JP2008007446A - 神経栄養因子とその利用法 - Google Patents

Abstract

【課題】神経栄養作用を持つ素材とその応用品を提供する。
【解決手段】該素材はエブセレンを含有することを特徴とする神経栄養因子であって、該栄養因子は神経細胞のマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＥＲＫ１／２またはＭＥＫ１／２）のリン酸化促進、ニューロフィラメントの発現の促進、神経細胞のアポトーシスの抑制および神経突起伸長の促進作用を有し、さらに該有効成分を配合してなる医薬組成物ならびに食用組成物を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、エブセレンを有効成分とする神経栄養因子に関するものであり、例えば痴呆剤としは末梢神経障害治療剤又は神経細胞保護剤等として使用することが期待さる。さらに、本発明の神経栄養因子を有効成分とする医薬組成物や食用組成物に関する。

エブセレン は下記の構造式

を有する化合物で、グルタチオンペルオキシダーゼ様抗酸化作用および抗炎症作用を有すること
（非特許文献１、２）、さらに抗リウマチ剤（特許文献１）、抗炎症剤（特許文献２）、原因の病気治療剤（特許文献３）、肝臓疾患治療剤（特許文献４）、悪性腫瘍治療剤（特許文献５）、腎臓疾患治療剤（特許文献６）、脳障害治療剤（特許文献７）、心臓疾患治療剤（特許文献８）、消化管疾患治療剤（特許文献９）、放射線障害治療剤（特許文献１０）、感染症用剤（特許文献１１）、経皮的冠動脈形成術後の再狭窄抑制剤（特許文献１２）およびＡＩＤＳ治療剤（特許文献１３）として有用であることが知られている。

これまで、鬱、ストレス、アルツハイマー病等の疾患の予防法として、クルクミン、コール酸、シムノール用いる技術（例えば特許文献１３）、アラキドン酸や中鎖脂肪酸を用いる技術（例えば特許文献１４）、ヨモギやクマザサを用いる技術（例えば特許文献１５）、テアニンを用いる技術（例えば特許文献１６）、L-カルニチンまたはアルカノイルを用いる技術（例えば特許文献１７）、ドコサヘキサエン酸を用いる技術（例えば特許文献１８，１９）、イソフラボノイドを用いる技術（例えば特許文献２０，２１）が知られている。

一方、代表的な神経栄養因子として神経成長因子（以下ＮＧＦと称する）が知られている。NGFには、神経突起の伸張作用及び神経伝達物質の産生を調節する作用があり、老動物の神経細胞に対し再生作用を持つことが試験管内で証明されている。しかし、ＮＧＦは脳血管関門（以下ＢＢＢと称する）透過性を持たないため、末梢からまたは経口投与では脳内に移行できず、培養細胞には効果的であっても生体に対しては実用的でないことが明らかになっている。従って、ＮＧＦとは異なりＢＢＢ透過作用を持つ化合物が抗痴呆剤としてもしくは末梢神経障害治療剤又は神経細胞保護剤として求められている。
特開昭５７−５６４２７号公報 特開昭５７−６７５６８号公報 特開昭６２−２９４６１３号公報 特開昭６３−２７４３１号公報 特開昭６３−１８３５２８号公報 特開平１−１３１１１３ 特開昭６４−５６６１５号公報 特開平１−１３１１１４号公報 特開平１−１３２５２２号公報 特開平１−１３５７１８号公報 特開平１−１８０８２５号公報 特開平５−２５５０８４号公報 ＷＯ９６／３３７１２ 特開２００３−４８８３１ 特開平１０−２７６７１９ 特開平７−１７３０５９ 特表２００２−５２７３８９ 特表２００２−５２７３８７ 特表平８−５１１５３３ 特表２００１−５１１１１７ 特表２００１−５００４８０ 特開２００３−２８１３ 特開２００２−５８４５０ 特開平１１−３１８３８７ 特開平９−１６９６６２ バイオケミカル ファーマコロジー；Vol.33, No.20, 3235〜3239（1984） バイオケミカル ファーマコロジー；Vol.33, No.20、3241〜3245（1984） Ｉ．Ｇａｙら Biochim Biophys Acta 1684, 18-28 ,2004

すなわち、公知技術の神経栄養作用は効果が不十分で、実用化が遅れていている。また、エブセレンの神経栄養作用、すなわち神経細胞の神経突起伸長作用、アポトーシス抑制作用、マイトジェン活性化蛋白キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ１／２）およびマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化促進作用、ニューロフィラメント発現亢進作用を利用する先行技術は知られていない。

そこで、本発明は、神経栄養作用を持つ素材を提供する。

本発明者等は、エブセレンが神経栄養作用を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は次の（１）〜（８）である。
（１）エブセレンを含有することを特徴とする神経栄養因子。
（２）神経細胞のマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化を促進する作用を有する（１）記載の神経栄養因子。
（３）神経細胞のマイトジェン活性化蛋白キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ１／２）のリン酸化を促進する作用を有する（１）記載の神経栄養因子。
（４）神経細胞のタンパク質（ニューロフィラメント）の発現を促進する作用を有する（１）記載の神経栄養因子。
（５）神経細胞のアポトーシスを抑制する作用を有する（１）記載の神経栄養因子。
（６）神経細胞の神経突起伸長を促進する作用を有する（１）記載の神経栄養因子。
（７）（１）〜（６）に記載の神経栄養因子を有効成分として配合してなる医薬用組成物。
（８）（１）〜（６）に記載の神経栄養因子を有効成分として配合してなる食用組成物。
すなわち、本発明は、エブセレンを含有することを特徴とする神経栄養因子とその利用法に関する。

本発明の神経栄養因子を食品または医薬品として摂取することにより、抗痴呆剤もしくは末梢神経障害治療剤又は神経細胞保護剤等としての効果が期待できる。

以下、本発明について詳細に説明する。本発明で使用するエブセレン(ｅｂｓｅｌｅｎ；２−フエニル−１，２−ベンゾイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン)は、脂溶性の有機セレン化合物であり、脳梗塞後の神経細胞障害に効果のあることが示されている。エブセレンは体内に入ると、セレンと窒素との結合[Se-Ｎ]が切れて[-SeＨ]の構造を取るため、グルタチオンペルオキシダーゼの活性中心と同じ構造をとり、酵素とよく似た作用を示すと考えられている。グルタチオンペルオキシダーゼの約１/100程度の活性を示すと同時に、脂肪の過酸化反応を抑制する強い抗酸化能を持っていることも明らかにされている。

本発明における神経細胞とは別名ニューロンと呼ばれる細胞で、大きく分けると、細胞体、樹状突起、軸索、シナプスという部分からなる。本発明における神経栄養作用は、神経細胞の神経突起伸長作用、神経細胞のアポトーシス抑制作用、神経細胞のマイトジェン活性化蛋白キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ１／２）およびマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化促進作用、神経細胞のニューロフィラメント発現亢進作用を指す。

本発明の神経栄養因子の作用機作としては、エブセレンが細胞膜のレセプターを活性化し、次いで細胞生存のシグナル伝達経路であるマイトジェン活性化キナーゼ経路を活性化し、ニューロフィラメントやＭＡＰ２等の神経分化を誘導するタンパク質が発現し最終的に神経細胞の分化を誘導する。

本発明の神経栄養因子は、エブセレンを０．０１から５０％、好ましくは０．１から３０％、より好ましくは１から１０％含有する。エブセレンの含有量が０．０１％未満では神経栄養作用が認められない。また。エブセレン含有量が５０％より多くしても、活性の顕著な増加は認められない。

次に、本発明の神経栄養因子を配合してなる医薬用組成物および食用組成物について説明する。本発明の神経栄養因子を配合してなる製剤は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、動物およびヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜に選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤があげられる。

本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明の神経栄養因子の配合量は０．０１から５０％、好ましくは０．１から３０％、より好ましくは１から１０％含有する。神経栄養因子の含有量が０．０１％未満では神経栄養活性が認められない。また。神経栄養因子の含有量が５０％より多くしても、活性の顕著な増加は認められない。この種の製剤には本発明の神経栄養因子の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。

上記の神経栄養因子を含有する医薬用組成物は懸濁液、エマルション剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。

本発明の神経栄養因子は食用組成物としても利用可能である。すなわち、前述のようにして得られるエブセレンを有効成分としてなる神経栄養因子は、これをそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキー等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。

これらの食品類あるいは食用組成物における本発明の神経栄養因子の配合量は、当該食品や組成物の種類や状態等により一律に規定しがたいが、約０．０１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％である。配合量が０．０１重量％未満では経口摂取による所望の効果が小さく、５０重量％を超えると食品の種類によっては風味を損なったり当該食品を調製できなくなる場合がある。なお、本発明の神経栄養因子は、原料が食品であれば、これをそのまま食用に供してもさしつかえない。

本発明の医薬用組成物および食用組成物は、細胞死を予防あるいは治癒をねらいとして利用するものであれば、それを使用する上で何ら制限を受けることなく適用される。

以下、本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

アポトーシス抑制作用の測定：９６穴プレートを用いて、馬血清１０容量％、牛胎児血清５容量％を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）にＰＣ−１２細胞（岐阜薬科大学から分与）を５万個／ｍＬ濃度で４８時間培養し、エブセレン（第一三共株式会社）を１００μＭになるように添加し、４８または１２０時間後にＭＴＴの８ｍｇ/ｍｌ溶液を6.3μl添加し、37℃で２時間インキュベートした後Lysis Buffer（ドデシル硫酸ナトリウム〔和光純薬工業（株）〕：ジメチルホルムアミド〔和光純薬工業（株）〕＝20：80（w/w）；ｐH４．７）を50μｌ添加し、細胞を溶解した。37℃で一晩インキュベート後562nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（アマシャム社製）を使用して測定した。
スタート時のＯＤ562−所定時間培養時のＯＤ562（染色度）を求めて、生細胞数の指標とした。結果を表１に示した。

ニューロフィラメント発現量の測定：既往の方法で、１８日齢のラット胎児から大脳ニューロンを採取し、馬血清１０容量％、牛胎児血清５容量％を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）で２４時間培養した。２４時間後に無血清のＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間後にエブセレン（第一三共株式会社）を１０μＭ添加した。４８または１２０時間後に大脳ニューロンの細胞質のタンパク質をリシスバッファーで採取した。採取したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、タンパク質をナイロンメンブレンにブロットした。ブロッキング後にニューロフィラメントマウスＩｇＧ抗体（シグマ社）で反応後、アビジンービオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼコンプレックスで処理した。ペルオキシダーゼ活性をジアミノベンジディン−Ｈ２Ｏ２を用いてニューロフィラメントを可視化することにより、ニューロフィラメントの発現量を測定した。陽性対象として、ＮＧＦβとＥＧＦ（いずれもシグマ製）を２５ｎｇ／ｍL添加し同じ操作を行った。結果を表２に示した。同表中の記号は、ニューロフィラメントの発現について−：なし、＋：あり、＋＋：顕著にありを意味する。

マイトジェン活性化蛋白キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ１／２）およびマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化能の測定：馬血清１０容量％、牛胎児血清５容量％を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）にＰＣ−１２細胞（岐阜薬科大学から分与）を２００万個／ｍＬ濃度で４８時間培養し、牛血清アルブミン（シグマ社）を１％含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）で８時間保持した。次に、エブセレン（第一三共株式会社）を１００μＭになるように添加し、１０分後にタンパク質をリシスバッファーで採取した。採取したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、タンパク質をナイロンメンブレンにブロットした。ブロッキング後にマイトジェン活性化蛋白キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ１／２）およびマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＥＲＫ１／２）ウサギＩｇＧ抗体（セルシグナルテクノロジー社）で反応後、アビジンービオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼコンプレックス（サンタクルズ社）で処理した。タンパク質量と相関するペルオキシダーゼ活性の測定を次の方法で行った。すなわち、ＢＣＬ（ＧＥヘルスケア社）を用い、発生した化学発光をＸ線用フィルム（ＧＥヘルスケア社製）に焼き付けることにより可視化し、リン酸化したマイトジェン活性化蛋白キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ１／２）およびリン酸化したマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＥＲＫ１／２）の量を画像処理ソフトウエアで数値化した。数値は、無添加に対する比とした。結果を図１に示した。

神経突起伸長作用の測定：馬血清１０容量％、牛胎児血清５容量％を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）にＰＣ−１２細胞（岐阜薬科大学から分与）を５万個／ｍＬ濃度で４８時間培養した。エブセレンを１０μＭ含有する培地に交換し、２４と４８時間後に１平方ｍｍで神経分化を起こした細胞の割合を顕微鏡下目視で測定した。結果を表３に示した。

比較例１

ヨモギ抽出物（一丸ファルコス（株）製）、テアニン（太陽化学（株）製）、ドコサヘキサエン酸（日本油脂（株）製）を、それぞれ実施例１に示した培地中に１ｍｇ／ｍｌ溶解し、スタート時のＯＤ562−所定時間培養時のＯＤ562（染色度）を求めて、生細胞数の指標とした。結果を表１に併せて示した。

比較例２

ヨモギ抽出物（一丸ファルコス（株）製）、テアニン（太陽化学（株）製）、ドコサヘキサエン酸（日本油脂（株）製）を、それぞれ実施例１に示した培地中に１ｍｇ／ｍｌ溶解し、に関して実施例２の方法でニューロフィラメントの発現を測定した。結果を表２に示した。

ヨモギ抽出物（一丸ファルコス（株）製）、テアニン（太陽化学（株）製）、ドコサヘキサエン酸（日本油脂（株）製）に関して実施例３の方法でマイトジェン活性化蛋白キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ１／２）およびマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化能を測定した。結果を図１に併せて示した。

ヨモギ抽出物（一丸ファルコス（株）製）、テアニン（太陽化学（株）製）、ドコサヘキサエン酸（日本油脂（株）製）に関して実施例４の方法で神経突起伸長作用を測定した。結果を表３に併せて示した。

表１〜３、図１に示されるように、本発明の神経栄養因子は、従来神経活性化作用があると言われていた、ヨモギ抽出物、テアニン、ドコサヘキサエン酸よりも格段に優れた神経栄養作用が認められる。

本発明によれば、エブセレンまたはエブセレンを含有することを特徴とする、神経栄養因子とその応用品を提供できる。

本発明と従来品のマイトジェン活性化蛋白キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ１／２）およびマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化能を比較した説明図である（実施例３、比較例３）。

Claims (8)

1. エブセレンを含有することを特徴とする神経栄養因子。
2. 神経細胞のマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化を促進する作用を有する請求項１記載の神経栄養因子。
3. 神経細胞のマイトジェン活性化蛋白キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ１／２）のリン酸化を促進する作用を有する請求項１記載の神経栄養因子。
4. 神経細胞のタンパク質（ニューロフィラメント）の発現を促進する作用を有する請求項１記載の神経栄養因子。
5. 神経細胞のアポトーシスを抑制する作用を有する請求項１記載の神経栄養因子。
6. 神経細胞の神経突起伸長を促進する作用を有する請求項１記載の神経栄養因子。
7. 請求項１〜６に記載の神経栄養因子を有効成分として配合してなる医薬用組成物。
8. 請求項１〜６に記載の神経栄養因子を有効成分として配合してなる食用組成物。
   

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