JPH1169997A - 清浄度検査試薬およびその試薬を用いる清浄度検査法 - Google Patents
清浄度検査試薬およびその試薬を用いる清浄度検査法Info
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- JPH1169997A JPH1169997A JP24598597A JP24598597A JPH1169997A JP H1169997 A JPH1169997 A JP H1169997A JP 24598597 A JP24598597 A JP 24598597A JP 24598597 A JP24598597 A JP 24598597A JP H1169997 A JPH1169997 A JP H1169997A
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- cleanliness
- atp
- luciferin
- luciferase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】汚れの指標成分であるＡＴＰに加え、従来のル
シフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬では測定が困難で
あったＡＤＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡも同時に測定して、
少い汚れでも、感度よく検出して、精度よく清浄度を評
価できる清浄度検査試薬および、この試薬を用いる清浄
度検査法を提供する。 【解決手段】検査箇所に汚れ採取用担体を接触させて、
該汚れの付着した担体を得、次いでこれに無菌水または
微生物細胞内成分抽出試薬を接触させ、得られる接触液
に、（１）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、
ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリ
ン、ルシフェラーゼおよび金属塩を含む清浄度検査試
薬、或いは（２）この清浄度検査試薬に、ＡＤＰからＡ
ＴＰを生成する反応を触媒する酵素およびＲＮＡ分解酵
素からなる群から選ばれる少なくとも１種を加えた清浄
度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定し、清浄度
検査を行なう。
シフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬では測定が困難で
あったＡＤＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡも同時に測定して、
少い汚れでも、感度よく検出して、精度よく清浄度を評
価できる清浄度検査試薬および、この試薬を用いる清浄
度検査法を提供する。 【解決手段】検査箇所に汚れ採取用担体を接触させて、
該汚れの付着した担体を得、次いでこれに無菌水または
微生物細胞内成分抽出試薬を接触させ、得られる接触液
に、（１）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、
ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリ
ン、ルシフェラーゼおよび金属塩を含む清浄度検査試
薬、或いは（２）この清浄度検査試薬に、ＡＤＰからＡ
ＴＰを生成する反応を触媒する酵素およびＲＮＡ分解酵
素からなる群から選ばれる少なくとも１種を加えた清浄
度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定し、清浄度
検査を行なう。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ルシフェリン・ル
シフェラーゼ発光試薬を用いる、ＡＴＰを汚染指標とし
た清浄度検査法（以下ＡＴＰ法による清浄度検査法とい
う）の改良に係り、特に汚れの指標成分であるＡＴＰに
加え、従来のルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬で
は測定が困難であったＡＤＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡも同
時に測定して、少い汚れでも、感度よく検出して、精度
よく清浄度を評価できる清浄度検査試薬および、この試
薬を用いる清浄度検査法に関する。
シフェラーゼ発光試薬を用いる、ＡＴＰを汚染指標とし
た清浄度検査法（以下ＡＴＰ法による清浄度検査法とい
う）の改良に係り、特に汚れの指標成分であるＡＴＰに
加え、従来のルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬で
は測定が困難であったＡＤＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡも同
時に測定して、少い汚れでも、感度よく検出して、精度
よく清浄度を評価できる清浄度検査試薬および、この試
薬を用いる清浄度検査法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ＡＴＰ法による清浄度検査法が知
られている。
られている。
【０００３】この方法は概略以下の手順により実施され
る。 （１）無菌水で湿らせた綿棒で検査箇所（１０ｃｍ2）
を拭き取り （２）綿棒を無菌水を入れた試験管の中で濯ぐ （３）すすぎ液の所定量を測定用試験管に取る （４）ＡＴＰ抽出試薬を所定量加える （５）発光試薬（ルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試
薬）を所定量加える （６）発光量測定器（ルミノメーター）で発光量を測定
する。
る。 （１）無菌水で湿らせた綿棒で検査箇所（１０ｃｍ2）
を拭き取り （２）綿棒を無菌水を入れた試験管の中で濯ぐ （３）すすぎ液の所定量を測定用試験管に取る （４）ＡＴＰ抽出試薬を所定量加える （５）発光試薬（ルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試
薬）を所定量加える （６）発光量測定器（ルミノメーター）で発光量を測定
する。
【０００４】一方、ＡＴＰは生物の死後において、速や
かにＡＴＰ分解酵素によって分解を受け、ＡＤＰもしく
はＡＭＰになる。それゆえ、飲食品、その半製品、およ
びそれらの原料には、ＡＤＰおよびＡＭＰが著量含有さ
れているが、これらは、ルシフェリン・ルシフェラーゼ
発光試薬と反応しない。したがって、従来のＡＴＰ法に
よる清浄度検査法では、ＡＴＰ以外のＡＭＰ、ＡＤＰ、
ＲＮＡを検出することができないので、精度の高い清浄
度検査を行なうことはできない。
かにＡＴＰ分解酵素によって分解を受け、ＡＤＰもしく
はＡＭＰになる。それゆえ、飲食品、その半製品、およ
びそれらの原料には、ＡＤＰおよびＡＭＰが著量含有さ
れているが、これらは、ルシフェリン・ルシフェラーゼ
発光試薬と反応しない。したがって、従来のＡＴＰ法に
よる清浄度検査法では、ＡＴＰ以外のＡＭＰ、ＡＤＰ、
ＲＮＡを検出することができないので、精度の高い清浄
度検査を行なうことはできない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、汚れの指標
成分であるＡＴＰに加え、従来のルシフェリン・ルシフ
ェラーゼ発光試薬では測定が困難であったＡＤＰ、ＡＭ
ＰおよびＲＮＡも同時に測定して、少い汚れでも、感度
よく検出して、精度よく清浄度を評価できる清浄度検査
試薬および、この試薬を用いる清浄度検査法を提供する
ことを目的とする。
成分であるＡＴＰに加え、従来のルシフェリン・ルシフ
ェラーゼ発光試薬では測定が困難であったＡＤＰ、ＡＭ
ＰおよびＲＮＡも同時に測定して、少い汚れでも、感度
よく検出して、精度よく清浄度を評価できる清浄度検査
試薬および、この試薬を用いる清浄度検査法を提供する
ことを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ピルベ
ートオルトホスフェートジキナーゼ（以下、ＰＰＤＫと
いうことがある）、ホスホエノールピルビン酸、ピロリ
ン酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩を含
む発光試薬（以下「ＰＰＤＫ含有発光試薬」ということ
がある）を使用すると、汚れの指標成分であるＡＴＰに
加え、従来のルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬で
は測定が不可能であったＡＭＰも同時に測定して、少い
汚れを、感度がよく検出して、精度の高い清浄度検査を
行なうことができることを知った。 また上記ＰＰＤＫ
含有発光試薬にさらに、「ＡＤＰからＡＴＰを生成する
反応を触媒する酵素」および／または「ＲＮＡ分解酵
素」を添加せしめると、ＡＴＰおよびＡＭＰに加え、さ
らにＡＤＰおよびＲＮＡも同時に測定して、さらに少な
い汚れを、感度よく検出して、より精度の高い清浄度検
査を行なうことができることを知り、これらの知見に基
づいて本発明を完成した。即ち（１）本発明はピルベー
トオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホエノールピル
ビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼお
よび金属塩を含むことを特徴とする清浄度検査試薬であ
り、（２）また本発明は、ＡＤＰからＡＴＰを生成する
反応を触媒する酵素、微生物細胞内成分抽出試薬および
ＲＮＡ分解酵素からなる群から選ばれる少なくとも１種
と、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホ
エノールピルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシ
フェラーゼおよび金属塩とを含むことを特徴とする清浄
度検査試薬であり、（３）また本発明は、ＡＤＰ、ＡＭ
ＰおよびＲＮＡからなる群より選ばれる少なくとも一種
と、ＡＴＰとを指標として測定することを特徴とする清
浄度検査法であり、（４）また本発明は、検査箇所に汚
れ採取用担体を接触させて、該汚れの付着した担体を
得、次いでこれに無菌水を接触させ、得られる接触液
に、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホ
エノールピルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシ
フェラーゼおよび金属塩を含む清浄度検査試薬を添加
し、生成する発光量を測定することを特徴とする清浄度
検査法であり、（５）また本発明は、検査箇所に汚れ採
取用担体を接触させて、該汚れの付着した担体を得、次
いでこれに微生物細胞内成分の抽出試薬を接触させ、得
られる接触液に、ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触
媒する酵素およびＲＮＡ分解酵素からなる群から選ばれ
る少なくとも１種と、ピルベートオルトホスフェートジ
キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、ル
シフェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩を含む清浄度
検査試薬とを添加し、生成する発光量を測定することを
特徴とする清浄度検査法であり、（６）また本発明は、
検査対象物または、その処理物に、ピルベートオルトホ
スフェートジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピ
ロリン酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩
を含む清浄度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定
することを特徴とする清浄度検査法であり、（７）また
本発明は、検査対象物または、その処理物に、ＡＤＰか
らＡＴＰを生成する反応を触媒する酵素、微生物細胞内
成分抽出試薬およびＲＮＡ分解酵素からなる群から選ば
れる少なくとも１種と、ピルベートオルトホスフェート
ジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、
ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩とを含む清
浄度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定すること
を特徴とする清浄度検査法である。
な課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ピルベ
ートオルトホスフェートジキナーゼ（以下、ＰＰＤＫと
いうことがある）、ホスホエノールピルビン酸、ピロリ
ン酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩を含
む発光試薬（以下「ＰＰＤＫ含有発光試薬」ということ
がある）を使用すると、汚れの指標成分であるＡＴＰに
加え、従来のルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬で
は測定が不可能であったＡＭＰも同時に測定して、少い
汚れを、感度がよく検出して、精度の高い清浄度検査を
行なうことができることを知った。 また上記ＰＰＤＫ
含有発光試薬にさらに、「ＡＤＰからＡＴＰを生成する
反応を触媒する酵素」および／または「ＲＮＡ分解酵
素」を添加せしめると、ＡＴＰおよびＡＭＰに加え、さ
らにＡＤＰおよびＲＮＡも同時に測定して、さらに少な
い汚れを、感度よく検出して、より精度の高い清浄度検
査を行なうことができることを知り、これらの知見に基
づいて本発明を完成した。即ち（１）本発明はピルベー
トオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホエノールピル
ビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼお
よび金属塩を含むことを特徴とする清浄度検査試薬であ
り、（２）また本発明は、ＡＤＰからＡＴＰを生成する
反応を触媒する酵素、微生物細胞内成分抽出試薬および
ＲＮＡ分解酵素からなる群から選ばれる少なくとも１種
と、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホ
エノールピルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシ
フェラーゼおよび金属塩とを含むことを特徴とする清浄
度検査試薬であり、（３）また本発明は、ＡＤＰ、ＡＭ
ＰおよびＲＮＡからなる群より選ばれる少なくとも一種
と、ＡＴＰとを指標として測定することを特徴とする清
浄度検査法であり、（４）また本発明は、検査箇所に汚
れ採取用担体を接触させて、該汚れの付着した担体を
得、次いでこれに無菌水を接触させ、得られる接触液
に、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホ
エノールピルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシ
フェラーゼおよび金属塩を含む清浄度検査試薬を添加
し、生成する発光量を測定することを特徴とする清浄度
検査法であり、（５）また本発明は、検査箇所に汚れ採
取用担体を接触させて、該汚れの付着した担体を得、次
いでこれに微生物細胞内成分の抽出試薬を接触させ、得
られる接触液に、ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触
媒する酵素およびＲＮＡ分解酵素からなる群から選ばれ
る少なくとも１種と、ピルベートオルトホスフェートジ
キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、ル
シフェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩を含む清浄度
検査試薬とを添加し、生成する発光量を測定することを
特徴とする清浄度検査法であり、（６）また本発明は、
検査対象物または、その処理物に、ピルベートオルトホ
スフェートジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピ
ロリン酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩
を含む清浄度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定
することを特徴とする清浄度検査法であり、（７）また
本発明は、検査対象物または、その処理物に、ＡＤＰか
らＡＴＰを生成する反応を触媒する酵素、微生物細胞内
成分抽出試薬およびＲＮＡ分解酵素からなる群から選ば
れる少なくとも１種と、ピルベートオルトホスフェート
ジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、
ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩とを含む清
浄度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定すること
を特徴とする清浄度検査法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下本発明の清浄度検査試薬につ
いて詳細に説明し、ついでこの清浄度検査試薬を用いた
清浄度検査法について詳細に説明する。先ず、本発明に
用いるピルベ−トオルトホスフェ−トジキナ−ゼとして
は、マグネシウムイオン存在下で、ＡＭＰ、ホスホエノ
−ルピルビン酸およびピロリン酸に作用して、ＡＴＰ、
ピルビン酸およびリン酸を生じる反応を触媒し、その逆
の反応も触媒する酵素で、その理化学的性質および製法
について既に知られており、容易に入手可能である。
いて詳細に説明し、ついでこの清浄度検査試薬を用いた
清浄度検査法について詳細に説明する。先ず、本発明に
用いるピルベ−トオルトホスフェ−トジキナ−ゼとして
は、マグネシウムイオン存在下で、ＡＭＰ、ホスホエノ
−ルピルビン酸およびピロリン酸に作用して、ＡＴＰ、
ピルビン酸およびリン酸を生じる反応を触媒し、その逆
の反応も触媒する酵素で、その理化学的性質および製法
について既に知られており、容易に入手可能である。
【０００８】該酵素は、微生物および植物由来のものが
知られている。微生物由来のものとしては、例えば以下
の属または種に属する微生物が挙げられる。 （１）プロピオニバクテリウム・シェルマニ（Ｐｒｏｐ
ｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）
［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０、７２１−７２９
（１９７１）］、（２）アセトバクタ−・キシリナム
（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）［Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７
０）］、（３）バクテロイデス・シンビオサス（Ｂａｃ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｙｍｂｉｏｓｕｓ）［Ｍｅｔｏｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４２、１９９−２
１２（１９７５）］および（４）ミクロビスポ−ラ属
（例えばミクロビスポ−ラ・サ−モロ−ザ（Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｓｐｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｓｅａＩＦＯ１４０４
７）等。また植物由来のものとしては、例えば以下に属
する植物が挙げられる。 （１）トウモロコシ葉由来［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１２、２８６２−２８６７ （１９７３）］。 （２）サトウキビ葉由来［Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ１１４、１１７−１２５（１９６
９）］。
知られている。微生物由来のものとしては、例えば以下
の属または種に属する微生物が挙げられる。 （１）プロピオニバクテリウム・シェルマニ（Ｐｒｏｐ
ｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）
［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０、７２１−７２９
（１９７１）］、（２）アセトバクタ−・キシリナム
（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）［Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７
０）］、（３）バクテロイデス・シンビオサス（Ｂａｃ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｙｍｂｉｏｓｕｓ）［Ｍｅｔｏｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４２、１９９−２
１２（１９７５）］および（４）ミクロビスポ−ラ属
（例えばミクロビスポ−ラ・サ−モロ−ザ（Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｓｐｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｓｅａＩＦＯ１４０４
７）等。また植物由来のものとしては、例えば以下に属
する植物が挙げられる。 （１）トウモロコシ葉由来［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１２、２８６２−２８６７ （１９７３）］。 （２）サトウキビ葉由来［Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ１１４、１１７−１２５（１９６
９）］。
【０００９】微生物の生産するピルベ−トオルトホスフ
ェ−トジキナ−ゼの製造例の一具体例を以下に示す。酵
母エキス０．２％、カザミノ酸０．２％、硫酸第一鉄
０．００１％、塩化カリウム０．０５％、リン酸二カリ
ウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、乳酸０．
３％からなる培地（ｐＨ７．０）５０ｍｌを坂口フラス
コ（５００ｍｌ容量）に入れて、１２１℃で１５分間殺
菌した。この培地に、ミクロビスポ−ラ・サ−モロ−ザ
（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａｔｈｅｒｍｏｒｏｓｅａ）
ＩＦＯ１４０４７を接種し、これを４５℃で一晩振盪培
養して培養物を得た。この培養物５０ｍｌを、前記と同
一組成の培地１リットルを入れた５リットル容坂口フラ
スコ中に接種し一晩培養して培養物を得た。この培養物
を、前記と同一組成の培地２０リットルを入れた３０リ
ットルのジャ−ファ−メンタ−２基に５００ｍｌづつ接
種し、通気量２０リットル／分、撹拌速度３００ｒ．
ｐ．ｍの条件で４５℃で２４時間通気撹拌培養を行なっ
た。培養終了後、この培養物４０リットルからマイクロ
−ザ（旭化成工業社製）を用いて菌体を集めた。この菌
体の一部（２００ｇ）に、５ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍｌ
ＭｇＳＯ4、１ｍＭ ＤＴＴを含有する２０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）（以下緩衝液Ａという）を
加え、菌体を十分に懸濁して７００ｍｌとした。
ェ−トジキナ−ゼの製造例の一具体例を以下に示す。酵
母エキス０．２％、カザミノ酸０．２％、硫酸第一鉄
０．００１％、塩化カリウム０．０５％、リン酸二カリ
ウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、乳酸０．
３％からなる培地（ｐＨ７．０）５０ｍｌを坂口フラス
コ（５００ｍｌ容量）に入れて、１２１℃で１５分間殺
菌した。この培地に、ミクロビスポ−ラ・サ−モロ−ザ
（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａｔｈｅｒｍｏｒｏｓｅａ）
ＩＦＯ１４０４７を接種し、これを４５℃で一晩振盪培
養して培養物を得た。この培養物５０ｍｌを、前記と同
一組成の培地１リットルを入れた５リットル容坂口フラ
スコ中に接種し一晩培養して培養物を得た。この培養物
を、前記と同一組成の培地２０リットルを入れた３０リ
ットルのジャ−ファ−メンタ−２基に５００ｍｌづつ接
種し、通気量２０リットル／分、撹拌速度３００ｒ．
ｐ．ｍの条件で４５℃で２４時間通気撹拌培養を行なっ
た。培養終了後、この培養物４０リットルからマイクロ
−ザ（旭化成工業社製）を用いて菌体を集めた。この菌
体の一部（２００ｇ）に、５ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍｌ
ＭｇＳＯ4、１ｍＭ ＤＴＴを含有する２０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）（以下緩衝液Ａという）を
加え、菌体を十分に懸濁して７００ｍｌとした。
【００１０】ピルベ−トオルトホスフェ−トジキナ−ゼ
の精製 上記菌体懸濁液７００ｍｌに対して以下に示すステ−ジ
操作により行なった。 ステップ １ （粗酵素液の調製）前記の菌体懸濁液７００ｍｌに、リ
ゾチ−ム（ナガセ生化学工業社製）８．７５ｇを加え、
室温でゆくる撹拌しながら２時間放置した後、リン酸二
アンモニウム２３．１ｇを加え、さらに２時間室温で撹
拌して菌体を破砕した。この破砕液を７０００ｒ．ｐ．
ｍ、１５分間、遠心分離して上清部分を集め、６２０ｍ
ｌの液を得た。 ステップ ２ （第一回目ＱＡＥ−セファデックス・クロマトグラフィ
−）前記６２０ｍｌの液に、２ｇ／１００ｍｌの割合で
硫安溶解させ、これをあらかじめ０．１５Ｍの硫安を含
有した前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）で平衡化したＱＡＥ
−セファデックス樹脂約７００ｍｌに酵素を吸着させ
た。これを０．１５Ｍ硫安を含んだ前記緩衝液Ａ（ｐＨ
７．５）洗浄して不要な蛋白を除いた後、０．６Ｍ硫安
を含んだ前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）で溶出した。 ステップ ３ （第二回目ＱＡＥ−セファデックス・クロマトグラフィ
−）前記溶出液をホロファイバ−限外濾過装置（ＰＡＮ
１３−ＤＸ、旭メディカル社製）によって濃縮した後、
あらかじめ前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）で平衡化したＱ
ＡＥ−セファデックスを充填したカラム（直径６ｃｍ×
１５ｃｍ）にかけて酵素を吸着させた。次に０．１５Ｍ
硫安を含んだ前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）で洗浄して不
要な蛋白を除いた後、０．１５Ｍ硫安を含んだ前記緩衝
液Ａ（ｐＨ７．５）と０．８Ｍ硫安を含んだ緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）をつなぐことによってつくった濃度勾配をも
った緩衝液３リットルで溶出した。 ステップ ４ （ブチルトヨパ−ル・クロマトグラフィ−）前記活性部
分を回収し、硫安を加え硫安濃度を１Ｍに調整した後、
あらかじめ１Ｍ硫安を含む前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）
で平衡化したブチルトヨパ−ル（東ソ−社製）を充填し
たカラム（直径４．５ｃｍ×１５ｃｍ）にかけて酵素を
吸着させた。これを、前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）中の
硫安濃度勾配（１．０Ｍ〜０Ｍ）をもった緩衝液（ｐＨ
７．５）１．２リットルによって溶出した。 ステップ ５ （ゲル濾過クロマトグラフィ−）前記の活性部をアミコ
ン社製限外濾過膜装置（分画１０，０００）で２ｍｌに
まで濃縮し、このうち１００μｌをあらかじめ０．３Ｍ
硫安を含んだ２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
で平衡化したＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷXLカラム（直径
０．７６ｃｍ×３０ｃｍ×２本）にかけてゲル濾過を行
なった。すべての酵素をゲル濾過し、活性部を濃縮し
た。活性部を再び前記と同様のカラムにかけてゲル濾過
を行なった。全ての酵素をゲル濾過して溶出された活性
画分５．４ｍｌを採取した。該画分は、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により均一と判断された本酵
素の標品であり、全タンパク量が６．６５ｍｇ、全活性
が６６．０Ｕ、比活性が９．９２Ｕ／ｍｇのものであっ
た。
の精製 上記菌体懸濁液７００ｍｌに対して以下に示すステ−ジ
操作により行なった。 ステップ １ （粗酵素液の調製）前記の菌体懸濁液７００ｍｌに、リ
ゾチ−ム（ナガセ生化学工業社製）８．７５ｇを加え、
室温でゆくる撹拌しながら２時間放置した後、リン酸二
アンモニウム２３．１ｇを加え、さらに２時間室温で撹
拌して菌体を破砕した。この破砕液を７０００ｒ．ｐ．
ｍ、１５分間、遠心分離して上清部分を集め、６２０ｍ
ｌの液を得た。 ステップ ２ （第一回目ＱＡＥ−セファデックス・クロマトグラフィ
−）前記６２０ｍｌの液に、２ｇ／１００ｍｌの割合で
硫安溶解させ、これをあらかじめ０．１５Ｍの硫安を含
有した前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）で平衡化したＱＡＥ
−セファデックス樹脂約７００ｍｌに酵素を吸着させ
た。これを０．１５Ｍ硫安を含んだ前記緩衝液Ａ（ｐＨ
７．５）洗浄して不要な蛋白を除いた後、０．６Ｍ硫安
を含んだ前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）で溶出した。 ステップ ３ （第二回目ＱＡＥ−セファデックス・クロマトグラフィ
−）前記溶出液をホロファイバ−限外濾過装置（ＰＡＮ
１３−ＤＸ、旭メディカル社製）によって濃縮した後、
あらかじめ前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）で平衡化したＱ
ＡＥ−セファデックスを充填したカラム（直径６ｃｍ×
１５ｃｍ）にかけて酵素を吸着させた。次に０．１５Ｍ
硫安を含んだ前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）で洗浄して不
要な蛋白を除いた後、０．１５Ｍ硫安を含んだ前記緩衝
液Ａ（ｐＨ７．５）と０．８Ｍ硫安を含んだ緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）をつなぐことによってつくった濃度勾配をも
った緩衝液３リットルで溶出した。 ステップ ４ （ブチルトヨパ−ル・クロマトグラフィ−）前記活性部
分を回収し、硫安を加え硫安濃度を１Ｍに調整した後、
あらかじめ１Ｍ硫安を含む前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）
で平衡化したブチルトヨパ−ル（東ソ−社製）を充填し
たカラム（直径４．５ｃｍ×１５ｃｍ）にかけて酵素を
吸着させた。これを、前記緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）中の
硫安濃度勾配（１．０Ｍ〜０Ｍ）をもった緩衝液（ｐＨ
７．５）１．２リットルによって溶出した。 ステップ ５ （ゲル濾過クロマトグラフィ−）前記の活性部をアミコ
ン社製限外濾過膜装置（分画１０，０００）で２ｍｌに
まで濃縮し、このうち１００μｌをあらかじめ０．３Ｍ
硫安を含んだ２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
で平衡化したＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷXLカラム（直径
０．７６ｃｍ×３０ｃｍ×２本）にかけてゲル濾過を行
なった。すべての酵素をゲル濾過し、活性部を濃縮し
た。活性部を再び前記と同様のカラムにかけてゲル濾過
を行なった。全ての酵素をゲル濾過して溶出された活性
画分５．４ｍｌを採取した。該画分は、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により均一と判断された本酵
素の標品であり、全タンパク量が６．６５ｍｇ、全活性
が６６．０Ｕ、比活性が９．９２Ｕ／ｍｇのものであっ
た。
【００１１】ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
の力価の測定法 （生成するＡＴＰを発光法で定量する方法）３ｍＭ 硫
酸マグネシウム、２５ｍＭ 硫酸アンモニウム、２ｍＭ
２メルカプトエタノール、２ｍＭ ピロリン酸、２ｍ
Ｍ ホスホエノールピルビン酸および０．１ｍＭ ＡＭ
Ｐを含む５０ｍＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ
緩衝液（ｐＨ６．８）１８０μｌをマイクロチューブに
とり、温度平衡を３７℃に到達させたのち、適当な活性
を有する酵素溶液２０μｌを加え、１５分間反応させ、
沸騰水中で３分間煮沸し、反応を止める。この反応液を
適当に希釈したもの５０μｌを試験管にとり、そこに
「ルシフェールＬＵ」（キッコーマン社製）溶液を５０
μｌ滴下し、発光量を測定する。別に予め既知濃度のＡ
ＴＰ標準溶液を用いて、その発光量との関係を調べたグ
ラフを用意する。このグラフを用いて３７℃で１分間当
たりに１μｍｏｌのＡＴＰを生成する酵素量を１単位と
する。
の力価の測定法 （生成するＡＴＰを発光法で定量する方法）３ｍＭ 硫
酸マグネシウム、２５ｍＭ 硫酸アンモニウム、２ｍＭ
２メルカプトエタノール、２ｍＭ ピロリン酸、２ｍ
Ｍ ホスホエノールピルビン酸および０．１ｍＭ ＡＭ
Ｐを含む５０ｍＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ
緩衝液（ｐＨ６．８）１８０μｌをマイクロチューブに
とり、温度平衡を３７℃に到達させたのち、適当な活性
を有する酵素溶液２０μｌを加え、１５分間反応させ、
沸騰水中で３分間煮沸し、反応を止める。この反応液を
適当に希釈したもの５０μｌを試験管にとり、そこに
「ルシフェールＬＵ」（キッコーマン社製）溶液を５０
μｌ滴下し、発光量を測定する。別に予め既知濃度のＡ
ＴＰ標準溶液を用いて、その発光量との関係を調べたグ
ラフを用意する。このグラフを用いて３７℃で１分間当
たりに１μｍｏｌのＡＴＰを生成する酵素量を１単位と
する。
【００１２】次に、本発明に用いるルシフェリンとして
は、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体およびルシフェ
リン前駆体などが挙げられる。ルシフェリン誘導体とし
ては、例えば以下のものが挙げられる。 （１）Ｄ−ルシフェリン−Ｏ−硫酸塩（Ｄ−ｌｕｃｉｆ
ｅｒｉｎ−Ｏ−ｓｕｌｐｈａｔｅ）、（２）Ｄ−ルシフ
ェリン メチルエステル（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ ｍ
ｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）、（３）Ｄ−ルシフェリン−Ｏ
−リン酸塩（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−Ｏ−ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ）、（４）Ｄ−ルシフェリン−Ｌ−フェニルア
ラニン（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａ
ｌａｎｉｎｅ）、（５）Ｄ−ルシフェリン−Ｌ−Ｎα−
アルギニン（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−Ｌ−Ｎα−ａｒ
ｇｉｎｉｎｅ）等。
は、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体およびルシフェ
リン前駆体などが挙げられる。ルシフェリン誘導体とし
ては、例えば以下のものが挙げられる。 （１）Ｄ−ルシフェリン−Ｏ−硫酸塩（Ｄ−ｌｕｃｉｆ
ｅｒｉｎ−Ｏ−ｓｕｌｐｈａｔｅ）、（２）Ｄ−ルシフ
ェリン メチルエステル（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ ｍ
ｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）、（３）Ｄ−ルシフェリン−Ｏ
−リン酸塩（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−Ｏ−ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ）、（４）Ｄ−ルシフェリン−Ｌ−フェニルア
ラニン（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａ
ｌａｎｉｎｅ）、（５）Ｄ−ルシフェリン−Ｌ−Ｎα−
アルギニン（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−Ｌ−Ｎα−ａｒ
ｇｉｎｉｎｅ）等。
【００１３】上記ルシフェリン前駆体としては、２−シ
アノ−６−メトキシベンゾチアゾール（２−Ｃｙａｎｏ
−６−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ）、お
よびＤ−システイン等が挙げられる。
アノ−６−メトキシベンゾチアゾール（２−Ｃｙａｎｏ
−６−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ）、お
よびＤ−システイン等が挙げられる。
【００１４】次に、ルシフェラーゼとしては、例えば以
下の甲虫類（コレオプテラ Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）由
来のルシフェラーゼ、それらの変異ルシフェラーゼおよ
び非甲虫類由来のルシフェラーゼ等が挙げられる。 ［甲虫類由来のルシフェラーゼ］ （１）ルシオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕ
ｃｉａｔａ）、（２）ルシオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉ
ｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、（３）ルシオラ・ミン
グレリカ（Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）、
（４）ランピリス・ナクティルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ
ｎａｃｔｉｌｕｃａ）、（５）フォティナス・ピラリス
（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）、（６）フォチ
ュリス・ペンシルバニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎ
ｓｙｌｖａｎｉｃａ）、（７）ホタリア・パルブーラ
（Ｈｏｔａｒｉａ ｐａｒｖｕｌａ）、（８）ピロコエ
リア・ミヤコ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍｉｙａｋ
ｏ）、（９）ピロホラス・プラギオフタラムス（Ｐｙｒ
ｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）
等。（１０）上記ルシフェラーゼおよび変異ルシフェラ
ーゼを遺伝子組換法で製造したルシフェラーゼ。
下の甲虫類（コレオプテラ Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）由
来のルシフェラーゼ、それらの変異ルシフェラーゼおよ
び非甲虫類由来のルシフェラーゼ等が挙げられる。 ［甲虫類由来のルシフェラーゼ］ （１）ルシオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕ
ｃｉａｔａ）、（２）ルシオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉ
ｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、（３）ルシオラ・ミン
グレリカ（Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）、
（４）ランピリス・ナクティルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ
ｎａｃｔｉｌｕｃａ）、（５）フォティナス・ピラリス
（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）、（６）フォチ
ュリス・ペンシルバニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎ
ｓｙｌｖａｎｉｃａ）、（７）ホタリア・パルブーラ
（Ｈｏｔａｒｉａ ｐａｒｖｕｌａ）、（８）ピロコエ
リア・ミヤコ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍｉｙａｋ
ｏ）、（９）ピロホラス・プラギオフタラムス（Ｐｙｒ
ｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）
等。（１０）上記ルシフェラーゼおよび変異ルシフェラ
ーゼを遺伝子組換法で製造したルシフェラーゼ。
【００１５】次に、金属塩としては、２価の金属塩、例
えば硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等のマグネシ
ウム塩、硫酸マンガン、塩化マンガン等のマンガン塩な
どが挙げられる。
えば硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等のマグネシ
ウム塩、硫酸マンガン、塩化マンガン等のマンガン塩な
どが挙げられる。
【００１６】またＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触
媒する酵素としては、以下のものが挙げられる。 （１）ピルビン酸キナーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎ
ａｓｅ） （Ｅ．Ｃ．２．７．１．４０） 基質：ホスホエノール・ピルビン酸（Ｐｈｏｓｐｈｏ
ｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ） （２）酢酸キナーゼ（Ａｃｅｔａｔｅ ｋｉｎａｓｅ） （Ｅ．Ｃ．２．７．２．１）、 基質：アセチル・リン酸（Ａｃｅｔｙｌ ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ） （３）クレアチンキナーゼ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎ
ａｓｅ） （Ｅ．Ｃ．２．７．３．２） 基質：クレアチン・リン酸（Ｃｒｅａｔｉｎｅ ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ） （４）ケトヘキソキナーゼ（Ｋｅｔｏｈｅｘｏｋｉｎａ
ｓｅ） （Ｅ．Ｃ．２．７．１．３） 基質：Ｄ−フルクトース １−リン酸（Ｄ−ｆｒｕｃｔ
ｏｓｅ １−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ） （５）ホスホリブロキナーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｕ
ｌｏ ｋｉｎａｓｅ） 基質：Ｄ−リブロース・１，５−ジリン酸（Ｄ−ｒｉｂ
ｕｌｏｓｅ １，５−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） （６）カルバメートキナーゼ（Ｃａｒｂａｍａｔｅ ｋ
ｉｎａｓｅ） 基質：カルバモイルリン酸（Ｃａｒｂａｍｏｙｌｅ ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ） （７）ホスホグリセレートキナーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｇ
ｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ） 基質：３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸（３−Ｐｈｏｓｐ
ｈｏ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒａｔｅ） （８）アスパルテートキナーゼ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ
ｋｉｎａｓｅ） 基質：Ｌ−アスパラギン酸 ４−リン酸（Ｌ−Ａｓｐａ
ｒｔａｔｅ ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）など。
媒する酵素としては、以下のものが挙げられる。 （１）ピルビン酸キナーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎ
ａｓｅ） （Ｅ．Ｃ．２．７．１．４０） 基質：ホスホエノール・ピルビン酸（Ｐｈｏｓｐｈｏ
ｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ） （２）酢酸キナーゼ（Ａｃｅｔａｔｅ ｋｉｎａｓｅ） （Ｅ．Ｃ．２．７．２．１）、 基質：アセチル・リン酸（Ａｃｅｔｙｌ ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ） （３）クレアチンキナーゼ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎ
ａｓｅ） （Ｅ．Ｃ．２．７．３．２） 基質：クレアチン・リン酸（Ｃｒｅａｔｉｎｅ ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ） （４）ケトヘキソキナーゼ（Ｋｅｔｏｈｅｘｏｋｉｎａ
ｓｅ） （Ｅ．Ｃ．２．７．１．３） 基質：Ｄ−フルクトース １−リン酸（Ｄ−ｆｒｕｃｔ
ｏｓｅ １−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ） （５）ホスホリブロキナーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｕ
ｌｏ ｋｉｎａｓｅ） 基質：Ｄ−リブロース・１，５−ジリン酸（Ｄ−ｒｉｂ
ｕｌｏｓｅ １，５−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） （６）カルバメートキナーゼ（Ｃａｒｂａｍａｔｅ ｋ
ｉｎａｓｅ） 基質：カルバモイルリン酸（Ｃａｒｂａｍｏｙｌｅ ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ） （７）ホスホグリセレートキナーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｇ
ｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ） 基質：３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸（３−Ｐｈｏｓｐ
ｈｏ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒａｔｅ） （８）アスパルテートキナーゼ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ
ｋｉｎａｓｅ） 基質：Ｌ−アスパラギン酸 ４−リン酸（Ｌ−Ａｓｐａ
ｒｔａｔｅ ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）など。
【００１７】また、微生物細胞内成分抽出試薬として
は、界面活性剤（塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコ
ニウム、トリトンＸ１００など）、メタノール、エタノ
ール、エタノールとアンモニアの混合液、トリクロル酢
酸水溶液、過塩素酸水溶液などが挙げられる。
は、界面活性剤（塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコ
ニウム、トリトンＸ１００など）、メタノール、エタノ
ール、エタノールとアンモニアの混合液、トリクロル酢
酸水溶液、過塩素酸水溶液などが挙げられる。
【００１８】またＲＮＡ分解酵素としては、ＲＮＡから
５’−モノヌクレオチド（ＡＭＰ，ＧＭＰ，ＣＭＰ，Ｕ
ＭＰ）を生成する反応を触媒する酵素を意味し、例えば
以下の記載のものが挙げられる。 （１）エンドヌクレアーゼ・エス・ワン（Ｅｎｄｏｎｕ
ｃｌｅａｓｅ Ｓ1）（ＥＣ３．１．３０．１）、
（２）ベノム・エキソヌクレアーゼ（Ｖｅｎｏｍ ｅｘ
ｏｎｕｃｌｅａｓｅ）（ＥＣ３．１．１５．１）、
（３）ホスホ・ジエステラーゼ・ワン（Ｐｈｏｓｐｈｏ
ｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ１）（ＥＣ３．１．４．１）な
ど。 なお、上記エンドヌクレアーゼ・エス・ワンには、ヌク
レアーゼ・ピイ・ワン（Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐ1）、マ
ング・ビーン・ヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎｓ
ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ニューロスポラ・クラッサ・ヌク
レアーゼ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ｎｕ
ｃｌｅａｓｅ）などが含まれる。
５’−モノヌクレオチド（ＡＭＰ，ＧＭＰ，ＣＭＰ，Ｕ
ＭＰ）を生成する反応を触媒する酵素を意味し、例えば
以下の記載のものが挙げられる。 （１）エンドヌクレアーゼ・エス・ワン（Ｅｎｄｏｎｕ
ｃｌｅａｓｅ Ｓ1）（ＥＣ３．１．３０．１）、
（２）ベノム・エキソヌクレアーゼ（Ｖｅｎｏｍ ｅｘ
ｏｎｕｃｌｅａｓｅ）（ＥＣ３．１．１５．１）、
（３）ホスホ・ジエステラーゼ・ワン（Ｐｈｏｓｐｈｏ
ｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ１）（ＥＣ３．１．４．１）な
ど。 なお、上記エンドヌクレアーゼ・エス・ワンには、ヌク
レアーゼ・ピイ・ワン（Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐ1）、マ
ング・ビーン・ヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎｓ
ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ニューロスポラ・クラッサ・ヌク
レアーゼ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ｎｕ
ｃｌｅａｓｅ）などが含まれる。
【００１９】また、本発明では上記の成分以外に、酵素
の賦活剤、酵素の安定剤、緩衝剤、清浄度検査試薬の持
込みＡＴＰ消去剤などの一種または二種以上を添加する
ことが好ましい。
の賦活剤、酵素の安定剤、緩衝剤、清浄度検査試薬の持
込みＡＴＰ消去剤などの一種または二種以上を添加する
ことが好ましい。
【００２０】酵素の賦活剤としては、例えば硫酸アンモ
ニウム（ピルベートオルトホスフェートジキナーゼの賦
活剤）などが挙げられる。
ニウム（ピルベートオルトホスフェートジキナーゼの賦
活剤）などが挙げられる。
【００２１】酵素の安定剤としては、ジチオスレイトー
ルおよびＥＤＴＡ（ルシフェラーゼの安定剤）などが挙
げられる。そのほか、単糖類（例えばグルコースな
ど）、二糖類（例えばシュクロースなど）、多糖類およ
び糖アルコール（例えばグリセロールなど）などが挙げ
られる。
ルおよびＥＤＴＡ（ルシフェラーゼの安定剤）などが挙
げられる。そのほか、単糖類（例えばグルコースな
ど）、二糖類（例えばシュクロースなど）、多糖類およ
び糖アルコール（例えばグリセロールなど）などが挙げ
られる。
【００２２】また緩衝剤としては、発光反応溶液をルシ
フェラーゼの至適ｐＨの範囲に保持するものが好適であ
り、グリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤およ
びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどのＴｒ
ｉｓ緩衝剤などが挙げられる。
フェラーゼの至適ｐＨの範囲に保持するものが好適であ
り、グリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤およ
びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどのＴｒ
ｉｓ緩衝剤などが挙げられる。
【００２３】また、清浄度検査試薬の持込みＡＴＰ消去
剤としては、ＡＴＰ分解酵素、例えばアデノシンリン酸
デアミナーゼ（酵素活性の測定法：特開平９−１８２６
００参照）などが挙げられる。
剤としては、ＡＴＰ分解酵素、例えばアデノシンリン酸
デアミナーゼ（酵素活性の測定法：特開平９−１８２６
００参照）などが挙げられる。
【００２４】次に、本発明の清浄度検査試薬の構成成分
の好適な濃度範囲を以下に示す。 （１）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰ
ＤＫ）：０．００１Ｕ／ｍｌ以上（終濃度）、特に０．
００２〜１００Ｕ／ｍｌ（〃）となる濃度。 （２）ホスホエノールピルビン酸：０．１ｍＭ（〃）以
上、特に０．５〜８．０ｍＭ（〃）となる濃度。 （３）ピロリン酸：１．０μＭ（〃）以上、特に５．０
〜１０００μＭ（〃）となる濃度。 （４）ルシフェリン：５．０μＭ（〃）以上、特に５
０．０〜１００００μＭ（〃）となる濃度。 （５）ルシフェラーゼ：０．１ｍｇ／ｍｌ（〃）以上、
特に０．５〜２０ｍｇ／ｍｌ（〃）となる濃度。 （６）マグネシウムイオン：１．０ｍＭ（〃）以上、特
に５．０〜１００ｍＭ（〃）となる濃度。 （７）硫酸アンモニウム：０．１ｍＭ（〃）以上、特に
０．５〜１００ｍＭ（〃）となる濃度。 （８）ジチオスレイトール：０．１ｍＭ（〃）以上、特
に０．５〜１０ｍＭ（〃）となる濃度。 （９）ＥＤＴＡ：０．１ｍＭ（〃）以上、特に０．５〜
１０ｍＭ（〃）となる濃度。 （１０）ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）：１０ｍＭ
（〃）以上、特に２０〜２００ｍＭとなる濃度。 （１１）アデノシンリン酸デアミナーゼ：０．００１Ｕ
／ｍｌ以上、特に０．０１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌとな
る濃度。
の好適な濃度範囲を以下に示す。 （１）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰ
ＤＫ）：０．００１Ｕ／ｍｌ以上（終濃度）、特に０．
００２〜１００Ｕ／ｍｌ（〃）となる濃度。 （２）ホスホエノールピルビン酸：０．１ｍＭ（〃）以
上、特に０．５〜８．０ｍＭ（〃）となる濃度。 （３）ピロリン酸：１．０μＭ（〃）以上、特に５．０
〜１０００μＭ（〃）となる濃度。 （４）ルシフェリン：５．０μＭ（〃）以上、特に５
０．０〜１００００μＭ（〃）となる濃度。 （５）ルシフェラーゼ：０．１ｍｇ／ｍｌ（〃）以上、
特に０．５〜２０ｍｇ／ｍｌ（〃）となる濃度。 （６）マグネシウムイオン：１．０ｍＭ（〃）以上、特
に５．０〜１００ｍＭ（〃）となる濃度。 （７）硫酸アンモニウム：０．１ｍＭ（〃）以上、特に
０．５〜１００ｍＭ（〃）となる濃度。 （８）ジチオスレイトール：０．１ｍＭ（〃）以上、特
に０．５〜１０ｍＭ（〃）となる濃度。 （９）ＥＤＴＡ：０．１ｍＭ（〃）以上、特に０．５〜
１０ｍＭ（〃）となる濃度。 （１０）ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）：１０ｍＭ
（〃）以上、特に２０〜２００ｍＭとなる濃度。 （１１）アデノシンリン酸デアミナーゼ：０．００１Ｕ
／ｍｌ以上、特に０．０１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌとな
る濃度。
【００２５】次に本発明の清浄度検査法について説明す
る。本発明の清浄度検査法は、検査箇所に汚れ採取用担
体を接触させて、該汚れの付着した担体を得、次いでこ
れに無菌水を接触させ、得られる接触液に、ピルベート
オルトホスフェートジキナーゼ、ホスホエノールピルビ
ン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよ
び金属塩を含む清浄度検査試薬を添加し、生成する発光
量を測定することにより行なわれる。あるいは検査箇所
に汚れ採取用担体を接触させて、該汚れの付着した担体
を得、次いでこれに微生物細胞内成分の抽出試薬を接触
させ、得られる接触液に、ＡＤＰからＡＴＰを生成する
反応を触媒する酵素およびＲＮＡ分解酵素からなる群か
ら選ばれる少なくとも１種と、ピルベートオルトホスフ
ェートジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリ
ン酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩とを
含む清浄度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定す
ることにより行なわれる。あるいは、検査対象物また
は、その処理物に、ピルベートオルトホスフェートジキ
ナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、ルシ
フェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩を含む清浄度検
査試薬を添加し、生成する発光量を測定することにより
行なう。
る。本発明の清浄度検査法は、検査箇所に汚れ採取用担
体を接触させて、該汚れの付着した担体を得、次いでこ
れに無菌水を接触させ、得られる接触液に、ピルベート
オルトホスフェートジキナーゼ、ホスホエノールピルビ
ン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよ
び金属塩を含む清浄度検査試薬を添加し、生成する発光
量を測定することにより行なわれる。あるいは検査箇所
に汚れ採取用担体を接触させて、該汚れの付着した担体
を得、次いでこれに微生物細胞内成分の抽出試薬を接触
させ、得られる接触液に、ＡＤＰからＡＴＰを生成する
反応を触媒する酵素およびＲＮＡ分解酵素からなる群か
ら選ばれる少なくとも１種と、ピルベートオルトホスフ
ェートジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリ
ン酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩とを
含む清浄度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定す
ることにより行なわれる。あるいは、検査対象物また
は、その処理物に、ピルベートオルトホスフェートジキ
ナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、ルシ
フェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩を含む清浄度検
査試薬を添加し、生成する発光量を測定することにより
行なう。
【００２６】検査箇所としては、まな板、包丁、シャモ
ジなどの調理器具、医薬品製造用機械、食品製造機械な
どが挙げられる。
ジなどの調理器具、医薬品製造用機械、食品製造機械な
どが挙げられる。
【００２７】これらの検査箇所に、綿棒、ガーゼなどの
布、不織布およびスポンジなどのよごれ採取用担体を接
触させて、よごれの付着した担体を得る。この際、検査
対象物が、固体あるいはペースト状などを呈しており、
担体による接触では採取できない汚れは、掻取り具（ヘ
ラ、スプーン、ナイフなど）で採取したのち、無菌水に
溶解して水溶液（処理物）としたのち、あるいは無菌水
に混ぜ磨砕または濾過などして懸濁液、抽出液（処理
物）としたのち、検査用試料（サンプル）として利用す
る。また溜り水や水滴状を呈している汚れ水の場合は、
スポイドなどで採取して、そのまま、あるいは無菌水で
希釈したのち検査用試料として利用する。
布、不織布およびスポンジなどのよごれ採取用担体を接
触させて、よごれの付着した担体を得る。この際、検査
対象物が、固体あるいはペースト状などを呈しており、
担体による接触では採取できない汚れは、掻取り具（ヘ
ラ、スプーン、ナイフなど）で採取したのち、無菌水に
溶解して水溶液（処理物）としたのち、あるいは無菌水
に混ぜ磨砕または濾過などして懸濁液、抽出液（処理
物）としたのち、検査用試料（サンプル）として利用す
る。また溜り水や水滴状を呈している汚れ水の場合は、
スポイドなどで採取して、そのまま、あるいは無菌水で
希釈したのち検査用試料として利用する。
【００２８】次いでこれに微生物細胞内成分の抽出試薬
を接触させて得られる接触液を調製する。
を接触させて得られる接触液を調製する。
【００２９】これらの界面活性剤の濃度は、０．００１
％〜１％が好ましい。
％〜１％が好ましい。
【００３０】こうして微生物細胞内成分、例えばＡＴ
Ｐ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＲＮＡなどが抽出された接触液が
調製される。
Ｐ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＲＮＡなどが抽出された接触液が
調製される。
【００３１】次にこの接触液に前述した清浄度検査試薬
を添加すると、該試薬がＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＲＮ
Ａに作用して、発光反応が行なわれるので、その生成す
る発光量を測定する。
を添加すると、該試薬がＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＲＮ
Ａに作用して、発光反応が行なわれるので、その生成す
る発光量を測定する。
【００３２】上記微生物細胞内成分と清浄度検査試薬の
発光反応を、以下に説明する。
発光反応を、以下に説明する。
【００３３】先ず、ＡＭＰと清浄度検査試薬の発光反応
について説明する。本反応は、一般式
について説明する。本反応は、一般式
【化１】 に示したように、破線枠（イ）で示すように、ＡＭＰ、
ピロリン酸、ホスホエノ−ルピルビン酸およびマグネシ
ウムイオンに、ピルベ−トオルトホスフェイトジキナ−
ゼを作用させ、ＡＴＰ、ピルビン酸およびリン酸とに変
換せしめる反応と、一点鎖線（ロ）で示すように、ＡＴ
Ｐ、ルシフェリン、溶存酸素およびマグネシウムイオン
に、ルシフェラ−ゼを作用させ、ＡＭＰ、ピロリン酸、
オキシルシフェリン、炭酸ガスおよび光を生じせしめる
反応を組合せたことを特徴としている。
ピロリン酸、ホスホエノ−ルピルビン酸およびマグネシ
ウムイオンに、ピルベ−トオルトホスフェイトジキナ−
ゼを作用させ、ＡＴＰ、ピルビン酸およびリン酸とに変
換せしめる反応と、一点鎖線（ロ）で示すように、ＡＴ
Ｐ、ルシフェリン、溶存酸素およびマグネシウムイオン
に、ルシフェラ−ゼを作用させ、ＡＭＰ、ピロリン酸、
オキシルシフェリン、炭酸ガスおよび光を生じせしめる
反応を組合せたことを特徴としている。
【００３４】この化１の反応式により、まず（ロ）の反
応によりＡＴＰが消費されて、発光し、ＡＭＰとピロリ
ン酸が生成するが、このＡＭＰとピロリン酸は（イ）の
反応によりにＡＴＰに再生される。そして、このＡＴＰ
は再び（ロ）の反応に供され、ＡＴＰが消費されて発光
する。以下この２つの反応が同時に行なわれ、発光が減
衰することなく高水準のまま、短くとも１０分間一定の
値に維持される。
応によりＡＴＰが消費されて、発光し、ＡＭＰとピロリ
ン酸が生成するが、このＡＭＰとピロリン酸は（イ）の
反応によりにＡＴＰに再生される。そして、このＡＴＰ
は再び（ロ）の反応に供され、ＡＴＰが消費されて発光
する。以下この２つの反応が同時に行なわれ、発光が減
衰することなく高水準のまま、短くとも１０分間一定の
値に維持される。
【００３５】次に、ＡＤＰと清浄度検査試薬の発光反応
について説明する。発光反応は、一般式
について説明する。発光反応は、一般式
【化２】 に示したように、反応（イ）（前述した通り）と反応
（ロ）（前述した通り）に、新たに二点鎖線枠（ハ）で
示したホスホエノールピルビン酸とマグネシウムイオン
の存在下で、ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触媒す
る酵素であるピルビン酸キナーゼによりＡＴＰおよびピ
ルビン酸に変換せしめる反応を組合わせたことを特徴と
している。なお、ここで用いられるＡＤＰからＡＴＰを
生成する反応を触媒する酵素として、ピルビン酸キナー
ゼに代えて、酢酸キナーゼまたはクレアチンキナーゼな
どの他の酵素を用いてもよい。酢酸キナーゼの反応式、
クレアチンキナーゼの反応式をそれぞれ以下に示す。
（ロ）（前述した通り）に、新たに二点鎖線枠（ハ）で
示したホスホエノールピルビン酸とマグネシウムイオン
の存在下で、ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触媒す
る酵素であるピルビン酸キナーゼによりＡＴＰおよびピ
ルビン酸に変換せしめる反応を組合わせたことを特徴と
している。なお、ここで用いられるＡＤＰからＡＴＰを
生成する反応を触媒する酵素として、ピルビン酸キナー
ゼに代えて、酢酸キナーゼまたはクレアチンキナーゼな
どの他の酵素を用いてもよい。酢酸キナーゼの反応式、
クレアチンキナーゼの反応式をそれぞれ以下に示す。
【００３６】酢酸キナーゼの反応式
【化３】
【００３７】クレアチンキナーゼの反応式
【化４】
【００３８】上記化２の反応において、まず二点鎖線枠
で示すように、マグネシウムイオンおよびホスホエノー
ルピルビン酸の存在下で、ＡＤＰにピルビン酸キナーゼ
を反応させてＡＴＰおよびピルビン酸に変換せしめる反
応（ハ）を行ない、これによりＡＤＰがＡＴＰに変換さ
れ、次いで反応（ロ）によりこのＡＴＰが消費されて、
発光し、ＡＭＰが生成し、次いで反応（イ）によりこの
ＡＭＰがＡＴＰに再び変換される。このＡＴＰは再び反
応（ロ）に供され、ＡＴＰが消費されて発光し、ＡＭＰ
に変換される。以下、この２つの反応が同時に、連続的
に繰返し行なわれる。この一連のＡＴＰ変換反応系にお
いて生成する発光は減衰することなく、高水準のまま、
少なくとも１０分間にわたって安定である。化３および
化４の反応においては、以上と同様な態様を示し、重複
するので、割愛する。
で示すように、マグネシウムイオンおよびホスホエノー
ルピルビン酸の存在下で、ＡＤＰにピルビン酸キナーゼ
を反応させてＡＴＰおよびピルビン酸に変換せしめる反
応（ハ）を行ない、これによりＡＤＰがＡＴＰに変換さ
れ、次いで反応（ロ）によりこのＡＴＰが消費されて、
発光し、ＡＭＰが生成し、次いで反応（イ）によりこの
ＡＭＰがＡＴＰに再び変換される。このＡＴＰは再び反
応（ロ）に供され、ＡＴＰが消費されて発光し、ＡＭＰ
に変換される。以下、この２つの反応が同時に、連続的
に繰返し行なわれる。この一連のＡＴＰ変換反応系にお
いて生成する発光は減衰することなく、高水準のまま、
少なくとも１０分間にわたって安定である。化３および
化４の反応においては、以上と同様な態様を示し、重複
するので、割愛する。
【００３９】次に、ＲＮＡと清浄度検査試薬の発光反応
について説明する。本反応は、一般式
について説明する。本反応は、一般式
【化５】 に示したように反応（イ）（前述した通り）と反応
（ロ）（前述した通り）に、新たに三点鎖線枠で示した
ＲＮＡをＲＮＡ分解酵素と反応させて、ＡＭＰ、ＧＭ
Ｐ、ＣＭＰおよびＵＭＰに変換せしめる反応（ニ）を組
合わせたことを特徴としている。
（ロ）（前述した通り）に、新たに三点鎖線枠で示した
ＲＮＡをＲＮＡ分解酵素と反応させて、ＡＭＰ、ＧＭ
Ｐ、ＣＭＰおよびＵＭＰに変換せしめる反応（ニ）を組
合わせたことを特徴としている。
【００４０】上記反応において、まず三点鎖線枠で示す
ように、ＲＮＡをＲＮＡ分解酵素と反応させて、ＡＭ
Ｐ、ＧＭＰ、ＣＭＰおよびＵＭＰに変換せしめる反応
（ニ）を行ない、これによりＲＮＡが、ＡＭＰに変換さ
れ、次いで反応（イ）によりこのＡＭＰがＡＴＰに変換
され、次いで反応（ロ）によりこのＡＴＰが消費され
て、発光し、ＡＭＰが生成する。このＡＭＰは再び反応
（イ）に供され、ＡＴＰに変換され、このＡＴＰは次い
で反応（ロ）により消費されて発光し、ＡＭＰに変換さ
れる。以下、これらの反応が同時に、連続的に繰返し行
なわれる。この一連のＡＴＰ変換反応系において生成す
る発光は減衰することなく、高水準のまま、少なくとも
１０分間にわたって安定である。
ように、ＲＮＡをＲＮＡ分解酵素と反応させて、ＡＭ
Ｐ、ＧＭＰ、ＣＭＰおよびＵＭＰに変換せしめる反応
（ニ）を行ない、これによりＲＮＡが、ＡＭＰに変換さ
れ、次いで反応（イ）によりこのＡＭＰがＡＴＰに変換
され、次いで反応（ロ）によりこのＡＴＰが消費され
て、発光し、ＡＭＰが生成する。このＡＭＰは再び反応
（イ）に供され、ＡＴＰに変換され、このＡＴＰは次い
で反応（ロ）により消費されて発光し、ＡＭＰに変換さ
れる。以下、これらの反応が同時に、連続的に繰返し行
なわれる。この一連のＡＴＰ変換反応系において生成す
る発光は減衰することなく、高水準のまま、少なくとも
１０分間にわたって安定である。
【００４１】以下実施例を示して本発明をより具体的に
説明する。
説明する。
【００４２】
実施例１ ＡＴＰとＡＭＰの測定が可能な清浄度検査試薬の調製 以下の成分を含有する（１）発光試薬を均一に混和し、
清浄度検査試薬を調製した。 １）発光試薬 ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ） １．８Ｕ／ｍｌ ホスホエノールピルビン酸 ４．２ｍＭ ピロリン酸ナトリウム ２００μＭ ルシフェリン １．５ｍＭ ルシフェラーゼ（キッコーマン社製） ４．５ｍｇ／ｍｌ 硫酸マグネシウム（金属塩） １５ｍＭ ※ＨＥＰＥＳ（緩衝剤） ５０ｍＭ（ｐＨ７．０） ※シュークロース（酵素安定剤） ０．３７重量％ ※ＥＤＴＡ・２Ｎａ（酵素の金属による阻害防止剤） １．０ｍＭ ※ジチオスレイトール（酵素安定剤） １．０ｍＭ ※硫酸アンモニウム（酵素活性化剤） ７．５ｍＭ ※アデノシンリン酸デアミナーゼ ０．１Ｕ／ｍｌ
清浄度検査試薬を調製した。 １）発光試薬 ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ） １．８Ｕ／ｍｌ ホスホエノールピルビン酸 ４．２ｍＭ ピロリン酸ナトリウム ２００μＭ ルシフェリン １．５ｍＭ ルシフェラーゼ（キッコーマン社製） ４．５ｍｇ／ｍｌ 硫酸マグネシウム（金属塩） １５ｍＭ ※ＨＥＰＥＳ（緩衝剤） ５０ｍＭ（ｐＨ７．０） ※シュークロース（酵素安定剤） ０．３７重量％ ※ＥＤＴＡ・２Ｎａ（酵素の金属による阻害防止剤） １．０ｍＭ ※ジチオスレイトール（酵素安定剤） １．０ｍＭ ※硫酸アンモニウム（酵素活性化剤） ７．５ｍＭ ※アデノシンリン酸デアミナーゼ ０．１Ｕ／ｍｌ
【００４３】なお上記成分のうち、記号「※」のついた
ＨＥＰＥＳ緩衝剤は反応系のｐＨ安定化のため、シュー
クロースはルシフェラーゼの安定化のため、ＥＤＴＡは
酵素の金属による阻害防止のため、ジチオスレイトール
は酵素安定化のため、硫酸アンモニウムはピルベ−トオ
ルトホスフェ−トジキナ−ゼの活性化を強めるため、そ
してまた、アデノシンリン酸デアミナーゼは清浄度検査
試薬の持込みＡＴＰ消去剤のため、それぞれ使用するも
ので、必須の成分ではない。
ＨＥＰＥＳ緩衝剤は反応系のｐＨ安定化のため、シュー
クロースはルシフェラーゼの安定化のため、ＥＤＴＡは
酵素の金属による阻害防止のため、ジチオスレイトール
は酵素安定化のため、硫酸アンモニウムはピルベ−トオ
ルトホスフェ−トジキナ−ゼの活性化を強めるため、そ
してまた、アデノシンリン酸デアミナーゼは清浄度検査
試薬の持込みＡＴＰ消去剤のため、それぞれ使用するも
ので、必須の成分ではない。
【００４４】実施例２ 微生物以外の汚れ成分および微生物細胞内成分である、
ＡＴＰとＡＭＰ測定が可能な清浄度検査試薬の調製 以下の（１）発光試薬および（２）微生物細胞内成分抽
出試薬の組合せからなる清浄度検査試薬を調製した。 １）発光試薬 上記実施例１に同じ。 ２）微生物細胞内成分抽出試薬 塩化ベンザルコニウム ０．０２重量％ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ
ＡＴＰとＡＭＰ測定が可能な清浄度検査試薬の調製 以下の（１）発光試薬および（２）微生物細胞内成分抽
出試薬の組合せからなる清浄度検査試薬を調製した。 １）発光試薬 上記実施例１に同じ。 ２）微生物細胞内成分抽出試薬 塩化ベンザルコニウム ０．０２重量％ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ
【００４５】実施例３ ＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡの測定が可能な清浄度検査
試薬の調製 以下の（１）発光試薬および（３）ＲＮＡ分解酵素試薬
の組合せからなる清浄度検査試薬を調製した。 １）発光試薬 上記実施例１に同じ。 ３）ＲＮＡ分解酵素試薬。 ヌクレアーゼ・ピイ・ワン（シグマ社製ＲＮＡ分解酵素） １．２Ｕ／ｍｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ
試薬の調製 以下の（１）発光試薬および（３）ＲＮＡ分解酵素試薬
の組合せからなる清浄度検査試薬を調製した。 １）発光試薬 上記実施例１に同じ。 ３）ＲＮＡ分解酵素試薬。 ヌクレアーゼ・ピイ・ワン（シグマ社製ＲＮＡ分解酵素） １．２Ｕ／ｍｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ
【００４６】実施例４ 微生物以外の汚れ成分および微生物細胞内成分である、
ＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡの測定が可能な清浄度検査
試薬の調製 以下の（１）発光試薬、（２）微生物細胞内成分抽出試
薬および（３）ＲＮＡ分解酵素試薬の組合せからなる清
浄度検査試薬を調製した。 １）発光試薬。 実施例１に同じ。 ２）微生物細胞内成分抽出試薬 塩化ベンザルコニウム ０．０２重量％ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ ３）ＲＮＡ分解酵素試薬。 ヌクレアーゼ・ピイ・ワン（シグマ社製ＲＮＡ分解酵素） １．２Ｕ／ｍｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ
ＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡの測定が可能な清浄度検査
試薬の調製 以下の（１）発光試薬、（２）微生物細胞内成分抽出試
薬および（３）ＲＮＡ分解酵素試薬の組合せからなる清
浄度検査試薬を調製した。 １）発光試薬。 実施例１に同じ。 ２）微生物細胞内成分抽出試薬 塩化ベンザルコニウム ０．０２重量％ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ ３）ＲＮＡ分解酵素試薬。 ヌクレアーゼ・ピイ・ワン（シグマ社製ＲＮＡ分解酵素） １．２Ｕ／ｍｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ
【００４７】実施例５ 微生物以外の汚れ成分および微生物細胞内成分であるＡ
ＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰの測定が可能な清浄度検査試
薬の調製 以下の（１）発光試薬、（２）微生物細胞内成分抽出試
薬の組合せからなる清浄度検査試薬を調製した。 １）発光試薬。 実施例１の発光試薬にピルビン酸キナーゼ（シグマ社
製）５００Ｕ／ｍｌを加えた以外は、 実施例１に同
じ。 ２）微生物細胞内成分抽出試薬 塩化ベンザルコニウム ０．０２重量％ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ
ＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰの測定が可能な清浄度検査試
薬の調製 以下の（１）発光試薬、（２）微生物細胞内成分抽出試
薬の組合せからなる清浄度検査試薬を調製した。 １）発光試薬。 実施例１の発光試薬にピルビン酸キナーゼ（シグマ社
製）５００Ｕ／ｍｌを加えた以外は、 実施例１に同
じ。 ２）微生物細胞内成分抽出試薬 塩化ベンザルコニウム ０．０２重量％ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ
【００４８】実施例６ 微生物以外の汚れ成分および微生物細胞内成分であるＡ
ＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡを測定することが可
能な清浄度検査試薬の調製 以下の（１）発光試薬、（２）ＲＮＡ分解酵素試薬およ
び（３）微生物細胞内成分抽出試薬の組合せからなる清
浄度検査試薬を調製した。 １）発光試薬。 実施例１の発光試薬にピルビン酸キナーゼ（シグマ社
製）５００Ｕ／ｍｌを加えた以外は、実施例１に同じ。 ２）微生物細胞内成分抽出試薬 塩化ベンザルコニウム ０．０２重量％ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ ３）ＲＮＡ分解酵素試薬。 ヌクレアーゼ・ピイ・ワン（シグマ社製） １．２Ｕ／ｍｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ
ＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡを測定することが可
能な清浄度検査試薬の調製 以下の（１）発光試薬、（２）ＲＮＡ分解酵素試薬およ
び（３）微生物細胞内成分抽出試薬の組合せからなる清
浄度検査試薬を調製した。 １）発光試薬。 実施例１の発光試薬にピルビン酸キナーゼ（シグマ社
製）５００Ｕ／ｍｌを加えた以外は、実施例１に同じ。 ２）微生物細胞内成分抽出試薬 塩化ベンザルコニウム ０．０２重量％ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ ３）ＲＮＡ分解酵素試薬。 ヌクレアーゼ・ピイ・ワン（シグマ社製） １．２Ｕ／ｍｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ
【００４９】実施例７ （清浄度検査法）表１に記載されたサンプルを、滅菌済
み超純水に溶解または懸濁して、表１に記載された濃度
（％）に希釈して用いた。なお、サンプルが薄すぎて測
定できない場合は、より濃い濃度のサンプルを測定し、
比例計算で各濃度における発光量に換算した。 （１）この希釈水（濯ぎ液）１００μｌを測定用試験管
に採る。 （２）これに超純水１００μｌおよび上記実施例１で調
製した清浄度検査試薬（ＰＰＤＫ含有発光試薬）１００
μｌを加える。 （３）生成する発光量をベルトールド社製発光量測定器
ＬＢ９５０１（ルミノメーター）にて、１０秒後の発光
量を測定した。 なお、実施例１で調製した清浄度検査試薬は、ＡＴＰお
よびＡＭＰの測定が可能である。
み超純水に溶解または懸濁して、表１に記載された濃度
（％）に希釈して用いた。なお、サンプルが薄すぎて測
定できない場合は、より濃い濃度のサンプルを測定し、
比例計算で各濃度における発光量に換算した。 （１）この希釈水（濯ぎ液）１００μｌを測定用試験管
に採る。 （２）これに超純水１００μｌおよび上記実施例１で調
製した清浄度検査試薬（ＰＰＤＫ含有発光試薬）１００
μｌを加える。 （３）生成する発光量をベルトールド社製発光量測定器
ＬＢ９５０１（ルミノメーター）にて、１０秒後の発光
量を測定した。 なお、実施例１で調製した清浄度検査試薬は、ＡＴＰお
よびＡＭＰの測定が可能である。
【００５０】比較例１ （比較のための清浄度検査試薬の調製）上記実施例１の
清浄度検査試薬において、ピルベートオルトホスフェー
トジキナーゼを含まない以外は全く同様にして比較のた
めの清浄度検査試薬を調製した。なお、比較例１で調製
した清浄度検査試薬は、ＡＴＰの測定は可能であるが、
ＡＭＰの測定はできない。
清浄度検査試薬において、ピルベートオルトホスフェー
トジキナーゼを含まない以外は全く同様にして比較のた
めの清浄度検査試薬を調製した。なお、比較例１で調製
した清浄度検査試薬は、ＡＴＰの測定は可能であるが、
ＡＭＰの測定はできない。
【００５１】比較例２ （比較例１の清浄度検査試薬を用いた清浄度検査法）上
記実施例７の清浄度検査法において、実施例１で調製し
た「清浄度検査試薬」に代えて、比較例１で調製した
「清浄度検査試薬」を用いる以外は、全く同様にして発
光量を測定した。
記実施例７の清浄度検査法において、実施例１で調製し
た「清浄度検査試薬」に代えて、比較例１で調製した
「清浄度検査試薬」を用いる以外は、全く同様にして発
光量を測定した。
【００５２】そして、上記実施例７および比較例２で得
られたそれぞれの発光量および後者の発光量対する前者
の発光量の比をまとめて表１に示す。
られたそれぞれの発光量および後者の発光量対する前者
の発光量の比をまとめて表１に示す。
【００５３】 表１ 本発明の清浄度検査試薬と比較例のそれの発光量の比較 サンプル 濃度（％） 本発明 比較例 発光量の比 の発光量 の発光量 本発明／比較例 酵母エキス 0.001 670484 937 716 牛肉エキス 0.0001 751413 0.0125 60113040 麦芽エキス 0.01 21905 30 730 ビール 1 271585 198 1372 牛乳 0.1 69893 4851 14 ご飯 0.1 324123 141 2299 豚肉 0.01 92404 2337 40
【００５４】表１の結果から、従来のルシフェリン・ル
シフェラーゼ発光試薬（比較例の清浄度検査試薬）を用
いる清浄度検査法では、ＡＴＰ以外のＡＭＰを検出する
ことができず、本発明の清浄度検査試薬（発光試薬）と
比べると、低い値の発光量を示し、感度および精度の高
い清浄度検査を行なうことはできない。これに対し、本
発明の清浄度検査試薬を用いた場合は、比較例に比べ
て、１４倍〜６千万倍も高い値の発光量が得られ、この
ことから少ない汚れでも、感度よく清浄度検査を行える
ことがが判る。そしてまた、特に牛肉エキスを検査対象
とする場合、比較例の清浄度検査試薬を用いる場合は、
殆ど汚れを検出することができないが、本発明のそれを
用いた場合は、非常に高感度によごれを検出できること
が判る。
シフェラーゼ発光試薬（比較例の清浄度検査試薬）を用
いる清浄度検査法では、ＡＴＰ以外のＡＭＰを検出する
ことができず、本発明の清浄度検査試薬（発光試薬）と
比べると、低い値の発光量を示し、感度および精度の高
い清浄度検査を行なうことはできない。これに対し、本
発明の清浄度検査試薬を用いた場合は、比較例に比べ
て、１４倍〜６千万倍も高い値の発光量が得られ、この
ことから少ない汚れでも、感度よく清浄度検査を行える
ことがが判る。そしてまた、特に牛肉エキスを検査対象
とする場合、比較例の清浄度検査試薬を用いる場合は、
殆ど汚れを検出することができないが、本発明のそれを
用いた場合は、非常に高感度によごれを検出できること
が判る。
【００５５】実施例８ （清浄度検査法）表２に記載されたサンプルを、滅菌済
み超純水に溶解または懸濁して、０．００１重量％に希
釈して用いた。なお、サンプルのＡＴＰ濃度が薄すぎて
（１×１０ー 13 Ｍ以下）測定できない場合は（表２に
おいて、※のついたサンプルが該当する）、１重量％の
濃度のサンプルを測定し、比例計算で０．００１重量％
濃度に換算した。 （１）この希釈水（サンプル）１００μｌを測定用試験
管に採る。 （２）これに超純水１００μｌおよび上記実施例１で調
製した清浄度検査試薬（ＰＰＤＫ含有発光試薬）１００
μｌを加える。 （３）ベルトールド社製発光量測定器ＬＢ９５０１に
て、１０秒後の発光量を測定した。そしてサンプル中の
ＡＴＰおよびＡＭＰの合計された濃度を測定した。この
合計された濃度は、以下の理由により濃度既知のＡＴＰ
標準液とその発光量との関係から求めた直線性を示す検
量線を使用して求めた。 理由：ＡＴＰ濃度とその発光量から求めた検量線は、Ａ
ＭＰ濃度とその発光量から求めた検量線と、ほぼ同一と
なるので、ＡＴＰとＡＭＰの合計濃度は、ＡＴＰ濃度と
その発光量から求めた検量線を用いて測定することがで
きる。その結果を表２の「実施例（イ）ＡＴＰ＋ＡＭ
Ｐ」欄に示した。
み超純水に溶解または懸濁して、０．００１重量％に希
釈して用いた。なお、サンプルのＡＴＰ濃度が薄すぎて
（１×１０ー 13 Ｍ以下）測定できない場合は（表２に
おいて、※のついたサンプルが該当する）、１重量％の
濃度のサンプルを測定し、比例計算で０．００１重量％
濃度に換算した。 （１）この希釈水（サンプル）１００μｌを測定用試験
管に採る。 （２）これに超純水１００μｌおよび上記実施例１で調
製した清浄度検査試薬（ＰＰＤＫ含有発光試薬）１００
μｌを加える。 （３）ベルトールド社製発光量測定器ＬＢ９５０１に
て、１０秒後の発光量を測定した。そしてサンプル中の
ＡＴＰおよびＡＭＰの合計された濃度を測定した。この
合計された濃度は、以下の理由により濃度既知のＡＴＰ
標準液とその発光量との関係から求めた直線性を示す検
量線を使用して求めた。 理由：ＡＴＰ濃度とその発光量から求めた検量線は、Ａ
ＭＰ濃度とその発光量から求めた検量線と、ほぼ同一と
なるので、ＡＴＰとＡＭＰの合計濃度は、ＡＴＰ濃度と
その発光量から求めた検量線を用いて測定することがで
きる。その結果を表２の「実施例（イ）ＡＴＰ＋ＡＭ
Ｐ」欄に示した。
【００５６】
比較例３ また、比較のため、本実施例の清浄度検査方法におい
て、「実施例１で調製した清浄度検査試薬」を用いる代
わりに「比較例で調製した清浄度検査試薬」を用いる以
外は、全く同様に清浄度検査法を実施し、検体中のＡＴ
Ｐ濃度を求めた。その結果を「比較例（ロ）」の欄に示
した。
て、「実施例１で調製した清浄度検査試薬」を用いる代
わりに「比較例で調製した清浄度検査試薬」を用いる以
外は、全く同様に清浄度検査法を実施し、検体中のＡＴ
Ｐ濃度を求めた。その結果を「比較例（ロ）」の欄に示
した。
【００５７】比較例３のＡＴＰ濃度に対する本実施例の
それの値（ＡＴＰ濃度の比）を求め、その結果を「実施
例（イ）／比較例（ロ）」欄に示した。
それの値（ＡＴＰ濃度の比）を求め、その結果を「実施
例（イ）／比較例（ロ）」欄に示した。
【００５８】 表２ 本発明の清浄度検査試薬と比較例のそれの検出ＡＴＰ濃度の比較 サンプル 実施例（イ） 比較例（ロ） ＡＴＰ濃度の比 ＡＴＰ＋ＡＭＰ ＡＴＰ 実施例（イ） ／比較例（ロ） 酵母エキス ４．７１×１０-9 ２．１４×１０-11 ２２０ ※牛肉エキス ３．６９×１０-8 １．６９×１０-15 ２１８０００００ ※麦芽エキス １．３７×１０-11 ６．９７×１０-14 １９７ ※ビール １．８６×１０-12 ４．１９×１０-15 ４４４ 牛乳 ４．７６×１０-12 ９．２９×１０-13 ５ ※ご飯 １．５９×１０-11 ２．３６×１０-14 ６７４ 豚肉 ４．０２×１０-11 ５．６１×１０-12 ７
【００５９】表２の結果から、牛肉エキス、麦芽エキ
ス、ビールおよびご飯をサンプルとする場合、それらの
ＡＴＰ濃度が薄すぎて（１×１０ー 13 Ｍ以下 ）、従来
のルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬（比較例の清
浄度検査試薬）では、測定できないことが判る。そし
て、また従来のＡＴＰ法による清浄度検査法では、汚染
指標としてＡＴＰ以外のＡＭＰを検出することができ
ず、本発明のＰＰＤＫ含有発光試薬と比べると、低い値
の発光量を示し、精度の高い清浄度検査を行なうことは
できない。これに対し、本発明の発光試薬を用いた場合
は、比較例に比べて、５倍（測定対象：牛乳）〜約２千
万倍（同：牛肉エキス）も高い値のＡＴＰ量の測定が可
能で、汚れを感度よく検査できることがが判る。すなわ
ち、同一のルミノメーターで測定すれば、５分の１〜２
千万分の１という非常に少ない汚れを検出することがで
きる。そして、特に牛肉エキスを検査対象とする場合
は、ＡＴＰが殆ど分解されており、ＡＴＰを指標として
清浄度検査行なう従来法では、汚れを検査することが難
しいことが判る。これに対し本発明によれば、ＡＴＰお
よびＡＭＰを指標とするためＡＴＰを指標にした場合に
比べ、２千万倍も高感度検査をすることができることが
判る。
ス、ビールおよびご飯をサンプルとする場合、それらの
ＡＴＰ濃度が薄すぎて（１×１０ー 13 Ｍ以下 ）、従来
のルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬（比較例の清
浄度検査試薬）では、測定できないことが判る。そし
て、また従来のＡＴＰ法による清浄度検査法では、汚染
指標としてＡＴＰ以外のＡＭＰを検出することができ
ず、本発明のＰＰＤＫ含有発光試薬と比べると、低い値
の発光量を示し、精度の高い清浄度検査を行なうことは
できない。これに対し、本発明の発光試薬を用いた場合
は、比較例に比べて、５倍（測定対象：牛乳）〜約２千
万倍（同：牛肉エキス）も高い値のＡＴＰ量の測定が可
能で、汚れを感度よく検査できることがが判る。すなわ
ち、同一のルミノメーターで測定すれば、５分の１〜２
千万分の１という非常に少ない汚れを検出することがで
きる。そして、特に牛肉エキスを検査対象とする場合
は、ＡＴＰが殆ど分解されており、ＡＴＰを指標として
清浄度検査行なう従来法では、汚れを検査することが難
しいことが判る。これに対し本発明によれば、ＡＴＰお
よびＡＭＰを指標とするためＡＴＰを指標にした場合に
比べ、２千万倍も高感度検査をすることができることが
判る。
【００６０】実施例９ 表３に記載されたサンプルを、滅菌済み超純水に溶解ま
たは懸濁して、０．００１重量％に希釈して用いた。な
お、サンプルが薄すぎて（表２において、※のついたサ
ンプルが該当する）測定できない場合（１×１０ー 13Ｍ
以下）は、より濃い濃度のサンプルを測定し、比例計算
で０．００１重量％濃度に換算した。 （１）この希釈水（サンプル）１００μｌを測定用試験
管に採る。 （２）これに実施例３で調製したＲＮＡ分解酵素試薬１
００μｌを加え、室温で１５分間放置する。 サンプル
に含まれるＲＮＡを分解し、ＡＭＰに変換する。 （３）上記実施例３で調製した清浄度検査試薬（ＰＰＤ
Ｋ含有発光試薬）１００μｌを加える。 （４）ベルトールド社製発光量測定器ＬＢ９５０１（ル
ミノメーター）にて、１０秒後の発光量を測定した。そ
してサンプル中のＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡ由来のＡ
ＭＰの成分の合計された濃度を測定した。この合計され
た濃度は、以下の理由によりＡＴＰ濃度と発光量を示す
検量線を用いて測定した。 理由：ＡＴＰ濃度と発光量を示す検量線は、ＡＭＰ濃度
と発光量を示す検量線と、ほぼ同一となるので、ＡＴＰ
とＡＭＰの合計濃度は、ＡＴＰ濃度と発光量を示す検量
線を用いて測定することができる。その結果を表３にＡ
ＴＰ＋ＡＭＰ＋ＲＮＡ欄に示した。また、比較例の清浄
度検査試薬を用いて得られるＡＴＰ濃度に対する本実施
例のそれの比較値を求め、その結果を「実施例（イ）／
比較例（ロ）」欄に示した。
たは懸濁して、０．００１重量％に希釈して用いた。な
お、サンプルが薄すぎて（表２において、※のついたサ
ンプルが該当する）測定できない場合（１×１０ー 13Ｍ
以下）は、より濃い濃度のサンプルを測定し、比例計算
で０．００１重量％濃度に換算した。 （１）この希釈水（サンプル）１００μｌを測定用試験
管に採る。 （２）これに実施例３で調製したＲＮＡ分解酵素試薬１
００μｌを加え、室温で１５分間放置する。 サンプル
に含まれるＲＮＡを分解し、ＡＭＰに変換する。 （３）上記実施例３で調製した清浄度検査試薬（ＰＰＤ
Ｋ含有発光試薬）１００μｌを加える。 （４）ベルトールド社製発光量測定器ＬＢ９５０１（ル
ミノメーター）にて、１０秒後の発光量を測定した。そ
してサンプル中のＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡ由来のＡ
ＭＰの成分の合計された濃度を測定した。この合計され
た濃度は、以下の理由によりＡＴＰ濃度と発光量を示す
検量線を用いて測定した。 理由：ＡＴＰ濃度と発光量を示す検量線は、ＡＭＰ濃度
と発光量を示す検量線と、ほぼ同一となるので、ＡＴＰ
とＡＭＰの合計濃度は、ＡＴＰ濃度と発光量を示す検量
線を用いて測定することができる。その結果を表３にＡ
ＴＰ＋ＡＭＰ＋ＲＮＡ欄に示した。また、比較例の清浄
度検査試薬を用いて得られるＡＴＰ濃度に対する本実施
例のそれの比較値を求め、その結果を「実施例（イ）／
比較例（ロ）」欄に示した。
【００６１】 表３ 本発明の清浄度検査試薬と比較例のそれの検出ＡＴＰ濃度の比較 サンプル 実施例（イ） 比較例（ロ） ＡＴＰ濃度の比 ＡＴＰ＋ＡＭＰ ＡＴＰ 実施例（イ） ＋ＲＮＡ ／比較例（ロ） 酵母エキス ９．５８×１０-9 ２．１４×１０-11 ４４８ ※牛肉エキス ５．４５×１０-8 １．６９×１０-15 ３２２０００００ ※麦芽エキス １．９３×１０-11 ６．９７×１０-14 ２７７ ※ビール ２．５８×１０-12 ４．１９×１０-15 ６１６ 牛乳 １．１５×１０-11 ９．２９×１０-13 １２ ※ご飯 ３．７０×１０-11 ２．３６×１０-14 １５６８ 豚肉 １．７１×１０-10 ５．６１×１０-12 ３０
【００６２】表２および表３の結果から、発光試薬とＲ
ＮＡ分解酵素試薬との組合せからなる実施例３で調製し
た清浄度検査試薬（ＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡの測定
が可能）は、ＲＮＡ分解酵素試薬を用いない実施例１で
調製した清浄度検査試薬（ＡＴＰおよびＡＭＰの測定が
可能）に比べて、酵母エキス：約２倍（４４８／２２
０）、牛肉エキス：約１．５倍（約３千万／約２千
万）、麦芽エキス：１．４倍（２７７／１９７）、ビー
ル：１．３倍（６１６／４４４）、牛乳：２．４倍（１
２／５）、ご飯：２．３倍（１５６８／６７４）、豚
肉：４．５倍（３０／７）もそれぞれ感度が良好になる
ことが判った。
ＮＡ分解酵素試薬との組合せからなる実施例３で調製し
た清浄度検査試薬（ＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡの測定
が可能）は、ＲＮＡ分解酵素試薬を用いない実施例１で
調製した清浄度検査試薬（ＡＴＰおよびＡＭＰの測定が
可能）に比べて、酵母エキス：約２倍（４４８／２２
０）、牛肉エキス：約１．５倍（約３千万／約２千
万）、麦芽エキス：１．４倍（２７７／１９７）、ビー
ル：１．３倍（６１６／４４４）、牛乳：２．４倍（１
２／５）、ご飯：２．３倍（１５６８／６７４）、豚
肉：４．５倍（３０／７）もそれぞれ感度が良好になる
ことが判った。
【００６３】実施例１０ （１）無菌水で湿らせた綿棒で、しゃもじの表面を拭き
取る（１０ｃｍ2）。なお、このしゃもじは、炊飯米を
わけるために使用した「しゃもじ」を軽く水で濯いだも
のである。 （２）綿棒を無菌水（超純水）を入れた試験管の中で濯
いだ。そして濯ぎ液５ｍｌを得る。 （３）測定用試験管Ａ，Ｂに、濯ぎ液を１００μｌづつ
入れる。 （４）一方の試験管Ａには超純水１００μｌを加える。
他方の試験管Ｂには、実施例３で調製したＲＮＡ分解酵
素試薬１００μｌを加え、室温で１５分放置する（サン
プルに含まれるＲＮＡを分解し、ＡＭＰに変換する）。 （５）試験管Ａおよび試験管Ｂに、それぞれ実施例１お
よび実施例３で調製した清浄度検査試薬（発光試薬）１
００μｌを加える。 （５）ベルトールド社製発光量測定器ＬＢ９５０１（ル
ミノメーター）にて、１０秒後の発光量を測定した。そ
して、濯ぎ液のＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡ由来のＡＭ
Ｐの濃度の合計量を測定した。ＡＭＰの濃度は、ＡＴＰ
に換算して求めた。それらの結果をまとめて表４に示
す。
取る（１０ｃｍ2）。なお、このしゃもじは、炊飯米を
わけるために使用した「しゃもじ」を軽く水で濯いだも
のである。 （２）綿棒を無菌水（超純水）を入れた試験管の中で濯
いだ。そして濯ぎ液５ｍｌを得る。 （３）測定用試験管Ａ，Ｂに、濯ぎ液を１００μｌづつ
入れる。 （４）一方の試験管Ａには超純水１００μｌを加える。
他方の試験管Ｂには、実施例３で調製したＲＮＡ分解酵
素試薬１００μｌを加え、室温で１５分放置する（サン
プルに含まれるＲＮＡを分解し、ＡＭＰに変換する）。 （５）試験管Ａおよび試験管Ｂに、それぞれ実施例１お
よび実施例３で調製した清浄度検査試薬（発光試薬）１
００μｌを加える。 （５）ベルトールド社製発光量測定器ＬＢ９５０１（ル
ミノメーター）にて、１０秒後の発光量を測定した。そ
して、濯ぎ液のＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡ由来のＡＭ
Ｐの濃度の合計量を測定した。ＡＭＰの濃度は、ＡＴＰ
に換算して求めた。それらの結果をまとめて表４に示
す。
【００６４】 表４（しゃもじの濯ぎ廃液の清浄度検査結果） 項目 清浄度検査試薬 汚れ成分 ＡＴＰ濃度 区分 の特徴 の指標 （Ｍ濃度） 相対値 比較例 ＰＰＤＫ非含有 ＡＴＰのみ 2.36×10ー 12 １ （比較例１調製品） 本発明 ＰＰＤＫ含有 ＡＴＰ 1.97×10ー 9 834 （実施例１調製品） ＋ＡＭＰ 本発明 ＰＰＤＫ ＡＴＰ 3.13×10-9 1326 ＋ＲＮＡ分解酵素 ＋ＡＭＰ （実施例３調製品） ＋ＲＮＡ
【００６５】実施例１１ （１）超純水で湿らせた綿棒で、しゃもじ（検査箇所）
（１０ｃｍ2）を拭き取った。このしゃもじは、炊飯米
をわけるために使用した「しゃもじ」を軽く水で濯い
で、これに、古くなった炊飯米から分離した雑菌の懸濁
液を噴霧したものである。 （２）この綿棒を、実施例２で調製した細胞内成分抽出
試薬液５ｍｌを入れた試験管の中で濯いだ。雑菌以外の
汚れと雑菌の細胞内成分であるＡＴＰがそれぞれ抽出さ
れた濯ぎ液５ｍｌを得た。 （３）４本の測定用試験管Ａ，Ｂ，ＣおよびＤにそれぞ
れ濯ぎ液（サンプル）１００μｌを取った。 （４）ついで、試験管Ａおよび試験管Ｂにはそれぞれ超
純水１００μｌを、また試験管Ｃおよび試験管Ｄには、
それぞれ実施例４および実施例６で調製したＲＮＡ分解
酵素試薬１００μｌを加え、室温で１５分放置する（サ
ンプルに含まれるＲＮＡを分解し、ＡＭＰに変換す
る）。 （５）ついで、試験官Ａ，Ｂ，ＣおよびＤにそれぞれ実
施例２、実施例５、実施例４および実施例６で調製した
発光試薬１００μｌを添加し、ベルトールド社製発光量
測定器ＬＢ９５０１（ルミノメーター）にて、１０秒後
の発光量を測定した。そしてサンプル中のＡＴＰ、ＡＤ
Ｐ、ＡＭＰおよびＲＮＡ由来のＡＭＰの成分の合計され
た濃度を測定した。なお、ＡＭＰの濃度は、ＡＴＰに換
算して求めた。それらの結果をまとめて表５に示す。
（１０ｃｍ2）を拭き取った。このしゃもじは、炊飯米
をわけるために使用した「しゃもじ」を軽く水で濯い
で、これに、古くなった炊飯米から分離した雑菌の懸濁
液を噴霧したものである。 （２）この綿棒を、実施例２で調製した細胞内成分抽出
試薬液５ｍｌを入れた試験管の中で濯いだ。雑菌以外の
汚れと雑菌の細胞内成分であるＡＴＰがそれぞれ抽出さ
れた濯ぎ液５ｍｌを得た。 （３）４本の測定用試験管Ａ，Ｂ，ＣおよびＤにそれぞ
れ濯ぎ液（サンプル）１００μｌを取った。 （４）ついで、試験管Ａおよび試験管Ｂにはそれぞれ超
純水１００μｌを、また試験管Ｃおよび試験管Ｄには、
それぞれ実施例４および実施例６で調製したＲＮＡ分解
酵素試薬１００μｌを加え、室温で１５分放置する（サ
ンプルに含まれるＲＮＡを分解し、ＡＭＰに変換す
る）。 （５）ついで、試験官Ａ，Ｂ，ＣおよびＤにそれぞれ実
施例２、実施例５、実施例４および実施例６で調製した
発光試薬１００μｌを添加し、ベルトールド社製発光量
測定器ＬＢ９５０１（ルミノメーター）にて、１０秒後
の発光量を測定した。そしてサンプル中のＡＴＰ、ＡＤ
Ｐ、ＡＭＰおよびＲＮＡ由来のＡＭＰの成分の合計され
た濃度を測定した。なお、ＡＭＰの濃度は、ＡＴＰに換
算して求めた。それらの結果をまとめて表５に示す。
【００６６】 表５（雑菌に汚染された、しゃもじの濯ぎ廃液の清浄度検査結果） 項目 清浄度検査試薬 細胞内成分 ＡＴＰ濃度 区分 の特徴 の指標 （Ｍ濃度） 相対値 比較例 ＰＰＤＫ非含有 ＡＴＰのみ 1.58×10ー 10 １ （比較例１調製品） 本発明 ＰＰＤＫ含有 ＡＴＰ 2.03×10ー 9 13 （実施例２調製品） ＋ＡＭＰ 本発明 ＰＰＤＫ含有 ＡＴＰ 3.15×10ー 9 20 （実施例５調製品） ＋ＡＤＰ ＋ＡＭＰ 本発明 ＰＰＤＫ ＡＴＰ 9.26×10-9 59 ＋ＲＮＡ分解酵素 ＋ＡＭＰ （実施例４調製品） ＋ＲＮＡ 本発明 ＰＰＤＫ ＡＴＰ 1.04×10-8 66 ＋ＲＮＡ分解酵素 ＋ＡＤＰ （実施例６調製品） ＋ＡＭＰ ＋ＲＮＡ
【００６７】実施例１２ （１）超純水で湿らせた綿棒で、 使用直後の挽肉製造
機の射出孔付近を軽く水で濯ぎ、その表面を拭き取った
（１０ｃｍ2）。 （２）綿棒を超純水を入れた試験管の中で濯いだ。そし
て濯ぎ液５ｍｌを得た。 （３）測定用試験管ＡおよびＢにそれぞれ濯ぎ液１００
μｌを取った。 （４）ついで試験官Ａには超純水１００μｌを、そして
試験管Ｂには、実施例３で調製したＲＮＡ分解酵素試薬
１００μｌを加え、室温で１５分放置した（サンプルに
含まれるＲＮＡを分解し、ＡＭＰに変換する）。 （５）ついで、試験官ＡおよびＢに、それぞれ実施例１
および実施例３で調製した発光試薬１００μｌを添加
し、ベルトールド社製発光量測定器ＬＢ９５０１（ルミ
ノメーター）にて、１０秒後の発光量を測定した。そし
て、濯ぎ液のＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡ由来のＡＭＰ
の濃度の合計量を測定した。ＡＭＰの濃度は、ＡＴＰに
換算して求めた。それらの結果をまとめて表６に示す。
機の射出孔付近を軽く水で濯ぎ、その表面を拭き取った
（１０ｃｍ2）。 （２）綿棒を超純水を入れた試験管の中で濯いだ。そし
て濯ぎ液５ｍｌを得た。 （３）測定用試験管ＡおよびＢにそれぞれ濯ぎ液１００
μｌを取った。 （４）ついで試験官Ａには超純水１００μｌを、そして
試験管Ｂには、実施例３で調製したＲＮＡ分解酵素試薬
１００μｌを加え、室温で１５分放置した（サンプルに
含まれるＲＮＡを分解し、ＡＭＰに変換する）。 （５）ついで、試験官ＡおよびＢに、それぞれ実施例１
および実施例３で調製した発光試薬１００μｌを添加
し、ベルトールド社製発光量測定器ＬＢ９５０１（ルミ
ノメーター）にて、１０秒後の発光量を測定した。そし
て、濯ぎ液のＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡ由来のＡＭＰ
の濃度の合計量を測定した。ＡＭＰの濃度は、ＡＴＰに
換算して求めた。それらの結果をまとめて表６に示す。
【００６８】 表６（挽肉製造機の濯ぎ廃液の清浄度検査結果） 項目 清浄度検査試薬 汚れ成分 ＡＴＰ濃度 区分 の特徴 の指標 （Ｍ濃度） 相対値 比較例 ＰＰＤＫ非含有 ＡＴＰのみ 1.60×10ー 10 1 （比較例１調製品） 本発明 ＰＰＤＫ含有 ＡＴＰ 1.44×10ー 9 9 （実施例１調製品） ＋ＡＭＰ 本発明 ＰＰＤＫ ＡＴＰ 6.58×10-9 41 ＋ＲＮＡ分解酵素 ＋ＡＭＰ （実施例３調製品） ＋ＲＮＡ
【００６９】実施例１３ （１）超純水で湿らせた綿棒で、使用直後の挽肉製造機
の射出孔付近を軽く水で濯ぎ、この表面に古くなったブ
タ肉から分離した雑菌の懸濁液を噴霧した箇所（検査箇
所）（１０ｃｍ2）を拭き取った。 （２）この綿棒を、実施例２で調製した細胞内成分抽出
試薬液５ｍｌを入れた試験管の中で濯いだ。雑菌以外の
汚れと雑菌の細胞内成分であるＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲ
ＮＡがそれぞれ抽出された濯ぎ液５ｍｌを得た。 （３）４本の測定用試験管Ａ，Ｂ，ＣおよびＤにそれぞ
れ濯ぎ液（サンプル）１００μｌを取った。 （４）ついで、試験管Ａおよび試験管Ｂにはそれぞれ超
純水１００μｌを、また試験管Ｃおよび試験管Ｄには、
それぞれ実施例４および実施例６で調製したＲＮＡ分解
酵素試薬１００μｌを加え、室温で１５分放置する（サ
ンプルに含まれるＲＮＡを分解し、ＡＭＰに変換す
る）。 （５）ついで、試験官Ａ，Ｂ，ＣおよびＤにそれぞれ実
施例２、実施例５、実施例４および実施例６で調製した
発光試薬１００μｌを添加し、ベルトールド社製発光量
測定器ＬＢ９５０１（ルミノメーター）にて、１０秒後
の発光量を測定した。そしてサンプル中のＡＴＰ、ＡＤ
Ｐ、ＡＭＰおよびＲＮＡ由来のＡＭＰの成分の合計され
た濃度を測定した。なお、ＡＭＰの濃度は、ＡＴＰに換
算して求めた。それらの結果をまとめて表７に示す。
の射出孔付近を軽く水で濯ぎ、この表面に古くなったブ
タ肉から分離した雑菌の懸濁液を噴霧した箇所（検査箇
所）（１０ｃｍ2）を拭き取った。 （２）この綿棒を、実施例２で調製した細胞内成分抽出
試薬液５ｍｌを入れた試験管の中で濯いだ。雑菌以外の
汚れと雑菌の細胞内成分であるＡＴＰ、ＡＭＰおよびＲ
ＮＡがそれぞれ抽出された濯ぎ液５ｍｌを得た。 （３）４本の測定用試験管Ａ，Ｂ，ＣおよびＤにそれぞ
れ濯ぎ液（サンプル）１００μｌを取った。 （４）ついで、試験管Ａおよび試験管Ｂにはそれぞれ超
純水１００μｌを、また試験管Ｃおよび試験管Ｄには、
それぞれ実施例４および実施例６で調製したＲＮＡ分解
酵素試薬１００μｌを加え、室温で１５分放置する（サ
ンプルに含まれるＲＮＡを分解し、ＡＭＰに変換す
る）。 （５）ついで、試験官Ａ，Ｂ，ＣおよびＤにそれぞれ実
施例２、実施例５、実施例４および実施例６で調製した
発光試薬１００μｌを添加し、ベルトールド社製発光量
測定器ＬＢ９５０１（ルミノメーター）にて、１０秒後
の発光量を測定した。そしてサンプル中のＡＴＰ、ＡＤ
Ｐ、ＡＭＰおよびＲＮＡ由来のＡＭＰの成分の合計され
た濃度を測定した。なお、ＡＭＰの濃度は、ＡＴＰに換
算して求めた。それらの結果をまとめて表７に示す。
【００７０】 表７（雑菌に汚染された、挽肉製造機の濯ぎ廃液の清浄度検査結果） 項目 清浄度検査試薬 細胞内成分 ＡＴＰ濃度 区分 の特徴 の指標 （Ｍ濃度） 相対値 比較例 ＰＰＤＫ非含有 ＡＴＰのみ 1.36×10ー 10 1 （比較例１調製品） 本発明 ＰＰＤＫ含有 ＡＴＰ 3.16×10ー 9 23 （実施例２調製品） ＋ＡＭＰ 本発明 ＰＰＤＫ含有 ＡＴＰ 4.38×10ー 9 32 （実施例５調製品） ＋ＡＤＰ ＋ＡＭＰ 本発明 ＰＰＤＫ ＡＴＰ 9.86×10-9 72 ＋ＲＮＡ分解酵素 ＋ＡＭＰ （実施例４調製品） ＋ＲＮＡ 本発明 ＰＰＤＫ ＡＴＰ 1.11×10-8 81 ＋ＲＮＡ分解酵素 ＋ＡＤＰ （実施例６調製品） ＋ＡＭＰ ＋ＲＮＡ
【００７１】
【発明の効果】本発明は、ＰＰＤＫ含有発光試薬を用い
るものであるから、汚れの指標成分であるＡＴＰに加
え、従来のルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬では
測定が困難であったＡＤＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡも同時
に測定して、少い汚れでも、感度よく検出して、精度よ
く清浄度を評価できる。また上記ＰＰＤＫ含有発光試薬
にさらに、「ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触媒す
る酵素」および／または「ＲＮＡ分解酵素」を添加利用
するものであるから、汚れの指標成分であるＡＴＰおよ
びＡＭＰに加え、さらにＡＤＰおよびＲＮＡも同時に測
定して、さらに少ない汚れを、感度よく検出して、より
精度の高い清浄度検査を行なうことができる。
るものであるから、汚れの指標成分であるＡＴＰに加
え、従来のルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬では
測定が困難であったＡＤＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡも同時
に測定して、少い汚れでも、感度よく検出して、精度よ
く清浄度を評価できる。また上記ＰＰＤＫ含有発光試薬
にさらに、「ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触媒す
る酵素」および／または「ＲＮＡ分解酵素」を添加利用
するものであるから、汚れの指標成分であるＡＴＰおよ
びＡＭＰに加え、さらにＡＤＰおよびＲＮＡも同時に測
定して、さらに少ない汚れを、感度よく検出して、より
精度の高い清浄度検査を行なうことができる。
Claims (7)
- 【請求項１】ピルベートオルトホスフェートジキナー
ゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、ルシフェ
リン、ルシフェラーゼおよび金属塩を含むことを特徴と
する清浄度検査試薬。 - 【請求項２】ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触媒す
る酵素、微生物細胞内成分抽出試薬およびＲＮＡ分解酵
素からなる群から選ばれる少なくとも１種と、ピルベー
トオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホエノールピル
ビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼお
よび金属塩とを含むことを特徴とする清浄度検査試薬。 - 【請求項３】ＡＤＰ、ＡＭＰおよびＲＮＡからなる群よ
り選ばれる少なくとも一種と、ＡＴＰとを指標として測
定することを特徴とする清浄度検査法。 - 【請求項４】検査箇所に汚れ採取用担体を接触させて、
該汚れの付着した担体を得、次いでこれに無菌水を接触
させ、得られる接触液に、ピルベートオルトホスフェー
トジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン
酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩を含む
清浄度検査試薬を添加し、生成する発光量を測定するこ
とを特徴とする清浄度検査法。 - 【請求項５】検査箇所に汚れ採取用担体を接触させて、
該汚れの付着した担体を得、次いでこれに微生物細胞内
成分抽出試薬を接触させ、得られる接触液に、ＡＤＰか
らＡＴＰを生成する反応を触媒する酵素およびＲＮＡ分
解酵素からなる群から選ばれる少なくとも１種と、ピル
ベートオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホエノール
ピルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシフェラー
ゼおよび金属塩を含む清浄度検査試薬とを添加し、生成
する発光量を測定することを特徴とする清浄度検査法。 - 【請求項６】検査対象物または、その処理物に、ピルベ
ートオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホエノールピ
ルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼ
および金属塩を含む清浄度検査試薬を添加し、生成する
発光量を測定することを特徴とする清浄度検査法。 - 【請求項７】検査対象物または、その処理物に、ＡＤＰ
からＡＴＰを生成する反応を触媒する酵素、微生物細胞
内成分抽出試薬およびＲＮＡ分解酵素からなる群から選
ばれる少なくとも１種と、ピルベートオルトホスフェー
トジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン
酸、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび金属塩を含む
清浄度検査試薬とを添加し、生成する発光量を測定する
ことを特徴とする清浄度検査法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24598597A JPH1169997A (ja) | 1997-08-28 | 1997-08-28 | 清浄度検査試薬およびその試薬を用いる清浄度検査法 |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24598597A JPH1169997A (ja) | 1997-08-28 | 1997-08-28 | 清浄度検査試薬およびその試薬を用いる清浄度検査法 |
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ID=17141766
Family Applications (1)
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|---|---|
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