WO2012004917A1 - 神経突起伸長剤 - Google Patents

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WO2012004917A1
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nad
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上西　秀則
順英 金城
良太 土橋
池田　剛
昭宏 坂元
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Kaminishi Hidenori
Kinjo Junei
Tsuchihashi Ryota
Ikeda Tsuyoshi
Sakamoto Akihiro
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
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    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical

Definitions

  • NGF nerve growth factor
  • a neurotrophic factor having an action (see Patent Document 1), an action of promoting neurite outgrowth of neurons containing ebselen having an action of promoting phosphorylation of mitogen-activated protein kinase (ERK1 / 2) of neurons
  • a neurite extender (see Patent Document 3), which contains at least one compound selected from the group consisting of neurotrophic factor (see Patent Document 2), caffeic acid or a derivative thereof as an active ingredient, and carnosic acid
  • An object of the present invention is to provide a non-peptide neurite / neurite extender that elongates neurites and neurites.
  • Nerve axon / neurite outgrowth agent (composition) containing as an ingredient, and (3) cancer cell growth inhibition / apoptosis containing the compound of (1) above or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • the present invention relates to a method used for production, and (7) a method of using the compound described in (1) above or a pharmacologically acceptable salt thereof for producing a cancer cell proliferation inhibitor / apoptosis inducer.
  • Nicotinamide mononucleotide represented by the following formula (II)
  • Nicotinamide represented by the following formula (V)
  • a method for producing a compound represented by formula (I) according to (8) above, or (10) a compound or a compound according to (1) above, which is produced by phosphorylating a nicotinamide mononucleoside represented by The present invention relates to a food or a food material characterized by adding a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a neurite / neurite extender capable of extending neurites and neurites, and a cancer cell proliferation inhibitor / apoptosis inducer.
  • FIG. 3 is a diagram showing a synthesis process of the subject nicotinamide mononucleotide portion containing ⁇ -L-ribose as a constituent sugar. It is a figure which shows the synthetic
  • the result of two-dimensional HMQC of this NAD analog is shown. It is a figure which shows the effect which acts on NB-1 cell derived from a human neuroblastoma cell of this NAD analog. (A) shows the control, and (b) and (c) show the case where 10 ⁇ g / mL was added. Arrows indicate neurites. It is a figure which shows the effect which acts on the NB-1 cell of the human neuroblastoma origin cell of this NAD analog. 3 is a graph showing the growth inhibitory effect of human myeloid leukemia cells on HL-60 cells by the present NAD analog. FIG. 18 shows that apoptosis of HL-60 cells was induced by this NAD analog (FIG.
  • the compound of the present invention (present NAD analog) is 3- (aminocarbonyl) -1- [5-O-[[1- (6-amino-9H-purin-9-yl) -1-deoxy- ⁇ - D-ribofuranose-5-O-yl] phosphonyloxy (oxilato) phosphinyl] - ⁇ -L-ribofuranosyl] pyridinium, and the production method of the NAD analog is not particularly limited. As shown in the retrosynthesis scheme of the present compound in FIG.
  • the NAD analog of the present invention can also be used as a cancer cell proliferation inhibitor / apoptosis inducer, and malignant black as a cancer for which the cancer cell proliferation inhibitor / apoptosis inducer of the present invention is effective.
  • Melanoma skin cancer, lung cancer, tracheal and bronchial cancer, oral epithelial cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, liver and intrahepatic bile duct cancer, kidney Cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, brain tumors and other epithelial cells that have become malignant cancer and tumor, myoma, osteosarcoma, Ewing sarcoma, etc.
  • Examples include cancers and tumors that have become malignant in cells and muscles, bones, hematopoietic cells such as leukemia, malignant lymphoma, myeloma, Burkitt lymphoma, etc., among which epithelial cells are malignant Cancer and tumor, human Induce apoptosis as well as inhibit the proliferation of marrow leukemia cells and in that also has antiproliferative effects against leukemia cells resistant to retinoic acid, it may be mentioned as the most reliable example leukemia.
  • NAD analog When the NAD analog is used as a nerve axon and / or neurite elongating agent or elongating composition, or a cancer cell growth inhibitory / apoptosis inducing agent, particularly when used as a pharmaceutical, in addition to these components , Pharmaceutically acceptable conventional carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents, pH buffering agents, disintegrating agents, solubilizers, solubilizers, isotonic agents, and various other formulation ingredients Can be added.
  • yogurt, drink yogurt, juice, milk, soy milk, liquor, coffee, tea, sencha, oolong tea, sports drinks, and other beverages pudding, cookies, bread, cakes Baked confectionery such as jelly, rice cracker, Japanese confectionery such as sheep crab, frozen confectionery, bread and confectionery such as chewing gum, noodles such as udon and buckwheat , Mention may be made of miso, soy sauce, dressing, mayonnaise, and sweeteners such as seasonings such, cheese, and dairy products such as butter, tofu, konjac, and other boiled, dumplings, croquettes, a variety of side dishes of salad.
  • These foods and food materials may be used in combination with known nerve axons / neurite outgrowth agents and substances that have cancer cell growth inhibition / apoptosis inducing actions.
  • the present nicotinamide mononucleotide portion was synthesized as a nicotinamide mononucleotide having ⁇ -L-ribose as a constituent sugar according to the method of phosphorylation of the 5-position hydroxyl group of the ribose moiety (FIG. 2). reference).
  • the nicotinamide mononucleotide part obtained above was dissolved in a 0.2 M manganese chloride formamide solution (1.5 equivalents), and AMP-morpholidate cocoon (1 equivalent) (Sigma) and magnesium sulfate ( 2 equivalents) was added, and the reaction solution was stirred at room temperature under a nitrogen stream for 21 hours. After the reaction, cold acetonitrile was added to the reaction solution, the mixture was clouded, centrifuged, the supernatant was discarded, and the precipitate was collected. The mixture was subjected to Sephadex LH-20 column chromatography (Pharmacia) and eluted with distilled water, and a fraction containing the main product was prepared. Although these fractions show weak neurite outgrowth activity, it was suggested that the NAD analogs of the present invention were included, although the reaction yield was not high.
  • FIG. 4 shows a purification chart of the compound purified under the above HPLC conditions.
  • commercially available ⁇ -NAD the constituent sugar of the nicotinamide mononucleotide part is ⁇ -D-ribose
  • ⁇ -NAD the constituent sugar of the nicotinamide mononucleotide part is ⁇ -D-ribose
  • the above formula (VII) has the system name 3- (aminocarbonyl) -1- [5-O-[[1- (6-amino-9H-purin-9-yl) -1-deoxy- ⁇ -D- Ribofuranose-5-O-yl] phosphonyloxy (oxilato) phosphinyl] - ⁇ -L-ribofuranosyl] pyridinium.
  • mice-derived neuroblastoma cells which are model cells for examining the neurite outgrowth effect.
  • Mouse-derived neuroblastoma cells (Neuro-2a cells) (available from Health Science Research Resources Bank) adjusted to 10 6 cells / mL and supplemented with 10% fetal bovine serum Eagle's minimal essential medium (EME) The medium was cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • rat fetal midbrain dopamine neurons [Effect of this NAD analog on rat fetal midbrain dopamine neurons] A fetus was removed from a Sprague-Dawley (SD) rat on the 15th day of gestation, and the ventral part of the midbrain was excised under a stereomicroscope. Cells were dispersed by treatment for minutes. Thereafter, rat fetal mesencephalic dopamine neurons were obtained by treatment with PBS containing 50 ⁇ g / mL deoxyribonuclease I (DNaseI) and 50 ⁇ g / mL trypsin inhibitor at 37 ° C. for 5 minutes. The obtained rat fetal midbrain dopamine neurons were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 in a Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) culture medium supplemented with 10% bovine serum.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the culture medium was exchanged, and the NAD analog was added at concentrations of 0 (control), 0.01, 0.1, 1.0, and 10 ⁇ g / mL. After addition, the cells were further cultured for 3 days. On day 5 of culture, dopamine neurons were stained with an anti-tyrosine hydroxylated antibody (Pel-Freez) and a fluorescein (FITC) -labeled secondary antibody (JacksonReImmunoResearch) by immunostaining. The length and number of neurites emerging from the cell body were measured with Neurolucida® (Micro Bright Field). The results are shown in FIG.
  • FIG. 7 shows the results of examining the neurite outgrowth effect of rat fetal brain dopamine cells. Comparing the length of the neurites extending from the cells, when the NAD analog was added at 10 ⁇ g / mL, the neurites were about 150% longer than the control when the control was taken as 100%. Showed a good elongation effect. In addition, it measured about 45 control cells and 38 test cells, and showed the average.
  • FIG. 8 is a graph showing quantitative changes in the neurite outgrowth effect of rat fetal brain dopamine cells. It was found that the neurites were elongated by the addition of 0.1 ⁇ g / mL of the present NAD analog. A similar experiment was conducted using commercially available ⁇ -NAD, but no neurite outgrowth was observed.
  • rat fetal linear neurons (dopamine cells) purchased from LONZA (USA) were used. The concentration of the cells was adjusted to 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL, and the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • the culture solution was prepared according to the protocol using a serum-free medium for primary neuronal cell culture (manufactured by LONZA).
  • the culture dish used was a polylysine-treated surface. This NAD analog was adjusted so that the final concentration in the culture solution was 10 ⁇ g / mL, and added at the same time as the start of cell culture.
  • KIF5C has been confirmed to be highly expressed in lower motoneurons in mice at 2 weeks of age or later, suggesting that it is necessary for maintenance rather than motor neuron formation (Kanai et al., The Journal). of Neuroscience, 2000, 20 (17): 6374-6384).
  • MAP2 is found in abundance in cytoskeletal components, becomes a substrate for many protein kinases and phosphatases, and controls the relationship with the cytoskeleton. It seems (Prog Neurobiol. 2000).
  • NB-1 cells human neuroblastoma-derived cells
  • the number of human neuroblastoma-derived cells (NB-1 cells) used as model cells for studying the neurite outgrowth effect was adjusted to 10 6 cells / mL.
  • Such NB-1 cells were added to Eagle's MEM medium at a final concentration of 10%, and further cultured in a medium supplemented with 10 ⁇ g / mL of the NAD analog. After 7 days, a phase contrast microscope was used. Then, the morphological change of the cells was observed at 200 times magnification. The results are shown in FIG.
  • HL-60 cells Human myeloid leukemia cells
  • the number of human myeloid leukemia cells (HL-60 cells) was adjusted to 1.0 ⁇ 10 4 cells / mL.
  • Such HL-60 cells are added to Eagle's MEM medium at a final concentration of calf serum of 10%, and the NAD analog is further adjusted to 0, 2.0, 4.0, 8.0 ⁇ g / mL. Then, the cells were cultured in the added medium, and the number of cells was counted after 5 days. The results are shown in FIG.
  • HL-60 cells human myeloid leukemia cells
  • the number of human myeloid leukemia cells (HL-60 cells) was adjusted to 1.0 ⁇ 10 4 cells / mL.
  • Such HL-60 cells are added to RPMI medium to a final concentration of calf serum of 10%, and further cultured in a medium supplemented with the NAD analog adjusted to 10 ⁇ g / mL or 20 ⁇ g / mL.
  • the cells were subjected to nuclear staining and observed with a fluorescence microscope. The result is shown in FIG. 18B.
  • DNA was extracted from the cells by a conventional method and electrophoresed. The result is shown in FIG. 18C.
  • FIG. 18A shows no change in the nuclear morphology of HL-60 cells in the control without addition of the subject NAD analog, but in FIG. 18B cultured for 4 days in the medium with the subject NAD analogue added, HL-60 The cell nuclear fragmentation was clearly observed. This phenomenon indicates that the cell is undergoing apoptosis.
  • FIG. 18C shows the results of electrophoresis of DNA extracted from HL-60 cells. Lane 1 is a molecular size marker, Lane 2 is a control, Lanes 3 and 4 are 10 ⁇ g / mL and 20 ⁇ g / mL, respectively, of the subject NAD analog.

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Abstract

　本発明の課題は神経軸策と神経突起を伸長させる非ペプチド系の神経軸策・神経突起伸長剤を提供することにある。β－Ｌ－リボースを構成糖とするニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）類縁体である３－（アミノカルボニル）－１－［５－Ｏ－［［１－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－１－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノース－５－Ｏ－イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］－β－Ｌ－リボフラノシル］ピリジニウムを、神経軸策及び／又は神経突起の伸長剤や伸長組成物、がん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導剤やがん細胞の増殖抑制組成物・アポトーシス誘導組成物に用いる。

Description

神経突起伸長剤
　本発明は、神経軸索・神経突起伸長剤及び抗がん剤、より詳しくは、ニコチンアミドモノヌクレオチド部分の構成糖がβ－Ｌ－リボースである、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）類縁体を有効成分とする神経軸索・神経突起伸長剤及びがん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導剤、並びにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）類縁体を添加した脳神経の機能回復又はがんの予防・治療用の食品や食品素材に関する。
　脳損傷、脊髄損傷などにより神経回路網が傷害を受け、切断あるいは神経細胞死に陥ると、支配神経下の生理・運動機能は失われると同時に神経回路の復活は極めて困難である。しかし、失われたさまざまな機能回復・復活のためには生残する神経細胞間のネットワーク再構築が不可欠で、このために生残する神経細胞からの神経軸索と、それから伸張する神経突起の新生が必要である。神経突起伸長作用を有する物質としては、神経細胞から分泌される神経成長因子（ＮＧＦ）が注目を集めている。ＮＧＦは、神経組織の成長及び機能維持にとって重要かつ必要な因子であり、末梢神経における知覚及び交感神経の成熟、分化に不可欠であり、脳損傷時の神経細胞の変性を防ぐという作用を示すが、血液脳関門（ＢＢＢ）透過性を持たないため、末梢からまたは経口投与では脳内に移行できないといわれている。
　従来、非ペプチド系の神経突起の伸長剤、伸長誘導剤、伸長促進剤等としては、５－アシル－２－アミノ－１，３－セレナゾール類縁体を含有する神経細胞の神経突起伸長を促進する作用を有する神経栄養因子（特許文献１参照）、神経細胞のマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化を促進する作用を有するエブセレンを含有する神経細胞の神経突起伸長を促進する作用を有する神経栄養因子（特許文献２参照）、カフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する神経突起伸長剤（特許文献３参照）、カルノシン酸を含有するローズマリーおよびセージからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来の抽出物を有効成分として含有する神経突起伸長剤（特許文献４参照）、神経細胞の神経突起伸長作用を有するリゾホスファチジルエタノールアミンを含有することを特徴とする細胞死抑制物質（特許文献５参照）、モネンシン、コンカナマイシンＡなど細胞内小器官アルカリ化剤を主成分とする運動神経細胞の神経突起を伸長するための神経突起伸長組成物（特許文献６参照）、ノビレチン、タンゲレチン等のポリアルコキシフラボノイドを含有する神経突起伸長剤（特許文献７参照）、グリコサミノグリカン誘導体を含有する神経突起伸長活性剤（特許文献８参照）、ラクタシスチン誘導体を含有する神経突起伸長剤（特許文献９参照）、小分子複素環式ケトンまたはチオエステル化合物を含有する神経突起伸長剤（特許文献１０参照）、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂおよびＧＴ１ｂガングリオシドのヒドロキシル、シアリン酸並びにセラミド基でのパー硫酸化誘導体を除き、サッカライド、シアリン酸またはセラミド残基の少なくとも１つのヒドロキシル基が硫酸でエステル化されている、ガングリオシドおよびＮ－アシル－Ｎ－リゾ－ガングリオシド、Ｎ’－アシル－Ｎ’－リゾ－ガングリオシド並びにＮ，Ｎ’－ジ－またはポリ－アシル－Ｎ，Ｎ’－ジリゾ－ガングリオシドの誘導体を含有する神経突起伸長剤（特許文献１１参照）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）－ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）の二糖を含むコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含有する神経突起伸長剤（特許文献１２参照）、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体等を含有する神経突起伸長誘導剤（特許文献１３参照）、低分子合成化合物を有効成分とする神経突起伸長誘導剤（特許文献１４参照）などが知られている。
特開２００８－１００９５４号公報 特開２００８－７４４６号公報 特開２００７－２３０９４６号公報 特開２００７－２３０９４５号公報 特開２００７－２２９６６号公報 特開２００６－５２１９２号公報 特開２００２－６０３４０号公報 特開平１１－３１０６０２号公報 特開平８－２３１５０１号公報 特表２００３－５１４８９３号公報 特表平８－５０７３０７号公報 ＷＯ２００５／１０３０８９号公報 ＷＯ２００５／０９７１５５号公報 特開２００９－１３２６２２号公報
　従来、種々の要因により傷害を受けた中枢神経系の再生や修復は困難と考えられてきたが、近年の研究により中枢神経系にも潜在的に修復能力を有していることが明らかにされてきた。この再生能力の臨床応用は運動、感覚、記憶などの障害や、難病とされている多くの精神・神経疾患に対してその克服をもたらす可能性が高い。これまでの研究で神経再生に阻害的に作用する物質や再生に必要な分子の存在が明らかにされ、動物実験レベルでの標的分子治療の有効性が示唆されている。一方、傷害を受けた中枢神経系の再生、修復に関する研究ではＥＳ細胞や神経幹細胞などを用いた移植医療ではなく、内在性神経幹細胞や、内在性神経再生能の活性化に向けた研究が主流になっており、標的を定めた創薬においても国際的に大きな取組みが始まっている。本発明の課題は、神経軸索と神経突起を伸長させる非ペプチド系の神経軸索・神経突起伸長剤を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、３－（アミノカルボニル）－１－［５－Ｏ－［［１－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－１－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノース－５－Ｏ－イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］－β－Ｌ－リボフラノシル］ピリジニウム（以下、「本件ＮＡＤ類縁体」と呼ぶことがある）が神経軸索と神経突起を伸長させる作用を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は、（１）３－（アミノカルボニル）－１－［５－Ｏ－［［１－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－１－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノース－５－Ｏ－イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］－β－Ｌ－リボフラノシル］ピリジニウムである化合物や、（２）上記（１）記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む神経軸策・神経突起伸長剤（組成物）や、（３）上記（１）記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含むがん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導剤（組成物）や、（４）上記（１）記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を、神経軸策と突起の伸長剤として使用する方法や、（５）上記（１）記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を、がん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導剤として使用する方法や、（６）上記（１）記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を、神経軸策と突起の伸長剤製造のために使用する方法や、（７）上記（１）記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を、がん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導剤製造のために使用する方法に関する。
　また、本発明は、（８）以下の式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
で表わされるニコチンアミドモノヌクレオチドと、以下の式（II）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
で表わされるアデノシン一リン酸モルフォリデートとを、反応させることを特徴とする以下の式（III）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
で表される化合物の製造方法や、（９）以下の式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
で表わされるニコチンアミドモノヌクレオチドが、以下の式（IV）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
で表わされるニコチンアミドと以下の式（Ｖ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
で表わされるＬ－リボーステトラアセテートとを反応して得られる以下の式（VI）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
で表わされるニコチンアミドモノヌクレオシドをリン酸化して製造されることを特徴とする上記（８）記載の式（Ｉ）で表わされる化合物の製造方法や、（１０）上記（１）記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を添加したことを特徴とする食品又は食品素材に関する。
　本発明によると、神経軸索と神経突起を伸長させることができる神経軸索・神経突起伸長剤や、がん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導剤を提供することができる。
本件化合物のレトロ合成スキームを示す図である。 β－Ｌ－リボースを構成糖とする本件ニコチンアミドモノヌクレオチド部の合成工程を示す図である。 ＡＭＰと本件ニコチンアミドモノヌクレオチド部のリン酸エステル結合の合成工程を示す図である。 本件ＮＡＤ類縁体をＨＰＬＣで精製した化合物の精製チャートを示す図である。 本件ＮＡＤ類縁体のＮｅｕｒｏ－２ａマウス神経芽腫細胞に及ぼす効果を示す図である。 本件ＮＡＤ類縁体によるラット胎児中脳神経細胞に及ぼす効果を示す図である。 本件ＮＡＤ類縁体によるラット胎児脳ドーパミン細胞の神経突起伸長効果を示す図である。 本件ＮＡＤ類縁体の濃度ごとのラット胎児脳ドーパミン細胞の神経突起伸長効果の相違を示す図である。 本件ＮＡＤ類縁体のＭＳ（質量分析）による分析結果に示す。 本件ＮＡＤ類縁体のプロトン核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ－ＮＭＲ）の結果を示す。 本件ＮＡＤ類縁体のカーボン核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ－ＮＭＲ）の結果を示す。 本件ＮＡＤ類縁体の二次元Ｈ－ＨＣＯＳＹの結果を示す。 本件ＮＡＤ類縁体の二次元ＨＭＢＣの結果を示す。 本件ＮＡＤ類縁体の二次元ＨＭＱＣの結果を示す。 本件ＮＡＤ類縁体のヒト神経芽腫細胞由来のＮＢ－１細胞に及ぼす効果を示す図である。（ａ）はコントロール、（ｂ）と（ｃ）は、１０μｇ／ｍＬ添加した場合を示す。矢印は、神経突起を示す。 本件ＮＡＤ類縁体のヒト神経芽腫由来細胞のＮＢ－１細胞に及ぼす効果を示す図である。 本件ＮＡＤ類縁体によるヒト骨髄性白血病細胞のＨＬ－６０細胞の増殖抑制効果を示すグラフである。 本件ＮＡＤ類縁体によりＨＬ－６０細胞のアポトーシス誘導がされたことを示す図（図１８Ｂ）、及び、培養したＨＬ－６０細胞から抽出したＤＮＡを電気泳動の結果を示す図（図１８Ｃ）である。図１８Ａは陰性対照を示す。 本件ＮＡＤ類縁体によるレチノイン酸耐性白血病細胞のＵＦ－１細胞の増殖抑制効果を示す図である。 本件ＮＡＤ類縁体によるヒト繊維肉腫細胞のＨＴ１０８０細胞の増殖抑制効果を示す図である。 本件ＮＡＤ類縁体によるヒト結腸腺がん細胞のＨＴ２９細胞の増殖抑制効果を示す図である。
　本発明の化合物（本件ＮＡＤ類縁体）は、３－（アミノカルボニル）－１－［５－Ｏ－［［１－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－１－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノース－５－Ｏ－イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］－β－Ｌ－リボフラノシル］ピリジニウムと表記することができ、上記本件ＮＡＤ類縁体の製造方法としては特に制限されないが、例えば、図１の本件化合物のレトロ合成スキームに示すとおり、β－Ｌ－リボースを構成糖とする本件ニコチンアミドモノヌクレオチド部を含む本件ＮＡＤ類縁体について、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ；adenosine monophosphate）部分とニコチンアミド部分を別々に調製し、最後にジリン酸体にすることで合成することができる。また、ニコチンアミド部分はニコチンアミドとＤ－リボースのアセチル体との縮合で合成することが報告されていることから、Ｌ－リボースでもこの方法を適用することとした。すなわち、天然物のＮＡＤではβ－Ｄ－リボースを構成糖とするニコチンアミドモノヌクレオチドに対し、本件ではβ－Ｌ－リボースを構成糖とするニコチンアミドモノヌクレオチド（以下、「本件ニコチンアミドモノヌクレオチド部」と呼ぶことがある）を合成し、かかる本件ニコチンアミドモノヌクレオチド部と、ＡＭＰとのリン酸エステル結合反応を公知の合成法により行うことで、本件ＮＡＤ類縁体を得ることができる。ＡＭＰとしては、リボース部分が天然型のＤ－リボースであるＡＭＰ活性錯体を用いることが好ましい。また、本発明の化合物は、以下の式（VII）として例示することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　本発明の化合物の薬理学的に許容される塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を挙げることができる。薬理学的に許容される酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等の各無機酸塩や、有機酸としてはギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、安息香酸等の各カルボン酸塩類や、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等のスルホン酸類、グルタミン酸、アスパラギン酸等の各アミノ酸塩類などを挙げることができ、薬理学的に許容される金属塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム等の各アルカリ金属塩や、マグネシウム、カルシウム等の各アルカリ土類金属塩や、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩などを挙げることができる。また、薬理学的に許容されるアンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の各塩を、薬理学的に許容される有機アミン塩としては、トリエチルアミン、ピペリジン、モルホリン、トルイジン等の各塩を、薬理学的に許容されるアミノ酸付加塩としては、グルタミン酸、リジン、グリシン、アラニン等の付加塩などを挙げることができる。
　本発明の本件ＮＡＤ類縁体は、神経軸索・神経突起（神経軸索及び／又は神経突起）等神経細胞の伸長剤や伸長組成物として有利に用いることができ、例えば、損傷した中枢神経組織や神経変性疾患の治療における新しい機能物質としての可能性があり、様々な原因で損なわれた神経、特に脳神経の機能回復への応用や、加齢に伴う神経、特に脳神経の機能低下防止への応用が期待でき、神経細胞の活性化作用・保護作用を必要とする疾病の予防・治療薬としてその有用性が期待できる。神経細胞としては、具体的には、中脳ドーパミン神経細胞、大脳皮質神経細胞、小脳皮質神経細胞、海馬神経細胞などを挙げることができる。かかる神経細胞の活性化作用・保護作用を必要とする疾病としては、具体的には、脊髄損傷（spinal cord injury）、脳挫傷（cerebral contusion）、脳梗塞（brain infarction）、脳出血（cerebral hemorrhage）、クモ膜下出血（subarachnoid hemorrhage）、アルツハイマー病（Alzheimer's disease）、パーキンソン症候群(Parkinson's syndrome)、多発性硬化症（multiple sclerosis）、脱髄疾患（demyelinating disease）、ギラン・バレー症候群（Guillain-Barre syndrome）、高次脳機能障害を挙げることができ、なかでも、パーキンソン症候群を好適に例示することができる。
　本発明の本件ＮＡＤ類縁体は、また、がん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導剤として用いることができ、本発明のがん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導剤が有効ながんとしては、悪性黒色腫（メラノーマ）、皮膚がん、肺がん、気管及び気管支がん、口腔上皮がん、食道がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、大腸がん、肝臓及び肝内胆管がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、脳腫瘍等の上皮細胞などが悪性化したがんや腫瘍、筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫等の支持組織を構成する細胞である筋肉や骨が悪性化したがんや腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫、バーキットリンパ腫等の造血細胞由来のがんや腫瘍などを挙げることができるが、中でも上皮細胞などが悪性化したがんや腫瘍や、ヒト骨髄性白血病細胞の増殖を抑制すると共にアポトーシスを誘導し、また、レチノイン酸に耐性を有する白血病細胞に対しても増殖抑制効果を有する点で、白血病を最も確実な例として挙げることができる。
　本件ＮＡＤ類縁体を、神経軸索及び／又は神経突起の伸長剤や伸長組成物、或いはがん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導剤として用いる場合、特に医薬品として用いる場合には、これら成分に加えて、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。
　本件ＮＡＤ類縁体又はその薬理学的に許容される塩を添加した、神経の機能回復、特に脳神経の機能回復、又はがんの予防・治療用の食品や食品素材の種類としては特に制限されず、ここで神経の機能回復とは、神経細胞の活性化作用・保護作用を発揮しうることをいい、また、がんの予防・治療とは、がんの予防又は症状改善効果を発揮しうることをいい、食品や食品素材として具体的には、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜を挙げることができる。これら食品や食品素材には、公知の神経軸策・神経突起伸長剤やがん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導作用を有する物質を併用してもよい。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（本件ＮＡＤ類縁体の合成）
　ＮＡＤのニコチンアミド部分のβ－Ｄ－リボース部分の鏡像異性体であるβ－Ｌ－リボースをニコチンアミドモノヌクレオチドの構成糖とする本件ＮＡＤ類縁体を化学合成して神経突起伸長効果を検証した。本件ＮＡＤ類縁体は、以下の工程に従って合成した。
［本件ＮＡＤ類縁体の本件ニコチンアミドモノヌクレオチド部の合成］
　Tanimori et al.（Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, 1135-1137 (2002) 参照）のニコチンアミドとリボースからのニコチンアミドリボシド合成法と、J. Lee et al（Chem. Comm., 1999, 729-730）のリボース部分の５位水酸基のリン酸化反応の方法に従い、β－Ｌ－リボースを構成糖とするニコチンアミドモノヌクレオチドとして本件ニコチンアミドモノヌクレオチド部の合成を行った（図２参照）。具体的には、ニコチンアミド（Wako社製）１７２ｍｇとＬ－リボーステトラアセテート（Sigma社製）４００ｍｇとを、無水アセトニトリル１０ｍＬに溶解し、窒素気流下、トリメチルシリルトリフルオロスルホン酸（ＴＭＳＯＴｆ）を過剰量添加後、室温にて１時間３０分反応液を攪拌した。メタノール５．０ｍＬを添加して反応を停止させた上記反応液を、活性炭（Wako社製）を充填したカラム（直径１．５ｃｍ×長さ３ｃｍ）に付し、蒸留水で洗浄後、メタノールで溶出して生成物を回収した。
　上記生成物は、ＮＭＲ分析によりグリコシド結合の割合が、α：β＝約７：１であることが推定され、Ｌ－リボース部分の１位のアノマー異性体の混合物であった（図２（Ａ）参照）。上記生成物は室温で放置しておくと分解することから、これ以上の精製は行わずにＬ－リボース部分の５位水酸基のリン酸化反応を行うこととした。
　上記生成物２５８ｍｇをトリメトキシリン酸１．５ｍＬに溶解し、氷冷下、オキシ塩化リン０．２５ｍＬを滴下し、窒素気流下、０℃にて２０時間反応液を攪拌した。２規定水酸化ナトリウム水溶液を添加して中和させ、反応を停止させた上記反応液に、冷アセトニトリル－エーテル（１：３）溶液２．０ｍＬを添加して分配操作を行った。下層(水相)を陰イオン交換樹脂（Amberlite IRA410、formic acid form、ローム・アンド・ハース社製）（直径１．７ｃｍ×長さ８．５ｃｍ）に通して反応物を回収した。さらに、陽イオン交換樹脂（Amberlite IR120B, H+form ローム・アンド・ハース社製）（直径１．０ｃｍ×長さ１２ｃｍ）に付して精製を重ね、本件ニコチンアミドモノヌクレオチド部と思われる画分を凍結乾燥して２３８ｍｇ回収した。
　上記画分に含まれる化合物は、ＭＳ、１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、３１Ｐ-ＮＭＲによりその化学構造が確証された。本件ニコチンアミドモノヌクレオチド部の収率は、上記２工程を経て、上記Tanimori et alの文献とほぼ同様の７０％前後であった（図２（Ｂ）参照）。
［ＡＭＰと本件ニコチンアミドモノヌクレオチド部のリン酸エステル結合］
　図３にＡＭＰと本件ニコチンアミドモノヌクレオチド部のリン酸エステル結合の合成ステップを示す。ＡＭＰとしては、リボース部分がβ－Ｄ－リボースである市販のＡＭＰ活性錯体（ＡＭＰ－モルフォリデート（morpholidate））を用いた。
　上記で得られた本件ニコチンアミドモノヌクレオチド部を０．２Ｍ塩化マンガンのホルムアミド溶液（１．５等量）で溶解し、ＡＭＰ－モルフォリデート (１等量）（Sigma社製）と硫酸マグネシウム（２等量）を添加し、窒素気流下、室温にて反応液を２１時間攪拌した。反応後、上記反応液に冷アセトニトリルを添加し、白濁させ、遠心して上清を捨て、沈殿を回収した。ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０カラムクロマトグラフィー（ファルマシア社製）に付し、蒸留水で溶出後、主生成物を含む画分を調製した。かかる画分には弱いながら神経突起伸長活性が認められることから、反応収率的には高くないものの、本件発明のＮＡＤ類縁体が含まれることが示唆された。
［本件ＮＡＤ類縁体の精製］
　本件ＮＡＤ類縁体の精製は、Ｌ－２１３０形ポンプ、Ｌ－２４５０形ダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）、Ｌ－２２００形オートサンプラー、Ｌ－２３００形カラムオーブン(いずれも日立ハイテク社製)、フラクションコレクターＳＦ－２１００(アドバンテック社製)からなるＨＰＬＣ－ＰＤＡシステムを用いて行った。ＨＰＬＣの分離条件は以下のとおりである。
カラム：コスモシールpackedカラムＨＩＬＩＣ, ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ　ｉ．ｄ．(ナカライテスク社製)
サンプル濃度：４０ｍｇ／ｍＬ(Ｈ２Ｏ)
注入量：３０μＬ
カラム温度：４０℃
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ
溶媒Ｂ：１００ｍｍｏｌ　ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４水溶液
グラジエント：Ａ：Ｂ＝９０：１０(０分)、７０：３０(１３分)、０:１００(１５分)、０：１００（１８分)、９０：１０（１９分)、９０：１０(２５分)
分取条件：０～２５分、２５フラクション(分取インターバル１分)
　上記のＨＰＬＣ条件で精製した化合物の精製チャートを図４に示す。標準物質として市販のα－ＮＡＤ（ニコチンアミドモノヌクレオチド部の構成糖がα－Ｄ－リボース）（Sigma社製）及びβ－ＮＡＤ（ニコチンアミドモノヌクレオチド部の構成糖がβ－Ｄ－リボース）（Sigma社製）を用いた。９．８分付近にα－ＮＡＤ及びβ－ＮＡＤのピークが観察されている一方、それら２つのピークとは異なる９．３分付近に今回精製された化合物のピークが観察されており、上記のＨＰＬＣ条件で精製された化合物は、α－ＮＡＤ又はβ－ＮＡＤとは相違する本件ＮＡＤ類縁体であると確認した。
　以下、本件ＮＡＤ類縁体の同定を以下の方法で行った。
　質量（ＦＡＢ　ＭＳ）スペクトル測定は、日本電子株式会社製　ＪＭＳ－７００Ｔ（イオン源：Ｘｅ atom beam、加速電圧：１０ｋｖ、分解能：５０００）にて行った。プロトン核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ－ＮＭＲ：５００ＭＨｚ）、カーボン核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ－ＮＭＲ：１２５ＭＨｚ）は、日本電子株式会社製　ＪＮＭ－Ａ５００（サンプル濃度：１．５％（ｗ／ｖ％）、測定濃度：３５℃、溶媒：Ｄ２Ｏ、デジタル分解能：１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）０．３１Ｈｚ；１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）１．０３Ｈｚ）で測定した。化学シフトは、 tetramethylsilane（ＴＭＳ）を内部標準とし、δ値（ｐｐｍ）で表し、結合定数（Ｊ）は、Ｈｚで表した。シグナルの表示には、次の略号を用いた。「ｓ：singlet、ｄ：doublet、ｔ：triplet、ｑ：quartet、ｄｄ：double doublet、ｔｄ：triplet doublet、 ｍ：multiplet.」（表１等参照。）
　質量（ＭＳ）スペクトルの結果を図９に、プロトン核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ－ＮＭＲ）の結果を図１０に、カーボン核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ－ＮＭＲ）の結果を図１１に、二次元Ｈ－ＨＣＯＳＹの結果を図１２に、二次元ＨＭＢＣの結果を図１３に、二次元ＨＭＱＣの結果を図１４に示す。また、１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ－ＮＭＲの帰属について、以下の表１及び式（VIII）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（結果）
　高分解能ＭＳ測定を行った結果、ｍ／ｚ＝６６４のプロトン化分子（（Ｍ＋Ｈ）＋）について精密質量６６４．１１６８が得られた。構成元素をＣ，Ｈ，Ｎ，Ｓ，Ｐとして組成演算し、組成式としてＣ２１Ｈ２８Ｎ７Ｏ１４Ｐ２を選択し、核磁気共鳴スペクトルとの結果より、得られた本件ＮＡＤ類縁体は、上記式（VII）で表される構造を有する新規化合物であることを決定した。上記式（VII）は、体系名として３－（アミノカルボニル）－１－［５－Ｏ－［［１－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－１－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノース－５－Ｏ－イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］－β－Ｌ－リボフラノシル］ピリジニウムと表すこともできる。
（本件ＮＡＤ類縁体の神経細胞の形態に及ぼす効果－１）
［本件ＮＡＤ類縁体のマウス神経芽腫細胞に及ぼす効果］
　神経突起伸張効果を検討する際のモデル細胞であるマウス由来神経芽腫細胞を用いて、神経突起の誘導作用について検証した。マウス由来神経芽腫細胞（Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞）（Health Science Research Resources Bankより入手）を、１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整して１０％ウシ胎児血清添加イーグル最小必須培地（Eagle’s minimal essential medium；ＥＭＥ）培養液で５％ＣＯ２存在下、３７℃にて培養した。
　上記Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞を３時間培養した後、上記の同培地と交換し、本件ＮＡＤ類縁体１０μg／ｍＬを添加してさらに４８時間培養した後、位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化を観察した。結果を図５に示す。Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞から神経突起（神経軸索様突起）が出現し、これが伸長している様子が明らかである（（ａ）、矢印）。本件ＮＡＤ類縁体を添加しないコントロール（ｂ）を培養した場合も、わずかに神経軸索様の突起状構造が観察されるが、本件ＮＡＤ類縁体を添加した場合と比較して明らかに短かった。また、市販のβ－ＮＡＤを用いて同様の実験を行ったが、神経突起について変化は見られなかった。
［本件ＮＡＤ類縁体のラット胎児中脳ドーパミン神経細胞に及ぼす効果］
　妊娠１５日の Sprague-Dawley（ＳＤ）ラットから胎児を取り出し、実体顕微鏡下で中脳腹側部を切り分けた後、メスで細切して、０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ中で３７℃、２０分間処理して細胞を分散させた。その後、５０μｇ／ｍＬのデオキシリボヌクレアーゼＩ(DNaseＩ)と５０μｇ／ｍＬのトリプシンインヒビター（trypsin inhibitor）を含むＰＢＳで３７℃にて５分間処理を行うことによりラット胎児中脳ドーパミン神経細胞を得た。得られたラット胎児中脳ドーパミン神経細胞は、ウシ血清１０％添加ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle’s medium：ＤＭＥＭ）培養液で５％ＣＯ２存在下、３７℃にて培養した。
　上記ラット胎児中脳ドーパミン神経細胞を２日間培養後、培養液を交換し、本件ＮＡＤ類縁体を０（コントロール）、０．０１、０．１、１．０、及び１０μｇ／ｍＬの各濃度で添加し、さらに３日間培養した。培養５日目に免疫染色法によりドーパミン神経細胞を抗チロシン水酸化抗体（Pel-Freez社製）とFluorescein（ＦＩＴＣ）標識した二次抗体（Jackson ImmunoResearch社製）で染色し、染色された細胞の細胞体から出ている神経突起の長さと数をNeurolucida (Micro Bright Field社)で計測した。結果を図６に示す。ラット胎児中脳神経細胞において、０～１０μｇ／ｍＬまでのデータでは、本件ＮＡＤ類縁体の濃度が高くなるほど、神経突起が、コントロールに比較して明らかに長くなっており、本件ＮＡＤ類縁体は神経軸索の伸長をもたらすとともに、突起上にこぶ状のいわゆる「バリコシティ」を多数形成し、これにより神経再生につながるシナプス形成を可能にすることが明らかとなった。また、市販のβ－ＮＡＤを用いて同様の実験を行ったが、神経突起の伸長は観察されなかった。
　図７は、ラット胎児脳ドーパミン細胞の神経突起伸長効果を調べた結果を示す。細胞から伸長する神経突起の長さを計測比較すると、本件ＮＡＤ類縁体を１０μｇ／ｍＬ添加した場合、神経突起はコントロールを１００％とした場合にコントロールよりも約１５０％の長さになり、明らかな伸長効果を示した。なお、４５個のコントロール細胞と３８個の被検細胞について計測し、その平均を示した。
　図８はラット胎児脳ドーパミン細胞の神経突起伸長効果について量的変化を調べたグラフである。０．１μｇ／ｍＬの本件ＮＡＤ類縁体の添加で神経突起は伸長することがわかった。また、市販のβ－ＮＡＤを用いて同様の実験を行ったが、神経突起の伸長は観察されなかった。
（本件ＮＡＤ類縁体の神経細胞の形態に及ぼす効果－２）
［本件ＮＡＤ類縁体のヒト神経芽腫細胞由来のＮＢ－１細胞に及ぼす効果］
　神経伸長のモデル細胞として、ヒト神経芽腫細胞由来細胞を用いて、神経突起の誘導作用について検証した。ヒト神経芽腫細胞（ＮＢ－１細胞）（Health Science Research Resources Bank より入手）を、１０3ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整して１０％ウシ胎児血清添加イーグル最小必須培地（Eagle’s minimal essential medium；EME）培養液で５％ＣＯ２存在下、３７℃にて培養した。
　上記ＮＢ－１細胞を３時間培養した後、上記の同培地と交換し、本件ＮＡＤ類縁体１０μg／ｍＬを添加してさらに培養を継続し、位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化を観察した。培養途中、４～５日毎に新鮮な培養液と交換した。細胞培養開始１０日目の観察結果を図１５に示す。ＮＢ－１細胞から神経突起（神経軸索様突起）が出現し、神経突起が伸長している様子が明らかである（図１５（ｂ）及び（ｃ）参照）。本件ＮＡＤ類縁体を添加しないコントロール（図１５（ａ）参照）を培養した場合も、わずかに神経軸索様の突起状構造が観察されたが、本件ＮＡＤ類縁体を添加した場合と比較して明らかに短かった。また、市販のβ－ＮＡＤを用いて同様の実験を行ったが、神経突起について変化は見られなかった。
（マイクロアレイによる遺伝子発現の解析）
　本件ＮＡＤ類縁体をラット神経細胞の培養時に添加し、神経細胞における遺伝子発現をマイクロアレイ解析により調べた。
　［試験方法］
　神経細胞はＬＯＮＺＡ社（米国）から購入したラット胎児線状神経細胞（ドーパミン細胞）を用いた。細胞は１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに濃度を調整し、５％ＣＯ２存在下３７℃にて培養した。培養液は、初代神経細胞培養用無血清培地（ＬＯＮＺＡ社製）を用い、プロトコールに従って調製した。培養シャーレは、表面をポリリジン処理したものを用いた。本件ＮＡＤ類縁体は培養液中における終濃度が１０μｇ／ｍＬになるように調整し、細胞培養開始と同時に添加した。２４時間後に常法に従い、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（Invitrogen社）を用いて細胞からＲＮＡを抽出し、１日目の試料とし、細胞培養開始から４８時間培養後に細胞からＲＮＡを抽出し２日目の試料とした。なお、本件ＮＡＤ類縁体を添加しない培養物を陰性対照とした。
　上記培養後のラット胎児線状神経細胞から抽出したＲＮＡの１日目の試料（Ｄａｙ１）と２日目の試料（Ｄａｙ２）について、神経細胞における遺伝子発現解析は株式会社セルイノベーター（福岡市、日本）に委託して行われた。
　上記ラット胎児線状神経細胞から抽出したＲＮＡのＤａｙ１とＤａｙ２は、アフィメトリックス社（ＵＳＡ）のＲａｔ Ｇｅｎｏｍｅ ２３０ ２．０ Ａｒｒａｙを使用して、マイクロアレイ試験に供された。全般的にみて、本件ＮＡＤ類縁体を添加することによる遺伝子の発現変動は小さいことがわかった。このことは、本件ＮＡＤ類縁体の薬剤としての毒性の低さを示している可能性が高い。
　発現変動がＤａｙ１に比べて大きかったＤａｙ２に注目し、発現変動の見られた遺伝子を抽出して、ＩＰＡ（Ingenuity Pathways Analysis）による解析を行った。Ｄａｙ２のＩＰＡにおける解析結果を以下の表２に示す。細胞骨格や神経細胞に関する遺伝子が発現変動を起こしていることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) により無料で提供されているデータベースＤＡＶＩＤを用いて、アノテーション情報を解析した（詳細な解析方法は、Nature Protocols 2009; 4(1):44 & Genome Biology 2003; 4(5) 等を参照のこと）。かかる解析により、上記マイクロアレイデータの解析結果で得られた１群の遺伝子に多く含まれる類似の生物学的な機能を有する遺伝子群がクラスターとして分類され、スコアが高いクラスターから表示される。ｐ＜０．０５が統計的に有意であると判断される。以下の表３では、特に微小管細胞骨格（microtubule cytoskeleton）、微小管細胞骨格組織（microtubule cytoskeleton organization）等、細胞骨格（cytoskeleton）に関係する遺伝子が多く含まれていることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以下の表４及び表５では、上記表３にて有意差があると判断され、細胞骨格に関係する遺伝子が含まれているクラスターである、ＧＯＴＥＲＭ＿ＣＣ＿ＦＡＴ（microtubule cytoskeleton）の１３個の遺伝子とＧＯ＿ＴＥＲＭ＿ＢＰ＿ＦＡＴ（microtubule cytoskeleton organization）の６個の遺伝子がリストされている。前記アフィメトリックス社のマイクロアレイ試験において用いられたプローブセットＩＤがＵｎｉＧｅｎｅのＩＤに変換され、発現変動していた遺伝子の遺伝子記号（Gene Symbol）が明らかにされた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記発現変動していることが確認された遺伝子のうち、ＭＡＲＣＫＳは、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の主要基質として知られているタンパク質で、分子中央に、膜脂質やカルモジュリン、アクチン等の分子と相互作用するマルチ結合ドメインを有し、中枢神経系の発達，細胞の運動や接着，神経分泌などに重要であると考えられている（Arbuzova et al., Biochem J. 2002 362 1-12）。微小管結合タンパク質として知られるＭＡＰ２（microtubule-associated protein 2）は、細胞骨格成分において豊富に見いだされ、多くのタンパク質キナーゼやホスフォターゼの基質となり、また、細胞骨格との関係を制御しているようである（Prog Neurobiol. 2000）。ＫＩＦ５Ｃは下位運動ニューロンにおいて生後２週間又はそれ以降のマウスにおいて高発現することが確認されており、運動ニューロンの形成よりも維持に必要であることが示唆されている（Kanai et al., The Journal of Neuroscience, 2000, 20(17):6374-6384）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記発現変動していることが確認された遺伝子において、例えば、ＭＡＰ２は、細胞骨格成分において豊富に見いだされ、多くのタンパク質キナーゼやホスフォターゼの基質となり、また、細胞骨格との関係を制御しているようである（Prog Neurobiol. 2000）。
［結果と考察］
　以上のとおり、本件ＮＡＤ類縁体を添加して発現変動の見られた遺伝子を抽出しＩＰＡによる解析を行った結果、培養２４時間の神経細胞では対照培養（本件ＮＡＤ類縁体）と比較して、上記表４や表５に示すように細胞の形態変化を支持する複数の遺伝子が有意に発現していることが確認された。したがって、本件ＮＡＤ類縁体は、中枢神経細胞に対して神経突起の伸長をもたらすなど、形態を変化させる作用すなわち分化誘導能を有していることが分子生物学的解析で確認された。本件ＮＡＤ類縁体がドーパミン細胞の分化をもたらすことが明らかになった。このことはドーパミン細胞の異常に起因するパーキンソン病や関連が指摘されている鬱病の改善に利用・応用可能であることを示唆する。
（本件ＮＡＤ類縁体の各種細胞に及ぼす効果）
　以下に示す培養細胞について、本件ＮＡＤ類縁体の効果について検討した。なお、ヒト神経芽腫由来細胞（ＮＢ－１細胞）及びヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ－６０細胞）は独立行政法人理化学研究所から購入した。ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０細胞）及びヒト結腸腺がん細胞（ＨＴ２９細胞）は大日本住友製薬株式会社から購入した。また、レチノイン酸耐性白血病細胞（ＵＦ－１細胞）は慶応義塾大学木崎昌弘博士から分与を受けた。これらの細胞は、５％ＣＯ２存在下３７℃にて培養した。
［ヒト神経芽腫由来細胞（ＮＢ－１細胞）の神経突起伸長効果］
　神経突起伸長効果を検討するためのモデル細胞として用いられているヒト神経芽腫由来細胞（ＮＢ－１細胞）の細胞数を１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。かかるＮＢ－１細胞をイーグルＭＥＭ培地に仔牛血清を最終濃度で１０％となるよう添加し、さらに本件ＮＡＤ類縁体を１０μｇ／ｍＬ添加した培地にて培養し、７日経過後に位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化を倍率２００倍にて観察した。結果を図１６に示す。
［結果］
　図１６Ｂから明らかな通り、本件ＮＡＤ類縁体を添加していない培地で培養された細胞（図１６Ａ）と比較して、本件ＮＡＤ類縁体を添加した培地で培養されたＮＢ－１細胞においては神経突起様の構造物が著明に伸長していることが観察された。したがって、本件ＮＡＤ類縁体が、神経細胞の突起伸長作用を促す作用を有することが明らかとなった。
［ヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ－６０細胞）の増殖抑制効果］
　ヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ－６０細胞）の細胞数を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。かかるＨＬ－６０細胞をイーグルＭＥＭ培地に仔牛血清を最終濃度で１０％となるよう添加し、さらに本件ＮＡＤ類縁体を０，２．０，４．０，８．０μｇ／ｍＬの各濃度に調整して添加した培地にて培養し、５日経過後に細胞数を計測した。結果を図１７に示す。
［結果］
　ｔ検定により解析し、ｐ＜０．０５を有意差ありと判定したところ、本件ＮＡＤ類縁体を２．０μｇ／ｍＬ以上の量を添加した場合８．０μｇ／ｍＬに至るまで、ＨＬ－６０細胞の増殖が明らかに抑制されることがわかった（図１７参照）。
［ヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ－６０細胞）のアポトーシス誘導］
　ヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ－６０細胞）の細胞数を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。かかるＨＬ－６０細胞をＲＰＭＩ培地に仔牛血清を最終濃度で１０％となるよう添加し、さらに本件ＮＡＤ類縁体を１０μｇ／ｍＬ又は２０μｇ／ｍＬの各濃度に調整して添加した培地にて培養し、４日後に細胞の核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１８Ｂに示す。また、細胞からＤＮＡを常法により抽出して電気泳動を行った。結果を図１８Ｃに示す。
（結果） 
　図１８Ａは本件ＮＡＤ類縁体を添加していない対照でＨＬ－６０細胞の核の形態には変化を認められないが、本件ＮＡＤ類縁体を添加した培地で４日間培養した図１８ＢではＨＬ－６０細胞の核の分断が明瞭に観察された。この現象は細胞がアポトーシスを起こしていることを示すものである。図１８Ｃは、ＨＬ－６０細胞から抽出したＤＮＡの電気泳動の結果を示し、レーン１は分子サイズマーカー、レーン２は対照、レーン３、４は本件ＮＡＤ類縁体をそれぞれ１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬをそれぞれ添加して培養した細胞のＤＮＡを電気泳動したものであり、アポトーシスによるＤＮＡの断片化が「ラダー」として観察された。レーン５は陽性対照として抗がん剤アクチノマイシンＤを添加した培地で培養したＨＬ－６０細胞から抽出したＤＮＡを電気泳動したものである。これらの結果は、本件のＮＡＤ類縁体がＨＬ－６０細胞に対してアポトーシスを誘導していることを示している。
［レチノイン酸耐性白血病細胞（ＵＦ－１細胞）に対する増殖抑制効果］
　レチノイン酸耐性白血病細胞（ＵＦ－１細胞）の細胞数を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。かかるＵＦ－１細胞をＲＰＭＩ培地に仔牛血清を最終濃度で１０％となるよう添加し、さらに本件ＮＡＤ類縁体を０，２．０，４．０，８．０μｇ／ｍＬの各濃度に調整して添加した培地にて培養し、２８日経過後に細胞数を計測した。結果を図１９に示す。
（結果）
　ｔ検定により解析し、ｐ＜０．０５を有意差ありと判定したところ、本件ＮＡＤ類縁体を８．０μｇ／ｍＬ以上の量を添加した場合に有意に抑制されたと判断され、明らかに細胞の増殖が抑制効果があることが確認された（図１９参照）。従来、骨髄性白血病細胞の治療にはレチノイン酸による分化誘導療法が行われているが、白血病細胞はやがてレチノイン酸に対して耐性を獲得し、レチノイン酸の効果が無力化されることが知られている。しかし、本件ＮＡＤ類縁体を用いた試験結果から、レチノイン酸に耐性を獲得した白血病細胞に対しても本件ＮＡＤ類縁体は増殖抑制作用を有することを確認した。通常それほどの長期間にわたって培養を行うことはないが、かかる結果が、２８日間の培養後に見いだされたという点で画期的であり、白血病の治療に応用が可能であることを示唆するものである。
（ヒト腫瘍細胞の増殖抑制効果）
［ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０細胞）の増殖抑制効果］
　ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０細胞）の細胞数を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。かかるＨＴ１０８０細胞をイーグルＭＥＭ培地に仔牛血清を最終濃度で１０％となるよう添加し、さらに本件ＮＡＤ類縁体を０，２．０，４．０，８．０μｇ／ｍＬの各濃度に調整して添加した培地にて培養し、７日経過後に細胞数を計測した。結果を図２０に示す。
　ｔ検定により解析し、ｐ＜０．０５を有意差ありと判定したところ、本件ＮＡＤ類縁体を４．０μｇ／ｍＬ以上の量を添加した場合に、有意に細胞の増殖が抑制されることが確認された（図２０参照）。
［ヒト結腸腺がん細胞（ＨＴ２９細胞）の増殖抑制効果］
　ヒト結腸腺がん細胞（ＨＴ２９細胞）の細胞数を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。かかるＨＴ２９細胞をイーグルＭＥＭ培地に仔牛血清を最終濃度で１０％となるよう添加し、さらに本件ＮＡＤ類縁体を０，２．０，４．０，８．０μｇ／ｍＬの各濃度に調整して添加した培地にて培養し、７日経過後に細胞数を計測した。結果を図２１に示す。
（結果）
　ｔ検定により解析し、ｐ＜０．０５を有意差ありと判定したところ、２μｇ／ｍＬ以上の量を添加した場合、有意に細胞の増殖が抑制されることが確認された（図２１参照）。ＨＴ１０８０細胞及びＨＴ２９細胞についての結果から、本件ＮＡＤ類縁体は、腫瘍細胞増殖抑制効果を有することが確認された。

Claims (10)

  1. ３－（アミノカルボニル）－１－［５－Ｏ－［［１－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－１－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノース－５－Ｏ－イル］ホスホニルオキシ（オキシラト）ホスフィニル］－β－Ｌ－リボフラノシル］ピリジニウムである化合物。
  2. 請求項１記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む神経軸策・神経突起伸長剤。
  3. 請求項１記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含むがん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導剤。
  4. 請求項１記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を、神経軸策と突起の伸長剤として使用する方法。
  5. 請求項１記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を、がん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導剤として使用する方法。
  6. 請求項１記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を、神経軸策と突起の伸長剤製造のために使用する方法。
  7. 請求項１記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を、がん細胞の増殖抑制・アポトーシス誘導剤製造のために使用する方法。
  8. 以下の式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    で表わされるニコチンアミドモノヌクレオチドと、以下の式（II）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    で表わされるアデノシン一リン酸モルフォリデートとを、反応させることを特徴とする以下の式（III）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
    で表される化合物の製造方法。
  9. 以下の式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
    で表わされるニコチンアミドモノヌクレオチドが、以下の式（IV）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
    で表わされるニコチンアミドと、以下の式（Ｖ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
    で表わされるＬ－リボーステトラアセテートとを、反応して得られる以下の式（VI）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
    で表わされるニコチンアミドモノヌクレオシドをリン酸化して製造されることを特徴とする請求項８記載の式（Ｉ）で表わされる化合物の製造方法。
  10. 請求項１記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を添加したことを特徴とする食品又は食品素材。
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