CN105651892B - 一种基于gc-msqqq的卷烟指纹图谱分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于GC‑MSQQQ的卷烟指纹图谱分析方法，经过卷烟样品溶剂浸提、GC‑MSQQQ指纹图谱的获得、夹角余弦和欧氏距离计算分析，从而判定卷烟内在质量稳定性。本发明的特征是，针对卷烟的特征致香成分，通过超声提取、首先运用全扫描模式(SCAN)进行检测，对其中29种含量最高的组分定性分析，然后建立多反应模式(MRM)检测方法，对其进行定量分析，获得的指纹图谱基线平稳、分离度高、定量更加准确。本发明能客观的反映卷烟的内在质量稳定性，作为传统的人工评吸感官质量评价方法的有效补充，评价更具科学性，不仅有助于稳定产品质量，而且能够为异地加工的产品质量一致性提供技术支撑。

Description

一种基于GC-MSQQQ的卷烟指纹图谱分析方法
技术领域
本发明涉及卷烟测试领域，尤其是一种基于GC-MSQQQ的卷烟指纹图谱分析方法。
背景技术
近年来，各种现代仪器分析法如GC/MS、HPLC和HPLC/MS等已成为指纹图谱研究中常用的方法，具有分离效率高、分析速度快、稳定性较好等优点，是建立指纹图谱常见的有效方法。
申请号为201110365633.9文献涉及一种烤烟GC/MS指纹图谱的建立方法及应用。它是采用超纯水体系同时蒸馏萃取方法提取、GC/MS检测，获得基线分离好、特征峰多、峰响应度高的GC/MS指纹图谱。将建立的烤烟GC/MS指纹图谱及其配套分析技术应用于烤烟品质分级、产地识别和配方打叶中的烟叶质量控制。
申请号为200810196807.1文献涉及一种烤烟醇化品质判定的HPLC指纹图谱主成分分析方法。它是采用HPLC分析方法测定不同烟叶样品，得出烟叶指纹图谱特征峰，然后利用指纹图谱软件对特征峰进行分析，建立特征峰主成分值与烟叶样品感官质量的回归关系模型；以感官评吸值Y为依变量，7个主成分值A1至A7为因变量，建立特征峰主成分值与感官评吸值的多元回归模型：Y＝85.64+1.34A1+1.21A2+0.27A3-0.40A4-1.17A5-0.46A6+0.48A7，根据分析所得到的主成分值A，计算出感官质量Y。
申请号为201110302768.0文献涉及供一种黄芩药材UPLC-MS指纹图谱的测定方法。它是采用UPLC-MS进行测定，23个共有峰都标定了离子质量和分子式，测定步骤包括：制备供试品溶液；设定指纹图谱检测的色谱条件和质谱条件；记录18分钟的色谱图，根据各峰分子离子的质核比获得23个共有峰的提取离子色谱图，进行指纹图谱评价，本发明的优点是采用了超高效液相色谱仪进行分离，质谱仪进行检测，大大缩短了分离时间，提高了分离效率和检测灵敏度，并能实现对共有峰的准确定位，该方法灵敏度高，专属性强，可用于黄答药材的鉴别和质量评价。
上述专利文献都注重样品的整体性，对样品成分进行全扫描，再对其中的共有峰进行定量分析，但由于卷烟等样品基质非常复杂，基线不平稳，且某些成分干扰共有峰，造成定量不精确，影响指纹图谱数据分析的准确性。随着现代分析技术的发展，GC-MSQQQ的应用将使指纹图谱的研究方法更加多样化，尤其是它具有基线平稳、选择性好、能够有效消除干扰等诸多优点，在色谱指纹图谱研究中具有独特的优势，但尚未有其用于卷烟指纹图谱研究的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于GC-MSQQQ的卷烟指纹图谱分析方法，其操作简单、节省时间、选择性好、重现性高、检测限低，实用性强。
为了解决上述技术问题，本发明的一种基于GC-MSQQQ的卷烟指纹图谱分析方法，包括以下步骤：
1)样品前处理：将卷烟烟丝磨碎成末，过40目筛，混合均匀，准确称取1.0000g烟末25mL具塞三角瓶中，准确加入10mL甲醇，100μL乙酸苯乙酯内标储备液(1mg/mL甲醇溶液)，样品浸泡24h，室温下超声提取30min，静 置10min后，取上层清液用0.45μm有机滤膜过滤，待GC-MSQQQ分析；
2)仪器分离检测：
a、GC分离条件：色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度：250℃；载气：高纯He，恒定流速：1.0mL/min；进样量：1μL；分流比：30︰1；程序升温：初始温度60℃，保持3min，以10℃/min的速率升至280℃，保持10min；
b、MSQQQ检测条件：离子源：EI；电离能量：70eV；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；传输线温度：250℃；谱图检索：NIST谱库；
MS1 Scan扫描模式：首先对待测样品溶液进行MS1 Scan模式全扫描，扫描范围35～450amu，对色谱图中含量最高的30种组分(含内标)进行谱库检索，定性分析以确定组分名称，并选丰度最高的离子作母离子；
Production扫描模式：根据全扫面谱图确定30种组分的时间片断和驻留时间，观察各组分母离子的子离子扫描图，选择丰度最高的特征子离子作为MRM方法的子离子；
MRM扫描模式：对确定的30对离子对(母离子→子离子)分别设定不同碰撞池电压的运行序列，优化每个子离子的最佳碰撞能量，最后使用优化的碰撞能量，离子源参数保持不变，建立MRM方法；
3)指纹图谱数据分析：
对10个不同批次的卷烟样品进行MRM监测方法测定，以选定的所有共有峰作为样品的特征指纹峰，以乙酸苯乙酯作为内标物参照峰求出各特征指纹峰的相对保留时间α值和相对峰面积Sr值，利用夹角余弦和欧氏距离计算相似度，建立标准指纹图谱；
a、夹角余弦：反映指纹图谱特征变量变化模式的相似度，对指纹图谱峰强度的变化进行评价；
式中：Cir—第i批次样品与标准指纹图谱的相似度；
Xik—第i批次样品的第k个特征变量(k＝1,2,3…)；
Xrk—共有模式均值向量的第k个特征变量(k＝1,2,3…)；
b、欧式距离：反映研究对象之间的亲疏程度，与指纹图谱数据的线性比例关系有关，表征内在成分浓度的变化；
式中：dir—第i批次样品与标准指纹图谱的欧式距离；
Xik—第i批次样品的第k个特征变量(k＝1,2,3…)；
Xrk—共有模式均值向量的第k个特征变量(k＝1,2,3…)。
本发明的有益效果是：本发明针对卷烟的内在成分，采用甲醇溶剂超声提取烟末样品，采用一级质谱进行内在成分定性解析，二级质谱进行定量分析，获得的GC-MSQQQ指纹图谱具有基线平稳、分离度好、灵敏度高的特点，再以夹角余弦和欧氏距离进行相似度评价，可有效控制卷烟产品的内在质量稳定。
附图说明
图1为本发明一种基于GC-MSQQQ的卷烟指纹图谱分析方法的流程图；
图2为本发明中MS1 Scan扫描模式和MRM扫描模式的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
参见图1和图2，本发明是一种利用三重串联四极杆气质联用仪(GC-MSQQQ)指纹图谱控制卷烟内在质量的方法，它是采用多反应模式(MRM)监测，对卷烟特征香气成分进行准确定量，从而达到对卷烟的质量整体稳定性予以控制的目的。本发明旨在建立一种基于GC-MSQQQ的卷烟指纹图谱的分析方法，具体说是针对卷烟的特征致香成分，通过溶剂超声提取、首先运用全扫描模式(SCAN)进行检测，对其中29种含量最高的组分定性分析，然后建立MRM检测方法，对其进行定量分析，通过夹角余弦和欧氏距离计算不同批次样品间的相似度。
本发明能客观的反映卷烟的内在质量稳定性，作为传统的人工评吸感官质量评价方法的有效补充，评价更具科学性，不仅有助于稳定产品质量，而且能够为异地加工的产品质量一致性提供技术支撑。
实施例
本发明提供的卷烟样品的GC-MSQQQ指纹图谱分析方法，经过下列步骤：
1)仪器与试剂：7890-7000三重串联四极杆气质联用仪(美国Agilent公司)；KQ-600DE型超声波清洗器(昆山超声仪器公司)；XS204电子天平(0.0001g，瑞士Mettler公司)；有机相过滤膜(尼龙、0.45μm，上海安谱)；无水甲醇(色谱纯，德国Merck)；乙酸苯乙酯(分析纯，科密欧)；卷烟样品A和B(天津卷烟厂提供)。
2)样品前处理：将卷烟烟丝磨碎成末，过40目筛，混合均匀，准确称取1.0000g A号卷烟烟末25mL具塞三角瓶中，准确加入10mL甲醇，100μL乙酸苯乙酯内标储备液(1mg/mL甲醇溶液)，样品浸泡24h，室温下超声提取30min，静置10min后，取上层清液用0.45μm有机滤膜过滤，待GC-MSQQQ分析。
3)仪器分离检测：色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)； 进样口温度：250℃；载气：高纯He，恒定流速：1.0mL/min；进样量：1μL；分流比：30︰1；程序升温：初始温度60℃，保持3min，以10℃/min的速率升至280℃，保持10min。离子源：EI；电离能量：70eV；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；传输线温度：250℃；谱图检索：NIST谱库。
MS1 Scan扫描模式：首先对待测样品溶液进行MS1 Scan模式全扫描，扫描范围35～450amu，对色谱图中含量最高的30种组分(含内标)进行谱库检索，定性分析以确定组分名称，并选丰度最高的离子作母离子。
Production扫描模式：根据全扫面谱图确定30种组分的时间片断和驻留时间，观察各组分母离子的子离子扫描图，选择丰度最高的特征子离子作为MRM方法的子离子。
MRM扫描模式：对确定的30对离子对(母离子→子离子)分别设定不同碰撞池电压的运行序列，优化每个子离子的最佳碰撞能量，最后使用优化的碰撞能量，离子源参数保持不变，建立MRM方法，MRM扫描参数见表1。
表1 MRM扫描参数
MS1 Scan扫描模式和MRM扫描模式的色谱图见图2(图2中a：MS1 Scan扫描模式色谱图；b：MRM扫描模式色谱图)，分别代表一级质谱色谱图和二级质谱色谱图。
4)标准指纹图谱的建立
对10个不同批次的A号卷烟样品按上述方法进行测定，以选取的29个共有峰作为该卷烟的特征指纹峰，以乙酸苯乙酯作为内参照峰求出各特征指纹峰的相对保留时间α值和相对峰面积Sr值，以Sr平均值作为卷烟的标准指纹图谱，分别运用夹角余弦法和欧氏距离法计算各批次卷烟与标准指纹图谱的夹角余弦和欧氏距离，具体结果见表2，从而确定A号卷烟的稳定性阈值为夹角余弦 ≥99.962％，并且欧氏距离≤1.819。
表2 A 号卷烟标准指纹图谱
5)参兑实验验证
在生产车间中随机抽取1个批次的A号卷烟和1个批次的B号卷烟，在A号卷烟中分别参兑B号卷烟样品5％、10％、15％、20％、25％、50％和100％(质量分数)，分别按实验方法制备供试溶液，进样分析，计算与标准指纹图谱的夹角余弦和欧氏距离，结果见表3，参兑后A号卷烟的相似度发生了明显的变化，并且随着参兑比例的增加，夹角余弦逐渐减小，欧氏距离不断变大，并且都超过了稳定性阈值，表明产品质量发生了波动。
表3 参兑实验结果
参兑比例 5％ 10％ 15％ 20％ 25％ 50％ 100％
夹角余弦/％ 99.941 99.928 99.883 99.844 99.812 99.445 97.372
欧氏距离 2.637 2.638 2.671 2.824 4.899 5.170 10.434
本发明具有下列优点和效果：本发明针对卷烟的内在成分，采用甲醇溶剂超声提取烟末样品，采用一级质谱进行内在成分解析，二级质谱进行定量分析，获得的GC-MSQQQ指纹图谱具有基线平稳、分离度好、灵敏度高的特点，再以夹角余弦和欧氏距离进行相似度评价，可有效控制卷烟产品的内在质量稳定。
1)本发明的样品前处理方法
本研究分别考察了甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷等几种不同溶剂对卷烟的提取效果，比较相同体积的不同溶剂提取的组分数目和含量，其中甲醇溶剂的提取效果最佳，因此我们选择甲醇为萃取溶剂。进一步优化甲醇萃取液的体积和浸泡时间，综合实验结果选择10mL甲醇浸泡24h。卷烟样品的出峰数目在50以上，前29种含量最高组分的峰面积占总峰面积的90％以上。前处理方法操作简单、有效。
2)本发明的定性和定量方法
为了获取一个稳定和可重复的色谱指纹图谱，指纹图谱的分析是建立在相对保留时间和相对峰面积的基础上，因此，我们选择乙酸苯乙酯作内标参考物，其相对保留时间和相对峰面积分别设为1和100％，MRM方法利用离子对和相对保留时间双重定性，更加体现二级质谱在指纹图谱研究中的优势。
3)本发明的精密度、稳定性和重现性
同一批次样品称取1份，按上述方法制备供试溶液，连续进样10次分析。观察各指纹图谱无明显差异，主要色谱峰的相对保留时间α值(待测峰的保留时间与参考峰的保留时间比值)的RSD均小于2％，相对峰面积Sr值(待测峰的峰面积与参考峰的峰面积比值)的RSD均小于3％，表明仪器精密度良好。
同一批次样品称取1份，按上述方法制备供试溶液，在室温下放置，分别于0、2、4、8、16、24h进样分析。观察各指纹图谱无明显差异，主要色谱峰的相对保留时间α值的RSD均小于2％，相对峰面积Sr值的RSD均小于3％，表明供试品溶液的成分在24h内是稳定的。
同一批次样品平行称取10份，分别按上述方法制备供试溶液，依次进样分析。观察各指纹图谱无明显差异，主要色谱峰的相对保留时间α值的RSD均小于2％，相对峰面积Sr值的RSD均小于5％，表明方法重现性良好。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，本领域的技术人员可以在本发明的技术指导思想之内提出其他的实施例，但这些实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (1)

1.一种基于GC-MSQQQ的卷烟指纹图谱分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)样品前处理：将卷烟烟丝磨碎成末，过40目筛，混合均匀，准确称取1.0000g烟末25mL具塞三角瓶中，准确加入10mL甲醇，100μL乙酸苯乙酯内标储备液，样品浸泡24h，室温下超声提取30min，静置10min后，取上层清液用0.45μm有机滤膜过滤，待GC-MSQQQ分析；
2)仪器分离检测：
a、GC分离条件：色谱柱：HP-5MS毛细管柱；进样口温度：250℃；载气：高纯He，恒定流速：1.0mL/min；进样量：1μL；分流比：30︰1；程序升温：初始温度60℃，保持3min，以10℃/min的速率升至280℃，保持10min；
b、MSQQQ检测条件：离子源：EI；电离能量：70eV；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；传输线温度：250℃；谱图检索：NIST谱库；
MS1Scan扫描模式：首先对待测样品溶液进行MS1Scan模式全扫描，扫描范围35～450amu，对色谱图中含量最高的30种组分进行谱库检索，定性分析以确定组分名称，并选丰度最高的离子作母离子；
Product ion扫描模式：根据全扫面谱图确定30种组分的时间片断和驻留时间，观察各组分母离子的子离子扫描图，选择丰度最高的特征子离子作为MRM方法的子离子；
MRM扫描模式：对确定的30对离子对分别设定不同碰撞池电压的运行序列，优化每个子离子的最佳碰撞能量，最后使用优化的碰撞能量，离子源参数保持不变，建立MRM方法；
3)指纹图谱数据分析：
对10个不同批次的卷烟样品进行MRM监测方法测定，以选定的所有共有峰作为样品的特征指纹峰，以乙酸苯乙酯作为内标物参照峰求出各特征指纹峰的相对保留时间α值和相对峰面积Sr值，利用夹角余弦和欧氏距离计算相似度，建立标准指纹图谱；
a、夹角余弦：反映指纹图谱特征变量变化模式的相似度，对指纹图谱峰强度的变化进行评价；
式中：Cir—第i批次样品与标准指纹图谱的相似度；
Xik—第i批次样品的第k个特征变量；
Xrk—共有模式均值向量的第k个特征变量；
b、欧式距离：反映研究对象之间的亲疏程度，与指纹图谱数据的线性比例关系有关，表征内在成分浓度的变化；
式中：dir—第i批次样品与标准指纹图谱的欧式距离；
Xik—第i批次样品的第k个特征变量；
Xrk—共有模式均值向量的第k个特征变量。
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CN105651892A (zh) 2016-06-08

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