CN101503723A - 一种利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法，即用核酸酶P1酶解核糖核酸，结合酶解反应器及超滤装置和纳滤装置的反应分离耦合技术制备核苷酸。本发明方法利用超滤装置将酶解产物与RNA相分离，克服核苷酸生产过程中的产物抑制作用，提高了RNA的酶解率和核苷酸浓度，同时利用纳滤技术回收利用超滤过程流失的寡核苷酸，进一步提高了RNA的酶解率。本发明方法可实现产物的连续化分离生产，缩短了工艺流程，突破了化学平衡的限制，大大提高了酶的利用率以及反应收率，减少了能耗，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物催化和生物分离技术领域，涉及一种利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法。
背景技术
核苷酸及其衍生物是重要的生物化工原料，已在遗传工程、医药、食品、农业生产和科研领域中得到了广泛的应用。它一般可通过酵母提取核糖核酸(RNA)，然后用核酸酶P1酶解而得到。
目前一般在间歇式反应釜中将核酸酶P1和RNA混和，搅拌加热的情况下酶解RNA，再用沉淀剂将酶P1和RNA沉淀使核苷酸分离出来(CN1049521A)。此法由于没有将酶解得到的核苷酸即时分离出去，而产生了一定的产物抑制效应，使得RNA的收率只有50％。酶解的核苷酸浓度也较低，只有12g/L左右(CN1286259A)。这样能耗相对较大，生产成本偏高。
中国科学院大连化学物理研究所(CN1121112A)报道了一种由RNA连续酶水解制备核苷酸的方法，将核酸酶P1首先注入超滤膜反应器，再连续泵入RNA缓冲液，收集渗透液并经过分离、浓缩、结晶得到核苷酸产品。经过第一个膜反应器时RNA水解率为80％，经过第二个膜反应器时RNA水解率为90％。因此解除了产物抑制的作用，提高了RNA的酶解率和核苷酸的浓度。但是由于核酸酶P1既是内切酶又是外切酶，因而在酶解得到单核苷酸的同时，也得到会得到一些小片段的寡核苷酸，它们在超滤的过程中有时也会随着单核苷酸分离出去，这样造成了收率的降低。
因此，为了克服核苷酸生产过程中的产物抑制作用，提高RNA的酶解率和核苷酸浓度，以及核苷酸的收率，最终降低能耗和生产成本，我们有必要对核苷酸生产过程的装置进行改造。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法，以克服核苷酸生产过程中的产物抑制作用，并提高RNA的酶解率及核苷酸浓度。
本发明所述的酶解率是生产工艺所得的总核苷酸质量与反应原料RNA质量的比值。
为解决上述技术问题，本发明的思路为：
1.为突破反应平衡的限制，解除核苷酸产物的抑制作用，提高RNA的酶解率和核苷酸浓度，本发明将反应与分离耦合技术应用于RNA的酶解。自行设计高效的酶膜反应器(酶解反应器和超滤膜组合)，结合催化过程与膜分离过程，消除了产物抑制。
2.为回收超滤流失的寡核苷酸，提高RNA的酶解率，本发明将酶膜反应器和纳滤膜分离过程集成，使得回收的寡核苷酸进行重复酶解，从而提高RNA的酶解率。
具体技术方案如下：
一种利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法，用核酸酶P1酶解核糖核酸，结合酶解反应器及超滤装置和纳滤装置的反应分离耦合技术制备核苷酸。
具体来说，就是在酶解反应器中，用核酸酶P1酶解核糖核酸，利用超滤装置将寡核苷酸和核苷酸分离出来，未分解的核糖核酸和酶返回酶解反应器继续反应，分离出的寡核苷酸和核苷酸再经纳滤装置将核苷酸分离出来，寡核苷酸返回酶解反应器继续反应。
其中，所述的核酸酶P1的浓度为100～10000μ/mL，优选3000～5000μ/mL。
其中，所述的核糖核酸，其浓度为20～200g/L。
其中，所述的酶解反应温度为50～80℃，反应pH值为4.0～7.0。
其中，所述的超滤膜为聚砜超滤膜，膜截留分子量为5000～10000道尔顿。超滤膜为中空纤维式膜、板框式膜、卷式膜或管式膜。
其中，所述的纳滤膜为聚砜纳滤膜，膜截留分子量为300～1000道尔顿。纳滤膜为中空纤维式膜、板框式膜、卷式膜或管式膜。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种利用反应分离耦合制备核苷酸的方法，即将酶解反应器与超滤装置及纳滤装置进行耦合，利用超滤装置将酶解产物与RNA相分离，克服核苷酸生产过程中的产物抑制作用，提高了RNA的酶解率和核苷酸浓度，同时利用纳滤技术回收利用超滤过程流失的寡核苷酸，进一步提高了RNA的酶解率。本发明方法可实现产物的连续化分离生产，缩短了工艺流程，突破了化学平衡的限制，大大提高了酶的利用率以及反应收率，减少了能耗，降低了生产成本。
附图说明
图1是本发明的核苷酸生产装置示意图。
其中，1为RNA储罐；2为酶解反应器；3为超滤装置；4为纳滤装置；5为核苷酸储罐；6a，6b为泵；7为压力表；8为阀门。
具体实施方式：
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
如图1所示，本发明的利用反应分离耦合技术制备核苷酸的装置，包括RNA储罐1、酶解反应器2、超滤装置3、纳滤装置4、核苷酸储罐5，RNA储罐1经泵6a与酶解反应器2相连，酶解反应器2经泵6b与超滤装置3相连；超滤装置3的小分子通路与纳滤装置4相连，超滤装置3的大分子通路与酶解反应器2相连，纳滤装置4的小分子通路与核苷酸储罐5相连，纳滤装置4的大分子通路与酶解反应器2相连。RNA经酶解后通过超滤装置3使得核苷酸和寡核苷酸分离出来，未反应的RNA和酶返回酶解反应器2中继续反应，分离出的核苷酸和寡核苷酸再通过纳滤装置4将核苷酸分离出来注入核苷酸储罐5，纳滤残液(寡核苷酸)返回酶解反应器2中继续反应。核苷酸储罐5中的核苷酸可供下一步分离操作。
实施例1：
将浓度为3000μ/mL的核酸酶P1置入一5L的酶解反应器中，用蠕动泵连续泵入浓度为20g/L，pH5.0的RNA溶液进行酶解反应，控制酶解温度70℃，RNA溶液泵入流速20mL/min。反应1小时后开始把反应液泵入聚砜中空纤维超滤膜内超滤，超滤膜截留分子量为10000道尔顿，流速30mL/min，压力不超过0.3Kg/cm2。超滤液再流入聚砜中空纤维纳滤膜内进行纳滤分离，纳滤膜截留分子量为1000道尔顿，滤出液即为核苷酸，流入储罐收集。而超滤和纳滤残留液回流入反应器中继续进行酶解。总反应时间为4小时，最后RNA酶解率达到96％，核苷酸浓度达到6.2g/L。
实施例2：
将浓度为3000μ/mL的核酸酶P1置入一50L的反应器中，用蠕动泵连续泵入浓度为50g/L，pH6.0的RNA溶液进行酶解反应，控制酶解温度65℃，RNA溶液泵入流速50mL/min。反应一小时后开始把反应液泵入聚砜中空纤维超滤膜内超滤，超滤膜截留分子量为7000道尔顿，流速70mL/min，压力不超过0.5Kg/cm2。超滤液再流入聚砜中空纤维纳滤膜内进行纳滤分离，纳滤膜截留分子量为300道尔顿，滤出液即为核苷酸，流入储罐收集。而超滤和纳滤残留液回流入反应器中继续进行酶解。总反应时间为4小时，最后RNA酶解率达到95％，核苷酸浓度达到15.3g/L。
实施例3：
将浓度为3500μ/mL的核酸酶P1置入一100L的反应器中，用蠕动泵连续泵入浓度为100g/L，pH7.0的RNA溶液进行酶解反应，控制酶解温度75℃，RNA溶液泵入流速70mL/min。反应一小时后开始把反应液泵入聚砜中空纤维超滤膜内超滤，超滤膜截留分子量为7000道尔顿，流速100mL/min，压力不超过0.5Kg/cm2。超滤液再流入聚砜中空纤维纳滤膜内进行纳滤分离，纳滤膜截留分子量为400道尔顿，滤出液即为核苷酸，流入储罐收集。而超滤和纳滤残留液回流入反应器中继续进行酶解。总反应时间为4小时，最后RNA酶解率达到93％，核苷酸浓度达到27.5g/L。
实施例4：
将浓度为4000μ/mL的核酸酶P1置入一20L的反应器中，用蠕动泵连续泵入浓度为150g/L，pH6.0的RNA溶液进行酶解反应，控制酶解温度70℃，RNA溶液泵入流速40mL/min。反应一小时后开始把反应液泵入聚砜中空纤维超滤膜内超滤，超滤膜截留分子量为5000道尔顿，流速50mL/min，压力不超过0.5Kg/cm2。超滤液再流入聚砜中空纤维纳滤膜内进行纳滤分离，纳滤膜截留分子量为300道尔顿，滤出液即为核苷酸，流入储罐收集。而超滤和纳滤残留液回流入反应器中继续进行酶解。总反应时间为4小时，最后RNA酶解率达到90.5％，核苷酸浓度达到38.2g/L。
比较例1：
将浓度为3000μ/mL的核酸酶P1置入一50L的反应器中，用蠕动泵连续泵入浓度为50g/L，pH6.0的RNA溶液进行酶解反应，控制酶解温度65℃，RNA溶液泵入流速50mL/min。反应时间为4小时，最后RNA酶解率为80％，核苷酸浓度达到11.8g/L。
比较例2：
将浓度为3500μ/mL的核酸酶P1置入一100L的反应器中，用蠕动泵连续泵入浓度为100g/L，pH7.0的RNA溶液进行酶解反应，控制酶解温度75℃，RNA溶液泵入流速70mL/min。反应一小时后开始把反应液泵入聚砜中空纤维超滤膜内超滤，超滤膜截留分子量为7000道尔顿，流速100mL/min，压力不超过0.5Kg/cm2。滤出液即为核苷酸，流入储罐收集。总反应时间为4小时，最后RNA酶解率达到87％，核苷酸浓度达到20.8g/L。
Claims (10)
1、一种利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法，其特征在于该方法用核酸酶P1酶解核糖核酸，结合酶解反应器及超滤装置和纳滤装置的反应分离耦合技术制备核苷酸。
2、根据权利要求1所述的利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法，其特征在于在酶解反应器中，用核酸酶P1酶解核糖核酸，利用超滤装置将寡核苷酸和核苷酸分离出来，未分解的核糖核酸和酶返回酶解反应器继续反应，分离出的寡核苷酸和核苷酸再经纳滤装置将核苷酸分离出来，寡核苷酸返回酶解反应器继续反应。
3、根据权利要求2所述的利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法，其特征在于所述的核酸酶P1的浓度为100～10000μ/mL。
4、根据权利要求3所述的利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法，其特征在于所述的核酸酶P1的浓度为3000～5000μ/mL。
5、根据权利要求2所述的利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法，其特征在于所述的核糖核酸，其浓度为20～200g/L。
6、根据权利要求2所述的利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法，其特征在于所述的酶解反应温度为50～80℃，反应pH值为4.0～7.0。
7、根据权利要求2所述的利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法，其特征在于所述的超滤膜为聚砜超滤膜，膜截留分子量为5000～10000道尔顿。
8、根据权利要求2或7所述的利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法，其特征在于所述的超滤膜为中空纤维式膜、板框式膜、卷式膜或管式膜。
9、根据权利要求2所述的利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法，其特征在于所述的纳滤膜为聚砜纳滤膜，膜截留分子量为300～1000道尔顿。
10、根据权利要求2或9所述的利用反应分离耦合制备核苷酸的方法，其特征在于所述的纳滤膜为中空纤维式膜、板框式膜、卷式膜或管式膜。
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|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20090812 |