CN103163271B - 烟叶中蛇床子素残留量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟叶中蛇床子素残留量的测定方法，包括以下步骤：称取研磨的烟叶用甲醇水溶液超声提取，液液萃取后得到滤液，用N-丙基乙二胺和氟罗里硅土固相萃取柱净化，再用高效液相色谱仪-紫外检测器测定鲜烟叶中蛇床子素残留量的方法，本发明首次建立蛇床子素在鲜烟叶的残留检测方法，具有前处理简单和干扰较少的优点，还具有线性范围宽、重复性好和检测限低等优点。
Description
技术领域
本发明属于烟草中农药残留的检测领域，具体涉及为烟叶中蛇床子素残留量的测定方法。
背景技术
天然化合物蛇床子素(osthol)，是从蛇床、欧前胡等传统中草药中提取的香豆素类化合物，化学名称为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，是由江苏省农业科学院联合苏科农化有限责任公司在21世纪初研发的杀菌、杀虫剂。主要用于防治蔬菜中各种白粉病、霜霉病、小菜蛾、菜青虫、蚜虫等常年危害严重的病虫害，具有高活性、微毒性、低残留等特点。随着这一产品在烟草上的大好使用前景，建立快速、准确的测定烟草中蛇床子素的分析方法十分必要。
目前关于蛇床子素化合物的分析方法报道较多，但主要为中药的常规质量控制及生物试样的检测，对其在农产品上的残留分析方法研究较少，只有陈浩等采用高效液相色谱-紫外检测器法对土壤和黄瓜中蛇床子素的残留进行了研究。有关蛇床子素的主要检测方法有液相色谱-紫外检测器法、气相色谱-火焰离子化检测器法、气相色谱-质谱联用法。由于蛇床子素结构的共轭双键较多，最大吸收波长达到322 nm，在该波长下分析检测，干扰成分相对较少，灵敏度较高，使得高效液相色谱-紫外检测器法是检测蛇床子素的主流方法。本发明提供了一种用甲醇水溶液提取，通过液液萃取和固相萃取净化后，高效液相色谱-紫外检测器法检测烟叶中的生物源新农药-蛇床子素的测定方法，具有良好的检测效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用甲醇水溶液提取，通过液液萃取和固相萃取净化后，高效液相色谱-紫外检测器法检测烟叶中的生物源新农药-蛇床子素的测定方法，首次建立了生物源新农药-蛇床子素在烟叶中的残留检测方法，本方法具有操作简便，提取效率高; 所建立的色谱检测方法线性范围宽，重复性好，检测限低等优点。
本发明采用的技术方案：
本发明烟叶中蛇床子素残留量的测定方法，包括以下步骤：
（1）称取研磨的鲜烟叶，用甲醇水溶液超声提取后抽滤，用二氯甲烷萃取，合并浓缩；
（2）浓缩液依次用N-丙基乙二胺固相萃取柱和氟罗里硅土固相萃取柱净化；
（3）用高效液相色谱仪测定烟叶中的蛇床子素残留量。
所述的甲醇水溶液为甲醇与水的体积比为1：1。
所述的浓缩液依次用N-丙基乙二胺固相萃取柱和氟罗里硅土固相萃取柱净化具体步骤为：将N-丙基乙二胺固相萃取柱用二氯甲烷预处理活化后，将浓缩液转移至柱中，用二氯甲烷洗脱分析物，将洗脱液在40 ℃下浓缩至近干，氮气吹干，再将残留物用正己烷溶解后转移至用正己烷活化的氟罗里硅土固相萃取柱中，加入正己烷淋洗萃取柱，弃去淋洗液后用正己烷与丙酮的混合溶液对分析物进行洗脱，收集洗脱液后氮气吹干，用体积比为1:1的甲醇水溶液溶解，过 0.45 μm微孔有机滤膜。
正己烷与丙酮的混合溶液为丙酮与正己烷体积比为6：4。
高效液相色谱仪的检测器为紫外二极管阵列检测器。
高效液相色谱仪的色谱条件为：Zorbax SB-C18 色谱柱；柱温25℃; 流 速1 mL /min; 进样量：20 μL；检测波长：322 nm，参比波长为400 nm；流动相为A=甲醇，B=水；时间程序：开始50%B到10 min时减少至20% B，并保持到15 min，到17 min时又升至 50% B，并保持到18 min结束。
本发明达到的有益效果：
（1）首次建立蛇床子素在烟叶中的残留检测方法
相对于现有的检测方法，该方法更合适分析复杂基质中蛇床子素中的含量，本发明用甲醇水溶液提取，通过液液萃取和固相萃取净化后获得杂质含量较少的提取成分，用高效液相色谱-紫外检测器检测具有较简单的色谱图。
（2）检测灵敏度高，线性范围宽
紫外检测器采用波长较长的参比波长（400 nm）进行比对，提高了蛇床子素在紫外检测器上的灵敏度，降低了检测限。将一定浓度的标准品添加(0.05 mg/kg)到样品中，经过前处理和上机检测分析，以S/N=3.14计算检测限（LOD），检测限为0.016 mg/kg；
将浓度梯度为0.25 ug/mL，0.5 ug/mL，1.0 ug/mL，5.0 ug/mL和10.0 ug/mL用高效液相色谱-紫外检测器分析，以浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标，进行线性回归，蛇床子素的回归方程为Y=40.4827X-0.8418，R2=0.9998，表明线性关系较好，说明该方法具有检测灵敏度高，线性范围宽的优点。
（3）回收率高，精密度好
蛇床子素在鲜烟叶中的回收率在92.7%-96.7%之间，日内变异系数为3.4%-5.1%，日间变异系数3.2%-6.4%，说明该方法回收率高，精密度好。
附图说明：附图 1为0.5 μg/mL蛇床子素标准溶液和烟草空白样品添加0.1 mg/kg蛇床子素的色谱图。
具体实施方式
实施例1
称取研磨的鲜烟叶10 g于250 mL锥形瓶中，加入体积比为1:1（V/V）的甲醇水溶液60 mL，混匀后，室温超声提取15 min，经铺有 Celite 545 的砂芯漏斗快速抽滤，残渣再用20 mL提取液洗涤，将滤液转移至250 mL的分液滤斗中，加入10 mL饱和食盐水后，依次用50 mL、30 mL、20 mL二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷过装有无水硫酸钠和脱脂棉的三角漏斗，于 40 ℃下浓缩至2 mL。将N-丙基乙二胺萃取柱（型号：Cleanert PSA 500MG，3ML）用5 mL二氯甲烷预处理活化后，将2 mL残留物转移至柱中，再用4 mL二氯甲烷洗脱分析物，将6 mL洗脱液在40 ℃下浓缩近干，氮气吹干。将残留物用2 mL正己烷溶解，将溶解物转移至用5 mL正己烷活化的氟罗里硅土固相萃取柱中（型号：BOND ELUT-FL 500MG，3ML），再加入6 mL正己烷淋洗杂质，最后用体积比为4:6（V/V）的正己烷:丙酮10 mL对分析物进行洗脱，收集洗脱液后氮气吹干，用1 mL 1:1（V/V）的甲醇水溶液溶解，过 0.45 μm微孔有机滤膜，将其转移至2 mL色谱瓶中，待高效液相色谱仪检测。
高效液相色谱仪的检测器为紫外二极管阵列检测器。
高效液相色谱仪的色谱条件：Zorbax SB-C18 色谱柱( 4.6 mm×150 mm，5μm )；柱温25℃; 流 速1 mL /min; 进样量 20 μL；检测波长：322 nm，参比波长为400 nm；流动相为A=甲醇，B=水；时间程序：开始时50%B到10 min时减少至20% B，并保持到15 min，到17 min时又升至 50% B，并保持到18 min结束。在该色谱条件下，蛇床子素的保留时间为12.05 min。
实施例2
蛇床子素标准品用甲醇配制，浓度为200 μg/mL的储存标准溶液。工作标准溶液用甲醇把储存标准溶液稀释为相应的浓度。即配制成不同浓度的蛇床子素标准溶液，标准溶液的浓度梯度为：0.25 ug/mL，0.5 ug/mL，1.0 ug/mL，5.0 ug/mL和10.0 ug/mL。
将蛇床子素标准品以0.05 mg/kg的浓度添加到样品中，经过前处理和上机检测分析，以S/N=3.14计算检测限（LOD），检测限为0.016 mg/kg；
将浓度梯度为0.25 ug/mL，0.5 ug/mL，1.0 ug/mL，5.0 ug/mL和10.0 ug/mL用高效液相色谱-紫外检测器分析，以浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标，进行线性回归，蛇床子素的回归方程为Y=40.4827X-0.8418，R2=0.9998，表明线性关系较好，说明该方法具有检测灵敏度高，线性范围宽的优点。
实施例3
在新鲜烟叶中加入三个浓度梯度的蛇床子素标准溶液，放入4℃左右冰箱中静置过夜，然后进行前处理，再用高效液相色谱检测分析。并按照添加量和测定值计算其添加回收率。结果见表1，从表1可以看出，按照0.05 mg/kg，0.1 mg/kg，0.5 mg/kg进行添加时，蛇床子素的平均添加回收率在92.7%-96.7%范围内，日内相对标准偏差为3.4%-5.1%，日间相对标准偏差为3.2%-6.4%，说明本方法回收率高，精密度较好。
0.5 μg/mL蛇床子素标准溶液和烟草空白样品添加0.1 mg/kg蛇床子素的色谱图见附图1所示。
Claims (4)
1.烟叶中蛇床子素残留量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）称取研磨的鲜烟叶，用甲醇水溶液超声提取后抽滤，用二氯甲烷萃取，合并浓缩；
（2）浓缩液依次用N-丙基乙二胺固相萃取柱和氟罗里硅土固相萃取柱净化，具体步骤为：将N-丙基乙二胺固相萃取柱用二氯甲烷预处理活化后，将浓缩液转移至柱中，用二氯甲烷洗脱分析物，将洗脱液在40 ℃下浓缩至近干，氮气吹干，再将残留物用正己烷溶解后转移至用正己烷活化的氟罗里硅土固相萃取柱中，加入正己烷淋洗萃取柱，弃去淋洗液后用正己烷与丙酮的混合溶液对分析物进行洗脱，收集洗脱液后氮气吹干，用体积比为1:1的甲醇水溶液溶解，过 0.45 μm微孔有机滤膜；
（3）用高效液相色谱仪测定烟叶中的蛇床子素残留量，其中高效液相色谱仪的色谱条件为：Zorbax SB-C18 色谱柱；柱温25℃; 流 速1 mL /min; 进样量：20 μL；检测波长：322 nm，参比波长为400 nm；流动相为A=甲醇，B=水；时间程序：开始50%B到10 min时减少至20% B，并保持到15 min，到17 min时又升至 50% B，并保持到18 min结束。
2.根据权利要求1所述的烟叶中蛇床子素残留量的测定方法，其特征在于：所述步骤（1）中的甲醇水溶液为甲醇与水的体积比为1：1。
3.根据权利要求1所述的烟叶中蛇床子素残留量的测定方法，其特征在于：所述的正己烷与丙酮的混合溶液为丙酮与正己烷体积比为6：4。
4.根据权利要求1所述的烟叶中蛇床子素残留量的测定方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪的检测器为紫外二极管阵列检测器。
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