WO2005032542A1 - 空胞化毒素中和剤 - Google Patents

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WO2005032542A1
WO2005032542A1 PCT/JP2004/014979 JP2004014979W WO2005032542A1 WO 2005032542 A1 WO2005032542 A1 WO 2005032542A1 JP 2004014979 W JP2004014979 W JP 2004014979W WO 2005032542 A1 WO2005032542 A1 WO 2005032542A1
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proanthocyanidins
toxin
active ingredient
neutralizing agent
hop
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PCT/JP2004/014979
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Inventor
Kinnosuke Yahiro
Motoyuki Tagashira
Toshiya Hirayama
Masatoshi Noda
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Asahi Breweries, Ltd.
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    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/58—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4
    • C07D311/60—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4 with aryl radicals attached in position 2
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    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy

Definitions

  • the present invention contains, as an active ingredient, proanthocyanidins having an effect of detoxifying vacuolated toxin produced by Helicopauc pulpili, particularly preferably proanthocyanidins obtained from apples or hops.
  • Hops are a perennial plant of the hemp family, and their cones (matures of unfertilized female flowers) are generally called hops. Hops have other parts, such as leaves, vines and roots, in addition to the flower part.
  • the rubulin part (yellow granules formed at the base of the inner bract of cones) present in the hop cones is the main bitterness and aroma of hops, and along with yeast and malt in beer brewing. It is an important beer ingredient.
  • Hops are commonly used as sedatives and anti-aphrodisiacs in folk medicine. Hop bracts are hop cones excluding the lubricated portion and are not useful for beer brewing. In some cases, they are removed during brewing and are produced as a by-product. At that time, hop bracts have not been found to be any particularly effective use other than being used as fertilizer for soil improvement, and the development of higher value-added uses is desired.
  • Patent Documents 1, 2, 3, 4, 5, and 6 filed by the applicant of the present invention disclose hops, particularly polyfetools derived from hop bracts, for their antioxidant effect, foam stabilizing effect on malt beverages, and piles. It has been confirmed to have caries, deodorant, cancer cell metastasis inhibitory and topoisomerase inhibitory effects. Further, Patent Document 7 confirms that the compound has a neutralizing effect on a protein toxin having RNA-glycosidase activity or ADP-ribosyllaniferase activity.
  • H. pylori is a spiral-shaped gram-negative bacillus whose presence has been reported by Warren and Marshall (Non-Patent Document 1). It has been clarified to be deeply involved in the development of gastrointestinal diseases such as gastritis, gastric ulcer, and duodenal ulcer (see Non-Patent Documents 2, 3, and 4). In addition, since more than 90% of gastric cancer patients are carriers of H. pylori, it is highly likely that H. pylori is involved in the development of stomach cancer. It is a carcinogen of gastric cancer. "
  • anti-ulcer drugs such as sofacolcon and prounothol; proton pump inhibitors (PPI) such as omeprazole and lansoprazole; gastric acid secretion suppression such as famotidine and cimetidine Agents (H2 pro-force) have been used.
  • PPI proton pump inhibitors
  • H2 pro-force gastric acid secretion suppression
  • these drugs do not have an effect of suppressing the growth of H. pylori and are symptomatic drugs for ulcerative diseases. Therefore, even after the ulcer disease is cured by the above-mentioned drugs, the H. pylori remains in the stomach, and the recurrence rate within one year after the treatment is 80-90% It had the disadvantage of being high.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. H09-9-0292177
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 09-1636969
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 09-2959544
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-10-0252232
  • Patent Document 5 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2000-32027
  • Patent Document 6 Japanese Patent Publication No. 2 0 0 1 0 3 9 8 8 6
  • Patent Document 7 International Publication No. 02/077826 pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Lancet, 1273-1275 (1983)
  • Non-Patent Document 2 Med.J.Aust., 142, 436 (1985)
  • Non-Patent Document 3 Gastroenterology, 102, 1575 (1992)
  • Non-Patent Document 4 N. Engl. Med., 328, 308 (1993)
  • Non-Patent Document 5 Infect. Immun. 63, 4154-4160 (1995)
  • an object of the present invention is to prevent, prevent or treat gastrointestinal diseases involving Helicobacter pylori, which have few side effects and no resistant bacteria, and neutralize the empty toxin produced by H. pylori. It is to provide a medicinal product, a quasi-drug, and a food and drink having an effect.
  • the present inventors have tried to solve the problem by finding a factor that does not kill H. pylori but detoxifies the vacuolated toxin produced by H. pylori. If an effective non-toxic dangling factor of the vacuole dang is found, its medical and industrial significance is immeasurable.
  • the present inventors have conducted intensive studies and found that a type of polyphenols present in hops and apples effectively detoxifies the vacuole-forming toxin produced by H. pylori, The present invention has been completed.
  • This polyphenol is particularly abundant in immature fruits of apples and bracts of hops.
  • This polyphenol contained in hops is adsorbed by resins that have an affinity for polyphenol, such as styrene divinylbenzene resin, and has the property of not permeating through an ultrafiltration membrane with a cut-off molecular weight of 1,000 or more. It is considered to be bronthocyanidins that hydrolyze to produce cyanidin when heated in an alcohol solution containing about 5% hydrochloric acid.
  • These proanthocyanidins give a chromatogram as shown in FIG. 1 in GPC (gel permeation chromatography) analysis, and give an absorbance distribution as shown in FIG. 2 in absorbance analysis.
  • this polyphenol contained in apple is also adsorbed by resins that have an affinity for polyphenol such as styrene-divinylbenzene resin, and when heated in an alcohol solution containing about 5% hydrochloric acid, it is hydrolyzed to cyanidin.
  • resins that have an affinity for polyphenol such as styrene-divinylbenzene resin, and when heated in an alcohol solution containing about 5% hydrochloric acid, it is hydrolyzed to cyanidin.
  • the present invention relates to a neutralizing agent for vacuolar gall toxin containing proanthocyanidins, particularly preferably proanthocyanidins derived from hops or apples, as an active ingredient.
  • Substances that neutralize vacuolated toxin include 5-fluoro-2--2- (3-phenylpropylamino) benzene phloretin, and some borifhenols, which are responsible for the current on the cell membrane caused by vacuolated toxin. Inhibiting changes has been shown by Tombola et al. (Imbola F. et al., FEBS Lett. 543, 184-189 (2003)). However, it is reported in the same literature that substances that suppress changes in the current on the cell membrane in these systems are not related to inhibition of intracellular vacuolation by vacuolating toxin or neutralization of toxicity to cells. It is stated. In these documents, compounds that are shown as substances that suppress changes in current on cell membranes are compounds that are not proanthocyanidins, although they are bolifenols.
  • Figure 1 shows the results of GPC (gel permeation chromatography) analysis of hop-derived proanthocyanidins.
  • FIG. 2 is a diagram showing the absorbance distribution of hop-derived proanthocyanidins.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of HPLC analysis of proanthocyanidins derived from hops.
  • FIG. 4 is a diagram showing non-toxic illness of vacuolar venom toxin in cultured cells of human gastric cancer cells AZ-521. (Example 13)
  • FIG. 5 is a view showing the non-toxic illness of vacuolar venom in cultured cells of human kidney cancer cells G401. (Example 13)
  • FIG. 6 is a diagram showing the inhibition of the uptake of vacuolar gamma toxin into cells of cultured human gastric cancer cells AZ-521. (Example 14)
  • FIG. 7 is a diagram showing the inhibition of the incorporation of vacuolar gamma toxin into cells of cultured human kidney cancer cells G401. (Example 14)
  • vacuolating toxin neutralizing agent of the present invention in addition to immature fruits of apples, vine bracts of hops are suitable, but in particular, whole apple hops should be used without separating each part. You can also.
  • Hop bracts are obtained by removing the rubulin part from hop cones.
  • hop bracts are obtained by crushing hop cones and removing the rubrin part by sieving.
  • hop cones are formed into pellets without removing hop bracts that are not useful for beer brewing. They tend to be used for brewing. Accordingly, the raw material of the present invention is not particularly limited as long as it contains hop bracts, and there is no problem even if hop cones or hop pellets containing hop bracts are used as raw materials.
  • hop vines, bracts, hob cones and hop pellets containing hop bracts, or those containing those hop plant parts are used as raw materials.
  • This is extracted with water or an aqueous solution of an organic solvent miscible with water such as alcohol, acetone, or acetonitrile of 8 O v / v% or less.
  • a suitable example is ethanol containing 50 v / v% or less of hydrated ethanol.
  • the ratio between the raw material and the extraction solvent is preferably about 1:20 to 100 (weight ratio), and the extraction is performed at 4 to 95 ° (:, with stirring, for about 20 to 60 minutes.
  • An extract is obtained by filtration, and if necessary, a filter aid such as perlite can be used.
  • the solvent is removed from the extract thus obtained by a conventional method such as concentration, lyophilization, spray drying, etc., and the vacuolated toxin neutralizing agent can be obtained as a powder.
  • the vacuolated toxin neutralizing agent obtained here can be sufficiently used practically, but if necessary, its purification degree can be further increased by the following method using an adsorption resin. However, this step is merely a step for increasing the degree of purification of the vacuolating toxin neutralizing agent, and can be omitted if unnecessary.
  • the extract is treated with granulated synthetic resin having an affinity for polyphenols, and the vacuolating toxin neutralizing agent is concentrated.
  • the hop extract may be passed through a column filled with granular synthetic resin, and after sufficiently washing the column, the neutralizing agent for the vacuolar gamma toxin adsorbed on the column may be eluted. Then, the granular resin can be immersed in a hop extract and batch-processed.
  • the hop extract When adsorbing the vacuolating toxin neutralizing agent to the synthetic resin, cool the hop extract to room temperature of 15 to 30 ° C, and if necessary, reduce the pressure in order to increase the adsorption efficiency. It is desirable to lower the concentration of the organic solvent in the extract in advance, for example.
  • the material of the synthetic adsorbent hydroxypropylated dextran, KK-functional vinyl polymer, styrene-divinylbenzene polymer and the like can also be used.
  • the synthetic resin is washed, and the degree of purification of the vacuolating toxin neutralizing agent can be further increased.
  • a solvent used for washing water or an aqueous solution of 1 to 10 w / w% ethanol is suitable, and it is desirable to wash using a solvent amount of about 1 to 10 times the amount of the resin.
  • the vacuolating toxin neutralizing agent is desorbed and eluted from the synthetic resin to which polyphenols are adsorbed.
  • aqueous alcohol, aqueous acetone, aqueous acetate nitrile and the like can be used, and particularly preferable examples include an aqueous ethanol solution of 30 w / w% or more or ethanol.
  • the flow rate of the elution solvent is preferably about 2 to 6 times the amount of the resin.
  • the solvent is removed from the obtained eluate by a usual method such as concentration, freeze-drying, spray-drying, etc., and the neutralizing agent for vacuolar gamma toxin can be obtained as a powder. Also, during concentration under reduced pressure, alcohol, acetone, acetonitrile, etc. can be collected and reused.
  • the used synthetic resin can be repeatedly used after being washed with an alcohol aqueous solution of 8 O v / v% or more, an aqueous solution of sodium hydroxide of about 0.05 N or the like.
  • the thus-obtained neutralizing agent for vacuolated toxin can be used as it is, but the purification degree can be further increased by a method using an ultrafiltration membrane as described below. However, this step is merely a step for increasing the degree of purification of the vacuolating toxin neutralizing agent, and can be omitted if unnecessary.
  • the vacuolating toxin neutralizing agent obtained by the above method is dissolved in water or an organic solvent miscible with water, and treated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 1,000 or more.
  • the material of the membrane can be used without any particular limitation, such as cellulose, cellulose acetate, polysulfone, polypropylene, polyester, polyethersulfone, and PVDF, which are usually used as materials for ultrafiltration membranes. . If the molecular weight cut-off is 1,000 or more, it can be used without any problem.However, if a membrane with an excessively high molecular weight is used, the yield will be extremely reduced, and if the molecular weight cut-off is small, the processing time will be short.
  • an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of about 5,000 to 50,000 is suitable.
  • the treatment depends on the type of extraction solvent and the ratio of extraction solvent to hops or hop bracts, but is carried out until the amount of the remaining liquid is about 1/1/10 at the start of the treatment: L / 100. It is desirable.
  • the pressure at that time depends on the ultrafiltration membrane and the filtration device, but is preferably about 0.1 to 10.0 kg / cm 2 . If necessary, once processed, the remaining solution can be diluted again with a suitable solvent such as water, and then reprocessed in the same manner to increase the degree of purification.
  • the solvent in the obtained upper residue is removed by a conventional method such as concentration, freeze-drying, spray-drying or the like, and the neutralizing agent for vacuolar gallantoxin can be obtained as a powder.
  • concentration concentration, freeze-drying, spray-drying or the like
  • the neutralizing agent for vacuolar gallantoxin can be obtained as a powder.
  • alcohol, acetone, acetonitrile, etc. can be collected and reused.
  • the thus-obtained neutralizing agent for vaccinated toxin is an odorless, brownish or pale yellow powder having a slightly bitter taste, and is used as a synthetic resin having an affinity for polyphenol. It is a proanthocyanidin that is adsorbed and does not pass through the membrane when treated with an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut-off of 1,000 or more.
  • the yield is 0.5 to 20.0 w / w% in terms of hop bract weight, and 0.5 to I5.0 w / w% in terms of hop cone weight.
  • a method for producing a vacuolated toxin neutralizing agent from apples is as follows: apple fruits, preferably unripe apples, are squeezed by pressing to form a solution containing a vacuolated toxin neutralizing agent, and the solution is concentrated. It can be used as a powder by ordinary methods such as freeze-drying and spray-drying. Further, if necessary, the neutralizing agent for vacuolar mite may be purified using a column or the like packed with a granular resin or the like having an affinity for polyphenol to increase the degree of purification. This step is the same operation as the step of concentrating and purifying the neutralizing agent for the vacuolar mite toxin obtained from hops.
  • the vacuolated toxin neutralizing agent thus obtained can be formulated together with commonly used carriers, auxiliaries, additives, etc., and can be used as a medicinal product as an oral or parenteral product according to a conventional method. It can also be mixed with food materials to make food and drink. Pharmaceuticals include tablets, capsules, granules and syrups as oral preparations, parenteral preparations for external use such as ointments, creams and solutions, and injections such as sterile solutions and suspensions. When these products are administered to the human body as a medicine, 2 mg to 500 mg is administered once or several times a day, that is, in a total daily dose of 2 mg to 100 mg, and the effect can be sufficiently exerted.
  • compositions containing the vacuolating toxin neutralizing agent of the present invention can take the required unit dosage form together with a physiologically acceptable vehicle, carrier, excipient, integrator, stabilizer, flavoring agent, etc. .
  • the adjuvants mixed with tablets and capsules are as follows. Binders such as tragacanth, acacia, corn starch, gelatin, excipients such as microcrystalline cellulose, corn starch, whole gelatinized starch, leavening agents such as alginic acid, lubricants such as magnesium stearate, Sweeteners such as sugar, lactose, saccharin, flavoring agents such as peppermint, coconut oil, and cellulose.
  • the above materials may further contain a liquid carrier such as oil and fat, and the other materials may be used as a coating material or the physical form of the preparation may be changed by another method.
  • a liquid carrier such as oil and fat
  • the other materials may be used as a coating material or the physical form of the preparation may be changed by another method.
  • tablets may be coated with shellac or sugar You can.
  • a syrup or elixir may contain sucrose as a sweetening agent, methyl or propylparabens as preservatives, a dye and flavoring such as cellulose or orange flavor.
  • Sterile compositions for injections dissolve the active substance in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, peanut oil, cottonseed oil, or sword beefgur such as ethylolate Alternatively, it can be formulated by a usual method of suspending. In addition, buffers, preservatives, antioxidants, and the like can be added as necessary. As external preparations, vaseline, paraffin, oils and fats, lanolin, macrogol and the like can be used, and ointments and creams can be prepared in a usual manner.
  • the food and beverage containing the vacuolating toxin neutralizing agent of the present invention may be in the form of the above-mentioned preparations, but may be prepared in the form of candy, rice crackers, cookies, beverages, etc. It can also be processed and manufactured by the method.
  • health foods and functional foods are used for disease prevention and health maintenance, they are ingested as a processed product containing 5 mg to 500 mg as a daily dose divided into several times a day.
  • the neutralizing agent for vacuolar toxin When adding a neutralizing agent for vacuolar toxin to these foods and drinks, the neutralizing agent for vacuolar toxin may be added as it is in a powder form. It is desirable to add a 1% to 2% aqueous solution or an alcohol aqueous solution or an alcohol solution, and to add them to foods and drinks so that the final concentration is 1 to: 10,000 ppm, preferably 100 to 5000 ppm.
  • the neutralizing agent for vacuolated toxin of the present invention is used as a preventive agent when used for the purpose of preventing the digestive disease, and as a preventive agent when used for the purpose of preventing the recurrence of the digestive disease once cured.
  • a preventive agent for recurrence it can be used as a disinfectant when used for treating the digestive disease by removing H. pylori.
  • the bactericidal agent of the present invention may be used alone, or a proton pump inhibitor and / or an antibiotic may be used. Substances may be used in combination.
  • the daily dose of the vacuolating toxin-neutralizing agent of the present invention is appropriately selected depending on its usage, the age of the patient, gender and other conditions, the degree of the disease, and the like. It is recommended that the amount of the compound be about 0.1 to 2000 mg, preferably about 0.5 to about 800 mg, particularly preferably about 1.0 to about 500 mg per day, for adults, divided into 1 to 4 times a day, for example, on an empty stomach. can do.
  • vacuolating toxin neutralizing agent obtained in Example 2 is dissolved in 500 ml of a 10% aqueous ethanol solution, and the ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of 5,000 becomes 1.0 kg / cm 2 at room temperature to 20 ml. Processed. The obtained upper residue was freeze-dried to obtain 0.4 g of a vacuolating toxin neutralizer as a flesh-colored powder having an odorless and slightly bitter taste. When this powder is analyzed by HPLC under the conditions shown below, it has a characteristic mouth mass diagram as shown in Fig. 3. Method) yielded a value of 40.6% in terms of catechin content.
  • Lactose 50 O g
  • a candy was prepared according to a conventional method using the above components in each part by weight. Note that, instead of the substance obtained according to Example 5, candies to which the substances obtained according to Examples 1, 2, 3, 4, and 6 were respectively added were similarly obtained.
  • Juices were prepared using the above parts by weight of each component according to a conventional method. It should be noted that instead of the substance obtained according to Example 5, juices to which the substances obtained according to Examples 1, 2, 3, 4, and 6 were added were also obtained.
  • Cookies were prepared according to a conventional method using the above components in each part by weight. Note that instead of the substance obtained according to Example 5, cookies obtained by adding the substances obtained according to Examples 1, 2, 3, 4, and 6 respectively were obtained similarly.
  • AZ-521 cells, a human gastric cancer-derived cell line, or G401 cells, a human kidney cancer-derived cell line were adjusted to a suspension of 2.0 ⁇ 10 5 cells / ml. After dispensing 100/1 into a 96-well plate, the plate was left overnight to prepare a monolayer film of each cell. To this was added a mixture of a constant concentration of vacuolated toxin and various concentrations of the neutralizing agent of vacuolar gizzard toxin obtained in Example 5 or 6, after incubation at 37 ° (30 minutes). the final concentration is 120 nM, final concentration of example 5 or 6 was 0-100 g / ml.
  • Adjusting the G401 cells is AZ-521 cells or human kidney cancer-derived cell line is a human gastric cancer derived cell line in a suspension of 2.0 x i0 5 cells / ml.
  • the 100 ⁇ 1 was dispensed into a 96-well plate, and left overnight to prepare a monolayer film of each cell.
  • Various concentrations of pyotin-labeled vacuolated toxin and a constant concentration of the vacuolated toxin neutralizing agent obtained in Example 5 or 6 were used37. (After 30 minutes incubation, the cells were added to the cell monolayer. The final concentration of vacuolated toxin was 0-100 nM, and the final concentration of Examples 5 or 6 was 10 zg / ml.
  • Example 5 To a 4-week-old C57BL / 6J mouse fasted for 24 hours (ItoR alone), 5 g of vacuolated toxin per 10 g of body weight and 50 to 250 zg of Example 5 were administered using an oral probe. Animals were housed individually in individual gauges, and 48 hours after administration, the stomach was removed. The excised specimen was fixed in 10% formalin, and stereoscopic observation was performed before and after that. The fixed specimens were stained with hematoxylin and eosin, and the degree of gastric injury was scored according to the method of Ghiara et al. (Ghiara.P., Et al. Infect.Immun. 63, 4154-4160. (1995)). evaluated. The results are shown in Table 1. Example 5 significantly suppressed gastric injury. ⁇ Table 1 Number Sample Gastrointestinal Damage Score _
  • the neutralizing agent for vacuolated toxin of the present invention has an effect of detoxifying vacuolar toxin, and is therefore effective in preventing and treating infectious diseases using vacuolated toxin as a pathogenic factor.
  • the product of the present invention can be commercialized as a prophylactic / therapeutic agent for infectious diseases using a vacuolating toxin as a pathogenic factor, a biochemical experimental reagent, and the like.
  • H. pylori examples include gastric ulcer, duodenal ulcer, gastritis, gastric cancer, and MALT lymphoma.

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Abstract

この発明は、副作用が少なく、耐性菌の発生のない、ヘリコバクター・ピロリ菌が関与する消化器疾患の予防、再発予防又は治療およびヘリコバクター・ピロリの除菌効果を有する医薬品、医薬部外品または飲食品を提供する。ヘリコバクター・ピロリが産生する空胞化毒素を中和（無毒化）する効果を有するプロアントシアニジン類、特に好ましくはリンゴ未熟果またはホップ苞に由来するプロアントシアニジン類を有効成分として含有する、医薬品、医薬部外品、飲食品を提供する。

Description

明細書
空胞化毒素中和剤
技術分野
本発明は、 へリコパク夕一 ' ピロリが産生する空胞化毒素を無毒化する効果 を有するプロアントシァニジン類、 特に好ましくはリンゴ、 またはホップより得 られるプロアントシァニジン類を有効成分として含有する、 へリコパクター .ピ ロリが関与する消化器疾患の予防、 再発予防又は治療およびへリコパク夕一 ·ピ 口リ菌が産生する空胞化毒素の中和剤、 医薬品、 医薬部外品および飲食品に関す る。
w匕景: 技
ホップはアサ科の多年生植物であり、 その毬花 （未受精の雌花が成熟したも の） を一般にホップと呼んでいる。 ホップにはこの花部の他、 葉、 蔓、 根などの 各部が存在する。 ホップの毬花に存在するルブリン部分 （球果の内苞の根元に形 成される黄色の顆粒） は、 ホッ.プの苦味、 芳香の本体であり、 ビール醸造におい て酵母、 麦芽と並んで重要なビール原料である。 またホップは、 民間療法では鎮 静剤ゃ抗催淫剤として通用している。 ホップ苞はホップ毬花よりルブリン部分を 除いたものであり、 ビール醸造には有用とされず、 場合によってはビール醸造の 際に取り除かれ、 副産物として生じる。 その際、 ホップ苞は土壌改良用の肥料と して用いられる他に特に有効な利用法は見い出されておらず、 より付加価値の高 い利用法の開発が望まれている。
なお、 本出願人の出願にかかる特許文献 1、 2、 3、 4、 5、 6ではホップ、 特にホップ苞由来のポリフエツール類について、 抗酸化作用、 発泡麦芽飲料に対 する泡安定化作用、 杭う蝕作用、 消臭作用、 癌細胞転移抑制作用、 トポイソメラ ーゼ阻害作用を有することを確認している。 また、 特許文献 7では、 R NA N ーグリコシダーゼ活性、 または A D Pリボシレランスフェラ一ゼ活性を持つ蛋白 質毒素中和効果を有することを確認している。
しかし、 ホップ由来のプロアントシァニジン類について、 ヘリコバクタ一 'ピ 口リの産生する空胞ィ匕毒素の中和 （無毒化） 効果を明らかにした例はこれまでに 見当たらない。 へリコパク夕一 .ピロリ （以下単に 「ピロリ菌」 という） はらせん状の形態を 有するグラム陰性桿菌であり、ワーレン及びマーシャルによりその存在が報告 (非 特許文献 1 ) されて以来、 急性胃炎、 慢性胃炎、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍等の消化 器疾患の発症に、 深く関与することが明らかとなっている （非特許文献 2、 3、 4参照)。また、胃癌患者の 9 0 %以上がピロリ菌の保菌者であることなどから、 ピロリ菌は胃癌の発生に関与している可能性が高く、 WHOは 1994年に 「ピロ リ菌はまぎれもなく胃癌の発癌因子である」 と発表するに至っている。
ピロリ菌の産生する病因因子として、 これまでにゥレアーゼ、 カタラーゼ、 リ ポ多糖 （LPS) などが報告されてきたが、 近年、 胃の粘膜細胞に空胞ィ匕変性を引 き起こす空胞化毒素 （VacA) の単独投与により動物モデルで胃炎が惹起される ことが明らかとなり （非特許文献 5 )、 空胞化毒素がピロリ菌の主要な病因因子 であるという認識が急速に高まっている。
従来より、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍等の潰瘍性疾患の治療には、 ソファルコン、 プロウノトール等の抗潰瘍剤；オメプラゾ一ル、 ランソプラゾール等のプロトン ポンプ阻害剤 （PPI)；ファモチジン、 シメチジン等の胃酸分泌抑制剤 （H2 プロ ッ力一） 等が用いられてきた。 しかし、 これらの薬物は、 ピロリ菌に対する増殖 抑制等の効果を有するものではなく、 潰瘍性疾患に対する対症療法剤であった。 そのため、 上記のような薬剤による潰瘍性疾患の治癒が見られた後も、 ピロリ菌 が胃内に残存しているため、 治療終了後の 1年以内の再発率が 8 0 - 9 0 %もの 高率であるという欠点を有していた。
上記のような欠点を克服するため、 対症療法に加えて、 ピロリ菌を除菌する治 療法が提案され、 ピロリ菌に抗菌効果を有するァモキシシリン、 クラリス口マイ シン、. メトロニダゾ一ル、 チニダゾ一ル等の抗生物質が臨床で用いられるように なった。 現在ではプロトンポンプ阻害剤と、 抗生物質 2剤を組み合わせた、 いわ ゆる新 3剤併用療法が除菌治療の主流になっている。
しかし、 新 3剤併用療法にも、 比較的多量の薬剤の長期投与が必要となるため に、 薬剤の副作用ゃ菌交代症の発症が臨床上の問題として現実に生じている。 ま た、 抗生物質の使用は、 菌体の破壊に伴い、 ピロリ菌の産生する病因因子である 空胞化毒素を胃粘膜周辺に多量に排出させる可能性が懸念される。 さらに抗生物 質の多用は、 新たな、 より強力な耐性菌の発生をもたらす恐れがある。 以上のよ うな知見を考え合わせると、 現在広く用いられている新 3剤併用療法も理想的な 治療法であるとは言い難い。
日本ではピロリ菌の感染率が特に 40代以上の世代で高いほか、 潰瘍性疾患、 および胃癌の発症率が欧米に比べ高く、 仮に副作用や、 耐性菌の問題のない治療 法が見出された場合、 産業上の価値は大きなものである。
特許文献 1 ：特開平 0 9— 0 0 2 9 1 7号公報
特許文献 2 ：特開平 0 9— 1 6 3 9 6 9号公報
特許文献 3 ：特開平 0 9— 2 9 5 9 4 4号公報
特許文献 4 ：特開平 1 0— 0 2 5 2 3 2号公報
特許文献 5 ：特開 2 0 0 0— 3 2 7 5 8 2号公報
特許文献 6 ：特閧 2 0 0 1— 0 3 9 8 8 6号公報
特許文献 7 ：国際公開第 0 2 / 0 7 8 2 6号パンフレツ ト
非特許文献 1 ： Lancet, 1273-1275 (1983)
非特許文献 2 ： Med.J.Aust., 142, 436 (1985)
非特許文献 3 ： Gastroenterology, 102, 1575 (1992)
非特許文献 4 ： N.Engl.Med., 328， 308 (1993)
非特許文献 5 ： Infect. Immun. 63, 4154-4160 (1995)
発明が解決しょうとする課題
従って、 本発明の目的は、 副作用が少なく、 耐性菌の発生のない、 ピロリ菌 が関与する消化器疾患の予防、 再発予防又は治療、 およびピロリ菌が産生する空 ' 胞ィ匕毒素の中和効果を有する医薬品、医薬部外品、飲食品を提供することである。 本発明者らは、 これらの現状に鑑み、 ピロリ菌を死滅させるのではなく、 ピロリ 菌が産生する空胞化毒素を無毒化する因子を見出すことにより、 問題を解決する ことを試みた。 もしも空胞ィ匕毒素の効果的な無毒ィ匕因子が見出されれば、 その医 学、 産業上の意義には測り知れないものがある。
発明の開示
本発明者らは、 鋭意検討の結果、 ホップおよびリンゴ中に存在するポリフエノー ルの一種が、ピロリ菌の産生する空胞ィ匕毒素を効果的に無毒ィヒすることを見出し、 本発明を完成した。 このポリフエノールは、 リンゴの未熟果ゃホップの苞部分に 特に多く含有される。
ホップに含まれるこのポリフエノールは、 スチレンージビニルベンゼン樹脂な どのポリフエノールと親和性を示す樹脂に吸着され、 分画分子量が 1,000 以上 の限外ろ過膜により処理した際に膜を透過しない性質を持ち、 さらに 5 %程度の 塩酸を含むアルコール溶液中で加熱した際には加水分解されシァニジンを生じる、 ブロアントシァニジン類であると考えられる。 またこのプロアントシァニジン類 は、 G P C (ゲル透過クロマトグラフィー） 分析において図 1のようなクロマト グラムを与え、 一方、 吸光度分析において図 2のような吸光度分布を与える。 またリンゴに含まれるこのポリフエノールもスチレンージビニルベンゼン樹脂な どのポリフ Iノールと親和性を示す樹脂に吸着され、 5 %程度の塩酸を含むアル コール溶液中で加熱した際には加水分解されシァニジンを生じる、 プロアントシ ァニジン類であると考えられる。
すなわち、 本発明は、 プロアントシァニジン類、 特に好ましくはホップまたは リンゴに由来するプロアントシァニジン類を有効成分として含有する空胞ィ匕毒素 中和剤に関する。
空胞化毒素を中和する物質としては、 5-二ト口- 2-(3-フェニルプロピルァミノ） ベンゼン酸ゃフロレチン、 さらに一部のボリフエノール類が、 空胞化毒素により 生じる細胞膜上の電流の変化を抑制することが、 Tombola らによって示されて いる （I mbola F. et al., FEBS Lett. 543, 184-189 (2003))。 しかし、 これらの 系で細胞膜上の電流の変化を抑制する物質は、 空胞化毒素による細胞内の空胞ィ匕 の阻害や、 細胞への毒性の中和とは無関係であることが同じ文献に述べられてい る。 また、 これらの文献で細胞膜上の電流の変化を抑制する物質として示されて いる化合物は、 ボリフエノール類ではあるものの、 全てプロアントシァニジン類 ではない化合物である。
従って、 植物、 特に好ましくはホップまたはリンゴに由来するプロアントシァニ ジン類を用いて空胞ィ匕毒素を無毒ィ匕する技術については、 これまでに全く報告が - なされていない。
図面の簡単な説明 図 1はホップ由来のプロアントシァニジン類の G P C (ゲル透過クロマトグラ フィ一） 分析結果を示す図である。
図 2はホップ由来のプロアントシァニジン類の吸光度分布を示す図である。 図 3はホヅプ由来のプロアントシァニジン類の H P L C分析結果を示す図であ o
図 4はヒト胃癌細胞 A Z— 5 2 1の培養細胞における空胞ィ匕毒素の無毒ィ匕を示 す図である。 （実施例 1 3 )
図 5はヒ卜腎臓癌細胞 G 4 0 1の培養細胞における空胞ィ匕毒素の無毒ィ匕を示す 図である。 （実施例 1 3 )
図 6はヒト胃癌細胞 A Z - 5 2 1の培養細胞における空胞ィ匕毒素の細胞への取 り込みの阻害を示す図である。 （実施例 1 4 )
図 7はヒト腎臓癌細胞 G 4 0 1の培養細胞における空胞ィ匕毒素の細胞への取り 込みの阻害を示す図である。 （実施例 1 4 )
発明き実施するための最良の形態
本発明の空胞化毒素中和剤の原料としては、 リンゴの未熟果のほか、 ホップ の蔓ゃ苞部分が好適であるが、 特にリンゴゃホップの各部を分離せずに、 全体を 使用することもできる。
ホップ苞とは、ホップ毬果よりルブリン部分を取り除いて得られるものであり、 一般に、 ホップ毬果を粉砕後、 ふるい分けによってルブリン部分を除くことによ つてホップ苞を得る。 しかし、 最近のビール醸造において、 ホップ苞をふるい分 けして除去する手間を省くために、 ビール醸造に有用でないホップ苞を取り除か ずにホップ毬果をそのままペレット状に成形し、 ホップペレットとして、 ビール 醸造に利用する傾向にある。 従って、 本発明の原料として、 ホップの蔓ゃ苞を含 むものであれば特に限定せず、 ホップ苞を含むホップ毬果やホップペレツトを原 料としてもなんら問題ない。
空胞ィ匕毒素中和剤をホップから得る場合の製造法としては、 ホップ蔓、 苞、 ま たはホップ苞を含むホヅブ毬果やホップペレツト、 あるいはそれらのホップ植物 体の部分を含むものを原料とし、 これを水または 8 O v/v%以下のアルコール、 アセトン、 ァセトニトリルなどの水と混和する有機溶媒の水溶液で抽出する。 好 適な例としては、 エタノール 5 0 v/v%以下の含水エタノールが挙げられる。 原 料と抽出溶媒の割合は、 1 ： 2 0 ~ 1 0 0 (重量比） 程度が望ましく、 また抽出 は 4〜9 5 ° (：、 撹拌下、 2 0〜6 0分間程度行われることが望ましい。 濾過に より抽出液を得るが、 その際必要があればパーライ トなどの濾過助材を用いるこ ともできる。
かくして得られた抽出液より溶媒を濃縮、 凍結乾燥、 スプレードライなどの通 常の方法により除き、 空胞化毒素中和剤を粉末として得ることができる。 ここで 得られた空胞化毒素中和剤は十分に実用に供しうるが、 必要があれば以下に述べ る吸着樹脂を用いる方法によってさらにその精製度を上げることもできる。 ただ しこの過程はあくまで空胞化毒素中和剤の精製度を上げるための工程であり、 必 要がなければ省略することもできる。
上記抽出液をポリフエノール類と親和性を持つ合成樹脂を粒状にしたものによ り処理し、 空胞化毒素中和剤を濃縮する。 この工程は、 粒状の合成樹脂を充填し たカラムにホップ抽出液を通液し、 カラムを十分に洗浄した後、 カラムに吸着さ れた空胞ィ匕毒素中和剤を溶出してもよいし、粒状の樹脂をホップ抽出液に浸漬し、 バッチ処理して行う事も出来る。
合成樹脂に空胞化毒素中和剤を吸着させる際には、 ホップ抽出液を 1 5〜3 0 °Cの室温程度まで冷却した後、 必要があれば、 吸着効率を上げるために、 減 圧濃縮などによりあらかじめ抽出液の有機溶媒濃度を下げておくことが望ましい。 合成吸着剤の材質としては、 ヒドロキシプロピル化デキストラン、 ¾ _K性ビニル ポリマ一、 スチレン一ジビニルベンゼン重合体などを用いる事も出来る。
次いで合成樹脂を洗浄し、 空胞化毒素中和剤の精製度をよりあげることができ る。 洗浄に用いる溶媒としては、 水ないし 1〜1 0 w/w%のエタノール水溶液が 好適であり、樹脂量の 1〜 1 0倍程度の溶媒量を用い、洗浄することが望ましい。 続いて、 ポリフエノール類を吸着した合成樹脂より空胞化毒素中和剤を脱離溶 出する。 溶出に用いる溶媒としては含水アルコール、 含水アセトン、 含水ァセト ニトリルなどを用いることができ、 特に好適な例としては 3 0 w/w%以上のエタ ノール水溶液またはエタノールが挙げられる。 溶出溶媒の通液量は樹脂量の 2〜 6倍程度が望ましい。 得られた溶出液より溶媒を濃縮、 凍結乾燥、 スプレードライなどの通常の方法 により除き、 空胞ィ匕毒素中和剤を粉末として得ることができる。 また減圧濃縮の 際、 アルコール、 アセトン、 ァセトニトリルなどを回収し、 再利用することもで きる。 使用した合成樹脂は 8 O v/v%以上のアルコール水溶液、 0.05N程度の水 酸ィ匕ナトリウム水溶液などで洗浄した後、 繰り返し使用することが可能である。 かくして得られた空胞化毒素中和剤は、 そのまま実用に供する事も出来るが、 以下に述べるような限外ろ過膜を用いる方法によって、 さらに精製度を上げる事 も出来る。 ただしこの過程はあくまで空胞化毒素中和剤の精製度を上げるための 工程であり、 必要がなければ省略することもできる。
上記方法で得られた空胞化毒素中和剤を、 水、 あるいは水と混和する有機溶媒 に溶解し、 分画分子量が 1,000 以上の限外ろ過膜で処理する。 膜の素材として は、 セルロース、 セルロースアセテート、 ポリサルフォン、 ポリプロピレン、 ポ リエステル、 ポリエーテルスルホン、 P VD Fなど、 通常限外ろ過膜の材質とし て使用するものであれば、 特に制限なく用いることができる。 また分画分子量は 1,000 以上であれば特に問題なく用いることができるが、 あまり分画分子量の大 きい膜を用いると、 収量が極端に下がり、 また分画分子量が小さい場合は、 処理 に要する時間が長くなるので、 分画分子量 5,000〜50,000程度の限外ろ過膜が 好適である。 また処理は、 抽出溶媒の種類や抽出溶媒とホップまたはホップ苞の 割合にもよるが、 およそ上残り液の量が処理開始時の 1 / 1 0〜： L / 1 0 0程度 になるまで行うのが望ましい。 その際の圧力は、 限外ろ過膜やろ過装置にもよる が、 およそ 0.1〜10.0kg/cm2であることが望ましい。 また必要があれば、 一度処 理した上残り液を再び水などの適当な溶媒で薄め、 同様に再処理して精製度を高 めることもできる。
得られた上残り液の溶媒を濃縮、 凍結乾燥、 スプレードライなどの通常の方法 により除き、 空胞ィ匕毒素中和剤を粉末として得ることができる。 また ftE濃縮の 際、 アルコール、 アセトン、 ァセトニトリルなどを回収し、 再利用することもで ぎる。
このようにして得られた空胞ィ匕毒素中和剤は、 かすかに苦味を呈した無臭の肌 色、 褐色ないし淡黄色の粉末であり、 ポリフエノールと親和性を持つ合成樹脂に 吸着し、 分画分子量が 1,000 以上の限外ろ過膜により処理した際に膜を透過し ないプロアントシァニジンである。
なお収率は、 ホップ苞重量換算で 0.5〜20.0w/w%、 ホップ毬果重量換算で 0.5 〜： I5.0w/w%である。
空胞化毒素中和剤をリンゴから得る場合の製造法としては、 リンゴ果実、 好ま しくはリンゴ未熟果を、 圧搾により搾汁し、 空胞化毒素中和剤を含む溶液とし、 その溶液を濃縮、 凍結乾燥、 スプレードライなどの通常の方法により粉末として 用いることができる。 また、 必要に応じて空胞ィ匕毒素中和剤を、 ポリフ Iノール に親和性のある粒状の樹脂などを充填したカラムなどを用いて精製し、 精製度を 上げて用いることもできる。 その工程はホップより得られる空胞ィ匕毒素中和剤を 濃縮精製する工程と同様の操作である。
かくして得られた空胞化毒素中和剤は、 一般に使用される担体、 助剤、 添加剤 等とともに製剤化することができ、 常法に従って経口、 非経口の製品として医薬 品として用いることができ、また食品素材と混合して飲食品とすることができる。 医薬品は経口剤として錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 シラップ剤などが、 非経口 剤として軟膏剤、 クリーム、 水剤などの外用剤、 無菌溶液剤や懸濁剤などの注射 剤などがある。これらの製品を医薬として人体に投与するときは、 2 mg〜500mg を 1日に 1ないしは数回、 すなわち 2 mg〜： lOOOmgの全日量で投与し、 十分に その効果を奏しうるものである。
本発明の空胞化毒素中和剤を含有する医薬品は、 生理的に認めうるべヒクル、 担体、 賦形剤、 統合剤、 安定剤、 香味剤などとともに要求される単位容量形態を とることができる。錠剤、カプセル剤に混和される佐薬は次のようなものである。 トラガント、 アラビアゴム、 コーンスターチ、 ゼラチンのような結合剤、 微晶性 セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 全ゼラチン化澱粉、 アルギン酸の ような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、 ショ糖、 乳糖、 サヅ カリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油、 チェリ一のような香味剤な ど。 また、 カプセル剤の場合は上記の材料に更に油脂のような液体担体を含有す ることができ、 また、 他の材料は被覆剤として、 または製剤の物理的形態を別な 方法で変化させることができる。 例えば、 錠剤はシェラック、 砂糖で被覆するこ とができる。 シロップまたはエリキシル剤は、 甘味剤としてショ糖、 防腐剤とし てメチルまたはプロピルパラベン、 色素およびチェリ一またはオレンジ香味のよ うな香味剤を含有することができる。
注射剤のための無菌組成物は、 注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 ゴマ 油、 ヤシ油、 落花生油、 綿実油のような天然産出植物油、 またはェチルォレート のような合劍旨肪ベヒグルを溶解または懸濁させる通常の方法によって処方する ことができる。 また、 緩衝剤、 防腐剤、 酸ィ匕防止剤などを必要に応じて配合する ことができる。 外用剤としては としてワセリン、 パラフィン、 油脂類、 ラノ リン、 マクロゴールなどを用い、 通常の方法によって軟膏剤、 クリーム剤などと することができる。
本発明の空胞化毒素中和剤を含有した飲食品は、 上記製剤の形態でもよいが、 あめ、 せんべい、 クッキー、 飲料などの形態でそれそれの食品原料に所要量を加 えて、 一般の製造法により加工製造することもできる。 健康食品、 機能性食品と しての摂取は、 病気予防、 健康維持に用いられるので、 経口摂取として 1日数回 に分けて、 全日量として 5 mg〜500mgを含む加工品として摂取される。
これらの飲食品に空胞ィヒ毒素中和剤を添カ卩する際には、 空胞ィヒ毒素中和剤を粉末 のまま添加してもよいが、 好ましくは空胞化毒素中和剤を 1〜 2 %の水溶液また はアルコール水溶液の溶液あるいはアルコール溶液とし、 飲食品に対し最終濃度 が 1〜： I0,000ppm、 好ましくは 100〜5000ppm となるように添加することが望 ましい。
本発明の空胞化毒素中和剤は、 該消化^^患を予防する目的で使用する際には 予防剤として、 いったん治癒した該消化^^患の再発を予防する目的で使用する 際には再発予防剤として、 ピロリ菌を除去することによって該消化 ^^患を治療 する目的で使用する際には除菌剤として使用され得る。 また、 該消化器疾患を予 防、 再発予防又は治療する際に、 本発明のへリコパク夕一 ·ビ口リ除菌剤を単独 で使用してもよいし、 プロトンポンプ阻害剤及び/又は抗生物質を併用してもよ い。
本発明の空胞化毒素中和剤の一日投与量は、 その用法、 患者の年齢、 性別その 他の条件、 疾患の程度等により適宜選択されるが、 通常有効成分である本発明化 合物の量が成人 1日当たり 0.1〜2000mg程度、好ましくは 0.5〜： I800mg程度、 特に好ましくは 1.0〜： I500mg程度とするのがよく、 1日 1〜4回に分けて、 例え ば空腹時に投与することができる。
以下、 実施例を示すが本発明はこれに限定されるものではない。
実施例 1
(ゲル型合成吸着剤によるホップ毬果からの空胞化毒素中和剤の調製） ホップ毬果 20g を乳鉢で粉碎し、 2Lの水で撹拌下、 95°C、 40分間抽出した。 ろ過後、 放冷し、 抽出液を親水性ビニルポリマ一樹脂 80mlを充填したカラムに 通液し、 次いで 400ml の 5%エタノール水溶液で洗浄した。 さらに同カラムに 80%エタノール水溶液 400ml を通液し、 同溶出液を回収し、 凍結乾燥して、 空 胞化毒素中和剤 800mgを無臭のかすかに苦味を呈した淡黄色の粉末として得た。 ホップからの収率は 4%であった。
実施例 2
(ゲル型合成吸着剤によるホップ苞からの空胞化毒素中和剤の調製） ホヅプ苞 20gを 600mlの 50%ェ夕ノ一ル水溶液で撹拌下、 30。C、 20分間抽出 した。 ろ過後、減圧濃縮し、 その濃縮液をスチレン一ジビニルベンゼン樹脂 80ml を充填したカラムに通液し、 次いで 400mlの水で洗浄した。 さらに同カラムに 80%エタノール水溶液 400ml を通液し、 同溶出液を回収し、 凍結乾燥して、 空 胞化毒素中和剤 1.6g を無臭のかすかに苦味を呈した淡黄色の粉末として得た。 ホップ苞からの収率は 8%であった。
実施例 3
(限外ろ過膜によるホップ毬果からの空胞化毒素中和剤の調製）
ホップ毬果 20g を乳鉢で粉碎し、 2Lの水で撹拌下、 95° (：、 40分間抽出した。 ろ過後、 放冷し、 抽出液を分画分子量が 50,000の限外ろ過膜により、 1.0kg/cm2、 室温下、 20ml になるまで処理した。 得られた上残り液を減圧乾固し、 空胞化毒 素中和剤 200mgを無臭のかすかに苦味を呈した淡黄色の粉末として得た。 ホッ プからの収率は 1%であった。
実施例 4
(限外ろ過膜によるホヅプ苞からの空胞化毒素中和剤の調製） ホップ苞 20gを 600mlの 50%エタノール水溶液で撹拌下、 80°C 40分間抽出 した。 ろ過後、 抽出液を分画分子量が 1,000 の限外ろ過膜により、 3.0kgた m2 室温下、 60ml になるまで処理した。 得られた上残り液を凍結乾燥して、 空胞化 毒素中和剤 0.8g を無臭のかすかに苦味を呈した淡黄色の粉末として得た。 ホッ プ苞からの収率は 4%であった。
実施例 5
(空胞化毒素中和剤のさらなる精製および定性分析）
実施例 2で得た空胞化毒素中和剤 0.8gを、 500mlの 10%エタノール水溶液に 溶解し、 分画分子量が 5,000 の限外ろ過膜により、 1.0kg/cm2、 室温下、 20ml になるまで処理した。得られた上残り液を凍結乾燥して、 空胞化毒素中和剤 0.4g を無臭のかすかに苦味を呈した肌色の粉末として得た。 この粉末を下記に示すよ うな条件で H P L C分析すると、 図 3に示すような特徴的なク口マトグラムとな り、 また一般的なポリフエノール類の定量法のひとつであるカテキン定量 （食品 公定分析法） を行ったところカテキン含量に換算して 40.6%の値を得た。
( H P L C条件） 装置：島津 LC— 10Aシステム、 カラム： ODS-80TM (東ソ ― 4.6 I.D. x25cm)、 移動相： （A液： B液） = ( 100:0) から同 （50:50) まで 30分間の直線ダラディエント、 A液： 5%ァセトニトリル (0.1% HC1含有)、 B液：ァセトニトリル、 サンプル注入畺 検出： 200 300nm での多 波長検出。
実施例 6
(リンゴ未熟果からの空胞ィ匕毒素中和剤の調製）
リンゴ未熟果 （平均重量 5.03 g) 400 gを 1 %塩酸酸性メタノールと共にホモ ジナイズした後、 加熱還流しながら抽出し （3回）、 抽出液を減圧濃縮してメタ ノールを留去後、 クロ口ホルムを加えて分配し （2回）、 水層を回収し、 濾過後 蒸留水で 200ml にメスアップした。 さらに Sep-pak C18 を用いた固相抽出法 により精製し、 凍結乾燥して空胞化毒素中和剤を得た。
実施例 7
(錠剤、 カプセル剤）
実施例 5に従って得た物質 1 0 · 0 g 乳糖 75. O g
ステアリン酸マグネシウム 15. O g
合 計 100. 0 g
上記の各重量部を均一に混合し、 常法に従って錠剤、 カプセル剤とした。 なお実 施例 5に従って得た物質の代わりに、 それそれ実施例 1、 2、 3、 4、 6に従つ て得た物質を添加した錠剤、 力プセル剤も同様に得た。
難例 8
(散剤、 顆粒剤）
実施例 5に従って得た物質 20. 0 g
澱粉 30. 0 g
乳糖 50. O g
合 計 100. 0 g
上記の各重量部を均一に混合し、 常法に従って散剤、 顆粒剤とした。 なお 例 5に従って得た物質の代わりに、 それぞれ実施例 1、 2、 3、 4、 6に従って得 た物質を添加した散剤、 顆粒剤も同様に得た。
実施例 9
(注射剤）
¾1例 5に従って得た物質 1. O g
界面活性剤 9. 0 g
生理食塩水 90. 0 g
合 計 100. 0 g
上記の各重量部を加熱混合、 滅菌して注射剤とした。 なお 例 5に従って得た 物質の代わりに、 それぞれ実施例 1、 2、 3、 4、 6に従って得た物質を添加し た散剤、 顆粒剤も同様に得た。
餓例 10
(飴）
ショ糖 20. 0 g
水飴 （75%固形分） 70. 0 g
水 9. 5 g 着色料 0. 45- g
香 料 0. 045 g
実施例 5に従って得た物質 0. 005 g
合 計 100. 0 g
上記の各重量部の各成分を用い、 常法に従って飴とした。 なお実施例 5に従って 得た物質の代わりに、 それそれ実施例 1、 2、 3、 4、 6に従って得た物質を添 加した飴も同様に得た。
実施例 11
(ジュース）
濃縮ミカン果汁 15. 0 g
果 糖 5. 0g
クェン酸 0. 2 g
香 料 0. 1 g
色 素 0. 15 g
ァスコルビン酸ナトリウム 0. 048g
m 5に従って得た物質 o . o o 2 g
水 79. 5 g
合 計 100. 0 g
上記の各重量部の各成分を用い、 常法に従ってジュースとした。 なお実施例 5に 従って得た物質の代わりに、 それそれ実施例 1、 2、 3、 4、 6に従って得た物 質を添加したジュースも同様に得た。
実施例 12
(クッキー）
薄力粉 32. Og
全 卵 16. 0 g
バター 16. 0 g
砂 糖 25. 0 g
水 10. 8 g
ベーキングパウダー 0. 198 g »例 5に従って得た物質 0 . 0 0 2 g
合 計 1 0 0 . 0 g
上記の各重量部の各成分を用い、 常法に従ってクッキーとした。 なお実施例 5に 従って得た物質の代わりに、 それそれ実施例 1、 2、 3、 4、 6に従って得た物 質を添加したクッキーも同様に得た。
実施例 1 3
空胞化毒素の培養細胞に対する細胞毒性試験
ヒト胃癌由来細胞株である AZ-521 細胞またはヒト腎臓癌由来細胞株である G401細胞を 2.0 X 105cells/mlの懸濁液に調整した。 その 100 /1を 96穴ブレー 卜に分注した後、 一晩放置して各々の細胞の単層膜を調製した。 これに一定濃度 の空胞化毒素と、 各種濃度の実施例 5または 6で得た空胞ィ匕毒素中和剤を混合し たものを 37° (：、 30分インキュベーションした後添加した。 空胞化毒素の最終濃 度は 120nM、 実施例 5または 6の最終濃度は 0-100 g/ml とした。 プレートを 5 % C 02雰囲気化、 37°Cで 8時間培養した後、 細胞に対する空胞ィ匕毒素の毒性 を、 ニュートラルレツド (0.05%PBS溶液)の空胞への取り込みの度合い（Ab540) により評価した。 その結果を図 4および図 5に示す。 実施例 5および 6で得た空 胞化毒素中和剤の濃度に依存して、 AZ-521細胞と G401細胞の双方に対して空 胞化毒素による細胞毒性が無毒ィ匕された。
実施例 1 4
培養細胞への結合
ヒト胃癌由来細胞株である AZ-521 細胞またはヒト腎臓癌由来細胞株である G401細胞を 2.0 x i05cells/mlの懸濁液に調整した。 その 100^1を 96穴プレー 卜に分注した後、 一晩放置して各々の細胞の単層膜を調製した。 各種濃度のピオ チン標識空胞化毒素と、 一定濃度の実施例 5または 6で得た空胞化毒素中和剤を 37。 (、 30分インキュベーション後、 細胞の単層膜に添加した。 空胞化毒素の最 終濃度は 0-100nM、 実施例 5または 6の最終濃度は 10 zg/ml とした。 細胞の 単層膜を 5 % C 02、 37°Cインキュベータ中 4時間培養した後、 細胞を 0.25%グ ル夕ルアルデヒドで固定した。 細胞表面に接着したピオチン標識空胞化毒素の量 を、 アビジン標識したホースラディッシュペルォキシ夕ーゼ (Pharmacia)および TMBZ色素の発色（Ab450mn)で評価した。 その結果を図 6および図 7に示す。 実施例 5または 6の得た空胞化毒素中和剤の濃度に依存して、 空胞化毒素の細胞 への結合が阻害された。
餓例 1 5
マウス胃傷害実験 ，.
24時間絶食（ItoRのみ自由摂取） した 4週齢の C57BL/6Jマウスに対し、 体 重 10g当り 5 gの空胞化毒素および 50-250 z gの実施例 5を、 経口ゾンデを 用いて投与した。 動物は 1匹ずつ個別ゲージにて飼育し、 投与 48時間後、 胃を 摘出した。 摘出標本を 10%ホルマリンにて固定し、 その前後で実体顕 観察 を行った。 固定標本はへマトキシリンェォジン染色を行い Ghiara らの方法 (Ghiara. P ., et al. Infect.Immun. 63, 4154-4160.(1995)) に従い、 胃傷害の程 度を点数化し、 評価した。 その結果を表 1に示す。 実施例 5は有意に胃の傷害を 抑制した。 · 表 1 番号 試 料 胃暉害スコア _
1 リン酸緩衝液 1-6 ± 0.8
2 実施例 5(250 1.8 土 0.8
3 空胞化毒素 (5 g) 3.0 ± 0.8
4 空胞化毒素 (5;U g)+実施例 5( 50;U g) 2.4 土 1.0
5 空胞化毒素 (5i^ g)+実施例 5(100/i g) 2· 土 0.8*
__ 6 _空胞化毒素 8) +実施例5(250 2) 2.2 ± 0.8*
*は 3に比べ危険率 5%以下で有意な差があることを示す。 産業上の利用の可能性
本発明の空胞化毒素中和剤は、 空胞ィ匕毒素を無毒ィ匕する効果を有するので、 空 胞化毒素を病原因子とする感染症の予防および治療上有効なものである。 本発明 品は空胞化毒素を病原因子とする感染症の予防/治療剤および生化学的実験用試 薬などとして製品化することができる。
ピロリ菌が関与する消ィ匕職患としては、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 胃炎、 胃癌、 MALTリンパ腫等が例示される。

Claims

6 請求の範囲
1 . へリコパク夕一 'ビロリが産生する空胞ィヒ毒素を中和 （無毒化） する効果を 有するプロアントシァニジン類。
2 . プロアントシァニジン類がホップまたはホップ苞に由来するプロアントシァ 二ジン類である、 請求項 1記載のプロアントシァニジン類。
3 ·プロアントシァニジン類がリンゴに由来するプロアントシァニジン類である、 請求項 1記載のプロアントシァニジン類。
4 . 請求項 1記載のプロアントシァニジン類を有効成分として含有する、 へリコ パクター 'ピロリが関与する消化器疾患の予防剤、 再発予防剤又は治療剤。
5 . 請求項 2記載のプロアントシァニジン類を有効成分として含有する、 へリコ パク夕一 ·ピロリが関与する消化器疾患の予防剤、 再発予防剤又は治療剤。
6 . 請求項 3記載のプロアントシァニジン類を有効成分として含有する、 へリコ パク夕一 ·ピロリが関与する消化器疾患の予防剤、 再発予防剤又は治療剤。
7 . 請求項 1記載のプロアントシァニジン類を有効成分として含有する、 へリコ パク夕— ·ピロリ菌が産生する空胞化毒素の中和剤。
8 . 請求項 2記載のプロアントシァニジン類を有効成分として含有する、 へリコ パク夕一 ·ピロリ菌が産生する空胞化毒素の中和剤。
9 . 請求項 3記載のプロアントシァニジン類を有効成分として含有する、 へリコ パク夕一 ·ピロリ菌が産生する空胞化毒素の中和剤。
1 0 . 請求項 1記載のプロアントシァニジン類を有効成分として含有する医薬部 口
外 口
1 . 請求項 2記載のプロアントシァニジン類を有効成分として含有する医薬部
2 . 請求項 3記載のプロアントシァニジン類を有効成分として含有する医薬部 外ロロ
3 .請求項 1記載のプロアントシァニジン類を有効成分として含有する飲食品。
4 .請求項 2記載のプロアントシァニジン類を有効成分として含有する飲食品。
5 .請求項 3記載のプロアントシァニジン類を有効成分として含有する飲食品。
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