WO2021192683A1 - β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物、並びにその品質評価方法および酵素反応性の判定方法 - Google Patents

β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物、並びにその品質評価方法および酵素反応性の判定方法 Download PDF

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nmn
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reactivity
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lactate dehydrogenase
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由葵子 竹谷
寛和 松川
美子 砂原
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オリエンタル酵母工業株式会社
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)

Definitions

  • the present invention relates to a compound consisting of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof, and a method for evaluating the quality thereof and a method for determining enzyme reactivity.
  • ⁇ -NMN The ⁇ -nicotinamide mononucleotide
  • ⁇ -NMN has an effect of improving insulin secretory capacity in aged mice and a dramatic improvement in insulin sensitivity and secretion in a mouse model of type 2 diabetes caused by a high-fat diet and aging (for example,). It has been reported that it is involved in the control of circadianism (see, for example, Patent Document 2), and has an effect of significantly enhancing the mitochondrial function of aged muscles (see Patent Document 1).
  • ⁇ -NMN is useful for improving or preventing symptoms of various age-related diseases such as obesity, increased blood lipid concentration, decreased insulin sensitivity, decreased memory, and deterioration of eye function such as macular degeneration. It has also been reported (see, for example, Patent Document 3). Furthermore, administration of ⁇ -NMN is expected to have an anti-aging effect by increasing the amount of NAD + in the living body and activating the sirtuin gene, thereby suppressing / delaying the decline in physical function associated with aging of the living body. (See, for example, Patent Document 4).
  • the present inventors also refer to ⁇ -nicotinamide mononucleotides produced by themselves and ⁇ -NMN products available on the market as high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as “HPLC”). ), Despite the high purity measured in (), and even if crystallized to increase the purity, it was found that the same effect could not be obtained even at the same dose when administered to a living body. That is, since there are ⁇ -NMNs having the same purity as measured by HPLC but different physiological activities, it is necessary to provide ⁇ -NMNs having higher physiological activities.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the present invention is a compound consisting of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof, which has high purity and high enzymatic reactivity as measured by HPLC, and thus has high physiological activity.
  • a method for evaluating the quality of a compound consisting of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof, and a method for determining enzyme reactivity is a compound consisting of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof, which has high purity and high enzymatic reactivity as measured by HPLC, and thus has high physiological activity.
  • the present inventors have different physiological activities even if the purity measured by HPLC is the same, that is, the enzymatic reactivity of ⁇ -NMN in these products.
  • the present invention has been completed by finding that the above is due to the difference.
  • the present invention is based on the above-mentioned findings of the present inventors, and the means for solving the above-mentioned problems are as follows. That is, ⁇ 1> A compound consisting of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof, having a purity of 95% or more as measured by HPLC and having a reactivity with lactate dehydrogenase of 30. It is a compound characterized by being a unit or more. ⁇ 2> The compound according to ⁇ 1>, which has a purity of 98% or more as measured by HPLC and a reactivity with lactate dehydrogenase of 33 units or more.
  • ⁇ 3> The compound according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, which is in crystalline form.
  • ⁇ 4> The compound according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> above, wherein the lactate dehydrogenase is a lactate dehydrogenase derived from skeletal muscle of mammals.
  • the lactate dehydrogenase is the compound according to ⁇ 4>, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ 6> The compound according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, which does not substantially contain nicotinamide dinucleotide.
  • ⁇ 7> A method for evaluating the quality of a compound consisting of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a method comprising assessing the quality of a compound consisting of.
  • ⁇ 8> A method for determining the enzymatic reactivity of a compound consisting of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof with the purity as measured by HPLC being 95% or more and the reactivity to lactate dehydrogenase being 30 units or more as an index. It is a method characterized by comprising determining the reactivity of lactate dehydrogenase to lactate dehydrogenase.
  • ⁇ - that can solve the above-mentioned problems in the past, achieve the above-mentioned object, have high purity when measured by HPLC, and show high enzymatic reactivity, thereby having high physiological activity.
  • a method for evaluating the quality of a compound consisting of a nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof, and a method for evaluating the quality of a compound consisting of a ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof, and a method for determining enzyme reactivity. can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing the reaction between ⁇ -NMN and lactate dehydrogenase.
  • FIG. 2 is a graph showing the enzyme reactivity of the ⁇ -NMN compound of one example of the present invention measured in Test Example 1 with the lactate dehydrogenase (SEQ ID NO: 1) of a commercially available ⁇ -NMN product.
  • FIG. 3A is a graph showing the enzymatic reactivity of the ⁇ -NMN compound of one example of the present invention measured in Test Example 3 and the commercially available ⁇ -NMN product with lactate dehydrogenase (LDH) 1 (SEQ ID NO: 4) derived from pigs. Is.
  • FIG. 1 is a diagram showing the reaction between ⁇ -NMN and lactate dehydrogenase.
  • FIG. 2 is a graph showing the enzyme reactivity of the ⁇ -NMN compound of one example of the present invention measured in Test Example 1 with the lactate dehydrogenase (SEQ ID NO: 1) of
  • FIG. 3B is a graph showing the enzymatic reactivity of the ⁇ -NMN compound of one example of the present invention measured in Test Example 3 with human-derived lactate dehydrogenase (LDH) 1 (SEQ ID NO: 2) of a commercially available ⁇ -NMN product.
  • FIG. 3C is a graph showing the enzymatic reactivity of the ⁇ -NMN compound of one example of the present invention measured in Test Example 3 with human-derived lactate dehydrogenase (LDH) 5 (SEQ ID NO: 3) of a commercially available ⁇ -NMN product. Is.
  • FIG. 3B is a graph showing the enzymatic reactivity of the ⁇ -NMN compound of one example of the present invention measured in Test Example 3 with human-derived lactate dehydrogenase (LDH) 1 (SEQ ID NO: 2) of a commercially available ⁇ -NMN product.
  • LDH human-derived lactate dehydrogenase
  • FIG. 4A is a graph showing the relative activity values of lactate dehydrogenase (SEQ ID NO: 1) with respect to various concentrations of the ⁇ -NMN compound of the present invention and the commercially available ⁇ -NMN product 1 measured in Test Example 4. be.
  • FIG. 4B is a graph showing the relative activity values of lactate dehydrogenase (SEQ ID NO: 1) with respect to various concentrations of the ⁇ -NMN compound of the present invention and the commercially available ⁇ -NMN product 2 measured in Test Example 4. be.
  • FIG. 4A is a graph showing the relative activity values of lactate dehydrogenase (SEQ ID NO: 1) with respect to various concentrations of the ⁇ -NMN compound of the present invention and the commercially available ⁇ -NMN product 1 measured in Test Example 4. be.
  • FIG. 4C is a graph showing the relative activity values of lactate dehydrogenase (SEQ ID NO: 1) with respect to various concentrations of the ⁇ -NMN compound of the present invention and the commercially available ⁇ -NMN product 3 measured in Test Example 4. be.
  • FIG. 4D shows the relative activity of human-derived lactate dehydrogenase (LDH) 1 (SEQ ID NO: 2) with respect to various concentrations of the ⁇ -NMN compound of the present invention and the commercially available ⁇ -NMN product 1 measured in Test Example 4. It is a graph which showed the value.
  • LDH human-derived lactate dehydrogenase
  • FIG. 4E shows the relative activity of human-derived lactate dehydrogenase (LDH) 1 (SEQ ID NO: 2) with respect to various concentrations of the ⁇ -NMN compound of the present invention and the commercially available ⁇ -NMN product 2 measured in Test Example 4. It is a graph which showed the value.
  • FIG. 4F shows the relative activity of human-derived lactate dehydrogenase (LDH) 1 (SEQ ID NO: 2) with respect to various concentrations of the ⁇ -NMN compound of the present invention and the commercially available ⁇ -NMN product 3 measured in Test Example 4. It is a graph which showed the value.
  • FIG. 5A is a graph showing the cell damage rate determined from the AST activity inside and outside the cell when the ⁇ -NMN compound of one example of the present invention was used, which was measured in Test Example 5.
  • FIG. 5B is a graph showing the cell damage rate determined from the AST activity inside and outside the cell when the ⁇ -NMN product 3 was used, which was measured in Test Example 5.
  • FIG. 6A is a graph showing the intracellular NAD content measured in Test Example 5 when the ⁇ -NMN compound of one example of the present invention was used.
  • FIG. 6B is a graph showing the intracellular NAD content when ⁇ -NMN product 3 was used, which was measured in Test Example 5.
  • the compound of the present invention is a compound consisting of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof, which has a purity of 95% or more as measured by HPLC and a reaction to lactate dehydrogenase.
  • the sex is 30 units or more.
  • ⁇ -nicotinamide mononucleotide There are two types of ⁇ -nicotinamide mononucleotides, ⁇ and ⁇ , as optical isomers.
  • the structure of ⁇ -nicotinamide mononucleotide (CAS number: 1094-61-7) according to the present invention is as follows. Is.
  • ⁇ -NMN compound The compound composed of ⁇ -NMN or a pharmacologically acceptable salt thereof according to the present invention (hereinafter, may be referred to as “ ⁇ -NMN compound”) is prepared by any method. May be good.
  • ⁇ -NMN that has been artificially synthesized by a chemical synthesis method, an enzyme method, a fermentation method, or the like can be used as an active ingredient.
  • ⁇ -NMN is a component widely present in a living body
  • ⁇ -NMN obtained by extracting and purifying from natural raw materials such as animals, plants and microorganisms can also be used as an active ingredient.
  • commercially available purified ⁇ -NMN may be used.
  • ⁇ -NMN As a chemical synthesis method for synthesizing ⁇ -NMN, for example, ⁇ -NMN can be produced by reacting nicotinamide with L-ribose tetraacetate and phosphorylating the obtained nicotinamide mononucleoside. Further, as an enzymatic method, for example, from nicotinamide and 5'-phosphoribosyl-1'-pyrrolic acid (hereinafter, may be referred to as "PRPP”), nicotinamide phosphoribosyl transferase (hereinafter, referred to as "NAMPT").
  • PRPP 5'-phosphoribosyl-1'-pyrrolic acid
  • NAMPT nicotinamide phosphoribosyl transferase
  • ⁇ -NMN can be produced by nicotinamide riboside kinase, and ⁇ -NMN can be produced from nicotinamide riboside by nicotinamide riboside kinase. Further, as a fermentation method, for example, ⁇ -NMN can be produced from nicotinamide by utilizing the metabolic system of a microorganism expressing NAMPT.
  • the ⁇ -NMN may be a pharmacologically acceptable salt.
  • the pharmacologically acceptable salt of ⁇ -NMN may be an inorganic acid salt or an organic acid salt having a basic moiety such as amine.
  • Examples of the acids constituting such acid salts include acetic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid, camphorsulfonic acid, citric acid, ethenesulfonic acid, fumaric acid, gluconic acid, glutamic acid, hydrobromic acid, hydrochloric acid and ISEthione.
  • the pharmacologically acceptable salt of ⁇ -NMN may be an alkaline salt or an organic salt having an acidic moiety such as a carboxylic acid.
  • Examples of the base constituting such an acid salt are alkali metal salts or alkaline earth metal salts, such as sodium hydride, potassium hydroxide, calcium hydroxide, aluminum hydroxide, lithium hydroxide, and magnesium hydroxide.
  • Zinc hydroxide ammonia, trimethylamonia, triethylammonia, ethylenediamine, lysine, arginine, ornithine, choline, N, N'-dibenzylethylenediamine, chloroprocine, procaine, diethanolamine, N-benzylphenethylamine, diethylamine, piperazin, tris ( Those derived from bases such as hydroxymethyl) -aminomethane and tetramethylammonium hydroxide can be mentioned.
  • the ⁇ -NMN compound according to the present invention may be in a crystalline form or in an amorphous form, but in order to suppress the mixing of impurities to a lower level, the stability as a compound is further enhanced. In order to obtain it, it is preferable that it is crystallized by being subjected to a crystallization step using an alcohol-containing solution such as a methanol solution or ethanol.
  • the method for crystallization of the ⁇ -NMN compound is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected. For example, the method described in JP-A-2018-534265 or WO 2018/047715 is used. be able to.
  • HPLC purity The purity of the ⁇ -NMN compound according to the present invention is not particularly limited as long as the purity measured by HPLC (hereinafter, may be referred to as “HPLC purity”) is 95% or more, and is appropriately selected. However, 98% or more is preferable.
  • the HPLC analysis method for measuring the HPLC purity is not particularly limited as long as it is a method and conditions capable of efficiently separating and measuring ⁇ -NMN, and can be appropriately selected, for example, as a column.
  • Hypercarb TM length: 15 cm, inner diameter: 4.6 mm, particle size: 3 ⁇ m, manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • a TSK-GEL ODS column length: 15 cm, inner diameter: 4.6 mm, particle size: 5 ⁇ m, manufactured by Toso
  • ⁇ Enzyme reactivity> The reactivity of the ⁇ -NMN compound according to the present invention with respect to lactate dehydrogenase (hereinafter, may be referred to as “enzyme reactivity”) is not particularly limited as long as it is 30 units or more, and may be appropriately selected. However, 33 units or more are preferable.
  • the lactate dehydrogenase (hereinafter sometimes referred to as “LDH”) in the present invention is a dehydrogenase also referred to as L-lactate dehydrogenase (EC 1.1.1.27).
  • L-lactate dehydrogenase a lactate dehydrogenase derived from mammalian skeletal muscle is preferable, and a lactate dehydrogenase (LDH) 5 derived from skeletal muscle consisting of a tetramer of a subunit having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • R-LDH5 mammalian lactate dehydrogenases
  • LDH pig-derived lactate dehydrogenase
  • LH human-derived lactate dehydrogenase
  • LDH uses lactic acid as a substrate to catalyze the dehydrogenation reaction and convert it to pyruvic acid, at which time ⁇ -NMN is converted to reduced ⁇ -NMN (see FIG. 1).
  • enzyme reactivity refers to a value obtained by measuring with the following reagents and methods.
  • ⁇ R1 reagent 80 mM Tris-HCl (pH 8.5) ⁇ 19 mM ⁇ -NMN (It is assumed that the purity of ⁇ -NMN in the measurement sample is 100%.
  • ⁇ -NMN is dissolved in an 80 mM sodium carbonate solution.
  • ⁇ R2 reagent 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) ⁇ 100 mM L-lactic acid ⁇ enzyme solution> -Adjust the enzyme solution so that LDH has a final concentration of 245 U / mL in the reaction solution.
  • the activity unit (U) of LDH is the activity unit when NAD is used as a coenzyme, and the activity unit when measured by the IFCC-compliant human LDH measurement method is used.
  • ⁇ Activity measurement> A 7180 Hitachi automatic analyzer (manufactured by Hitachi High-Tech) is used to measure the enzyme activity. The measurement parameters are shown below.
  • -Measurement parameters- ⁇ Analysis method ⁇ ⁇ ⁇ Rate A ⁇ Measurement wavelength (secondary / main) ⁇ ⁇ ⁇ 405nm / 340nm ⁇ Reaction time ⁇ ⁇ ⁇ 10 minutes ⁇ Measurement point ⁇ ⁇ ⁇ 20-24 ⁇ Sample solution (enzyme solution) ⁇ ⁇ ⁇ 18 ⁇ L ⁇ R1 reagent ⁇ ⁇ ⁇ 120 ⁇ L ⁇ R2 reagent ⁇ ⁇ 87 ⁇ L -Measurement procedure- After mixing 18 ⁇ L of the enzyme solution and 120 ⁇ L of the R1 reagent and incubating at 37 ° C.
  • the value of the change in absorbance per minute ( ⁇ mAbs / min) is calculated by subtracting the absorbance of water (blank) at the same photometric point from the absorbance value of the measurement sample 1-2 minutes after the start of the reaction (photometric point 20-24). do.
  • the active unit (unit of reactivity to lactate dehydrogenase R-LDH5) is 0.1 mAbs, which is the value of change in absorbance per minute.
  • the ⁇ -NMN compound according to the present invention does not substantially contain nicotinamide dinucleotide (hereinafter, may be referred to as “NAD”). This is because if NAD is contained, the reactivity to lactate dehydrogenase may not be accurately measured.
  • substantially free of nicotinamide dinucleotide means that NAD in the ⁇ -NMN compound is not detected by the above-mentioned HPLC analysis. It should be noted that the embodiment in which NAD is contained in the preparation or food or drink containing the ⁇ -NMN compound according to the present invention is not excluded.
  • the ⁇ -NMN compound of the present invention not only has high purity when measured by HPLC, but also has high enzymatic reactivity to lactate dehydrogenase. Therefore, it has higher bioavailability than conventional ⁇ -NMN products (drug substances), and is considered to be of high quality as ⁇ -nicotinamide mononucleotides or pharmacologically acceptable salts thereof and products containing them. At the same time, it has a high physiological effect. Therefore, it can be highly effective not only as a medicine containing ⁇ -NMN as an active ingredient, but also as a raw material for foods and drinks (including, but not limited to, supplements) and feeds, or by administering or ingesting the same. ..
  • the method for evaluating the quality of a compound of the present invention is a method for evaluating the quality of a compound consisting of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof, and includes at least an evaluation step, and further a measurement step if necessary. Including other steps such as.
  • ⁇ -nicotinamide is used as an index that the purity as measured by HPLC is 95% or more and the reactivity to lactate dehydrogenase is 30 units or more.
  • This is a step of evaluating the quality of a compound consisting of a mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the index of purity as measured by HPLC is not particularly limited as long as it is 95% or more, and can be appropriately selected, but 98% or more is preferable.
  • the index of reactivity with the lactate dehydrogenase is not particularly limited as long as it is 30 units or more, and can be appropriately selected, but 33 units or more is preferable.
  • the purity of the compound consisting of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof to be evaluated is 95% or more as measured by HPLC.
  • the reactivity to lactate dehydrogenase is 30 units or more, the quality of the evaluation target is evaluated as good. More specifically, when the purity as measured by HPLC is 95% or more and the reactivity to lactate dehydrogenase is 30 units or more, the evaluation target is ⁇ -nicotinamide having high bioavailability. It is evaluated as a compound consisting of a mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the purity and reactivity to lactate dehydrogenase as measured by the HPLC may be measured when the method for evaluating the quality of the compound of the present invention is carried out, or may be measured separately.
  • the other steps in the method for evaluating the quality of the compound of the present invention are not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected. Examples thereof include a measurement step.
  • the measurement step in the method for evaluating the quality of the compound of the present invention includes the purity of the compound consisting of the ⁇ -nicotinamide mononucleotide to be evaluated or a pharmacologically acceptable salt thereof measured by HPLC and the reaction to lactate dehydrogenase. This is the process of measuring sex.
  • the purity and reactivity to lactate dehydrogenase as measured by the HPLC can be measured in the same manner as described in the items of ⁇ HPLC purity> and ⁇ enzyme reactivity> of the above-mentioned (compound). can.
  • the method for determining the enzyme reactivity of a compound of the present invention is a method for determining the enzyme reactivity of a compound consisting of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof, which includes at least a determination step and is necessary. It further includes other steps depending on the situation.
  • ⁇ is used as an index that the purity as measured by HPLC is 95% or more and the reactivity to lactate dehydrogenase is 30 units or more.
  • the index of purity as measured by HPLC is not particularly limited as long as it is 95% or more, and can be appropriately selected, but 98% or more is preferable.
  • the index of reactivity with the lactate dehydrogenase is not particularly limited as long as it is 30 units or more, and can be appropriately selected, but 33 units or more is preferable.
  • the purity of the compound consisting of the ⁇ -nicotinamide mononucleotide to be determined or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 95% when measured by HPLC.
  • the reactivity to lactate dehydrogenase is 30 units or more, it is determined that the enzyme reactivity of the determination target is high. More specifically, when the purity as measured by HPLC is 95% or more and the reactivity to lactate dehydrogenase is 30 units or more, the evaluation target has high reactivity to lactate dehydrogenase.
  • the compound consists of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the purity and reactivity to lactate dehydrogenase as measured by the HPLC may be those measured when determining the enzyme reactivity of the compound of the present invention, or those measured separately. May be good.
  • the measurement step in the method for determining the enzyme reactivity of the compound of the present invention is the purity and lactate dehydrogenase measured by HPLC of a compound consisting of ⁇ -nicotinamide mononucleotide to be evaluated or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • This is a step of measuring the reactivity to an enzyme.
  • the purity and reactivity to lactate dehydrogenase as measured by the HPLC can be measured in the same manner as described in the items of ⁇ HPLC purity> and ⁇ enzyme reactivity> of the above-mentioned (compound). can.
  • bioavailability that cannot be evaluated only by the HPLC purity of ⁇ -nicotinamide mononucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof is evaluated and determined.
  • This can provide a compound consisting of high quality ⁇ -NMN or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the present invention also includes a method for producing a compound consisting of high-quality ⁇ -NMN or a pharmacologically acceptable salt thereof, which includes a method for evaluating the compound or a method for determining the enzymatic reactivity of the compound. ..
  • ⁇ Crystallization treatment> A 5 mL aqueous solution prepared by mixing water and ethanol at a volume ratio of 1: 2 was weighed in a test tube, and a ⁇ -NMN sample was dissolved therein to prepare a saturated aqueous solution of NMN. Then, when the aqueous solution was allowed to stand at 25 ° C. for 3 days, crystals were precipitated. Subsequently, the solution containing crystals was centrifuged to remove the supernatant. The obtained crystals were suspended in an excess amount of ethanol and then centrifuged to remove the supernatant. Subsequently, crystals were obtained by heating and drying at 60 ° C. for 1 hour.
  • Test Example 1 In addition to the ⁇ -NMN compound produced in Production Example 1, the following ⁇ -NMN products that are commercially available and have been subjected to crystallization treatment were used in this test example.
  • ⁇ ⁇ -NMN product 1 Fermented product, manufactured by company A
  • ⁇ ⁇ -NMN product 2 chemically synthesized product, manufactured by company A
  • ⁇ ⁇ -NMN product 3 manufactured by company B
  • HPLC purity measurement The HPLC system Prominence (manufactured by Shimadzu Corporation) was used as the HPLC equipment.
  • ⁇ -NMN sample was dissolved in distilled water so as to have a concentration of 2 mM, and this was used as a sample solution.
  • -Applied 10 ⁇ L of the sample solution to a TSK-GEL ODS-80TS column (length: 15 cm, inner diameter: 4.6 mm, particle size: 5 ⁇ m, manufactured by Tosoh Corporation).
  • -Separation of the ⁇ -NMN fraction adsorbed on the column was carried out by the following method.
  • Test Example 2 For the ⁇ -NMN compounds produced in Production Examples 2 to 4, HPLC purity and enzyme reactivity were measured by the same method as in Test Example 1. As a result, it was confirmed that the ⁇ -NMN compound of the present invention has high HPLC purity and high enzyme reactivity even when raw materials having different production lots are used. The results are shown in Table 2 below together with the test results of Production Example 1. The measurement result is an average value obtained three times. In each of the ⁇ -NMN compounds of Production Examples 2 to 4, no peak of NAD was observed by HPLC, and the ⁇ -NMN compounds were substantially free of NAD.
  • Test Example 3 ⁇ Evaluation of enzyme reactivity with LDH derived from other animal species>
  • the ⁇ -NMN compound produced in Production Example 1 and the same ⁇ -NMN products 1 to 3 used in Test Example 1 are used.
  • the enzyme reactivity with LDH ((A) pig-derived LDH1, (B) human-derived LDH1, (C) human-derived LDH5) was evaluated.
  • the evaluation of the enzyme reactivity was carried out in the same manner as in Test Example 1 except that the following enzyme solution was used.
  • FIGS. 3A to 3C FIGS. 3A: pig-derived LDH1, FIG. 3B: human-derived LDH1, FIG.
  • 3C human-derived LDH5).
  • -Enzyme solution- (A) Pig-derived LDH1 The enzyme solution was adjusted so that the LDH had a final concentration of 45 U / mL in the reaction solution. (B) Human-derived LDH1 The enzyme solution was adjusted so that the LDH had a final concentration of 45 U / mL in the reaction solution. (C) Human-derived LDH5 The enzyme solution was adjusted so that the LDH had a final concentration of 245 U / mL in the reaction solution.
  • Test Example 4 ⁇ -NMN compound concentration dependence of LDH activity value>
  • the R1 reagent was used with the ⁇ -NMN compound produced in Production Example 1 and the same ⁇ -NMN products 1 to 3 used in Test Example 1.
  • the enzyme activity of LDH was measured by changing the ⁇ -NMN concentration in the mixture.
  • the enzyme activity of LDH was measured in the same manner as in [Enzyme reactivity evaluation] of Test Example 1 except that the following R1 reagent and enzyme solution were used, and the value of change in absorbance per minute ( ⁇ mAbs / min). was calculated.
  • FIGS. 4A to 4F the relative activity value (%) of each concentration in each NMN was shown in FIGS. 4A to 4F (FIGS. 4A to C: R-LDH5, FIGS. 4D to F: Human-derived LDH1).
  • the measurement result is an average value obtained three times.
  • ⁇ -NMN was dissolved in a 100 mM sodium carbonate solution.
  • -Enzyme solution- R-LDH5 The enzyme solution was adjusted so that the LDH had a final concentration of 245 U / mL in the reaction solution.
  • the ⁇ -NMN compounds of Production Example 1 and ⁇ -NMN product 3 were added so that the final concentrations were 0 and 0.1 mM, respectively, and 7 in a CO 2 incubator at 37 ° C. without changing the medium. It was shake-cultured for a day. After 7 days of shaking culture, cells and culture supernatant were collected for various analyses.
  • L-type Wako AST / J2 manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used for intracellular and extracellular aspartate aminotransferase (AST) activity to detect deviation enzymes, and the reagent was specified.
  • the measurement was performed with a 7180 type Hitachi automatic analyzer (manufactured by Hitachi High-Tech).
  • NAD was detected using a NAD / NADH measurement kit (manufactured by Dojin Chemical Research Institute). Specifically, the weight of the collected cells was measured, and the NAD was measured for the cells extracted with the Extension buffer attached to the kit. The intracellular NAD content was calculated from the calibration curve obtained by measuring the NAD solution at each concentration.
  • FIG. 5A shows the cytotoxicity obtained from the AST activity inside and outside each cell when the ⁇ -NMN compound of Production Example 1 was used
  • FIG. 5B shows the cytotoxicity obtained from the AST activity inside and outside each cell when the ⁇ -NMN compound of ⁇ -NMN product 3 was used. The rate was shown.
  • FIG. 6A shows the intracellular NAD content when the ⁇ -NMN compound of Production Example 1 was used
  • FIG. 6B shows the intracellular NAD content when the ⁇ -NMN compound of ⁇ -NMN product 3 was used.
  • the rate of cell damage due to nutrient depletion associated with culturing for 7 days without changing the medium was higher when the ⁇ -NMN compound of Production Example 1 was added than in the ⁇ -NMN of ⁇ -NMN product 3.
  • the intracellular NAD content was lower when the compound was added, and the intracellular NAD content was higher when the ⁇ -NMN compound of Production Example 1 was added than when the ⁇ -NMN compound of ⁇ -NMN product 3 was added. ..

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Abstract

β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物であって、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上である化合物である。

Description

β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物、並びにその品質評価方法および酵素反応性の判定方法
　本発明は、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物、並びにその品質評価方法および酵素反応性の判定方法に関する。
　β－ニコチンアミドモノヌクレオチド（以下、「β－ＮＭＮ」と称することがある。）は、補酵素ＮＡＤ＋の生合成中間代謝産物である。近年、β－ＮＭＮは、老化マウスにおけるインスリン分泌能の改善効果、高脂肪食や老化によってひき起こされる２型糖尿病のマウスモデルにおいてインスリン感受性や分泌を劇的に改善する効果を有すること（例えば、特許文献１参照）、サーカディアンリズムの制御に関与していること（例えば、特許文献２参照）、老化した筋肉のミトコンドリア機能を顕著に高める効果を有することなどが報告されている。さらに、β－ＮＭＮの投与により、肥満、血中脂質濃度の上昇、インシュリン感受性の低下、記憶力低下、及び黄斑変性症等の眼機能劣化といった加齢に伴う各種疾患の症状の改善や予防に有用であることも報告されている（例えば、特許文献３参照）。さらに、β－ＮＭＮの投与は、生体中のＮＡＤ＋量を高め、サーチュイン遺伝子を活性化することより、生体の加齢に伴う身体機能の低下を抑制・遅延させ、抗老化の効果が期待されている（例えば、特許文献４参照）。
　一方、β－ＮＭＮを医薬やサプリメント、化粧料等に適用するにあたり、β－ＮＭＮの純度を高めたり、保存安定性を向上させるために結晶化することが提案されている（例えば、特許文献５および６参照）。
米国特許第７７３７１５８号明細書 米国特許出願公開第２０１１／１２３５１０号明細書 国際公開第２０１４／１４６０４４号 国際公開第２０１７／２０００５０号 特表２０１８－５３４２６５号公報 国際公開第２０１８／０４７７１５号
　本発明者らは、自らが製造したβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドや市場で入手可能なβ－ＮＭＮ製品は同様に高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；以下、「ＨＰＬＣ」と称することがある。）で測定したときの純度が高いにもかかわらず、また、結晶化して純度を高めても、生体に投与した際に同じ投与量でも同様な効果が得られないということを見出した。すなわち、ＨＰＬＣで測定したときの純度が同等であっても生理活性が異なるβ－ＮＭＮがあるため、より生理活性が高いβ－ＮＭＮの提供が必要である。
　本発明は、このような要望に応え、現状を打破し、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＨＰＬＣで測定したときの純度が高く、且つ高い酵素反応性を示し、これにより高い生理活性を有するβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物、並びにβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の品質評価方法および酵素反応性の判定方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、ＨＰＬＣで測定したときの純度が同等であっても生理活性が異なるのは、これら製品中のβ－ＮＭＮの酵素反応性が異なることによるものであることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
　＜１＞　β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物であって、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上であることを特徴とする化合物である。
　＜２＞　ＨＰＬＣで測定したときの純度が９８％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３３単位以上である前記＜１＞に記載の化合物である。
　＜３＞　結晶形態である前記＜１＞又は＜２＞に記載の化合物である。
　＜４＞　乳酸脱水素酵素が、哺乳類の骨格筋由来の乳酸脱水素酵素である前記＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載の化合物である。
　＜５＞　乳酸脱水素酵素が、配列番号１のアミノ酸配列を有する前記＜４＞に記載の化合物である。
　＜６＞　実質的にニコチンアミドジヌクレオチドを含まない前記＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の化合物である。
　＜７＞　β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の品質評価方法であって、
　ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上であることを指標として、前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の品質を評価することを含むことを特徴とする方法である。
　＜８＞　β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の酵素反応性の判定方法であって、
　ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上であることを指標として、前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩の乳酸脱水素酵素に対する反応性を判定することを含むことを特徴とする方法である。
　本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ＨＰＬＣで測定したときの純度が高く、且つ高い酵素反応性を示し、これにより高い生理活性を有するβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物、並びにβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の品質評価方法および酵素反応性の判定方法を提供することができる。
図１は、β－ＮＭＮと乳酸脱水素酵素の反応を示す図である。 図２は、試験例１において測定した本発明の一例のβ－ＮＭＮ化合物と市販のβ－ＮＭＮ製品の乳酸脱水素酵素（配列番号１）に対する酵素反応性を示したグラフである。 図３Ａは、試験例３において測定した本発明の一例のβ－ＮＭＮ化合物と市販のβ－ＮＭＮ製品のブタ由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）１（配列番号４）に対する酵素反応性を示したグラフである。 図３Ｂは、試験例３において測定した本発明の一例のβ－ＮＭＮ化合物と市販のβ－ＮＭＮ製品のヒト由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）１（配列番号２）に対する酵素反応性を示したグラフである。 図３Ｃは、試験例３において測定した本発明の一例のβ－ＮＭＮ化合物と市販のβ－ＮＭＮ製品のヒト由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５（配列番号３）に対する酵素反応性を示したグラフである。 図４Ａは、試験例４において測定した、各種濃度の本発明の一例のβ－ＮＭＮ化合物と市販のβ－ＮＭＮ製品１に対する乳酸脱水素酵素（配列番号１）の相対活性値を示したグラフである。 図４Ｂは、試験例４において測定した、各種濃度の本発明の一例のβ－ＮＭＮ化合物と市販のβ－ＮＭＮ製品２に対する乳酸脱水素酵素（配列番号１）の相対活性値を示したグラフである。 図４Ｃは、試験例４において測定した、各種濃度の本発明の一例のβ－ＮＭＮ化合物と市販のβ－ＮＭＮ製品３に対する乳酸脱水素酵素（配列番号１）の相対活性値を示したグラフである。 図４Ｄは、試験例４において測定した、各種濃度の本発明の一例のβ－ＮＭＮ化合物と市販のβ－ＮＭＮ製品１に対するヒト由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）１（配列番号２）の相対活性値を示したグラフである。 図４Ｅは、試験例４において測定した、各種濃度の本発明の一例のβ－ＮＭＮ化合物と市販のβ－ＮＭＮ製品２に対するヒト由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）１（配列番号２）の相対活性値を示したグラフである。 図４Ｆは、試験例４において測定した、各種濃度の本発明の一例のβ－ＮＭＮ化合物と市販のβ－ＮＭＮ製品３に対するヒト由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）１（配列番号２）の相対活性値を示したグラフである。 図５Ａは、試験例５において測定した、本発明の一例のβ－ＮＭＮ化合物を用いたときの細胞内外のＡＳＴ活性から求めた細胞障害率を示したグラフである。 図５Ｂは、試験例５において測定した、β－ＮＭＮ製品３を用いたときの細胞内外のＡＳＴ活性から求めた細胞障害率を示したグラフである。 図６Ａは、試験例５において測定した、本発明の一例のβ－ＮＭＮ化合物を用いたときの細胞内ＮＡＤ含量を示したグラフである。 図６Ｂは、試験例５において測定した、β－ＮＭＮ製品３を用いたときの細胞内ＮＡＤ含量を示したグラフである。
（化合物）
　本発明の化合物は、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物であって、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上である。
　β－ニコチンアミドモノヌクレオチドには、光学異性体としてα、βの２種類が存在するが、本発明に係るβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＣＡＳ番号：１０９４－６１－７）の構造は以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明に係るβ－ＮＭＮ又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物（以下、「β－ＮＭＮ化合物」と称することがある。）としては、いずれの方法で調製されたものであってもよい。例えば、化学合成法、酵素法、発酵法等により、人工的に合成したβ－ＮＭＮを精製したものを、有効成分として用いることができる。また、β－ＮＭＮは広く生体に存在する成分であるため、動物、植物、微生物などの天然原料から抽出・精製することによって得られたβ－ＮＭＮを有効成分として用いることもできる。また、市販されている精製されたβ－ＮＭＮを使用してもよい。
　β－ＮＭＮを合成する化学合成法としては、例えば、ニコチンアミドとＬ－リボーステトラアセテートとを反応させ、得られたニコチンアミドモノヌクレオシドをリン酸化することによりβ－ＮＭＮを製造できる。また、酵素法としては、例えば、ニコチンアミドと５’－ホスホリボシル－１’－ピロリン酸（以下、「ＰＲＰＰ」と称することがある。）から、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下、「ＮＡＭＰＴ」と称することがある。）によりβ－ＮＭＮを製造でき、ニコチンアミドリボシドからもニコチンアミドリボシドキナーゼによりβ－ＮＭＮを製造できる。また、発酵法としては、例えば、ＮＡＭＰＴを発現している微生物の代謝系を利用して、ニコチンアミドからβ－ＮＭＮを製造できる。
　前記β－ＮＭＮは、薬理学的に許容される塩であってもよい。前記β－ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、無機酸塩であってもよく、アミンのような塩基性部位を有する有機酸塩であってもよい。このような酸塩を構成する酸としては、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。また、β－ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、アルカリ塩であってもよく、カルボン酸のような酸性部位を有する有機塩であってもよい。このような酸塩を構成する塩基としては、例えば、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であって、水素化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛、アンモニア、トリメチルアンモニア、トリエチルアンモニア、エチレンジアミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、プロカイン、ジエタノールアミン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウム等の塩基から誘導されるものが挙げられる。
　本発明に係るβ－ＮＭＮ化合物としては、結晶形態であってもよいし、アモルファス（非晶質）であってもよいが、不純物の混入をより低く抑えるため、より化合物としての安定性を高め得るためにも、メタノール溶液やエタノール等のアルコール類含有溶液を用いる結晶化工程に供した結晶化したものであることが好ましい。β－ＮＭＮ化合物の結晶化方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば特表２０１８－５３４２６５号公報または国際公開第２０１８／０４７７１５号に記載される方法に従って行うことができる。
＜ＨＰＬＣ純度＞
　本発明に係るβ－ＮＭＮ化合物の純度としては、ＨＰＬＣで測定したときの純度（以下、「ＨＰＬＣ純度」と称することがある。）が９５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９８％以上が好ましい。
　本発明におけるＨＰＬＣ純度とは、β－ＮＭＮを含有する試料をＨＰＬＣで測定し、検出される様々なピーク面積の総量に対するＮＭＮ由来ピーク面積の割合を意味する。具体的には、下記の式から求めることができる。
－式－
　ＨＰＬＣ純度（％）＝（β－ＮＭＮ由来ピーク面積）／（測定されるピーク面積の総量）×１００
　本発明において、ＨＰＬＣ純度を測定する際のＨＰＬＣ分析方法としては、β－ＮＭＮを効率よく分離・測定できる方法・条件であれば、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、カラムとしてＨｙｐｅｒｃａｒｂＴＭ（長さ：１５ｃｍ、内径：４．６ｍｍ、粒子径：３μｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を使用し、「Ｙｏｓｈｉｎｏ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，　２０１１年，　ｖｏｌ．１４，　ｐ．５２８－５３６．」に記載される方法で、またはカラムとしてＴＳＫ－ＧＥＬ　ＯＤＳカラム（長さ：１５ｃｍ、内径：４．６ｍｍ、粒子径：５μｍ、東ソー社製）を使用し、「ビタミン誌、１９９０年、第６４巻１号、第１９～２５頁」に記載される方法で測定することができる。本発明においては以下の方法で測定した。
　・　ＨＰＬＣ機器として、ＨＰＬＣシステムＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）を使用する。
　・　β－ＮＭＮ試料を２ｍＭになるように蒸留水に溶解し、これを試料液とする。
　・　試料液１０μＬをＴＳＫ－ＧＥＬ　ＯＤＳ－８０ＴＳカラム（長さ：１５ｃｍ、内径：４．６ｍｍ、粒子径：５μｍ、東ソー社製）にアプライする。
　・　カラム吸着したβ－ＮＭＮ画分の分離は、以下の方法で実施する。
　　　溶離液として５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－酢酸（ｐＨ７．５）／メタノールを用い、０－１５％メタノールの濃度勾配にて、流速０．７ｍＬ／分になるよう調整して溶出・分離し、吸光度２６０ｎｍで測定する。
＜酵素反応性＞
　また、本発明に係るβ－ＮＭＮ化合物の乳酸脱水素酵素に対する反応性（以下、「酵素反応性」と称することがある。）としては、３０単位以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、３３単位以上が好ましい。
　本発明における乳酸脱水素酵素（以下、「ＬＤＨ」と称することがある。）はＬ－乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．２７）とも称される脱水素酵素である。
　前記乳酸脱水素酵素としては、哺乳類の骨格筋由来の乳酸脱水素酵素が好ましく、配列番号１のアミノ酸配列を有する、サブユニットの４量体からなる骨格筋由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５（以下、「Ｒ－ＬＤＨ５」と称することがある。）がより好ましいが、哺乳類の他の乳酸脱水素酵素、例えば、ブタ由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）１、ヒト由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）１、ヒト由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５なども使用することができる。ＬＤＨは、乳酸を基質として脱水素反応を触媒してピルビン酸に変換するが、このときβ－ＮＭＮは還元型β－ＮＭＮに変換される（図１を参照）。
　本発明において、酵素反応性は以下の試薬と方法により測定して得られる値のことをいう。
＜Ｒ１試薬＞
　・　８０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
　・　１９ｍＭ　β－ＮＭＮ
　（測定試料中のβ－ＮＭＮの純度を１００％と仮定する。また、β－ＮＭＮは８０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液に溶解しておく。）
＜Ｒ２試薬＞
　・　１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
　・　１００ｍＭ　Ｌ－乳酸
＜酵素溶液＞
　・　ＬＤＨが、反応液中の終濃度で２４５Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液を調整。
　　　本発明において、ＬＤＨの活性単位（Ｕ）は、ＮＡＤを補酵素として使用したときの活性単位であり、ＩＦＣＣ準拠のヒトＬＤＨ測定法で測定したときの活性単位を使用する。
＜活性測定＞
　酵素活性の測定には７１８０形日立自動分析装置（日立ハイテク社製）を使用する。測定パラメーターを以下に示す。
－測定パラメーター－
　・　分析方法　　　　　　・・・　レートＡ
　・　測定波長（副／主）　・・・　４０５ｎｍ／３４０ｎｍ
　・　反応時間　　　　　　・・・　１０分間
　・　測光ポイント　　　　・・・　２０－２４
　・　試料液（酵素溶液）　・・・　１８μＬ
　・　Ｒ１試薬　　　　　　・・・　１２０μＬ
　・　Ｒ２試薬　　　　　　・・・　８７μＬ
－測定手順－
　酵素溶液１８μＬとＲ１試薬１２０μＬを混合して３７℃で４．５分間インキュベートした後（測光ポイント１－１６）、Ｒ２試薬８７μＬを添加して反応を開始する（測光ポイント１７）。反応開始後１－２分（測光ポイント２０－２４）の測定試料の吸光値から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出する。活性単位（乳酸脱水素酵素Ｒ－ＬＤＨ５に対する反応性の単位）は、１分間当たりの吸光度変化の値０．１ｍＡｂｓを１単位とする。
　本発明に係るβ－ＮＭＮ化合物は、実質的にニコチンアミドジヌクレオチド（以下、「ＮＡＤ」と称することがある。）を含まないことが好ましい。ＮＡＤが含まれていると乳酸脱水素酵素に対する反応性を正確に測定できない可能性があるためである。
　本発明において、実質的にニコチンアミドジヌクレオチドを含まないとは、前記β－ＮＭＮ化合物におけるＮＡＤが前述のＨＰＬＣ分析で検出されないことをいう。なお、本発明に係るβ－ＮＭＮ化合物を配合する製剤や飲食品にＮＡＤが含まれている実施形態を排除するものではない。
　本発明のβ－ＮＭＮ化合物は、ＨＰＬＣで測定したときの純度が高いだけでなく、乳酸脱水素酵素に対する高酵素反応性を有する。そのため、従来のβ－ＮＭＮ製品（原薬）と比較して生体利用性が高く、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩とこれを含有する製品として高品質であると同時に、高い生理作用を有している。したがって、β－ＮＭＮを有効成分とする医薬としてだけでなく、飲食品（サプリメントを含むが、これに限定されない）や飼料の原料としてまたはこれを投与または摂取することにより高い効果を与えることができる。
（化合物の品質評価方法）
　本発明の化合物の品質評価方法は、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の品質評価方法であって、評価工程を少なくとも含み、必要に応じて更に測定工程などのその他の工程を含む。
＜評価工程＞
　本発明の化合物の品質評価方法における評価工程は、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上であることを指標として、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の品質を評価する工程である。
　前記ＨＰＬＣで測定したときの純度の指標としては、９５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９８％以上が好ましい。
　前記乳酸脱水素酵素に対する反応性の指標としては、３０単位以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、３３単位以上が好ましい。
－評価－
　本発明の化合物の品質評価方法における評価工程では、評価対象のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物が、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上である場合に、前記評価対象の品質が良いと評価する。より具体的には、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上である場合に、前記評価対象は生体利用性が高いβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物であると評価する。
　前記ＨＰＬＣで測定したときの純度および乳酸脱水素酵素に対する反応性は、本発明の化合物の品質評価方法を行う際に測定したものであってもよいし、別途測定したものであってもよい。
＜その他の工程＞
　本発明の化合物の品質評価方法におけるその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、測定工程などが挙げられる。
－測定工程－
　本発明の化合物の品質評価方法における測定工程は、評価対象のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物のＨＰＬＣで測定したときの純度および乳酸脱水素酵素に対する反応性を測定する工程である。
　前記ＨＰＬＣで測定したときの純度および乳酸脱水素酵素に対する反応性は、上記した（化合物）の＜ＨＰＬＣ純度＞の項目および＜酵素反応性＞の項目に記載したものと同様にして測定することができる。
（化合物の酵素反応性の判定方法）
　本発明の化合物の酵素反応性の判定方法は、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の酵素反応性の判定方法であって、判定工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
＜判定工程＞
　本発明の化合物の酵素反応性の判定方法における判定工程は、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上であることを指標として、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の酵素反応性を判定する工程である。
　前記ＨＰＬＣで測定したときの純度の指標としては、９５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９８％以上が好ましい。
　前記乳酸脱水素酵素に対する反応性の指標としては、３０単位以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、３３単位以上が好ましい。
－判定－
　本発明の化合物の酵素反応性の判定方法における判定工程では、判定対象のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物が、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上である場合に、前記判定対象の酵素反応性が高いと判定する。より具体的には、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上である場合に、前記評価対象は乳酸脱水素酵素に対する反応性が高いβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物であると判定する。
　前記ＨＰＬＣで測定したときの純度および乳酸脱水素酵素に対する反応性は、本発明の化合物の酵素反応性の判定方法を行う際に測定したものであってもよいし、別途測定したものであってもよい。
＜その他の工程＞
　本発明の化合物の酵素反応性の判定方法におけるその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、測定工程などが挙げられる。
－測定工程－
　本発明の化合物の酵素反応性の判定方法における測定工程は、評価対象のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物のＨＰＬＣで測定したときの純度および乳酸脱水素酵素に対する反応性を測定する工程である。
　前記ＨＰＬＣで測定したときの純度および乳酸脱水素酵素に対する反応性は、上記した（化合物）の＜ＨＰＬＣ純度＞の項目および＜酵素反応性＞の項目に記載したものと同様にして測定することができる。
　本発明の化合物の評価方法および化合物の酵素反応性の判定方法によれば、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩のＨＰＬＣ純度だけでは評価できない生体利用性を評価・判定することができ、これにより高品質なβ－ＮＭＮ又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物を提供することができる。
　また、本発明は、前記化合物の評価方法または化合物の酵素反応性の判定方法を包含する、高品質なβ－ＮＭＮ又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の製造方法をも包含する。
　以下、製造例および試験例を示して本発明を説明するが、本発明は、これらの製造例および試験例に何ら限定されるものではない。
（製造例１）
＜β－ＮＭＮの酵素処理＞
　１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にβ－ＮＭＮ試薬（オリエンタル酵母工業社製、アモルファス）約１００ｍｇを溶解し４Ｎ　ＫＯＨでｐＨを６．０に調整した後、骨格筋由来Ｒ－ＬＤＨ５　１０，０００Ｕを添加し、１０℃で１０分間反応させた。反応液を限外ろ過し、ろ液を集め、ＬＤＨの除去されたβ－ＮＭＮを回収した。回収したβ－ＮＭＮ含有溶液を凍結乾燥して粉末形態のβ－ＮＭＮ試料を得た。
＜結晶化処理＞
　水とエタノールを体積比１：２の割合で混合した水溶液５ｍＬを試験管に量り取り、ここにβ－ＮＭＮ試料を溶解させ、ＮＭＮの飽和水溶液を調製した。その後、当該水溶液を２５℃にて３日間静置したところ、結晶が析出した。続いて、結晶を含む当該溶液を遠心分離し、上澄を除去した。取得した結晶を過剰量のエタノール中に懸濁させた後、遠心分離し、上澄を除去した。続いて、６０℃で１時間加熱乾燥することで、結晶を取得した。
（製造例２～４）
　製造ロットが異なるβ－ＮＭＮ試薬を用い、製造例１と同様にして酵素処理および結晶化処理を行い、本発明のβ－ＮＭＮ化合物を製造した。
（試験例１）
　製造例１で製造したβ－ＮＭＮ化合物に加え、市場で入手可能な製品で、いずれも結晶化処理が施されている下記のβ－ＮＭＮ製品を本試験例で用いた。
　・　β－ＮＭＮ製品１（発酵製法品、Ａ社製）
　・　β－ＮＭＮ製品２（化学合成品、Ａ社製）
　・　β－ＮＭＮ製品３（製法不明、Ｂ社製）
＜ＨＰＬＣ純度の測定＞
　下記の方法により、本発明のβ－ＮＭＮ化合物（製造例１）とβ－ＮＭＮ製品１～３について、ＨＰＬＣ純度を測定した。得られた結果を下記の表１に示す。なお、測定結果は３回行った平均値である。
〔ＨＰＬＣ純度測定〕
　・　ＨＰＬＣ機器として、ＨＰＬＣシステムＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）を使用した。
　・　β－ＮＭＮ試料を２ｍＭになるように蒸留水に溶解し、これを試料液とした。
　・　試料液１０μＬをＴＳＫ－ＧＥＬ　ＯＤＳ－８０ＴＳカラム（長さ：１５ｃｍ、内径：４．６ｍｍ、粒子径：５μｍ、東ソー社製）にアプライした。
　・　カラム吸着したβ－ＮＭＮ画分の分離は、以下の方法で実施した。
　　　溶離液として５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－酢酸（ｐＨ７．５）／メタノールを用い、０－１５％メタノールの濃度勾配にて、流速０．７ｍＬ／分になるよう調整して溶出・分離し、吸光度２６０ｎｍで測定した。
　・　得られたＨＰＬＣチャートの総ピーク面積とβ－ＮＭＮのピーク面積から下記の式によりＨＰＬＣ純度を算出した。
－式－
　ＨＰＬＣ純度（％）＝（β－ＮＭＮ由来ピーク面積）／（測定されるピーク面積の総量）×１００
＜酵素反応性の評価＞
　下記の方法により、本発明のβ－ＮＭＮ化合物（製造例１）とβ－ＮＭＮ製品１～３について、Ｒ－ＬＤＨ５（配列番号１）に対する酵素反応性を評価した。得られた結果を表１および図２に示す。なお、測定結果は３回行った平均値である。
〔酵素反応性評価〕
－Ｒ１試薬－
　・　８０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
　・　１９ｍＭ　β－ＮＭＮ
　（測定試料中のβ－ＮＭＮの純度を１００％と仮定した。また、β－ＮＭＮは８０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液に溶解しておいた。）
－Ｒ２試薬－
　・　１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
　・　１００ｍＭ　Ｌ－乳酸
－酵素溶液－
　・　Ｒ－ＬＤＨ５が、反応液中の終濃度で２４５Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液を調整。
－活性測定－
　酵素活性の測定には７１８０形日立自動分析装置（日立ハイテク社製）を使用した。測定パラメーターを以下に示す。
－－測定パラメーター－－
　・　分析方法　　　　　　・・・　レートＡ
　・　測定波長（副／主）　・・・　４０５ｎｍ／３４０ｎｍ
　・　反応時間　　　　　　・・・　１０分間
　・　測光ポイント　　　　・・・　２０－２４
　・　試料液（酵素溶液）　・・・　１８μＬ
　・　Ｒ１試薬　　　　　　・・・　１２０μＬ
　・　Ｒ２試薬　　　　　　・・・　８７μＬ
－－測定手順－－
　酵素溶液１８μＬとＲ１試薬１２０μＬを混合して３７℃で４．５分間インキュベートした後（測光ポイント１－１６）、Ｒ２試薬８７μＬを添加して反応を開始した（測光ポイント１７）。反応開始後５分間測定し、開始から１－２分（測光ポイント２０－２４）の測定試料の吸光値から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出した。活性単位は、１分間当たりの吸光度変化の値０．１ｍＡｂｓを１単位とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１の結果から、製造例１のβ－ＮＭＮ化合物とβ－ＮＭＮ製品１～３はいずれもＨＰＬＣ純度は９９％以上であるにもかかわらず、酵素反応性では製造例１では３９単位であるが、製品１～３では２３～２６単位と低いものであった。
　なお、製造例１のβ－ＮＭＮ化合物とβ－ＮＭＮ製品１～３はいずれもＨＰＬＣではＮＡＤのピークは観察されず、実質的にＮＡＤを含まないものであった。
（試験例２）
　製造例２～４で製造したβ－ＮＭＮ化合物について、試験例１と同様の方法により、ＨＰＬＣ純度と酵素反応性を測定した。その結果、製造ロットが異なる原料を利用しても本発明のβ－ＮＭＮ化合物は、ＨＰＬＣ純度および酵素反応性がいずれも高いことが確認された。それらの結果を製造例１の試験結果と併せて下記の表２に示す。なお、測定結果は３回行った平均値である。
　なお、製造例２～４のβ－ＮＭＮ化合物はいずれもＨＰＬＣではＮＡＤのピークは観察されず、実質的にＮＡＤを含まないものであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（試験例３）
＜他の動物種由来ＬＤＨでの酵素反応性の評価＞
　他の動物種およびヒト由来のＬＤＨでも同様の傾向が見られるかを確認するため、製造例１で製造したβ－ＮＭＮ化合物と、試験例１で用いたものと同じβ－ＮＭＮ製品１～３について、ＬＤＨ（（Ａ）ブタ由来ＬＤＨ１、（Ｂ）ヒト由来ＬＤＨ１、（Ｃ）ヒト由来ＬＤＨ５）に対する酵素反応性を評価した。
　酵素反応性の評価は、下記の酵素溶液を用いた以外は、試験例１と同様にして行った。得られた結果を図３Ａ～Ｃ（図３Ａ：ブタ由来ＬＤＨ１、図３Ｂ：ヒト由来ＬＤＨ１、図３Ｃ：ヒト由来ＬＤＨ５）に示す。
－酵素溶液－
　（Ａ）ブタ由来ＬＤＨ１
　　　　ＬＤＨが、反応液中の終濃度で４５Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液を調整。
　（Ｂ）ヒト由来ＬＤＨ１
　　　　ＬＤＨが、反応液中の終濃度で４５Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液を調整。
　（Ｃ）ヒト由来ＬＤＨ５
　　　　ＬＤＨが、反応液中の終濃度で２４５Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液を調整。
　試験例３の結果から、試験例１と同様に、ブタ由来ＬＤＨ１、ヒト由来ＬＤＨ１およびヒト由来ＬＤＨ５を使用した場合においても、製造例１のβ－ＮＭＮ化合物に対して、製品１～３は酵素反応性が低いものであった。
（試験例４）
＜ＬＤＨ活性値のβ－ＮＭＮ化合物濃度依存性＞
　ＬＤＨ活性値のβ－ＮＭＮ化合物濃度依存性を確認するため、製造例１で製造したβ－ＮＭＮ化合物と、試験例１で用いたものと同じβ－ＮＭＮ製品１～３を用いて、Ｒ１試薬中のβ－ＮＭＮ濃度を変えてＬＤＨの酵素活性測定を行った。
　ＬＤＨの酵素活性測定は、下記のＲ１試薬および酵素溶液を用いた以外は、試験例１の〔酵素反応性評価〕と同様にして測定し、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出した。２００ｍＭの製造例１のβ－ＮＭＮ化合物を用いたときのＬＤＨの活性値を１００％としたときの、各濃度の各ＮＭＮにおける相対活性値（％）を図４Ａ～Ｆ（図４Ａ～Ｃ：Ｒ－ＬＤＨ５、図４Ｄ～Ｆ：ヒト由来ＬＤＨ１）に示した。なお、測定結果は３回行った平均値である。
－Ｒ１試薬－
　・　８０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
　・　０、１０、２０、５０、１００、または２００ｍＭ　β－ＮＭＮ
　（測定試料中のβ－ＮＭＮの純度を１００％と仮定した。また、β－ＮＭＮは１００ｍＭ炭酸ナトリウム溶液に溶解しておいた。）
－酵素溶液－
　（Ｉ）Ｒ－ＬＤＨ５
　　　　ＬＤＨが、反応液中の終濃度で２４５Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液を調整。
　（ＩＩ）ヒト由来ＬＤＨ１
　　　　ＬＤＨが、反応液中の終濃度で４５Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液を調整。
　測定の結果、Ｒ－ＬＤＨ５を使用した場合において、製品１は、β－ＮＭＮ濃度が２００ｍＭの場合に酵素活性を測定することができず、濃度依存性が追えなくなった（図４Ａ）。これは。β－ＮＭＮ濃度が高濃度になるにつれて原因不明の阻害反応が大きくなったためと考えられる。製品２（図４Ｂ）および製品３（図４Ｃ）ではβ－ＮＭＮ濃度が高濃度になるにつれて製造例１のβ－ＮＭＮ化合物に対する活性値の差が大きくなった。
　ヒト由来ＬＤＨ１を使用した場合においては、製品１（図４Ｄ）、製品２（図４Ｅ）および製品３（図４Ｆ）のいずれもが、β－ＮＭＮ濃度が高濃度になるにつれて製造例１のβ－ＮＭＮ化合物に対する活性値の差が大きくなった。
（試験例５）
＜培養細胞におけるＮＭＮの効果＞
　製造例１およびβ－ＮＭＮ製品３のβ－ＮＭＮ化合物について生物活性を評価するため、培養細胞をβ―ＮＭＮ化合物を含有させた培地で培養し、細胞内ＮＡＤの変動を測定した。
　培養細胞は、浮遊化処理したＨＥＫ２９３細胞を用いた。培地は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ　２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。
　まず、浮遊化処理したＨＥＫ２９３細胞を、培地に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、１２５ｍＬフラスコ６本に各３０ｍＬ分を分注した。各フラスコに、製造例１およびβ－ＮＭＮ製品３のβ－ＮＭＮ化合物を、それぞれ終濃度が０、０．１ｍＭとなるように添加し、培地交換せずに３７℃のＣＯ２インキュベーター内で７日間振とう培養した。
　７日間の振とう培養後、各種分析のため細胞と培養上清を回収した。まず、細胞障害率を算出するため、逸脱酵素の検出として、細胞内外のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性にはＬタイプワコー　ＡＳＴ・Ｊ２（富士フイルム和光純薬社製）を用い、試薬指定の方法に準じて７１８０形日立自動分析装置（日立ハイテク社製）にて測定した。また、細胞内ＮＡＤ含量を測定するため、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ測定キット（同仁化学研究所社製）を用いてＮＡＤの検出を行った。具体的には、回収した細胞の重量を測定し、これにキット添付のＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒにて抽出を行ったものについて、ＮＡＤを測定した。細胞内のＮＡＤ含量は、各濃度のＮＡＤ溶液を測定して求めた検量線から算出した。
　図５Ａには製造例１のβ－ＮＭＮ化合物を用いたときの、図５Ｂにはβ－ＮＭＮ製品３のβ－ＮＭＮ化合物を用いたときの、それぞれの細胞内外のＡＳＴ活性から求めた細胞障害率を示した。また、図６Ａには製造例１のβ－ＮＭＮ化合物を用いたときの、図６Ｂにはβ－ＮＭＮ製品３のβ－ＮＭＮ化合物を用いたときの、それぞれの細胞内ＮＡＤ含量を示した。測定の結果、培地交換せずに７日間培養することに伴う、栄養枯渇による細胞の障害率が、製造例１のβ－ＮＭＮ化合物を添加した時の方がβ－ＮＭＮ製品３のβ－ＮＭＮ化合物を添加したときよりも低く、また、細胞内ＮＡＤ含量は、製造例１のβ－ＮＭＮ化合物を添加したときの方がβ－ＮＭＮ製品３のβ－ＮＭＮ化合物を添加した時よりも高かった。

Claims (8)

  1. 　β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物であって、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上であることを特徴とする化合物。
  2. 　ＨＰＬＣで測定したときの純度が９８％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３３単位以上である請求項１に記載の化合物。
  3. 　結晶形態である請求項１又は２に記載の化合物。
  4. 　乳酸脱水素酵素が、哺乳類の骨格筋由来の乳酸脱水素酵素である請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
  5. 　乳酸脱水素酵素が、配列番号１のアミノ酸配列を有する請求項４に記載の化合物。
  6. 　実質的にニコチンアミドジヌクレオチドを含まない請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物。
  7. 　β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の品質評価方法であって、
    　ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上であることを指標として、前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の品質を評価することを含むことを特徴とする方法。
  8. 　β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の酵素反応性の判定方法であって、
    　ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する反応性が３０単位以上であることを指標として、前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物の乳酸脱水素酵素に対する反応性を判定することを含むことを特徴とする方法。
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