采用非靶向脂质轮廓分析结合主成分分析可区分进口牛肉与国产牛肉样品;在显著性差异p-value<0.05,Fold Change≥10条件下,分析得到可能差异化合物共83种,通过比对LipidMaps数据库及Metlin小分子代谢物数据库鉴定出其中的33种,基于定性结果,本实验初步筛选出27种PE作为鉴别进口与国产牛肉的差异因子,构建PLS-DA模型,模型预测准确率为96.296%,即以PE为标志物鉴别进口与国产牛肉有很高的准确率。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,但本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。