JP2021533151A - 微生物混合物、それらに由来する分子、およびそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、トリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体、ならびに少なくとも１つの許容される担体を含む組成物に関する。さらに、有機ベースの汚染物質の負荷の形成を低減させるための方法が提供される。
【選択図】図３０Ｂ

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年８月８日に出願された「ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭ ＭＩＸＴＵＲＥＳ， ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＴＨＥＲＥＦＲＯＭ，ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦ」と題された米国仮特許出願第６２／７１５，８７５号の優先権の利益を主張し、その内容は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は微生物学の分野にある。

既存の抗生物質に対する細菌耐性の広がりに照らして、代替の細菌殺傷または阻害メカニズムを通して作用する新規抗微生物剤が絶えず緊急に必要とされている。有望な戦略は最近、「クオラムセンシング」（ＱＳ）としても知られる細菌の情報伝達経路を干渉することに焦点を合わせている。ＱＳ細菌は、「自己誘導因子」と呼ばれる化学分子を放出し、多くの場合、近接する細菌細胞における遺伝子発現に影響を及ぼし、細菌−細菌シグナル伝達を通じて集団の調節に寄与する。グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌はどちらも、クオラムセンシング情報伝達回路を使用して様々な生理学的活動を調節する。クオラムセンシングを通して調節されるプロセスには、病原性、応答能、結合、抗生物質生成、運動性、およびバイオフィルム形成が含まれる。一般に、グラム陰性細菌は自己誘導因子としてアシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）を使用し、グラム陽性細菌はプロセシングされたオリゴペプチド（ＤＰＤ）を使用する。さらに、細菌の自己誘導因子が宿主生物の特定の生物学的応答も活性化することを示唆するデータが増大している。

病原性細菌のクオラムセンシング経路を干渉および／または妨害し、したがってそれらの病原性を遮断する物質の特定および使用は、非常に重要なものである。関連するアプローチは、有益な健康特性を示す細菌の情報伝達経路を活性化する化合物を開発することを目的にしている。類似分子によるＱＳの阻害は、従来の抗生物質に代替えを提供し、耐性発生が低い傾向であるという重要な利点を有する。

本発明は、バイオフィルムの生成を低減させるためなど、トリプトフォールおよび／または４−エチル−フェノールの誘導体を含む組成物に関する。本発明はさらに、酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓおよび少なくとも１つのプロバイオティクス微生物を含む微生物混合物およびそれらの使用に関する。

一態様によれば、（１）トリプトフォール誘導体と、（２）４−エチル−フェノール誘導体と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と、を含む組成物が提供され、トリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体は、１０：１〜１：１０のｗ／ｗ比にある。

別の態様によれば、（１）Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓと、（２）少なくとも１つのプロバイオティクス微生物と、を含む微生物混合物が提供され、微生物混合物は少なくとも３％のＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓを含む。

別の態様によれば、炎症性疾患、感染症、およびアミロイド凝集体関連疾患からなる群から選択される疾患を治療するための方法が、それを必要とする対象において提供され、本方法は、対象にトリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体から選択される少なくとも１つの分子と、本明細書に開示される微生物混合物と、のうちのいずれか１つを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、トリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体は、組成物内に少なくとも１μＭの濃度で各々存在する。

いくつかの実施形態では、トリプトフォール誘導体は、組成物内で少なくとも０．１μＭの濃度である。

いくつかの実施形態では、トリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体は、２：１（ｗ／ｗ）〜１：２（ｗ／ｗ）の範囲のｗ／ｗ比である。

いくつかの実施形態では、トリプトフォール誘導体は、酢酸トリプトフォールである。

いくつかの実施形態では、４−エチル−フェノール誘導体は、酢酸チロソール、ドーパミンＨＣｌ、およびカフェー酸からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、組成物は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓと、少なくとも１つのプロバイオティクス微生物と、をさらに含む。

いくつかの実施形態では、組成物は、微生物活性の低減させることと、炎症性疾患を治療することと、アミロイド凝集体関連疾患を治療することと、のうちのいずれか１つの使用のためのものである。

いくつかの実施形態では、プロバイオティクス微生物は、プロバイオティクス細菌である。

いくつかの実施形態では、プロバイオティクス細菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、混合物は培地に懸濁される。

いくつかの実施形態では、培地はミルクである。

いくつかの実施形態では、混合物はケフィアである。

いくつかの実施形態では、混合物は、トリプトフォール誘導体、４−エチル−フェノール誘導体、またはそれらの組み合わせをさらに含む。

いくつかの実施形態では、トリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体は、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓによって生成される。

いくつかの実施形態では、微生物混合物は、食品における使用のためのものである。

いくつかの実施形態では、微生物混合物は、微生物活性を低減させることと、炎症性疾患を治療することと、アミロイド凝集体関連疾患を治療することと、のうちのいずれか１つにおける使用のためのものである。

いくつかの実施形態では、感染症は、微生物、それに由来するバイオフィルム、またはその両方の負荷を含む。

いくつかの実施形態では、微生物は、ウイルス、真菌、寄生虫、酵母、細菌、および原生動物からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、真菌は、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、およびＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａからなる群から選択される属に属する。

いくつかの実施形態では、細菌は、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからなる群から選択される属に属する。

いくつかの実施形態では、組成物は、０．１〜５００μＭの半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。

いくつかの実施形態では、対象は、炎症性疾患、感染症、およびアミロイド関連疾患からなる群から選択される少なくとも１つの疾患に罹患している。

いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。

いくつかの実施形態では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎またはクローン病である。

いくつかの実施形態では、アミロイド凝集体関連疾患は、神経変性疾患である。

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に説明する。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は、単なる例示であり、必ずしも限定するように意図されるものではない。

本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内の種々の変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。

プロバイオティクスヨーグルト中の微生物混合物の同定である。（１Ａ）は、適用された微生物ゲノミクスのＯｎｅ ＣｏｄｅｘデータプラットフォームにおけるＢＬＡＳＴ比較に基づく、プロバイオティクスヨーグルト中の微生物の分布円グラフである。（１Ｂ）および（１Ｃ）は、それぞれ単一培養における、そしてプロバイオティクスヨーグルトからのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓの光学顕微鏡画像である。 プロバイオティクスヨーグルトにおける微生物亜集団の部分を示す。（２Ａ）は、集団Ｒ５（１９，５３９イベント）の自己蛍光強度対ＢＦ詳細強度の散布図である。明瞭な亜集団Ｒ３、Ｒ６、およびＲ７は目視可能であり、追加の複合亜集団Ｒ８を含む。（２Ｂ〜２Ｅ）は、それぞれ集団Ｒ３、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の細胞を示す顕微鏡写真である。 （３Ａ）ミルク抽出物および（３Ｂ）プロバイオティクスヨーグルトの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）クロマトグラムである。質量１８０および２０３に対応する２つの分子（以下、「１８０」分子および「２０３」分子と呼ぶ）は、プロバイオティクスヨーグルトにのみ存在し、円で囲まれている。 （４Ａ）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ培養培地および（４Ｂ）粗Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓのＬＣ−ＭＳクロマトグラムである。１８０および２０３分子は、粗Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓにのみ存在し、円で囲まれている。 分離後のＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ粗抽出物画分のＬＣ−ＭＳクロマトグラムである（５Ａ）１８０分子および（５Ｂ）２０３分子。 合成酢酸チロソールの重量および構造解析を示す。（６Ａおよび６Ｂ）は、１８０の質量を有する分子のＬＣ−ＭＳ（オービトラップ）クロマトグラムである。（６Ａ）はリテンションタイムスペクトルであり、（６Ｂ）はｍ／ｚスペクトルである。（６Ｃ）は、ピーク分布としてδ２．０４（３Ｈ，ｓ）、２．８７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、４．２８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、６．７０（２Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，２．４，０．５Ｈｚ）、６．９５（２Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，１．０，０．５Ｈｚ）を有する酢酸チロソールの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 合成酢酸トリプトフォールの重量および構造解析を示す。（７Ａおよび７Ｂ）は、２０３の質量を有する分子のＬＣ−ＭＳ（オービトラップ）クロマトグラムである。（７Ａ）はリテンションタイムスペクトルであり、（７Ｂ）はｍ／ｚスペクトルである。（７Ｃ）は、ピーク分布としてδ２．０５（３Ｈ，ｓ）、３．０８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）、４．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）、６．９３−７．１２（２Ｈ，６．９８（ｄｄｄ，Ｊ＝８．０，７．８，１．２Ｈｚ）、７．０７（ｄｄｄ，Ｊ＝８．０，７．８，１．６Ｈｚ））、７．３０−７．３６（２Ｈ，７．３３（ｄｄｄｄ，Ｊ＝８．０，１．２，０．５，０．５Ｈｚ）、７．３２（ｔ，Ｊ＝０．５Ｈｚ））、７．６２（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝８．０，１．６，０．５，０．５Ｈｚ）を有する酢酸トリプトフォールの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 合成酢酸トリプトフォールの存在下でのクオラムセンシング（ＱＳ）阻害または活性化の生物発光スクリーニングを示す縦棒グラフである。アッセイは、自己誘導因子をコードする遺伝子を欠く変異体細菌を使用して実施された。細菌を、生物発光レポータープラスミドでもクローニングした。Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）は、以下の細菌の活性化（アゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）に使用され、Ｃ８自己誘導因子（ＡＩ）に応答するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、ＣＡＩ１自己誘導因子に応答するＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、応答Ｃ４ ＡＩに応答するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＲｈｌＡ、およびＣ１２ ＡＩに応答するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＬａｓＲが挙げられる。（８Ａ）は、酢酸トリプトフォールがＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおけるＱＳを阻害することを示す。（８Ｂ）は、酢酸トリプトフォールがＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＬａｓＲ）におけるＱＳに低い阻害効果を有することを示す。（図８Ｃ〜８Ｄ）は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａにおいて、酢酸トリプトフォールが低い容量においてＱＳを活性化し、高い容量においてＱＳを１２．７±２．０μＭのＩＣ_５０で阻害することを示す。（８Ｅ）は、酢酸トリプトフォールがＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＲｈｌＡ）において、高い容量でＱＳに低い阻害効果を有することを示す。 酢酸チロソールがＶ．ｃｈｏｌｅｒａにおいて、低容量でＱＳを活性化し、高容量で２４．４±２．４μＭのＩＣ_５０でＱＳを全体として阻害することを示す縦棒グラフである。 プロバイオティクスヨーグルト（８００ｍｌのバッチで測定）中で２１３μＭの濃度を示すプロバイオティクスヨーグルト粗抽出物に分泌された物質を定量化するために使用される合成酢酸トリプトフォールの検量線である。 酢酸トリプトフォールの非存在下（１１Ａ、１％ＤＭＳＯ含むコントロール）または存在下（１１Ｂ、２０μＭ）おけるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを説明する共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）画像である。バイオフィルム形成への影響は観察されなかった。 酢酸トリプトフォールの非存在下（１２Ａ、１％ＤＭＳＯを含むコントロール）または存在下（１２Ｂ、５０μＭ）におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａを説明するＣＬＳＭ画像である。有意な影響がバイオフィルム形成に観察された。 酢酸トリプトフォールの非存在下（１３Ａ、１％ＤＭＳＯを含むコントロール）または存在下（１３Ｂ、５０μＭ）におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを説明するＣＬＳＭ画像である。有意な影響がバイオフィルム形成に観察された。 真菌増殖に対するプロバイオティクスヨーグルトの生物活性を説明する画像である。プロバイオティクスヨーグルトは、ポテトデキストロース寒天プレート上でのＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍの増殖を、（１４Ａ〜１４Ｂ）１２日間または（１４Ｃ〜１４Ｄ）１９日間もの間阻害した。プロバイオティクスヨーグルト抽出物（１４Ｂおよび１４Ｄ）を含む阻害されたプレート、およびＳ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ増殖を示すコントロールプレート（１４Ａおよび１４Ｃ）を示す。 真菌増殖に対するプロバイオティクスヨーグルト抽出物の生物活性を説明する画像である。（１５Ａ）コントロールプレート上で増殖したＢｏｔｒｙｔｉｓ真菌、（１５Ｂ）播種後２２日で記録されたプロバイオティクスヨーグルト抽出物添加プレートに播種されて阻害されたＢｏｔｒｙｔｉｓ真菌。 真菌増殖に対するプロバイオティクスヨーグルト抽出物の生物活性を説明する画像である。（１６Ａ）コントロールプレート上で増殖したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ真菌、（１６Ｂ）播種後２２日で記録されたプロバイオティクスヨーグルト抽出物添加プレートに播種されて阻害されたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ真菌。 Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａにおけるＱＳの活性化に対する酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールの相乗効果を示すグラフである。（１７Ａ）は、酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールが１：１の比で一緒に投与された組成物の効果を示すグラフであり、１１．６±０．９μＭのＩＣ_５０を有する。（１７Ｂ）は、（１７Ａ）に記載されるものと同じ濃度範囲での、酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールの各々ならびに両方の組成物の比較効果を示す縦棒グラフである。 変異型ＭＭ９２０ Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株（ΔＣｑｓＡ ΔｌｕｘＱ）で試験した酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールの組成物のバイオフィルム調節活性を説明するＣＬＳＭ画像である。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＣｑｓＡ変異体バイオフィルム（１８Ａおよび１８Ｅ）は、自己誘導因子のみ（１８Ｂおよび１８Ｆ、クオラムセンシングを促進し、そのためバイオフィルム形成を妨害する）、酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソール（１８Ｄおよび１８Ｈ）、特に３つの化合物が一緒（１８Ｃおよび１８Ｇ）では、通常のバイオフィルム成長の破壊において有意な相乗効果を示し、異なるバイオフィルム形態をもたらした。上段は上面画像で構成され、下段は対応する３Ｄ画像で構成される。 酢酸トリプトフォールの非存在下（０、１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯによるコントロール）または異なる濃度（２５、５０、１００、および２００μＭ）の存在下におけるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ毒素の定量化を示す縦棒グラフである。 粗ケフィア抽出物の非存在下または存在下における細胞生存率アッセイを示す縦棒グラフである。結果は、粗ケフィア抽出物が細菌細胞増殖に悪影響を及ぼさなかったことを確認した。 Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａに対する１００μＭ濃度の酢酸チロソールの効果を示す画像および縦棒グラフである。（２１Ａ）ＩＭＡＲＩＳソフトウェアを使用して共焦点ｚスタックから得られた代表的なバイオフィルム形成。スケールバー、５０μｍ。（２１Ｂ）ＶＣ１株（野生型）およびバイオアッセイ株ＭＭ９２０を使用してクリスタルバイオレットアッセイによって得られた定量的バイオフィルム体積。（２１Ｃ）ＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された野生型株におけるＱＳ遺伝子の発現における酢酸チロソールの効果。（２１Ｄ）ＧＭ１−ＥＬＩＳＡによるＣｈｏｌｅｒａｅ毒素の定量化。 プロバイオティクスヨーグルトバイオマス粗抽出物のクオラムセンシング効果を示す縦棒グラフである。（２２Ａ〜２２Ｃ）ヨーグルトバイオマス粗抽出物によるＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ（２２Ａ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（２２Ｂ）、およびＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ（２２Ｃ）レポーター株生物発光のＱＳ阻害／活性化。（２２Ｄ）静的な抗バイオフィルム活性。グラフは、プロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）粗抽出物の非存在下または存在下における３種の異なるＷＴ細菌であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから生成されたバイオフィルム体積を示す。データは平均±ＳＤである。ｎ＝３。Ｐ値：＊Ｐ＜０．１２、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００２。 Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅにおける酢酸トリプトフォールの効果を示す顕微鏡写真および縦棒グラフである。（２３Ａｉ〜２３Ａｖ）は、ＩＭＡＲＩＳソフトウェアを使用して共焦点ｚスタックから取得したバイオフィルム形成の代表的な画像である。スケールバー、５０μｍ。（２３Ａｉ）Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＶＣ１（ＷＴ）のバイオフィルムマトリックス、（２３Ａｉｉ）１００μＭ酢酸トリプトフォールの存在下におけるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＶＣ１、（２３Ａｉｉｉ）Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＭＭ９２０のみ、（２３Ａｉｖ）９００ｎＭ ＣＡＩ−１添加したＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＭＭ９２０、（２３Ａｖ）１００μＭ酢酸トリプトフォールの存在下において９００ｎＭ ＣＡＩ−１添加したＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＭＭ９２０。（２３Ａｖｉ）２３Ａｉ〜２３Ａｖに示されているバイオフィルムに対応する面積量あたりのバイオフィルム体積を示す棒グラフ。（２３Ｂ）マイクロタイタープレートにおいて酢酸トリプトフォールの異なる濃度（０、１２．５、２５、５０、１００、および２００μＭ）での２４時間のクリスタルバイオレット染色によって得られたＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの定量的バイオフィルム体積を示す縦棒グラフ。エラーバーは、４回測定の標準偏差を示す。コントロールに対して、＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００００１。（２３Ｃ）定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって評価された、野生型株におけるＱＳ遺伝子の発現における酢酸トリプトフォールの効果を示す縦棒グラフ。遺伝子発現レベルの相対的な大きさは、ＱＳ経路における遺伝子であるｈａｐＲ、ｖｐｓＴ、ｈａｐＡ、ａｐｈＡ、およびｃｔｘＡのｃＤＮＡのコピー数として定められ、処理によって影響を受けない参照ハウスキーピング遺伝子に対して基準化した。エラーバーは、４回測定の標準偏差を示す。未処理細菌に対して、＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０００１。 本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトおよびそこで同定された分子が、ネズミ炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデルにおける体重減少を低減させることを示す縦棒グラフである。（２４Ａ）は実験反復数２を示し、（２４Ｂ）は実験反復数３を示す。体重減少は、実験開始前の体重と比較した変化率として算出した。有意な結果は、ＤＳＳ＋Ｗと比較したＹ＋ＤＳＳ＋Ｙ、ＤＳＳ＋Ｙ、およびＤＳＳ＋分子（２５μＭまたは５０μＭのいずれか）との間の体重減少で認められた。さらに、市販のヨーグルト（Ｙｃ＋ＤＳＳ＋ＹｃまたはＤＳＳ＋Ｙｃ）を投与された群では、有意な体重減少効果はなかった。群：コントロール＋Ｗ−通常食餌−デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）なし、ＤＤＳ＋Ｗ−通常食餌、コントロール＋Ｙ−テスト食餌（ヨーグルト）−ＤＳＳなし、ＤＳＳ＋Ｙ−テスト食餌（ヨーグルト）、コントロール＋分子−分子試験項目（経口、酢酸チロソールおよび酢酸トリプトフォール、最終濃度２５μＭまたは５０μＭ）−ＤＳＳなし、ＤＳＳ＋分子−分子試験項目（経口、酢酸チロソールおよび酢酸トリプトフォール、最終濃度２５μＭまたは５０μＭ）、コントロール＋Ｙｃ−テスト食餌（市販ヨーグルト）−ＤＳＳなし、ＤＳＳ＋Ｙｃ−テスト食餌（市販ヨーグルト）、Ｙ＋ＤＳＳ＋Ｙ−ＤＳＳの前と後のヨーグルトの早期投与、およびＹｃ＋ＤＳＳ＋Ｙｃ−ＤＳＳの前と後の市販ヨーグルトの早期投与。（２４Ａ）では、＊Ｐ＜０．０００００３、＊＊Ｐ＜０．００１。（２４Ｂ）では、＊Ｐ＜０．００００５、＊＊Ｐ＜０．０５。 本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトおよびそこで同定された分子が、マウスＩＢＤモデルにおいて結腸短縮を低減させることを示す図、画像、および縦棒グラフである。（２５Ａ）盲腸、近位結腸、中央結腸、遠位結腸、直腸、および肛門を含む、マウス大腸の図解。（２５Ｂ）ＤＳＳ処理の７日後の結腸の長さ。画像は、実行された６回の実験のうちの１つの選択された代表である。（２５Ｃ）は実験反復数２の１０日目の測定値を示し、（２５Ｄ）は実験反復数３の１０日目の測定値を示す。結腸の長さは、実験の終了時点で直腸から盲腸まで測定した。結腸の短縮は、ＤＳＳで処理され、ＤＳＳの前に本明細書に開示されたプロバイオティクスヨーグルトで処理されたマウス（Ｙ＋ＤＳＳ＋Ｙ）の結腸と比較して、ＤＳＳで処理されたマウス（ＤＳＳ＋Ｗ）で観察された。さらに、統計的に有意に低減した結腸長の短縮は、本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトで同定された分子（５０μＭ）で処理されたマウスにおいて観察された。＊Ｐ＜０．０５。実験群は図２４のとおりでだった。 実験反復２（２６Ａ）および実験反復３（２６Ｂ）で決定された、本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトおよびその中で同定された分子が疾患活動性指数（ＤＡＩ）に及ぼす効果を示す垂直棒グラフである。ＤＡＩは、測定された便の粘度および便中の血液に基づいて決定された。臨床徴候は一日おきに記録された。結果は、反復２（２６Ａ）でＤＳＳ（Ｙ＋ＤＳＳ＋Ｙ）の前にヨーグルトで処理されたマウス、および反復３（２６Ｂ）で本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルト中で同定された分子の５０μＭ（ＤＳＳ＋分子）の濃度で処理されたマウスにおいて、臨床スコアの有意な減少を示した。実験群は図２４〜２５のとおりだった。 結腸組織学的切片の顕微鏡写真である。（２７Ａ）すべてのＤＳＳ処置マウスにおいて、腸の内壁からの陰窩細胞の損失、および炎症細胞の結腸への浸潤を伴う強い組織損傷が明らかにされた。（２７Ｂ）ＤＳＳ前にヨーグルトを与えられたマウス（Ｙ＋ＤＳＳ＋Ｙ）の結腸では、組織構造は最小限の炎症および結腸組織修復の初期兆候（円で囲んだ部分）のみを伴って維持された。（２７Ｃ）ＤＳＳ後に本明細書に開示されたプロバイオティクスヨーグルトを与えられたマウス（ＤＳＳ＋Ｙ）の結腸の切片。（２７Ｄ）はコントロール結腸（例えば、健康な結腸）である。 本明細書に本開示されるプロバイオティクスヨーグルトの適用後におけるリーシュマニア症潰瘍の治癒を示す画像である。従来の治療が潰瘍の治癒を改善しなかった（ＥＳＲＡＣＡＩＮによる局所麻酔後のＰＥＮＴＯＳＴＡＭ注射、およびＳＡＬＩＫＡＲＥＮの局所投与を含む）後に、プロバイオティクスヨーグルトを局所的に適用した（１日２回、例えば、朝と晩）。プロバイオティクスヨーグルトの適用開始後、（２８Ａ、２８Ｇ）０日目、（２８Ｂ、２８Ｈ）１日目、（２８Ｃ、２８Ｉ）２日目、（２８Ｄ）４日目、（２８Ｊ）５日目、（２８Ｅ）６日目、（２８Ｆ）１１日目、（２８Ｋ）１４日目。皮膚リーシュマニア症の加速された治癒は、１１日目および１４日目以降に明らかだった（それぞれ図２８Ｆおよび２８Ｋ）。 本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトの適用後に治癒する創傷を示す画像である。感染した創傷は０日目に明らかであった（２９Ａおよび２９Ｃ）。（２９Ａ）では、縫合が切開部の癒合に必要とされたが、それらは傷害から２４時間以上経過したために縫合が行われなかったため、本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトを局所的に適用し、創傷は４日後に治癒した（２９Ｂ）。新しい組織の成長は、プロバイオティクスヨーグルトの適用が開始された２日後（２９Ｄ）、および以降で明らかだった。プロバイオティクスヨーグルトの適用開始後、（２９Ｅ）０日目、（２９Ｂ）４日目、（２９Ｄ）２日目、および（２９Ｅ）７日目。 本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトにおいて同定された分子によって誘導される抗炎症効果を示す縦棒グラフである。マクロファージによるＩＬ−６（３０Ａ）およびＩＬ−１α（３０Ｂ）サイトカインの生成は、酢酸トリプトフォールおよび４−エチル−フェノール誘導体（例えば、酢酸チロソール、ドーパミンＨＣｌ、およびカフェー酸）の存在下で劇的に低減した。リポ多糖（ＬＰＳ）。 本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）から抽出された分子の混合物、および酢酸トリプトフォールの、アミロイドベータ（αβ１−４２）細線維化における効果を試験するチオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイの結果を示すグラフである。結果は、本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）から抽出された分子、および様々な濃度の酢酸トリプトフォールの両方が、αβ１−４２細線維化を低減させたことを示す。Ｍｉｘ−ヨーグルトから抽出された分子の混合物。ＯＭ−酢酸トリプトフォール。 酢酸トリプトフォールの非存在下または存在下におけるαβ１−４２細線維化を示すグラフである。（３２Ａ）３０μＭ αβ１−４２のみ（Ｌ１Ａ１−２−アミロイドＢ）、ＰＢＳに懸濁された３０μＭ αβ１−４２（Ｌ１Ａ３−４−ｂｆ）、または５０μＭ酢酸トリプトフォール存在下における３０μＭ αβ１−４２（Ｌ１Ａ５−６−アミロイドＢ＋２０３）の細線維化度を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のグラフ。（３２Ｂ）いくつかの酢酸トリプトフォール濃度（６μＭ、１２μＭ、２５μＭ、１００μＭ、および２００μＭ）の存在下における３０μＭ αβ１−４２の細線維化度を示すＳＰＲのグラフ。 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の顕微鏡写真である。αβ１−４２を、単独（３３Ａ）、または本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルト粗抽出物の５μｌ（３３Ｂ）、酢酸トリプトフォールの２５μＭ（３３Ｃ）、もしくは酢酸トリプトフォールの５０μＭ（３３Ｄ）の存在下において３７℃で２４時間インキュベートした。

いくつかの実施形態では、本発明は、トリプトフォールおよび／または４−エチル−フェノールの誘導体から選択される抗微生物分子、それらを含む組成物およびデバイス、ならびに限定されないがバイオフィルム形成の阻害を含むそれらの使用の方法に関する。

いくつかの実施形態では、本発明は、炎症性疾患、感染症、およびアミロイド凝集体関連疾患からなる群から選択される疾患を、それらを治療する方法を必要とする対象において治療するための方法に関するものであり、対象に、トリプトフォール誘導体と、４−エチル−フェノール誘導体と、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓおよび少なくとも１つのプロバイオティクス微生物を含む微生物混合物で、微生物混合物における少なくとも３％はＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓである微生物混合物と、のうちの少なくとも１つのうちのいずれか１つを含む医薬組成物の治療有効量を投与するによる。

いくつかの実施形態では、本発明は、アミロイド（例えば、アミロイドベータ）凝集体を阻害または低減するための方法に関するものであり、本方法は、表面または細胞を、トリプトフォール誘導体と、４−エチル−フェノール誘導体と、本明細書に記載の微生物混合物と、のうちのいずれか１つの有効量と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、アミロイド凝集は、アミロイド細線維化、アミロイドオリゴマー化、またはそれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、有機ベースの汚染物質の負荷を低減することは、アミロイドを阻害または低減することを含む。

本明細書で使用される場合、「アミロイド凝集体」および「アミロイド凝集」という用語は、複数のコピーを凝集させ、それによって凝集体、細原線維、オリゴマー、またはそれらの任意の組み合わせを生じることを可能にする立体構造に再び折り畳むアミロイドタンパク質の凝集体または凝集塊を指す。アミロイドにおいて特徴付けられるタンパク質のタイプは、当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、アミロイドはベータアミロイドを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の分子のうちのいずれか１つ、または本発明の微生物混合物（例えば、ケフィア）は、抗微生物活性、抗炎症活性、および抗アミロイド凝集活性のうちのいずれか１つを有する。

本明細書で使用される場合、「抗アミロイド凝集活性」という用語は、アミロイド二量体化、アミロイドオリゴマー化、アミロイド凝集、アミロイド沈降、アミロイドアンフォルディング、アミロイド非天然フォルディング、またはそれらの任意の組み合わせを防止または低減する能力を指す。

本明細書で使用される場合、「抗微生物活性」という用語は、細菌増殖、真菌増殖、バイオフィルム形成、アミロイド凝集、例えばアミロイドベータ、を阻害、防止、低減、または遅延し、あるいは生細菌細胞、またはそれらの胞子、懸濁液中、表面上、もしくは湿った環境中における真菌またはウイルスを根絶する、能力を指す。いくつかの実施形態では、微生物の負荷の形成を阻害または低減または遅延させることは、微生物によるバイオフィルム生成、アミロイド、例えばアミロイドベータの生成もしくは凝集を阻害することを低減、または遅延させること、および／あるいは微生物の既存集団の一部または全部を根絶することを指す。

本明細書で使用される場合、「抗炎症性」という用語は、サイトカイン生成、分泌、もしくはその両方、免疫細胞プライミング、ホーミング、活性化、動員、またはそれらの任意の組み合わせを含む、身体の炎症反応を阻害、予防、低減、または遅延する能力を指す。いくつかの実施形態では、炎症反応は、自己炎症反応を含む。

本発明は、部分的に、トリプトフォールおよび／または４−エチル−フェノールの誘導体（例えば、それぞれ、酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソール）が微生物のクオラムセンシング（細菌および真菌の両方）を修正し、バイオフィルム生成および真菌増殖を低減したという発見に基づいている。抗バイオフィルム効果、ならびに抗炎症性および抗アミロイド凝集効果は、本明細書に記載の微生物培養物から得られるトリプトフォール誘導体および／またはチロソール誘導体、ならびに合成トリプトフォール誘導体および／またはチロソール誘導体を使用して実証された。

本明細書で使用される場合、「本発明の化合物または分子」という用語は、以下に記載されるように、抗微生物活性、抗炎症活性、および抗アミロイド凝集活性のうちのいずれか１つを有する任意のトリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を指す。

トリプトフォール誘導体
いくつかの実施形態では、本発明のトリプトフォール誘導体は、以下の構造を有し、

式中、「Ｒ_１」、「Ｒ_２」、「Ｒ_３」、および「Ｒ_４」は、メチル（ＣＨ_３）、エチル（ＣＨ_３ＣＨ_２）、プロピル（ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＨ）_２）、およびブチル（ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２）からなる群から選択され、
「ｎ」は、１つ、２つ、３つ、または４つの炭素を含む炭素鎖であり、
「ｍ」は、メチル（ＣＨ_３）、エチル（ＣＨ_３ＣＨ_２）、プロピル（ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＨ_２）、およびブチル（ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、トリプトフォール誘導体は、酢酸トリプトフォールである。

酢酸トリプトフォールは、以下の構造を有するものとして当技術分野で知られている。

４−エチル−フェノール誘導体
いくつかの実施形態では、本発明の４−エチル−フェノール誘導体は、以下の構造を有し、

式中、各Ｒは、ヒドロキシル、水素、メチル（ＣＨ_３）、エチル（ＣＨ_３ＣＨ_２）、プロピル（ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＨ_２）、およびブチル（ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２）からなる群から独立して選択され、
「ｎ」、「ｍ」は、１〜４であり、
Ｒ_１は、ヘテロ原子を含むか、または存在せず、

は、ｓｐ３単Ｃ−Ｃ結合、ｓｐ２二重Ｃ−Ｃ結合、ｓｐ三重Ｃ−Ｃ結合からなる群から選択される結合を表し、
Ｘは、カルボン酸誘導体、アルキル、および水素からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、本発明の４−エチル−フェノール誘導体は、以下の構造を有し、

式中、Ｒ、Ｒ_１、およびＸは、上記のとおりである。

いくつかの実施形態では、各Ｒは、ヒドロキシル、および水素からなる群から独立して選択される。

いくつかの実施形態では、Ｒ_１は、Ｏ、ＮＨ、およびＮＨ_２から選択される。

いくつかの実施形態では、４−エチル−フェノール誘導体は、以下の式によって表されるドーパミン誘導体であり、

または以下の式であり、

式中、ＲおよびＸは、上記のとおりである。

いくつかの実施形態では、ドーパミン誘導体は、以下の式で表され、

または以下の式で表され、

式中、ＲおよびＸは、上記のとおりである。

いくつかの実施形態では、Ｘは水素である。

いくつかの実施形態では、４−エチル−フェノール誘導体は、ドーパミンまたはその塩である。

いくつかの実施形態では、本発明の４−エチル−フェノール誘導体は、以下の構造を有し、

式中、各Ｒは、ヒドロキシルおよび水素からなる群から独立して選択され、Ｘは、カルボン酸誘導体、アルキル、および水素からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、Ｘは

であり、Ｒ_２は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ_２、チオアルキル、オキシアルキル、アミノアルキル、水素、アルキル、置換アルキルからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、Ｒ_２は水素またはアルキルである。

いくつかの実施形態では、Ｒ_２は、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキルである。

いくつかの実施形態では、Ｒ_２は水素である。

いくつかの実施形態では、４−エチル−フェノールは、酢酸チロソールの誘導体である。

酢酸チロソールは、以下の構造を有するものとして当技術分野で知られている。

いくつかの実施形態では、４−エチル−フェノール誘導体は、以下の構造を有するカフェー酸の誘導体であり、

式中、各Ｒは、ヒドロキシル、水素、メチル（ＣＨ_３）、エチル（ＣＨ_３ＣＨ_２）、プロピル（ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＨ_２）、およびブチル（ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２）からなる群から独立して選択され、
「ｎ」、「ｍ」は、１〜４であり、

は、ｓｐ３単Ｃ−Ｃ結合、ｓｐ２二重Ｃ−Ｃ結合、ｓｐ三重Ｃ−Ｃ結合からなる群から選択される結合を表し、
Ｘは、カルボン酸誘導体、アルキル、および水素からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、各Ｒは、ヒドロキシル、および水素からなる群から独立して選択される。

いくつかの実施形態では、

は、不飽和Ｃ−Ｃ結合を表す。いくつかの実施形態では、

は、二重Ｃ−Ｃ結合を表す。

いくつかの実施形態では、Ｘは、カルボン酸誘導体、および水素からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、カフェー酸の誘導体は、以下の構造を有し、

式中、ＲおよびＸは、上記で定義されるとおりである。

いくつかの実施形態では、カフェー酸の誘導体は、以下の構造を有し、

式中、Ｒは上記で定義されるとおりであり、Ｒ_３は、水素、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ_２、チオアルキル、オキシアルキル、アミノアルキル、水素、アルキル、置換アルキルからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、Ｒは、水素、−ＯＨ、およびアルキルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、カフェー酸の誘導体は、以下の構造を有し、

式中、Ｒ_３は、上記で定義されるとおりである。

本明細書で使用される場合、「カルボン酸誘導体」という用語は、カルボキシ、アミド、カルボニル、無水物、炭酸エステル、およびカルバメートを包含する。

本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、化学反応によって類似化合物から生成される抗微生物活性を有する任意の化合物、または１つ以上の原子の置換によって別の化合物から生成される任意の化合物を包含する。いくつかの実施形態では、誘導体は構造的類似体を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、それが抗微生物活性を有する限り、トリプトフォールまたは４−エチル−フェノールの任意の化学修飾によって得られる。いくつかの実施形態では、トリプトフォールまたは４−エチル−フェノールは、アセチル化、メチル化、リン酸化、アミド化、または他から選択される少なくとも１つの化学基を加えることによって化学的に修飾される。いくつかの実施形態では、化学修飾は置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、トリプトフォールまたは４−エチル−フェノールへのアセテート基の付加を含む。いくつかの実施形態では、酢酸トリプトフォールまたは酢酸チロソールは、上記のような少なくとも１つの化学基をさらに含む。

本明細書で使用される場合、本発明の化合物は、トリプトフォールまたはチロソールを含まない。

いくつかの実施形態では、開示される発明は、トリプトフォール誘導体、および４−エチル−フェノール誘導体から選択される少なくとも１つの分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む組成物に関する。

いくつかの実施形態では、組成物は、酢酸トリプトフォール、もしくは酢酸チロソール、またはそれらの任意の組み合わせと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、化学的に合成されるか、または生合成される。生合成の方法は当技術分野で周知であり、限定されないが、細胞培養における生成または酵素的な細胞無含有生成を含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓを含む細胞培養物を使用して生合成される。いくつかの実施形態では、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓを含む培養物は、単一培養または多培養である。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓによって生合成される。いくつかの実施形態では、酢酸トリプトフォールまたは酢酸チロソールは、本発明の方法に従って、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓによって生合成される。

微生物混合物
いくつかの実施形態では、本発明は、微生物の混合物を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、プロバイオティクス微生物を含む。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス微生物は、酵母を含む。いくつかの実施形態では、開示される発明の混合物内の微生物の大部分は、プロバイオティクス酵母のものである。いくつかの実施形態では、開示される発明のプロバイオティクス酵母は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓである。

一実施形態では、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓは、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ株ＨＡ ６３［ＮＲＲＬ Ｙ−８２８１、ＣＢＳ７１２］である。

本明細書で使用される場合、「プロバイオティクス」という用語は、特に、有益な特性を有する微生物（例えば、腸内細菌叢）の増殖を促進する任意の物質および／または微生物を指す。

いくつかの実施形態では、本発明の混合物内の微生物含有量（％）は、混合物の全ＤＮＡのうちの微生物のＤＮＡの部分に従って定量化される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ定量化は、抽出されたＤＮＡの量に直接的に基づいている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ定量化は、酵素反応を含み、限定されないが、制限、連結、増幅、配列決定、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ定量化は、次世代配列決定に基づいている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ定量化は、微生物混合物のＤＮＡリードの総数と比較した微生物特異的ＤＮＡリードの量の比に基づいている。

いくつかの実施形態では、本発明の混合物内の微生物含有量は、混合培養の容量あたりの微生物の細胞の数を含む（例えば、コロニー形成単位［ＣＦＵ］）。いくつかの実施形態では、本発明の混合物内の微生物含有量は、混合物中の細胞の総数と比較した微生物の細胞の数を含む。いくつかの実施形態では、本発明の混合物内の微生物含有量は、微生物のＣＦＵを含む。

いくつかの実施形態では、微生物混合物中の細胞の少なくとも１％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、または少なくとも７０％は、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ細胞である。いくつかの実施形態では、微生物混合物中の細胞の１〜４％、２〜５％、４〜７％、６〜１１％、１０〜１６％、１５〜２２％、２０〜３２％、３０〜３５％、３２〜４０％、３８〜４８％、４５〜５５％、５０〜６０％、または５５〜７５％、６０〜８０％、６５〜９０％、または８０〜１００％は、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ細胞である。各々の可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

いくつかの実施形態では、開示される本発明の組成物は、少なくとも１つのプロバイオティクス細菌を含む。一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属から選択される。一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属から選択される。一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、属から選択される。一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属から選択される。一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロバイオティクス細菌は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０のプロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、微生物混合物中の細胞の最大で３０％、最大で２５％、最大で２０％、最大で１５％、最大で１０％、最大で５％、または最大で１％は、プロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、微生物混合物中の細胞の１〜５％、４〜１０％、８〜１８％、１２〜２０％、１７〜２５％、または２２〜３０％は、プロバイオティクス細菌である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

いくつかの実施形態では、開示される本発明の微生物混合物は、他のタイプの微生物をさらに含む。一実施形態では、他の微生物は、酵母または細菌などのプロバイオティクス微生物ではない。いくつかの実施形態では、微生物混合物中の細胞は、最大で１５％、最大で１３％、最大で１１％、最大で１０％、最大で９％、最大で７％、最大で５％、最大で４％、最大で３％、最大で２％、または最大で１％が、プロバイオティクス酵母および少なくとも１つのプロバイオティクス細菌以外の微生物タイプに属する。いくつかの実施形態では、微生物混合物は、プロバイオティクス酵母および少なくとも１つのプロバイオティクス細菌以外に、他のタイプの微生物を含まない。

いくつかの実施形態では、微生物混合物は培地に懸濁される。いくつかの実施形態では、微生物混合物は、培地中で増殖される。いくつかの実施形態では、培地は、微生物混合物の増殖および維持に適した細胞培養培地である。一実施形態では、細胞培養培地は、ミルクなど微生物増殖のために最適化されている。

本明細書で使用される場合、「細胞培養培地」は、細胞増殖を可能にする、液体または固体である任意の培地を指す。細胞培養培地は当技術分野で知られており、増殖させる細胞のタイプに応じて選択することができる。例えば、細胞を増殖する際に使用するための細胞培養培地は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ、Ｍｉｌｌｅｒのブロス）である。いくつかの実施形態では、微生物混合物は、有効な条件下で培養され、培養微生物混合物から生成の増加した収量を可能にする。増加した収量に関する非限定的な例には、限定されないが、増加した遺伝子発現、タンパク質生成および分泌、分子生合成、増殖、ならびに他が含まれる。いくつかの実施形態では、有効な培養条件には、限定されないが、増加した生成収量を可能にする、有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ、および酸素条件が含まれる。一実施形態では、有効な培地とは、微生物混合物が培養されて本発明の化合物を生成する任意の培地を指す。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、典型的には、同化可能な炭素、窒素、およびリン酸源、ならびに適切な塩、ミネラル、金属、およびビタミンなどの他の栄養素を有する水溶液を含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物混合物は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイター皿、およびペトリ皿において培養することができる。いくつかの実施形態では、培養は、酵母または細菌などのプロバイオティクス微生物に適切である温度、ｐＨ、および酸素含量で実行される。いくつかの実施形態では、培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。本発明の微生物混合物を培養するプロセスのための非限定的な例は、微生物混合物をミルク中で２８℃、約２４時間培養することを含む。

一実施形態では、培養のプロセスは、微生物混合物を、１２〜１６時間、１４〜１８時間、１２〜２４時間、１６〜２４時間、１８〜２８時間、１０〜２０時間、２２〜３６時間の期間培養することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

一実施形態では、培養のプロセスは、微生物混合物を２０〜２６℃、２４〜２８℃、２２〜３４℃、２６〜３４℃、２８〜３８℃、２０〜３０℃、３２〜４６℃の温度で培養することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

いくつかの実施形態では、本発明の微生物混合物は、ミルク中で培養される。いくつかの実施形態では、ミルク中で培養された微生物混合物は、発酵乳製品を生成する。いくつかの実施形態では、発酵乳製品は、ヨーグルト、プロバイオティクスヨーグルト、またはケフィアから選択される。

いくつかの実施形態では、本発明の発酵乳製品は、微生物混合物、トリプトフォール誘導体、またはチロソール誘導体、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の発酵乳製品は、ヒトの食品消費のためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の発酵乳製品は、対象によって毎日の消費の一部として消費される。一実施形態では、発酵乳製品は、対象によって食事消費の一部として消費される。いくつかの実施形態では、発酵乳製品は、皮膚病変を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、発酵乳製品は、対象に局所的に適用される。

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される微生物混合物を生成または得るための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載のようにＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓを培養することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に開示される微生物混合物が得られたか、または生成されたことを決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、決定は、混合物中の細胞の少なくとも３％は、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓであることを決定することを含む。いくつかの実施形態では、決定は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体が生成されることを決定することを含む。いくつかの実施形態では、決定は、トリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体が生成されることを決定することを含む。いくつかの実施形態では、決定は、混合物中の細胞の少なくとも３％がＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓであり、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体が十分な量で生成されることを決定することを含む。いくつかの実施形態では、決定は、混合物中の細胞の少なくとも３％がＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓであり、トリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体が十分な量で生成されることを決定することを含む。本明細書で使用される場合、十分な量は、抗炎症反応、抗微生物活性、抗アミロイド凝集活性、またはそれらの組み合わせを有するかまたは誘発するなど、本明細書に記載の治療有効量を含む。

使用の方法および組成物
いくつかの実施形態によれば、炎症性疾患、感染症、およびアミロイド凝集体関連疾患からなる群から選択される疾患ための方法がそれを必要とする対象において提供され、本方法は、当該対象に、トリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体から選択される少なくとも１つの分子と、本明細書に開示される微生物混合物と、のうちのいずれか１つを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、感染症は、有機ベースの汚染物質を含む。いくつかの実施形態では、有機ベースの汚染物質は、バイオフィルムを含む。

いくつかの実施形態では、有機ベースの汚染物質は、アミロイド凝集、例えば、アミロイドベータを含む。

本明細書で使用される場合、「有機」という用語は、炭素を含む化合物、生物から生成または誘導される物質、器官、および生物のうちのいずれか１つを指す。

いくつかの実施形態では、接触させることは、投与することである。いくつかの実施形態では、接触させることは、組み込むことである。いくつかの実施形態では、接触させることは、対象に投与することである。いくつかの実施形態では、接触させることは、表面に組み込むことである。いくつかの実施形態では、接触させることは、細胞に接触することである。いくつかの実施形態では、細胞は、単細胞微生物である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、神経系の細胞である。いくつかの実施形態では、神経系の細胞は、ニューロン細胞である。

いくつかの実施形態では、有機ベースの汚染物質は、表面、物品、細胞、または対象の上または内部にある。いくつかの実施形態では、対象は、細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性細胞または外因性細胞である。

いくつかの実施形態では、バイオフィルム関連感染症またはその症状を治療するための方法が、それを必要とする対象において提供され、本方法は、対象に、トリプトフォール誘導体もしくは４−エチル−フェノール誘導体から選択される少なくとも１つの分子、または本明細書に開示される微生物混合物と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。

本明細書で使用される場合、「有機ベースの汚染物質関連感染症」は、微生物の負荷の増加、および／またはバイオフィルムもしくは生物付着の形成によって対象に引き起こされる任意の疾患または障害を指す。いくつかの実施形態では、有機ベースの汚染物質関連感染症を誘発する生物は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫からなる群から選択される。

感染症の症状における非限定的な例には、限定されないが、発熱、下痢、倦怠感、筋肉痛、および咳が含まれる。

感染症の非限定的な例には、尿路感染症、胃腸感染症、腸炎、サルモネラ症、下痢、非結核性マイコバクテリア感染症、レジオネラ病、院内肺炎、皮膚感染症、コレラ、敗血症性ショック、歯周炎、感染症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病、および副鼻腔炎が含まれる。いくつかの実施形態では、感染症は、細菌血症、皮膚感染症、新生児感染症、肺炎、心内膜炎、骨髄炎、毒素性ショック症候群、熱傷性皮膚症候群、および食中毒からなる群から選択される状態を誘発する。

本明細書で使用される「対象」という用語は、動物、より具体的には非ヒト哺乳動物およびヒト生物を指す。ヒト以外の動物対象はまた、例えば、胚または胎児などの出生前の形態の動物を含んでもよい。非ヒト動物の非限定的な例には、ウマ、ウシ、ラクダ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、およびブタが含まれる。一実施形態では、対象は、ヒトである。ヒト対象は胎児を含んでもよい。

本明細書で使用される場合、疾患、障害、または状態の「治療」または「治療すること」という用語は、その少なくとも１つの症状の緩和、その重症度の低減、またはその進行の阻害を包含する。処置は、疾患、障害、または状態が完全に治癒することを意味する必要はない。有効な治療であるためには、本明細書における有用な組成物は、疾患、障害、もしくは状態の重症度を低減する、それに関連する症状の重症度を低減する、または患者もしくは対象の生活の質の改善を提供するだけでよい。

本明細書で使用される場合、疾患、障害、または状態の「予防」という用語は、疾患、障害、または状態の発症の遅延、予防、抑制、または阻害を包含する。本記載の主題に従って使用される場合、「予防」という用語は、疾患／障害プロセスの誘発または発症の前に、対象が本記載のペプチドに曝露される予防のプロセスに関連する。これは、個人が予防されるべき疾患／障害の発生に対する素因を示す遺伝的血統を有する場合に行うことができる。例えば、これは、祖先が、例えば、炎症性疾患の特定のタイプに対する素因を示す個人に当てはまり得る。「抑制」という用語は、疾患／障害プロセスがすでに始まっているが、その状態の明らかな症状がまだ現実化されていない状態を説明するために使用される。したがって、個人の細胞は病気／障害を有し得るが、病気／障害の外部兆候はまだ臨床的に認識されていない。いずれの場合も、予防法という用語は、予防と抑制の両方を包含するように適用することができる。逆に、「治療」という用語は、臨床症状が患者においてすでに現実化されている既存の状態と戦うための活性剤の臨床的適用を指す。

本明細書で使用される場合、「状態」という用語は、生きている動物またはその部分のうちの１つの正常な状態の障害を構成する、正常からの解剖学的および生理学的逸脱を含み、身体機能の実行を中断または変更する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、生きた組織内または物品の上もしくは中の微生物を殺傷するか、または物品の上もしくは中の微生物の生成を低減させることに関する。

いくつかの実施形態では、本発明は、物品の上もしくは中の有機ベースの汚染物質の負荷の形成を阻害または低減する方法に関するものであり、トリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体から選択される少なくとも１つの分子、または本明細書に開示される微生物混合物と、許容可能な担体と、を含む組成物を、物品の上および／もしくは中に組み込むか、またはコーティングすることを含む。

いくつかの実施形態では、有機ベースの汚染物質の負荷は、微生物の負荷、ならびに／あるいは物品の中および／または上におけるバイオフィルムもしくは生物付着の形成である。いくつかの実施形態では、微生物は、ウイルス、真菌、寄生虫、酵母、細菌、および原生動物からなる群から選択される。

いくつかの実施形態によれば、本方法は、有機ベースの汚染物質関連感染症またはその症状を、その治療または改善することを必要とする対象において治療または改善することを含み、対象に本発明の化合物またはそれを含む医薬組成物、あるいは本明細書に開示される微生物混合物、またはそれを含む発酵乳製品のうちのいずれか１つを投与することを含む。

いくつかの実施形態では、有機ベースの汚染物質関連感染症またはその症状の治療、改善、低減、または予防のための医薬品の作成における、本発明の化合物または本発明の微生物混合物の有効量を含む組成物の、それを必要とする対象における使用が提供される。いくつかの実施形態では、感染症またはその症状の治療のための医薬品の作成における、本発明に開示される化合物もしくはその誘導体、または微生物混合物の有効量を含む組成物の、それを必要とする対象における使用が提供される。

一実施形態では、本発明の化合物、または本発明の微生物混合物は、それ自体が対象に提供される。一実施形態では、本発明の化合物のうちの１つ以上は、それ自体が対象に提供される。一実施形態では、本発明の化合物、または本発明の微生物混合物は、それが薬学的に許容される担体と混合される医薬組成物の一部として対象に提供される。一実施形態では、本発明の化合物のうちの１つ以上は、それらが薬学的に許容される担体と混合される医薬組成物の一部として対象に提供される。

本明細書で使用される場合、「クオラムセンシング（ＱＳ）」という用語は、細胞集団密度の動態に応答して遺伝子発現経路を変更するシステムを指す。いくつかの実施形態では、本発明の分子またはそれらの任意の誘導体は、ＱＳを阻害するための方法において使用される。当技術分野で知られている任意の方法を、ＱＳに対する分子の効果を評価するために使用することができる。ＱＳ検査の非限定的な例には、活性な自己誘導因子遺伝子を欠如し、さらに蛍光レポーター遺伝子を含むＤＮＡベクターによってクローニングされた、操作された細菌に基づく生物発光アッセイの使用を含む。

本明細書で使用される場合、「バイオフィルム」という用語は、互いに接着する微生物の群を指し、ＤＮＡ、タンパク質、および多糖類を含む自己生成性および自己分泌性の細胞外ポリマー内に埋め込まれる。いくつかの実施形態では、バイオフィルムは、生きている宿主の表面に付着する。一実施形態では、バイオフィルムは、非生存性表面に付着する。いくつかの実施形態では、ＱＳ活性は、バイオフィルム形成のレベルと相関する。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物、発酵乳製品、または方法のうちのいずれか１つは、ＱＳ活性をコントロールと比較して、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％、あるいはそれらの間の任意の値および範囲で変更する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＱＳ活性を変更することは、コントロールと比較して、１〜５％、３〜６％、４〜１０％、８〜２０％、１５〜３０、２８〜４０％、３５〜５０％、４５〜６０％、５０〜７０％、６５〜８０％、７０〜９０％、または９０〜１００％である。いくつかの実施形態では、ＱＳ活性を変更することは、コントロールと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物、発酵乳製品または方法のいずれか１つは、バイオフィルム生成をコントロールと比較して、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％、あるいはそれらの間の任意の値および範囲で低減させる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、バイオフィルム生成は、コントロールと比較して、１〜５％、３〜６％、４〜１０％、８〜２０％、１５〜３０％、２８〜４０％、３５〜５０％、４５〜６０％、５０〜７０％、６５〜８０％、７０〜９０％、または９０〜１００％低減する。いくつかの実施形態では、バイオフィルム生成は、コントロールと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍、あるいはそれらの間の任意の値および範囲で低減する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

一実施形態では、コントロールは非発酵乳製品である。一実施形態では、コントロールは、開示される本発明の微生物混合物と比較して、異なる微生物混合物を有する発酵乳製品である。一実施形態では、コントロールは、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓを欠いている発酵乳製品または非発酵乳製品である。一実施形態では、コントロールは、２％以下のＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓを含む微生物混合物を含む発酵乳製品または非発酵乳製品である。一実施形態では、コントロールは、不活化されたＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓを含む微生物混合物を含む発酵乳製品または非発酵乳製品である。不活化の非限定的な例は、熱不活化である。いくつかの実施形態では、コントロールは、上記に開示されるように、チロソール、またはトリプトフォール、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、コントロールは、チロソール誘導体またはトリプトフォール誘導体、あるいはそれらの組み合わせを含まない。

いくつかの実施形態では、本発明は、有効成分として本発明の化合物の有効量と、許容される担体および／または希釈剤と、を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、有効成分として有効量の酢酸トリプトフォール、酢酸チロソール、ドーパミンＨＣＬ、カフェー酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、許容可能な担体は、活性成分の基材への組み込みまたはコーティングを促進する。

いくつかの実施形態では、組成物は、基材をさらに含む。いくつかの実施形態では、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体のうちの少なくとも１つを含む組成物は、基材の少なくとも一部分の中および／または上に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本発明は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体のうちの少なくとも１つを、少なくともその一部分の中および／または上に取り込んでいる基材を含む組成物に関する。

本明細書で使用される場合、「その一部分」という用語は、例えば、固体または半固体基材の表面もしくはその一部分、および／または本体もしくはその一部分、あるいは液体、ゲル、フォーム、およびその他の非固体基材の容量もしくはその一部分を指す。

大きく異なる化学的性質の基材は、本明細書に記載されるように、トリプトフォール誘導体もしくは４−エチル−フェノール、またはそれらを含む組成物のうちの少なくとも１つを、その上に組み込む（例えば、その表面に沈着させる）ために首尾よく利用され得る。「首尾よく利用される」という用語は、（ｉ）トリプトフォール誘導体もしくはチロソール誘導体、またはそれらを含む組成物のうちの少なくとも１つが、基材の表面上に均一で均質にコーティングを首尾よく形成したことと、（ｉｉ）得られたコーティングは、基材の表面に長期継続する所望の特性（例えば、抗菌特性）を付与することと、を意味する結果を指す。

したがって、本発明のいくつかの実施形態によって使用可能である基材は、硬質（リジッド）もしくは軟質、固体、半固体、または液体の基材であることができ、フォーム、溶液、エマルション、ローション、ゲル、クリーム、またはそれらの任意の混合物の形態をとり得る。

本発明のいくつかの実施形態に従って使用可能である基材は、例えば、有機または無機の表面を含むことができ、限定されないが、ガラス表面、磁器表面、セラミック表面、シリコンまたは有機ケイ素の表面、金属表面（例、ステンレス鋼）、マイカ、例えばプラスチック表面などのポリマー表面、ゴム表面、紙、木材、ポリマー、金属、炭素、バイオポリマー、シリコンミネラル（岩石またはガラス）、表面、羊毛、絹、綿、麻、皮革、毛皮、羽毛、皮膚（獣皮、毛皮、または毛）表面、プラスチック表面、およびポリマーを含むかまたはそれから作成される表面で、限定されないが、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレン（ＰＥＴ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリエステル（ＰＥ）、非プラスチック塩化ポリビニル（ＰＶＣ）、ならびに限定されないがポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））を含むフルオロポリマーを含むか、または、上記物質のいずれか、あるいはそれらの任意の混合物を含むか、またはそれらから作成することができる。

あるいは、他の部分、または基材全体が上記の材料から作成される。

いくつかの実施形態では、トリプトフォール誘導体もしくは４−エチル−フェノール誘導体、またはそれを含む組成物のうちの少なくとも１つを組み込む基材は、本明細書に記載されるとき、物品の一部であるか、または物品の一部を形成する。

いくつかの実施形態によれば、物品（例えば、製品）は、その少なくとも一部の中および／もしくは上に、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体あるいはそれらを含む組成物のうちの少なくとも１つを組み込んでいる基材を含む。

物品は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体の抗微生物活性および／もしくは抗バイオフィルム形成活性から利益を得ることができる任意の物品であり得る。

物品の非限定的な例には、限定されないが、医療用デバイス、有機廃棄物処理デバイス、流体デバイス、農業用デバイス、パッケージ、密封物品、燃料容器、水および冷却システムデバイス、ならびに建築構成要素が含まれる。

トリプトフォール誘導体もしくは４−エチル−フェノール誘導体またはそれらを含む組成物のうちの少なくとも１つを組み込むことができるデバイスの非限定的な例には、本明細書に記載されるとき、有益には、チューブ、ポンプ、排水管もしくは廃棄物パイプ、スクリュープレートなどが含まれる。

物品の非限定的な例には、限定されないが、水処理システム（水性媒体または水を収容および／または輸送および／または処理するためなど）、デバイス、容器、フィルター、チューブ、溶液、およびガスなどで使用される構成要素が含まれる。

物品の非限定的な例には、限定されないが、有機廃棄物処理システム（有機廃棄物を収容および／または処分および／または輸送および／または処理するためなど）、デバイス、容器、フィルター、チューブ、溶液、およびガスなどの構成要素が含まれる。

いくつかの実施形態では、本発明は、有効成分として、治療有効量の本発明の化合物または本発明の微生物混合物と、薬学的に許容される担体および／または希釈剤と、を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、有効成分として、治療有効量の酢酸トリプトフォール、もしくは酢酸チロソール、またはそれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、本発明の化合物の生物への投与を促進する。例えば、「薬学的に許容される」という用語は、連邦もしくは州政府の規制機関によって承認されたか、または動物、より具体的にはヒトで使用するために米国薬局方または他の一般的に認められた薬局方に列挙されていることを意味することができる。

いくつかの実施形態では、開示された発明は、病原性活性、微生物増殖、微生物活性を変更する際、炎症反応を変更する際、アミロイド凝集を変更する際、またはそれらの任意の組み合わせにおいて使用するための組成物に関する。本明細書で定義されるように、「変更する」は、所望の結果に応じて、増加または減少させることを包含する。いくつかの実施形態では、病原性活性は、微生物活性を含む。いくつかの実施形態では、微生物活性は、増殖、抗生物質耐性、細胞情報伝達もしくはクオラムセンシング、バイオフィルム生成、アミロイド凝集、細線維化もしくはオリゴマー化、またはそれらの任意の組み合わせ、毒素生成もしくは分泌、またはそれらの組み合わせから選択される任意の活性を含む。微生物活性は、任意の既知の方法を使用してアッセイすることができ、非限定的な例には、限定されないが、分光光度法、選択的基質を使用する薬剤耐性アッセイ、生物発光アッセイ、液体クロマトグラフィー、および質量分析法などが含まれ、それらのいくつかは本明細書に後述で例示され、それらのすべては当業者によく知られている。

いくつかの実施形態では、開示される発明は、炎症性疾患、感染症、アミロイド凝集関連疾患、またはそれらの組み合わせを治療するための方法に関する。

本明細書で使用される場合、「アミロイド凝集関連疾患」という用語は、疾患の病因または病態生理学の一部としてのアミロイドの関与を含む任意の病原性状態を包含する。いくつかの実施形態では、アミロイド関連疾患は、アミロイド凝集の上昇、アミロイド生成率の上昇、アミロイド細線維化率の上昇、アミロイドオリゴマー化率の上昇、アミロイド誘発性毒性、アミロイド誘発性アポトーシス、アミロイド誘発性細胞死、およびそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含む。

いくつかの実施形態では、アミロイド凝集関連疾患は、神経変性疾患である。本明細書で使用される場合、神経変性疾患はまた、神経−筋変性疾患を含み得る。限定的な例には、自律神経障害、ホルネル症候群、多系統萎縮症、純粋自律神経不全症、せん妄、認知症、アルツハイマー病、慢性外傷性脳症、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、パーキンソン病、多発性硬化症、視神経脊髄炎、ハンチントン病、進行性核上麻痺、神経眼科的および頭蓋的神経障害、アイザックス症候群、スティフパーソン症候群、ギランバール症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性運動神経障害（ＣＩＤＰ）、遺伝性神経障害、圧迫性麻痺に起因する遺伝的運動障害（ＨＮＰＰ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびその他の運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、重症筋無力症、神経根障害、髄核ヘルニア、末梢神経障害、単神経障害、多発性単神経障害、多発神経障害、腕神経叢および腰仙骨神経叢障害、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、胸郭出口症候群（ＴＯＳ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、発作性障害、脊髄障害、ならびに脳卒中が含まれる。

いくつかの実施形態では、変更は、少なくとも５％、少なくとも１５％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれらの間の任意の値および範囲である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、変更は、１〜５％、７〜１５％、１０〜２５％、２０〜４０％、３５〜５０％、４５〜６５％、５５〜７５％、７０〜８５％、８０〜９０％、８７〜９５％、または９２〜１００％である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

いくつかの実施形態では、低減させることは、少なくとも５％、少なくとも１５％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれらの間の任意の値および範囲である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、低減させることは、１〜５％、７〜１５％、１０〜２５％、２０〜４０％、３５〜５０％、４５〜６５％、５５〜７５％、７０〜８５％、８０〜９０％、８７〜９５％、または９２〜１００％である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

「低減させる」および「阻害する」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

いくつかの実施形態では、増強は、少なくとも５％、少なくとも１５％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれらの間の任意の値および範囲である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、増強は、１〜５％、７〜１５％、１０〜２５％、２０〜４０％、３５〜５０％、４５〜６５％、５５〜７５％、７０〜８５％、８０〜９０％、８７〜９５％、または９２〜１００％である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：１５〜１５：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：１４〜１４：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：１３〜１３：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：１２〜１２：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：１１〜１１：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、１トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：１０〜１０：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：９〜９：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：８〜８：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：７〜７：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：６〜６：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：５〜５：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：４から４：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：３〜３：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：２〜２：１のｗ／ｗ比で含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体を１：１〜１：１のｗ／ｗ比で含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

いくつかの実施形態では、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体は、組成物内に、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１５０μＭ、少なくとも２００μＭ、少なくとも２２５μＭ、もしくは少なくとも３５０μＭ、またはその間の任意の値および範囲の濃度で存在する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、トリプトフォール誘導体または４−エチル−フェノール誘導体は、組成物内に１〜１０μＭ、５〜２０μＭ、１０〜３０μＭ、２０〜４０μＭ、２５〜５０μＭ、３０〜６０μＭ、４０〜７０μＭ、５０〜８０μＭ、６５〜９０μＭ、７０〜１００μＭ、８０〜１１０μＭ、９０〜１２０μＭ、１１０〜１６０μＭ、１５０〜２７５μＭ、または２５０〜５００μＭの濃度で存在する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

いくつかの実施形態では、組成物または微生物混合物は、トリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体の各々を、組成物内に、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１５０μＭ、少なくとも２００μＭ、少なくとも２２５μＭ、もしくは少なくとも３５０μＭ、またはそれらの間の任意の値および範囲の濃度で含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、組成物または微生物混合物は、トリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体の各々を、組成物内に、１０〜５０ｎＭ、４０〜１００ｎＭ、７５〜５００ｎＭ、４５０〜９００ｎＭ、０．７５〜１．５μＭ、１〜１０μＭ、５〜２０μＭ、１０〜３０μＭ、２０〜４０μＭ、２５〜５０μＭ、３０〜６０μＭ、４０〜７０μＭ、５０〜８０μＭ、６５〜９０μＭ、７０〜１００μＭ、８０〜１１０μＭ、９０〜１２０μＭ、１１０〜１６０μＭ、１５０〜２７５μＭ、または２５０〜５００μＭの濃度で含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

本明細書で定義されるように、「半数阻害濃度（ＩＣ_５０）」という用語は、特定の生物学的または生化学的機能の阻害における物質の効力の尺度を指す。いくつかの実施形態では、トリプトフォール誘導体、４−エチル−フェノール誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む組成物（例えば、医薬組成物）は、ＩＣ_５０をマイクロモルレベルで有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような微生物混合物を含む組成物は、ＩＣ_５０をマイクロモルレベルで有する。いくつかの実施形態では、マイクロモルレベルは、最大で１，０００μＭ、最大で９００μＭ、最大で８００μＭ、最大で７００μＭ、最大で６００μＭ、最大で５００μＭ、最大で４００μＭ、最大で３００μＭ、最大で２００μＭ、最大で１００μＭ、最大で７５μＭ、最大で５０μＭ、最大で３５μＭ、最大で２０μＭ、最大で１５μＭ、最大で１０μＭ、最大で５μＭ、もしくは最大で１μＭ、またはその間の任意の値および範囲を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、マイクロモルレベルは、１〜１０μＭ、５〜２０μＭ、１５〜３０μＭ、２５〜５００μＭ、４０〜７５μＭ、７０〜１２０μＭ、１００〜２００μＭ、１５０〜３００μＭ、２５０〜４００μＭ、３７５〜５００μＭ、４００〜６５０μＭ、６００〜８５０μＭ、または８００〜１，０００μＭを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、活性化合物が一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような担体は、水ベースおよび油などの無菌液体であることができ、石油、動物、植物、または合成起源のものを含み、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒が挙げられる。

水は、活性化合物が静脈内投与される医薬組成物によって構成される場合などの担体として使用され得る。生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射可能な溶液の場合、液体担体として用いることができる。好適な賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいは酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのｐＨ緩衝剤を含むこともできる。ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤も想定される。担体は、全体として、本明細書に提示される組成物の約０．１重量％〜約９９．９９９９９重量％を含み得る。

本発明の一実施形態は、単位投与形態で提供され、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって作成される、本発明の分子またはその誘導体に関する。一実施形態では、単位投与形態は、錠剤、カプセル、トローチ、ウエハース、パッチ、アンプル、バイアル、またはプレフィルドシリンジの形態である。

さらに、最適な投与量範囲を特定するのを助けるために、インビトロアッセイを任意選択的に用いることができる。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路、および疾患または障害の性質にも依存し、開業医の判断および各患者の状況に応じて判定されるべきである。実効線量は、インビトロまたはインビボの動物モデル試験バイオアッセイまたはシステムから得られた用量反応曲線から推定することができる。

一実施形態では、本発明の組成物は、本発明の活性成分のうちの少なくとも１つ（例えば、トリプトフォール誘導体、または４−エチル−フェノール誘導体）を、薬学的に許容される担体または希釈剤とともに含む医薬組成物の形態で投与される。別の実施形態では、本発明の組成物は、任意の従来の経口、非経口、もしくは経皮投与剤形で、個別または一緒に投与することができる。

本明細書で使用される場合、「投与すること」、「投与」という用語、および同様の用語は、健全な医療行為において、活性剤を含む組成物を、治療効果を提供するような様式で対象に送達する任意の方法を指す。

いくつかの実施形態では、本発明の化合物、またはそれらの任意の誘導体もしくは組み合わせ、あるいは本発明の微生物混合物を含む医薬組成物は、経口（すなわち、経腸）、直腸、膣、局所、鼻、眼、皮下、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内の投与経路を介して投与される。医薬組成物の投与経路は、治療される疾患または状態に依存するであろう。好適な投与経路には、非経口注射、例えば、皮内、静脈内、筋肉内、病変内、皮下、髄腔内、および当技術分野で知られている他の任意の注射様式が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明の医薬組成物は、脳室内および髄腔内注入を含む任意の適切な経路によって導入することが望ましいものであり得、脳室内注入は、例えば、リザーバに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易化され得る。肺投与はまた、例えば、吸入器またはネブライザーの使用によって、用いることができる。

局所適用の場合、本発明の化合物、またはそれらの任意の誘導体もしくは組み合わせ、あるいは本発明の微生物混合物は、薬学的に許容される担体と組み合わせることができ、それによって、有効投与量が所望の活性に基づいて送達される。担体は、例えば、限定するものではなく、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、エアロゾル、坐剤、パッドまたはゲル化スティックの形態でよい。

経口適用のため、医薬組成物は錠剤またはカプセルの形態にあり得、以下の原料、または同様な性質の化合物のいずれかを含むことができ、微結晶性セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、またはコロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤が挙げられる。投与単位形態がカプセルである場合、それは、上記のタイプの材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含むことができる。さらに、投与単位形態は、投薬単位の物理的形態を修正する様々な他の材料、例えば、砂糖、シェラック、または他の腸溶性剤のコーティングを含むことができる。本発明の錠剤は、さらにフィルムコーティングすることができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物の経口適用は、飲用液体の形態であり得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物の経口適用は、食用製品の形態であり得る。経口担体の非限定的な例には、ミルク、ヨーグルト、プロバイオティクスヨーグルト、ケフィア、発酵乳、または他が含まれるが、これらに限定されない。

非経口投与の目的のために、ゴマ油もしくはピーナッツ油または水性プロピレングリコールにおける溶液、ならびに対応する水溶性塩の滅菌水溶液を使用することができる。そのような水溶液は、必要に応じて適切に緩衝化され得、液体希釈剤は、最初に十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張にされる。これらの水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内注入目的に特に適している。

組成物はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物の粒子調製物の中またはそれら上に、あるいはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロプラスト上に、活性物質の組み込みを含む。そのような組成物は、物理的状態、溶解性、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を与えるであろう。

一実施形態では、本発明は、組み合わせた調製物を提供する。一実施形態では、「組み合わせ調製物」は、特に「パーツのキット」を定義し、上記で定義される組み合わせパートナーが、独立して、または組み合わせパートナーの異なる量を伴う異なる固定した組み合わせの使用によって、すなわち、同時に、一緒に、別々に、または連続的に投与することができるという観点においてする。いくつかの実施形態では、次いで、パーツのキットのパーツは、例えば、同時にまたは時系列的にずらして、すなわち、異なる時点で、パーツキットの任意のパーツに対して同じまたは異なる時間間隔で投与することができる。いくつかの実施形態では、組み合わせパートナーの全量の比は、組み合わせた調製物で投与することができる。一実施形態では組み合わせた調製物は、例えば、治療される患者亜集団のニーズ、または当業者によって容易に作成され得る特定の疾患、疾患の重症度、年齢、性別、または体重に起因し得る異なるニーズである単一患者のニーズに対処するために、変更することができる。

一実施形態では、本発明の分子、またはそれらの任意の誘導体もしくは組み合わせ、あるいは本発明の微生物混合物は、追加の活性剤とともに個体に提供されて、各薬剤それ自体による治療と比較して改善された治療効果を達成できることが理解されるであろう。別の実施形態では、測定（例えば、補足薬剤の投薬および選択）は、併用療法に関連する有害な副作用に対して行われる。

一実施形態では、治療される状態の重症度および応答性に応じて、投薬は単回または複数回の投与でよく、治療の過程は、数日から数週間、または治癒が効果を奏するかもしくは疾患状態の減少が達成されるまで続く。

いくつかの実施形態では、予め設定された発明の組成物は、治療上安全かつ有効な量で投与される。本明細書で使用される場合、「安全かつ有効な量」という用語は、本明細書に記載されている方法で使用された場合の合理的な利益／現リスク比に見合った、過度の有害な副作用（毒性、刺激、またはアレルギー反応など）なしに所望の治療反応をもたらすのに十分な成分の量を指す。別の実施形態では、分子、またはそれらの任意の誘導体もしくは組み合わせの治療有効量は、インビボで測定可能な予想される生物学的効果のために必要である本明細書で言及される分子の量である。実際に投与される量、および投与の速度と時間経過は、治療される状態の性質と重症度に依存する。治療の処方、例えば投与量、時機などの決定は、一般開業医または専門家の責任の範囲内であり、通常、治療される障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法、および開業医に知られている他の要因を考慮する。技術とプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ、（２００５）に認められる。いくつかの実施形態では、有効量または用量の調製は、最初にインビトロアッセイから推定することができる。一実施形態では、用量は動物モデルで定式化することができ、そのような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に判定することができる。

一実施形態では、本明細書に記載の有効成分の毒性および治療効能は、インビトロでの細胞培養または実験動物において、標準的な薬学的手順によって決定することができる。一実施形態では、これらのインビトロおよび細胞培養アッセイならびに動物試験から得られたデータは、ヒトで使用するための範囲の投薬量を製剤化する際に使用することができる。一実施形態では、投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて変化する。一実施形態では、正確な処方、投与経路、および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。［例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９７５）“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照する］。

本発明の分子、またはそれらの任意の誘導体もしくは組み合わせ、あるいは本発明の微生物混合物を有効成分として含む医薬組成物は、従来の医薬配合技術に従って作成することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８^ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）を参照する。また、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（２００５）を参照する。

一実施形態では、適合性のある医薬担体で製剤化される本発明の調製物を含む組成物が作成され、適切な容器に入れられ、指示された状態の治療のために表示される。

一実施形態では、本発明の組成物は、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供され、有効成分を含む１つ以上の単位投与形態を含む。一実施形態では、パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含む。一実施形態では、パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための説明書を伴う。一実施形態では、パックまたはディスペンサーは、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の容器に関連する通知によって収容され、この通知は、組成物の形態の機関または人もしくは獣医の管理による承認を反映している。そのような通知は、一実施形態では、処方薬または承認された製品インサートについて、米国食品医薬品局によって承認される表示化である。

本明細書に記載の任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、または比率範囲は、特に明記しない限り、その範囲内の任意の整数およびその分数、例えば整数の１０分の１および１００分の１の濃度、パーセンテージまたは比率を含むと理解されるべきである。

ポリマーサブユニット、サイズ、または厚さなどの任意の物理的特徴に関連して本明細書に記載される任意の数の範囲は、特に明記しない限り、記載される範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。

考察において、特に明記しない限り、本発明の実施形態の特徴（複数可）の条件または関係特性を修飾する「実質的に」および「約」などの形容詞は、かかる条件または特性が、意図される適用のための実施形態の実施について許容される許容範囲内に定義されることを意味すると理解される。特に指示しない限り、明細書および特許請求の範囲における「または」という語は、排他的な「または」ではなく、むしろ包括的な「または」であるとみなされ、それが結び付く項目のうちの少なくとも１つ、または任意の組み合わせを示す。

上記および本明細書の他の場所で使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は、列挙された構成要素の「１つ以上」を指すことを理解されたい。特に明記しない限り、単数形の使用が複数形を含むことは当業者には明らかであろう。したがって、本出願では、「ａ」、「ａｎ」、および「少なくとも１つ」という用語は交換可能で使用される。

本教示をよりよく理解する目的のために、そして決して教示の範囲を制限することなく、特に明記しない限り、数量、パーセンテージ、または比率を表すすべての数字、ならびに本明細書および請求項で使用される他の数値は、すべての場合において、「約」という用語で修正されるものとして理解されるべきである。したがって、反対に示されない限り、以下の明細書および添付の請求項に示される数値パラメータは、得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、各数値パラメータは、報告された有効桁数に照らして、通常の丸め手法を適用することによって解釈する必要がある。

本願の説明および特許請求の範囲において、動詞「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「有する」ならびにそれらの活用形の各々は、動詞の目的語（複数可）が必ずしも動詞の主語（複数可）の構成要素、要素または部分を完全に列挙したものではないことを示すために使用される

本明細書で使用する他の用語は、当技術分野におけるそれらの周知の意味によって定義されることを意味する。

本発明の追加の目的、利点、および新規の特徴は、限定するように意図されるものではない以下の実施例を調査すると、当業者に明らかになるであろう。さらに、上記に記述され、かつ以下の特許請求の範囲のセクションで特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様の各々は、以下の実施例において実験的証拠を見出す。

明確にするために、別個の実施形態の文脈において説明される本発明のある特定の特徴がまた、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明されている本発明の様々な特徴は、別個に、もしくは任意の好適な部分的組み合わせで、または本発明の任意の他の説明された実施形態で好適として提供することもできる。様々な実施形態の文脈で説明されている特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは機能しない場合を除いて、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。

一般に、本明細書で使用される命名法、および本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物、および組換えＤＮＡの技術が含まれる。そのような技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）“Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）、米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に示される方法論、“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたく、それらのすべては、参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本書全体を通して提供される。

材料および方法
プロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）の試料および培養
５０ｇのケフィア粒を８００ｍｌの低温殺菌牛乳（ＴＡＲＡ、イスラエル）を含む１，０００ｍｌフラスコに接種し、滅菌ガーゼで覆った。続いて、混合物を２８℃で２４時間培養した。続いて、プロバイオティクスヨーグルトをろ過して、発酵乳から粒を分離した。発酵乳中の培養微生物に配列分析を行った。

ＤＮＡは、プロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）の培養物からＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ単離キット（ＭｏＢｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｋｅｒ Ａｖｅｎｕｅ Ｗｅｓｔ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造元の説明書に従って使用して抽出した。全ＤＮＡは、ショットガン配列決定のためにイリノイ大学シカゴ校（ＵＩＣ）のリサーチリソースセンターにあるＤＮＡサービス（ＤＮＡＳ）施設に送った。ペアエンドの配列２×１５０リードｉｌｌｕｍｉｎｅ Ｎｅｘ−Ｋｅｇ ５００シーケンサーシーケンスを用いて、シークエンス法Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴが実行された。リードはＦＡＳＴＱとしてＯｎｅ Ｃｏｄｅｘウェブサイトにアップロードされ、メタゲノミクスの分類注釈の結果について分析された。

イメージングフローサイトメトリー
プロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）を水で１：１０に希釈し、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ Ｍｋ ＩＩ（Ａｍｎｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，米国）で分析した。ＢＦ（明視野）のデフォルトマスクを使用して、焦点で微生物を識別し、勾配二乗平均平方根（ＲＭＳ）をプロットした。集団分析は、細菌細胞から検出されたが真菌細胞からは検出されなかった赤外線（ＩＲ）吸光度強度に従って実行した。カウント値を計算する目的のために、カスタムマスクを自動蛍光チャネルで真菌細胞に適用した。次いで、機器によって計算された強度値に従って、微生物を亜集団に分けた。

プロバイオティクスヨーグルト由来の有機分子の抽出
生成されたプロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、沈殿物と上清を分離した。次いで、５００ｍｌの上清を分液漏斗に移し、５００ｍｌの酢酸エチルと混合した。有機相を上清から分離し、丸底フラスコに移して、すべての溶媒を蒸発させて固体残留物を得、プロバイオティクスヨーグルトからの有機分子を含んだ。

抽出された有機分子の生物活性
生物発光アッセイは、関連する自己誘導因子（ＡＩ）をコードするヌクレオチド配列を欠く変異体細菌を用いて実施した。さらに、細菌を生物発光レポータープラスミドによってクローニングし、それらの発光強度をクオラムセンシング遺伝子発現が発生したときに測定した。９６ウェルマイクロタイタープレートアッセイを使用して、細菌としてＣ８自己誘導因子に応答するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、ならびに情報伝達するめに（Ｓ）−４，５−ジヒドロキシ−２，３−ペンタンジオン（ＤＰＤ）自己誘導因子に応答するＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉの両方のＡＩ活性化（アゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）を評価した。

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａ１３６ ｐＣＦ２１８ ｐＭＶ２６培養は、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび４．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補充したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ、Ｍｉｌｌｅｒのブロス）において２８〜３０℃で２４時間培養した。Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ株およびＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ株の両方は、テトラサイクリンを補充したＬＢブロス（Ｌｅｎｎｏｘ）において３０℃で２４時間増殖させた。一昼夜培養を新鮮なＬＢ培地によって０．０５の吸光度（ＯＤ_６００）に希釈した。プロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）抽出分子は、２タイプの実験において勾配濃度で試験し、４００ｐＭ ３−ｏｘｏ−Ｃ８−ＨＳＬ（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａ１３６ ｐＣＦ２１８ ｐＭＶ２６）ＣＡＩ１（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ ＭＭ９２０）２００ｎＭ ＤＰＤ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ ＭＭ３０）の非存在下（活性化／アゴニスト）または存在下（阻害／アンタゴニスト）、および新鮮なＬＢ培地によるＯＤ_６００で０．０５における競合アッセイだった。透明底９６ウェルマイクロリットルプレートを、ＬＢ培地に段階希釈した試験化合物含有ウェルで調製した（三重測定）。全１００μｌの希釈した細胞を各ウェルに加えた。コントロール試料は、細菌および特定のＡＩ分子を含み、ヨーグルト抽出分子は無添加だった。マイクロタイタープレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、３０℃で連続的に振とうしながら２０分ごとに１９時間発光を測定した。ＯＤ_６００の値で除した平均発光値を、添加した化合物濃度に対してプロットした。

Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ由来の有機分子の抽出
Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ株ＨＡ ６３［ＮＲＲＬ Ｙ−８２８１、ＣＢＳ７１２］を３００ｍｌの酵母およびモルトＬＢ中で培養し、２８℃で２４時間、１００ｒｐｍ攪拌で増殖させた。培養物を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を収集した。次いで、上清を分液漏斗に移し、抽出のために等容量の酢酸エチルと混合した。混合物を１０分間振とうさせ、有機相を新たな分液漏斗に移し、抽出を３回繰り返した。次いで、抽出物を蒸発させてすべての液体を除去し、最後に凍結乾燥機で乾燥させて水の存在を回避した。

液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）
Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ粗抽出物をＬＣ−ＭＳに注入して、酵母に由来する代謝物を同定した。Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ粗抽出物のクロマトグラフを培地粗抽出物のものと比較して、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ代謝物と特異的に結合する分子を特定した。分子の分子量は、陽イオンモードの静的ナノスプレーを備えたＬＴＱ ＸＬ Ｏｒｂｉｔｒａｐ（ＰＤＡおよびＱＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＱＤＡ）を使用してＭＳによって決定した。

合成した分子（２０３）の抗バイオフィルム活性
静的バイオフィルムアッセイでは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ０１）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ株の一昼夜培養物を、２０もしくは５０μＭの最終濃度の合成した分子（２０３）、またはコントロールとしてＤＭＳＯ（最大１％）を含む新鮮なＬＢ培地で１：１０希釈した。バイオフィルムは、９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，米国）において３７℃の非振とう条件下で成長させた。ＢａｃＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｄｅａｄ／Ｌｉｖｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，米国）で緑色に染色された生細胞と赤色に染色された死細胞を視覚化することによって、合成した分子（２０３）の使用は、細胞増殖に影響を与えなかった。コントロールバイオフィルムと比較して、合成分子（２０３）の存在下で死細胞の増加は観察されなかった。染色された細胞をＰＢＳで２回洗浄した。バイオフィルム画像は、ＣＬＳＭ（Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ２０ｘ／０．８ Ｍ２７，Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８８０，ドイツ）によって撮影した。

合成した酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールのバイオフィルム調節活性
この試験で使用された様々な病原性指標株は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株ＭＭ９２０（ΔＣｑｓＡ ΔｌｕｘＱ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ株ＭＭ３０（ＬｕｘＳ、Ｔｎ５）だった。バイオフィルム形成を開始するために、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ自己誘導因子１（ＣＡＩ１）の存在なしで細菌を増殖させた。さらに、細菌は、９００ｎＭ ＣＡＩ１（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ ＭＭ９２０）、９００ｎＭ ＣＡＩ１、２００μＭ酢酸トリプトフォール、および２００μＭ酢酸チロソール、ならびに２００μＭ酢酸トリプトフォールおよび２００μＭ酢酸チロソールの存在下で増殖させた。

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓが提供された。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓＩＶ群株、ＲＮ８２４２。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ０１、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ株を、ＬＢブロス培地において３７℃で２４時間インキュベートした。

バイオフィルムは、９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，米国）において３０℃での振とう条件下で成長させた。合成した分子の使用は、上記のように視覚化された細胞増殖に影響を与えなかった。染色された細胞をＰＢＳで２回洗浄した。バイオフィルム画像は、ＣＬＳＭ（Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ２０ｘ／０．８ Ｍ２７，Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８８０，ドイツ）によって撮影した。

抗真菌活性
抗真菌活性は、３タイプの真菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）を使用して評価した。真菌はポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ）培地において増殖させており、真菌が認められたプレートから寒天片を３０ｍｌのＰＤＢを含むファルコンに採取し、それを菌糸体が生成するまで２２℃でインキュベートすることによって行った。真菌懸濁液を新鮮なＰＤＢで１：１に希釈し、ＤＭＳＯに溶解したプロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）粗抽出物の７５μｌ、またはコントロールとしてＤＭＳＯ（リフレッシュメント試料）とともに２２℃で約４８時間インキュベートした。４８時間後、真菌懸濁液をろ過し、１０μｌのろ液を１．５％（ｖ／ｖ）のプロバイオティクスヨーグルト粗抽出物またはコントロールとしてＤＭＳＯを含むポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）プレートの中央に移した。

酢酸チロソールおよび酢酸トリプトフォールの化学合成
ホモバニリルアルコール（１ｍｍｏｌ）を３ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、次いで１．２ｍｍｏｌの塩化アセチルを反応混合物に加え、基材が消失するまで室温で２４時間撹拌した。反応の完了後、ＤＣＭを真空条件下で蒸発させ、混合物を酢酸エチルで溶解し、ＮａＣｌの飽和溶液で洗浄した。水相を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、５０ｍＬ飽和ＮａＣｌで洗浄してから、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶出にＥｔＯＡｃ−ヘキサン（２：１）を使用するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによる精製によって、酢酸チロソール（２％、１８ｍｇ）が得られた。Ｒｆ０．４３（３０％ＥｔＯＡｃ−７０％ヘキサン）、ＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲによって検証した。

３−（２−ヒドロキシエチル）インドール（３．２２４ｇ、２０ｍｍｏｌ）を４０ｍＬのピリジンに溶解し、２，６４８μＬ（２８ｍｍｏｌ）の無水酢酸を滴下して添加し、室温で１５時間撹拌した。溶液を１６０ｍＬのＨ_２Ｏ溶液に注ぎ、２０分間撹拌した。不均一な混合物を分離し、水層をＣＨ_２Ｃｌ_２（４×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、セライトで濾過し、減圧下で濃縮した。溶出にＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用したシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによる精製によって、酢酸トリプトフォール（５．２％、０．２１２ｇ）が無色オイルとして得られた。Ｒｆ０．４６（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、ＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲによって検証した。

クオラムセンシング活性の決定
細菌Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａ１３６、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＭＭ９２０、およびＶ．ｈａｒｖｅｙｉ ＭＭ３０におけるケフィアバイオマス粗抽出物分子の効果を、Ｂｒｅｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）による報告に従って測定した。一昼夜培養を新鮮なＬＢ培地によって０．０５の吸光度（ＯＤ_６００）に希釈した。透明底９６ウェルマイクロリットルプレートを、ＬＢ培地に段階希釈した試験化合物を含むウェルで作成した（三重測定）。全１００μＬの希釈細胞を各ウェルに加えた。コントロール試料は、ケフィア粗抽出分子を添加せずに細菌および特定の自己誘導分子を含んだ。マイクロタイタープレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、３０℃で連続的に振とうしながら２０分ごとに１９時間発光を測定した。２タイプの実験を実施し、４００ｐＭ ３−ｏｘｏ−Ｃ８−ＨＳＬ（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａ１３６）、ＣＡＩ−１（Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅ ＭＭ９２０）、２００ｎＭ ＤＰＤ（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ ＭＭ３０）の存在下、およびこれらのＡＩの非存在下における競合アッセイで、粗抽出分子のアゴニスト活性を測定した。ＯＤ_６００の値で除した平均発光値を、添加した化合物濃度に対してプロットした。

ケフィアバイオマス粗抽出物分子のバイオフィルム調節活性
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ０１、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ株を３７℃で２４時間インキュベートした。細菌懸濁液を新鮮なＬＢで１：１０に希釈し、ケフィアバイオマス粗抽出物分子またはコントロールとしてのＤＭＳＯ（リフレッシュメント試料）とともに３時間インキュベートした。すべての培養において、ＤＭＳＯ濃度は最大１％（ｖ／ｖ）だった。ヨーグルト抽出物またはコントロールとしてＤＭＳＯを添加した２００μｌのブロス培地混合物を、９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，米国）の各ウェルに加えた。２μｌのリフレッシュメント試料を各々適切なウェルに加えた。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、試料をＰＢＳで３回洗浄した。生細胞の可視化のために、ＢａｃＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｄｅａｄ／Ｌｉｖｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，米国）を使用して、細菌を緑色に染色し、死細胞を赤色に染色した。染色された細胞をＰＢＳで２回洗浄した。バイオフィルム画像はＣＬＳＭ（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，日本）によって撮影した。画像処理は、ＩＭＡＲＩＳソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ，Ｚｕｒｉｃｈ，スイス）を使用して行った。

合成した酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールのバイオフィルム調節活性
静的バイオフィルムアッセイでは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ菌株ＭＭ９２０の一昼夜培養物を、酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールの各々から最終濃度１００μＭ、またはコントロールとしてＤＭＳＯ（最大１％）を含む新鮮なＬＢ培地で１：１０に希釈した。本発明者らは、２つのタイプの試料を分析した。１つはＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ自己誘導因子（ＣＡＩ−１）が存在せず、他の１つは９００ｎＭ ＣＡＩ−１が存在する。バイオフィルムは、９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，米国）において３７℃の非振とう条件下で成長させた。ＢａｃＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｄｅａｄ／Ｌｉｖｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，米国）で緑色に染色された生細胞および赤色に染色された死細胞を視覚化することによって、合成した分子の使用は、細胞増殖に影響を与えなかった。コントロールバイオフィルムと比較して、両方の合成した分子の存在下で死細胞の増加は観察されなかった。染色された細胞をＰＢＳで２回洗浄した。バイオフィルム画像は、ＣＬＳＭ（Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ２０ｘ／０．８ Ｍ２７，Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８８０，ドイツ）によって撮影した。

核磁気共鳴（ＮＭＲ）
^１Ｈおよび^１３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）のスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＤＰＸ５００装置（５００ＭＨｚ）を用いて室温（ＲＴ）で記録した。

定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析
ＲＮＡは、保護細菌を用いて１００μＭ酢酸トリプトフォールまたは酢酸チロソールを補充または無補充のＬＢレノックス培地で培養して約１．０_ＯＤのＡ６００まで増殖された野生型株ＶＣ１から、製造業者によって説明されるオンカラムＤＮａｓｅＩ消化を含め、ＲＮＡ Ｐｒｏｔｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ試薬およびＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者の説明書に従って使用して抽出した。精製されたＲＮＡは、Ｂａｎａｌｙｚｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）を使用して定量化した。ｃＤＮＡは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ試薬キット（Ｔａｋａｒａ，Ｏｈｔｓｕ，日本）を使用して、１μｇのＲＮＡから合成した。反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、２μｌのｃＤＮＡを、ｑＰＣＲＢＩＯ ＳｙＧｒｅｅｎ Ｂｌｕｅ ｍｉｘ Ｈｉ−ＲＯＸ（ＰＣＲ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，英国）を使用して、ＡＢ Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。ＲＴ−ＰＣＲは、９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において２０μｌ容量で、三重測定で実施した。ｍｄｈ遺伝子を、反応の内因性負荷コントロールとして使用した。転写物の量は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓソフトウェアＶ２．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で分析した。Ｍｄｈフォワードプライマー５’−ＣＴＧＧＣＧＧＣＡＴＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＣ−３’（配列番号１）、Ｍｄｈリバースプライマー５’−ＡＣＣＣＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＧＣＧＣＡＡ−３’（配列番号２）、ｖｐｓＴフォワードプライマー５’−ＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号３）、ｖｐｓＴリバースプライマー５’−ＧＡＣＣＴＣＴＴＴＣＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＡ−３’（配列番号４）、ｃｔｘＡフォワードプライマー５’−ＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＴＡＴＧＣ−３’（配列番号５）、ｃｔｘＡリバースプライマー５’−ＣＣＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＣＴＴＧＣ−３’（配列番号６）、ａｐｈＡフォワードプライマー５’−ＡＣＣＧＧＧＴＡＣＧＡＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧ−３’（配列番号７）、ａｐｈＡリバースプライマー５’−ＧＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号８）。トランスクリプトームライブラリの構築のために、「定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析」のセクションで説明されているように精製されたＲＮＡを使用した。リボソームＲＮＡは、ＭＩＣＲＯＢＥｘｐｒｅｓｓキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，リトアニア）を使用して枯渇させた。ライブラリ作成は、ＳＭＡＲＴｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＲＮＡ−Ｓｅｑキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，米国）を製造業者の説明書に従って使用して実施した。ハイスループット配列決定分析は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００、ＳＲ ５０ ｂｐおよびバーコード生データ品質値ｐｈｒｅｄ＋３３によって行った。シーケンサーの自動品質フィルターを通過したリードの量および割合、コントロールマッピング値、エラー率、および塩基あたりの品質スコアは、配列決定が高品質であることを示す。リードの小さい割合のみがトリミングによって破棄され、長さ分布のピークは５１の初期長にある。比較分析に使用されたソフトウェアおよびアプリケーションは、ライブラリ品質管理：ＦＡＳＴＱＣバージョン０．１１．５、Ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ（ｃｕｔａｄａｐｔバージョン１．１０を使用）、マッピング：Ｔｏｐｈａｔ２バージョン２．１．０（Ｂｏｗｔｉｅ２バージョン２．２．６を使用）、遺伝子計数：ＨＴｓｅｑ−ｃｏｕｎｔバージョン０．６．１だった。基準化および差次的発現分析のために、ＤＥＳｅｑ２ Ｒパッケージバージョン１．１８．１入力ファイル。分析に使用された参照ゲノムは、以下のリンクからのＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ Ｏ１ ｂｉｏｖａｒ Ｅｌ Ｔｏｒ ｓｔｒ．Ｎ１６９６１のものだった。ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ａｌｌ／ＧＣＦ／０００／００６／７４５／ＧＣＦ＿０００００６７４５．１＿ＡＳＭ６７４ｖ１。計数は、以下のリンクからダウンロードした注釈ファイルを使用して実施した。ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ａｌｌ／ＧＣＦ／０００／００６／７４５／ＧＣＦ＿０００００６７４５．１＿ＡＳＭ６７４ｖ１／ＧＣＦ＿０００００６７４５．１＿ＡＳＭ６７４ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ．ｇｔｆ．ｇｚ。これらのファイルはすべてＦＴＰサーバーに認めることができ、セクション４−分析結果ファイルを参照する。

ＧＭ１−酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）−コレラ毒素検出アッセイ
ＧＭ１（モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド）を９６ウェル白色／透明底マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）マイクロタイタープレートに播種し、以下の手順で固定化した。ＧＭ１ストック溶液（ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳ（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）で希釈した。２００μＬのＧＭ１溶液を各ウェルに加え、３７℃で４〜１６時間、振とうせずにインキュベートした。プレートをＰＢＳ（×３）で洗浄した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＰＢＳに溶解して（最終濃度４ｍｇ／ｍＬ）、２００μＬのＢＳＡ−ＰＢＳを各ウェルに加え、３７℃で少なくとも４時間、振とうせずにインキュベートした。プレートをＰＢＳ（×３）で洗浄し、使用するまで冷蔵庫に保存した。試験した化合物（酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールをともに１００μＭの濃度）を添加したＶＣ１野生型株および細菌のみ添加したコントロールを、ＬＢ培地において３０℃で、通気および撹拌しながら一昼夜インキュベートした。培養物を５，０００ｒｃｆで５分間スピンダウンし、上清を採取して４ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で１：２に希釈した。２００μＬの希釈した上清を各ＧＭ１コーティングウェルに六重測定で添加し、プレートを３７℃で穏やかに振とうしながら少なくとも３０分間インキュベートした。その間に、ウサギ抗毒素血清（ＲＳＡ）ストック溶液をＢＳＡ−ＰＢＳで１：９９９に希釈した。プレートをＰＢＳ（×３）で洗浄し、２００μＬのＲＳＡ溶液を各ウェルに加え、プレートを３７℃で穏やかに振とうしながら少なくとも３０分間インキュベートした。その間に、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｈ＆Ｌアルカリホスファターゼストック溶液（ＤＤＷ中に１ｍｇ／ｍＬ）をＢＳＡ−ＰＢＳで１：１，４９９に希釈した。プレートをＰＢＳ（×３）で洗浄し、２００μＬのＩｇＧ溶液を各ウェルに加え、プレートを３７℃で穏やかに振とうしながら少なくとも３０分間インキュベートした。その間に、ルミノール作用溶液を、２つのストック溶液を調製することによって作成した。ストックＡは、ＤＭＳＯ中の２５０ｍＭルミノールを０．１ｍＬ、ＤＭＳＯ中の９０ｍＭクマル酸を４４μＬ、１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．５を１ｍＬ、およびＤＤＷを最終容量１０ｍｌまで添加することによって作成した。ストックＢは、３０％過酸化水素を６．４μｌ、１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．５を１ｍｌ、およびＤＤＷを最終容量が１０ｍｌになるまで添加することによって作成した。プレートをＰＢＳ（×３）で洗浄し、すばやくストックＡとＢの等量を混合して、ルミノール作用溶液を作成した。１００μＬのルミノール作用溶液を各ウェルに加え、プレートを１．５〜２分間振とうし、マイクロタイタープレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ，Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して発光を測定した。発光値はコントロールに対して基準化した。

マクロファージ細胞収集
腹腔マクロファージは、既に報告されている（Ｚｈａｎｇら，２００８）ようにプロトコルを使用して収集した。誘発されたマクロファージは、収集の７２時間前に３％Ｂｒｅｗｅｒチオグリコレートブロス（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）の２．５ｍｌ腹腔内投与を受けていたＷＴマウスから収集した。

インビトロＬＰＳ刺激
腹腔マクロファージ細胞（５×１０^５／ｍｌ）を、０．１μｇ／ｍｌリポ多糖（ＬＰＳ−Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ血清型０１２７：Ｂ８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、１００μＭ酢酸トリプトフォール、酢酸チロソール、ドーパミンＨＣｌ、カフェー酸、または酢酸トリプトフォールと酢酸チロソールの組み合わせの存在下で２４時間培養した。培養後、上清をＩＬ−６サイトカインの検出のために収集して、−２０℃で保存した。ＩＬ−１α検出のために、新鮮なＲＰＭＩ培地を添加し、３回解凍することによってマクロファージ溶解を誘導した。

サイトカインＥＬＩＳＡ
ＩＬ−１αおよびＩＬ−６レベルは、腹膜滲出液およびＬＰＳ刺激培養上清でＥＬＩＳＡによって測定した。サイトカインを検出するために、Ｒ＆Ｄ ＥＬＩＳＡキット（それぞれカタログ番号ＭＬＡ００およびＤＹ４０６）を製造元の説明書に従って使用した。標準曲線は、精製したＩＬ−１αまたはＩＬ−６の連続希釈を、１５ｎｇ／ｍｌの濃度で開始して作成した。

チオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイ
ＴｈＴ蛍光測定は、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１プレートリーダーで９６ウェルブラックプレートを使用して３７℃で行った。測定は、３０μＭアミロイドベータ［ａβ（１−４２）］を含む試料について、異なる濃度の酢酸トリプトフォールの非存在下または存在下で行った。凝集反応の１２０μＬ小分けをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の１０μＭ ＴｈＴと混合した。蛍光強度は、λ励起（λｅｘ）＝４４０およびλ発光（λｅｍ）＝４８５ｎｍで、３０分ごとに２４時間測定した。

表面プラスミン共鳴（ＳＰＲ）
抗アミロイドオリゴマー立体構造特異的抗体であるオリゴマーＡ１１抗体を有するＳＰＲセンサーチップを、３０μＭ ａβ（１−４２）を含む試料を用いて、異なる濃度の酢酸トリプトフォールの非存在下または存在下で試験した。

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
ＴＥＭグリッドは、３０μＭ ａβ（１−４２）を含む試料を、異なる濃度の酢酸トリプトフォールの非存在下または存在下で、３７℃で２４時間インキュベートした後に作成した。

実施例１
プロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）中の微生物の同定
本発明者らは、プロバイオティクスヨーグルト内の主要な細菌種が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓであることを発見した。プロバイオティクスヨーグルト中に存在する多くの他の属があるが、それらは通常、細菌叢の０．５％未満を示した。配列決定分析における重要な発見は、他の報告されたプロバイオティクスヨーグルト（ケフィアなど）と異なり、開示されるプロバイオティクスヨーグルト中で優勢な種（５９．０４％）であることが判明したプロバイオティクス酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓの同定だった（図１Ａ）。プロバイオティクスヨーグルトにおけるこの酵母の形態は、その単一培養形態と類似していることが認められた（図１Ｂおよび１Ｃ）。

実施例２
プロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）の微生物亜集団の組成物
本発明者らは、以下の表に要約されるように、集団Ｒ５（１９，５３９イベント、図２Ａ）の自己蛍光強度対ＢＦ詳細強度の散布図を得た。明瞭な亜集団Ｒ３、Ｒ６、およびＲ７が、他の複合亜集団（Ｒ８）と同様に、プロット（図２Ａ）で目視可能だった。異なるゲートに対して選択された異なる色は、プロットの周辺に示される画像のセットに対応した。Ｒ３（オレンジ色の点、図２Ａ）は細菌細胞（８６．１％、図２Ｂ）として定められる集団であり、Ｒ６（水色の点、図２Ａ）は真菌細胞（４．９４％、図２Ｃ）として定められる集団であり、Ｒ７（薄黄色の点、図２Ａ）は、真菌と細菌の両方の集合（７．５８％、図２Ｄ）として定められる集団だった。Ｒ８（赤紫色の点、図２Ａ）集団はより大きな集合体（図２Ｅ）であり、したがってＲ７の亜集団として定められた。

実施例３
粗抽出物の特性評価および質量分析（ＭＳ）解析
Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ単一培養粗抽出物をＬＣ−ＭＳに注入して、酵母の代謝に由来する分子を特定した。粗抽出物のクロマトグラフを培地粗抽出物と比較して、どの分子がＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ代謝に特異的に関連しているかを調べた。２つの分子がＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ粗抽出物クロマトグラムでのみ同定され（図４Ｂ）、リテンションタイム（ＲＴ）は１１．６８分および１３．８４分であり、培地抽出物クロマトグラムでは同定されなかった（図４Ａ）。分子量はＭＳによって決定され、それぞれ１８０および２０３のｍ／ｚピークが支配的だった。さらに、両方のピークは、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓを含むプロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）の粗抽出物のＬＣ−ＭＳクロマトグラムで認められた（図３Ｂ）。これらのピークは、プロバイオティクスヨーグルトを製造するための発酵に使用されたミルクの抽出物には認められなかった（図３Ａ）。

実施例４
酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールの合成および特性評価
本発明者らは、ＬＣ−ＭＳによって検証された、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ粗抽出物から質量１８０および２０３を有する２つの分子を単離している（図５）。その後、本発明者らは両方の分子を化学的に合成し、ＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲを使用して、それぞれ重量および構造分析について検証した（図６および７）。

実施例５
ＱＳシステムにおけるヨーグルト粗抽出分子の効果
ＱＳ活性化活性は、誘導因子生物発光シグナルのみとの基準化によって計算した。２０３分子を含む粗抽出物は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（図８Ａ）およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（図８Ｂ）においてＱＳを活性化した。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａでは、粗抽出２０３分子は低容量でＱＳを活性化し、高容量でＱＳを阻害した（図８Ｃおよび８Ｄ）。１８０分子は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａにおいて、低容量でＱＳを活性化し、高容量でＱＳを完全に阻害し２４．４±２．４μＭのＩＣ_５０を有する（図９）。

実施例６
真菌増殖におけるプロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）の効果
真菌生存におけるプロバイオティクスヨーグルトの効果をさらに調査した。プロバイオティクスヨーグルトを、真菌Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍが培養されたポテトデキストロース寒天プレートに補充した。プロバイオティクスヨーグルト補充した寒天プレート上で培養されたＳ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍは、１２日間（図１４Ａ）または１９日間（図１４Ｂ）もの間阻害されることが示された。同様の阻害効果は、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ（図１５）およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ（図１６）の播種後２２日間もの間観察されたが、より低い程度だった。

実施例７
合成酢酸トリプトフォール分子はバイオフィルム生成に影響を及ぼす
本発明者らは、いくつかのタイプの細菌によるバイオフィルムの形成における合成酢酸トリプトフォールの効果を調べた。酢酸トリプトフォールは、２０μＭで加えられた場合、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおけるバイオフィルム形成に影響を及ぼさないようだった（図１１）。それに反し、５０μＭの酢酸トリプトフォールは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（図１２）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（図１３）の両方においてバイオフィルム形成に有意な影響を有した。

実施例８
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａでのＱＳにおける酢酸チロソールおよび酢酸トリプトフォールの相乗効果
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅでのＱＳの活性化における酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールの相乗効果が認められた（図１７）。酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールの組成物が１：１の比で一緒に投与され、１１．６±０．９μＭのＩＣ_５０を有した。

さらに、酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールの様々な組み合わせを、変異したＭＭ９２０ Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株（ΔＣｑｓＡ ΔｌｕｘＱ）で調べた。変異したＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅによって生成されたバイオフィルム（図１８Ａおよび１８Ｅ）は、自己誘導因子のみを添加して生成されたそれぞれのバイオフィルム（図１８Ｂおよび１８Ｆ、クオラムセンシングを促進し、バイオフィルム形成を妨害した）よりもはるかに厚く、密度が高かった。酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソール（図１８Ｄおよび１８Ｈ）、ならびに特に３つの化合物が一緒（図１８Ｃおよび１８Ｇ）は、通常のバイオフィルム成長の破壊に有意な相乗効果を示し、異なるバイオフィルム形態をもたらした。

実施例９
合成酢酸トリプトフォールはＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ毒素の負荷を低減させる
次いで、本発明者らは、合成酢酸トリプトフォールがＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ毒素の生成レベルに影響を与えるか調べた。実際、合成酢酸トリプトフォールは、用量依存的にＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ毒素レベルを低減させることが認められた（図１９）。

実施例１０
合成酢酸チロソール分子はバイオフィルム生成に影響を及ぼす
本発明者らは、合成酢酸チロソールがＶｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａに及ぼす効果を調べた。酢酸チロソールは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのバイオフィルムおよび毒素の生成を阻害することが認められた。さらに、酢酸チロソールは、ＱＳ関連遺伝子の発現に影響を与えることが示された（図２１）。

実施例１１
細菌増殖およびバイオフィルム生成におけるプロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）の効果
細菌増殖におけるプロバイオティクスヨーグルトの効果をさらに調べた。ケフィア粗抽出物は、試験した３つの細菌株すべてのＱＳ経路を妨害した。ＣＡＩ−１自己誘導因子を合成する能力を欠くｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ＭＭ９２０変異株の場合、ケフィア粗抽出物は有意なクオラムセンシング阻害（ＱＳＩ）効果を示し、ケフィア粗抽出物希釈と、この株におけるＱＳの阻害を反映する生物発光の減衰との間に直接的な相関関係が明らかだった（図２２Ａ）。さらに、ケフィア抽出物は、ＱＳ経路が３−オキソ−オクタニル自己誘導因子によって誘導された、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａ１３６において濃度依存的なＱＳＩ効果を有したことを示した（図２２Ｂ）。興味深いことに、ＤＰＤ自己誘導因子を利用したＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ ＭＭ３０生物発光アッセイの結果は、ケフィア粗抽出物がすべての希釈でクオラムセンシング活性化（ＱＳＡ）効果を誘導したことを示すように思われた（図２２Ｃ）。生物発光アッセイは、ケフィア抽出物中の物質が、異なる細菌のＱＳ経路（阻害または活性化）に影響を与えることを証明し（図２２Ａ〜２２Ｃ）、本発明者らは、ケフィア抽出物が病原性細菌によって組み立てられるバイオフィルムマトリックスの形成に影響を与えるかさらに調査した。実際、粗ケフィア抽出物は、顕著な病原性細菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのバイオフィルム生成を有意に阻害することが明らかにされた（図２２Ｄ）。具体的には、結果は、各細菌種のバイオフィルム体積が、バイオフィルム層の三次元共焦点顕微鏡画像の画像分析によって計算され、ケフィアと共培養した細菌が、未処理の細菌と比較されたとき、約３０％〜４０％低減したことを示した（図２２Ｄ）。重要なことに、細胞生存率アッセイは、ケフィア粗抽出物が細菌細胞の増殖および生存率に悪影響を及ぼさなかったことを確認し（図２０）、したがって、ケフィアによるバイオフィルム発達の低減に寄与する可能性のある要因として細胞間情報伝達の破壊を示している。

実施例１２
Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅのバイオフィルムにおける酢酸トリプトフォールの効果
本発明者らは、ＱＳ自己誘導因子ＣＡＩ−１をコードするオリゴヌクレオチド配列を欠く発光性Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅレポーター株であるＭＭ９２０を使用して、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのバイオフィルム−その増殖および病原性での重要な成分における酢酸トリプトフォールの効果を試験した。

Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＶＣ１ ＷＴ（図２３Ａｉおよび２３Ａｉｉ）およびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＭＭ９２０変異体（図２３Ａｉｉｉおよび２３Ａｉｖ）のバイオフィルムマトリックスを、増殖培地において酢酸トリプトフォールの添加または無添加で２４時間増殖させ、ＢａｃＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｄｅａｄ／Ｌｉｖｅキットを使用して染色した。蛍光顕微鏡分析は、化合物の抗ＱＳ効果と矛盾することなく、バイオフィルムの形態および組織における酢酸トリプトフォールの有意な効果を証明した（例えば、図１７Ｂ）。具体的には、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＶＣ１ ＷＴの場合、コントロールのバイオフィルムマトリックス（酢酸トリプトフォールの添加なし）は薄く、不均一であるように現れ（図２３Ａｉ）、このバイオフィルムの外観は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＶＣ１ ＷＴ株における機能性ＱＳ経路と、この細菌によるバイオフィルムマトリックスの集合との間の相互関係に関する最近の報告に帰される。さらに実証されているのは、増殖中の細菌と酢酸トリプトフォール（１００μＭ、図２３Ａｉｉ）とのインキュベーションで形成される非常に密度の高いバイオフィルムであり、重要なＱＳ ＣＡＩ−１カスケードを阻害した。バイオフィルムの組み立てにおける酢酸トリプトフォールの同様の劇的な効果が、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＭＭ９２０変異体の場合に明らかだった（図２３Ａｉｉｉおよび２３Ａｖ）。変異体細菌のみのバイオフィルムは、ＣＡＩ−１ ＱＳカスケードの欠如によって、厚くて高い密度で出現した（図２３Ａｉｉｉ）。細菌増殖培地へのＣＡＩ−１自己誘導因子の添加は、ＱＳおよびバイオフィルム完全性の付随する破壊を再導入した（図２３Ａｉｖ）。しかしながら、酢酸トリプトフォールとＣＡＩ−１の同時添加は、密度の高い均一なバイオフィルム層の再形成を引き起し（図２３Ａｖ）、ＣＡＩ ＱＳ経路の阻害を反映した（図２３Ａｉ）。

定量的クリスタルバイオレット（ＣＶ）アッセイの適用を通じて実行されたバイオフィルムの体積分析は、図２３Ｂに示され、図２３Ａにおける蛍光顕微鏡結果を裏付け、酢酸トリプトフォールによるＱＳ阻害に関する追加の証拠を提供した。確かに、高細胞密度でのＱＳの活性化は低減したバイオフィルム形成につながるという事実を考えると、酢酸トリプトフォールの添加時に記録されたバイオフィルム体積の増加は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅにおけるＱＳ経路の直接的な阻害を裏付ける。

酢酸トリプトフォールによって潜在的に調節される遺伝子を特定するために、高細胞密度条件で、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＶＣ１ ＷＴの遺伝子発現を評価するリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）分析を実行した（図２３Ｃ）。ＲＴ−ｑＰＣＲの結果は、遺伝子発現経路、特にＱＳ、バイオフィルム、および毒性調節に関連する遺伝子における１００μＭの濃度の酢酸トリプトフォールの効果について劇的な証拠を提供し、本化合物によって誘発される表現型の変化を説明した（図２３Ａ〜２３Ｂ）。具体的には、ＲＴ−ｑＰＣＲデータは、酢酸トリプトフォールによるｈａｐＲの有意な下方調節を明らかにする（図２３Ｃ）。この結果は注目に値するものであり、ｈａｐＲ抑制は低細胞密度条件で発生し、実際、ｈａｐＲの下方調節を通じて低細胞密度を模倣すると、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅを酢酸トリプトフォールとインキュベートしたときに認められるバイオフィルム生成の増強を説明し得るためである（図２３Ａ〜２３Ｂ）。この解釈は、酢酸トリプトフォールによるｖｐｓＴの顕著な上方調節によって裏付けられ（図２３Ｃ）、バイオフィルム形成に必要とされるこの遺伝子の発現は、低細胞密度条件で増強される。さらに、酢酸トリプトフォールはまた、ｈａｐＲによって調節される下流遺伝子であるｈａｐＡのより低い発現をもたらした（図２３Ｃ）。ｈａｐＡは、体液生成および下痢など、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａによって誘発される様々な病原性効果に関連しているため、ｈａｐＡの抑制は、実際には、本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）の潜在的な治療効果を示し得る。重要なことに、酢酸トリプトフォールによってＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの低細胞密度を模倣することは、病原性の増強につながる遺伝的カスケードを促進すると予想される。実際、ＲＴ−ｑＰＣＲ実験は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ毒素生成に関連するａｐｈＡの上方調節を示した（図２３Ｃ）。しかしながら、驚くべきことに、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、ａｐｈＡ誘導した病原性カスケードの下流にある病原性誘導遺伝子ｃｔｘＡは、実際には酢酸トリプトフォールによって有意に抑制されたことを明らかにする（図２３Ｃ）。この結果の表現型の側面を評価するために、本発明者らは、酢酸チロソールが用量依存的にＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅによる毒素生成の低減をもたらすことを測定して示した（図１９）。

実施例１３
炎症性腸疾患の治療におけるプロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）
実験概要：
研究期間（各サイクル）：１０日、群サイズ：ｎ＝４または６、群数＝１０、動物：試験開始時に６〜８週齢の雄黒色マウス、モデル：飲用水への２．５％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）補充によってマウスに誘発された大腸炎／クローン病。ＤＳＳ−水は７日間毎日交換した。

処理：
試験項目：プロバイオティクスヨーグルト、または最終濃度２５μＭ（反復２）もしくは５０μＭ（反復３）の両方の分子の混合物（酢酸チロソールおよび酢酸トリプトフォール）を、１日目から７日目まで１日１回、以下に説明するように経口経路（強制胃管）で送達した。

罹患率および死亡率−１日１回、臨床徴候−１日おき、体重−初日およびその後１日おき、直腸出血および便粘性スコア化（以下の表２に示される）−初日（０日目またはベースライン）および７日目。

終了：
サイトカイン用の採血、臨床スコア化（表２による）、動物は１０日目に屠殺し、結腸を切除して、計測して重量を測定し、結腸を１０％緩衝ホルマリンで固定し、遠位結腸の解剖学的領域を組織学のためにパラフィン包埋した。組織学的試料は、組織病理学分析のためにヘマトキシリン＆エオシンで染色し、腸の内層からの陰窩細胞の喪失および炎症細胞の結腸への浸潤に基づいてスコア化した。

本発明者らは、本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトおよびそこで同定された分子が、ネズミ炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデルにおける体重減少を低減させることを示した。ＤＳＳ＋Ｗと比較して有意に低減した体重減少は、Ｙ＋ＤＳＳ＋Ｙ、ＤＳＳ＋Ｙ、およびＤＳＳ＋分子（２５μＭまたは５０μＭのいずれか）によって処理されたマウスで認められた（図２４）。さらに、市販のヨーグルト（Ｙｃ＋ＤＳＳ＋ＹｃまたはＤＳＳ＋Ｙｃ）を受けた群では、有意な体重減少効果はなかった。

本発明者らは、本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトおよびそこで同定された分子が、ネズミＩＢＤモデルにおいて結腸短縮を低減させることを示した（図２５）。結腸の長さは、実験の終了時点で直腸から盲腸まで測定した。結腸の短縮は、ＤＳＳで処理され、ＤＳＳの前に本明細書に開示されたプロバイオティクスヨーグルトを与えられたマウス（Ｙ＋ＤＳＳ＋Ｙ）の結腸と比較して、ＤＳＳで処理されたマウス（ＤＳＳ＋Ｗ）で観察された。さらに、統計的に有意な低減した結腸長の短縮は、本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトで同定された分子（５０μＭ）で処理されたマウスにおいて観察された。

本発明者らはさらに、本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトおよびそこで同定された分子の疾患活動性指数（ＤＡＩ）における効果を調べた。結果は、ＤＳＳの前にヨーグルトによる（Ｙ＋ＤＳＳ＋Ｙ、図２６Ａ）、または本明細書に開示されたプロバイオティクスヨーグルトで同定された分子の５０μＭの濃度による（ＤＳＳ＋分子、図２６Ｂ）、いずれかで処理されたマウスにおける臨床スコアの有意な減少を示した。

結腸の組織病理学的切片は、すべてのＤＳＳ処置マウスにおいて、腸の内層からの陰窩細胞の喪失、および結腸への炎症性細胞の浸潤を伴う強い組織損傷を明らかにした（図２７Ａ）。ＤＳＳ前にヨーグルトを与えられたマウス（Ｙ＋ＤＳＳ＋Ｙ）の結腸では、組織構造は最小限の炎症および結腸組織修復の初期兆候のみ（丸で囲んだ、図２７Ｂ）を伴って維持された。

実施例１４
皮膚潰瘍の治療におけるプロバイオティクスヨーグルト（例えば、ケフィア）の投与
本発明者らは、リーシュマニア症潰瘍は、本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトを使用して治療できることを示した。簡単に説明すると、治癒はヨーグルト混合物の適用後に観察され、適用は、患者を助けることに失敗した３ヶ月の従来治療の後に続けた。従来治療には、ＥＳＲＡＣＡＩＮ注射による局所麻酔後のＰＥＮＴＯＳＴＡＭ注射が含まれた。さらに、厚い走り書きのために、患者はＳＡＬＩＫＡＲＥＮを塗布した。ヨーグルト治療では、患者はプロバイオティクスヨーグルトをすべての潰瘍に塗布し、１日２回（朝と晩）潰瘍に包帯をした。結果は、治療の１１〜１４日後に皮膚リーシュマニア症の加速した治癒を示した（図２８）。

さらに、縫合が切開の癒合のために必要とされたが、傷害から２４時間以上経過したために縫合が行われなかった症例では、プロバイオティクスヨーグルトが適用され、創傷治癒は最初の適用後４日で早くも明らかだった。（図２９）。

実施例１５
酢酸トリプトフォールおよび酢酸チロソールの抗炎症活性
本発明者らは、炎症誘発性サイトカインであるＩＬ−１αおよびＩＬ−６の両方の生成が、酢酸トリプトフォール、酢酸チロソール、またはその両方の存在下で培養されたマクロファージにおいて劇的に減少したことを示した（図３０）。他の４−エチル−フェノール誘導体、ドーパミンＨＣｌ、およびカフェー酸は、匹敵する結果を示した。

実施例１６
酢酸トリプトフォールの抗神経変性活性
本発明者らは、一般的なインビトロ神経変性モデルにおいて、酢酸トリプトフォールを含む組成物の活性を検査した。本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトから抽出された分子の混合物、および酢酸トリプトフォールの両方が、１２時間のインキュベーション後にアミロイドベータ細線維化を効果的に低減させたことが示された（図３１）。さらに、酢酸トリプトフォールによるアミロイドベータの阻害は、用量依存的であることが示された（図３２）。

本発明者らはさらに、本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトの粗抽出物または酢酸トリプトフォールのアミロイドベータ細線維化における効果を２４時間のインキュベーション期間後に検査した。本明細書に開示されるプロバイオティクスヨーグルトの粗抽出物の存在下で、細線維化生成は完全に阻害された（図３３Ｂ）。細線維化はまた、酢酸トリプトフォールの存在下で、用量依存的に有意に阻害された（図３３Ｃ〜３３Ｄ）。

本発明の特定の特徴を本明細書で説明してきたが、多くの修正、置換、変更、および均等物が、当業者には着想されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨に含まれる、そのようなすべての修正および変更を網羅するように意図されることを理解されたい。

Claims (28)

1. ａ．トリプトフォール誘導体と、
   ｂ．４−エチル−フェノール誘導体と、
   少なくとも１つの薬学的に許容される担体と、を含み、前記トリプトフォール誘導体および前記４−エチル−フェノール誘導体が、１０：１〜１：１０ｗ／ｗの比にある、組成物。
2. 前記トリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体が、前記組成物内に少なくとも１μＭの濃度で各々存在する、請求項１に記載の組成物。
3. 前記トリプトフォール誘導体が、前記組成物内に少なくとも０．１μＭの濃度である、請求項１または２のいずれか一項に記載の組成物。
4. 前記トリプトフォール誘導体および前記４−エチル−フェノール誘導体が、２：１（ｗ／ｗ）〜１：２（ｗ／ｗ）の範囲のｗ／ｗ比にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記トリプトフォール誘導体が、酢酸トリプトフォールである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記４−エチル−フェノール誘導体が、酢酸チロソール、ドーパミンＨＣｌ、およびカフェー酸からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
7. Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓと、少なくとも１つのプロバイオティクス微生物と、をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 微生物活性を低減させることと、炎症性疾患およびアミロイド凝集体関連疾患を治療することと、のうちのいずれか１つにおける使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 微生物混合物であって、
   ａ．Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓと、
   ｂ．少なくとも１つのプロバイオティクス微生物と、を含み、
   前記微生物混合物が、少なくとも３％のＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓを含む、微生物混合物。
10. 前記プロバイオティクス微生物が、プロバイオティクス細菌である、請求項９に記載の微生物混合物。
11. 前記プロバイオティクス細菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃからなる群から選択される、請求項１０に記載の微生物混合物。
12. 前記混合物が、培地に懸濁されている、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の微生物混合物。
13. 前記培地が、ミルクである、請求項１２に記載の微生物混合物。
14. 前記混合物が、ケフィアである、請求項１３に記載の微生物混合物。
15. 前記混合物が、トリプトフォール誘導体、４−エチル−フェノール誘導体、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の微生物混合物。
16. 前記トリプトフォール誘導体および前記４−エチル−フェノール誘導体が、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓによって生成される、請求項１５に記載の微生物混合物。
17. 食品における使用のための、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の微生物混合物。
18. 微生物活性を低減させることと、炎症性疾患を治療することと、アミロイド凝集体関連疾患を治療することと、のうちのいずれか１つにおける使用のための、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の微生物混合物。
19. 炎症性疾患、感染症、およびアミロイド凝集体関連疾患からなる群から選択される疾患の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量のトリプトフォール誘導体および４−エチル−フェノール誘導体から選択される少なくとも１つの分子、ならびに請求項９〜１８いずれか一項に記載の微生物混合物のうちのいずれか１つを含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
20. 前記感染症が、微生物、それに由来するバイオフィルム、またはその両方の負荷を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記微生物が、ウイルス、真菌、寄生虫、酵母、細菌、および原生動物からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記真菌が、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、およびＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａからなる群から選択される属に属する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記細菌が、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからなる群から選択される属に属する、請求項２１に記載の方法。
24. 前記組成物が、０．１〜５００μＭの半数阻害濃度（ＩＣ_５０）を有する、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記対象が、炎症性疾患、感染症、およびアミロイド関連疾患からなる群から選択される少なくとも１つの疾患に罹患している、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記アミロイド凝集体関連疾患が、神経変性疾患である、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の方法。
    
    

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