JPWO2018147442A1 - 生体関連サンプル及び生体関連器具の清浄度測定キット及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ルシフェリン+ATP+O2→オキシルシフェリン+アデノシン一リン酸(AMP)+ピロリン酸(PPi)+CO2+光
ルシフェラーゼは細菌、原生動物、軟体動物、昆虫などに見出される。ルシフェラーゼを有する昆虫としては甲虫、例えばホタルやコメツキムシが挙げられる。ルシフェラーゼ遺伝子は多数単離されておりその塩基配列も決定されている。
特許文献2は、ATP、アデノシン一リン酸(AMP)及びアデノシン二リン酸(ADP)を測定する清浄度検査法を記載している。この方法には、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ(PPDK)、ホスホエノールピルビン酸(PEP)、ピロリン酸(PPi)、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩、並びにピルビン酸キナーゼ(PK)が使用されている。測定サンプルは酵母エキス、牛肉エキス、麦芽エキス、ビール、牛乳、ご飯、豚肉である。
特許文献5はATP及びAMPの測定方法を記載している。
[1] 血液関連サンプル又は血液関連器具の清浄度を測定するためのキットであって、ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を含む、前記キット。
[2] 生体関連サンプル又は生体関連器具の清浄度を測定するためのキットであって、ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を含む、前記キット。
[3] ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素が、ピルビン酸キナーゼ(PK)、酢酸キナーゼ(AK)、クレアチンキナーゼ(CK)、ポリリン酸キナーゼ(PPK)、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、グリセロールキナーゼ、フルクトキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、リボフラビンキナーゼ、及びフルクトースビスホスファターゼからなる群より選択される、1又は2に記載のキット。
[4] さらに、AMPからADP又はATPを生成する反応を触媒する酵素を含む、1〜3のいずれかに記載のキット。
[5] 前記AMPからADP又はATPを生成する反応を触媒する酵素が、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ(PPDK)、アデニル酸キナーゼ(ADK)又はピルビン酸ウォータージキナーゼ(PWDK)である、4に記載のキット。
[6] 血液関連サンプル又は血液関連器具の清浄度を測定するためのキットであって、AMPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を含む、前記キット。
[7] 生体関連サンプル又は生体関連器具の清浄度を測定するためのキットであって、AMPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を含む、前記キット。
[8] 前記AMPからATPを生成する反応を触媒する酵素が、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ(PPDK)又はピルビン酸ウォータージキナーゼ(PWDK)であり、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素が、ADP依存性ヘキソキナーゼ又はアピラーゼである、6又は7に記載のキット。
[9] 前記血液関連サンプルが、血液が付着又は残留する可能性のあるサンプルである、或いは前記血液関連器具が、血液が付着又は残留する可能性のある器具である、1、3〜6及び8のいずれかに記載のキット。
[10] 前記生体関連サンプルが、含まれるATPが分解された可能性のある生体由来の物質が付着又は残留する可能性のあるサンプルである、或いは前記生体関連器具が、含まれるATPが分解された可能性のある生体由来の物質が付着又は残留する可能性のある器具である、2〜5及び7〜8のいずれかに記載のキット。
[11] 前記生体関連サンプルが、汗が付着又は残留する可能性のあるサンプルである、或いは前記生体関連器具が、汗が付着又は残留する可能性のある器具である、10に記載のキット。
[12] 前記血液関連器具又は生体関連器具が、内視鏡である、1〜8のいずれかに記載のキット。
[13] 血液関連サンプル又は血液関連器具の清浄度を測定する方法であって、ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を使用する、前記方法。
[14] 生体関連サンプル又は生体関連器具の清浄度を測定する方法であって、ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を使用する、前記方法。
[15] ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素が、ピルビン酸キナーゼ(PK)、酢酸キナーゼ(AK)、クレアチンキナーゼ(CK)、ポリリン酸キナーゼ(PPK)、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、グリセロールキナーゼ、フルクトキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、リボフラビンキナーゼ、及びフルクトースビスホスファターゼからなる群より選択される、13又は14に記載の方法。
[16] さらに、AMPからADP又はATPを生成する反応を触媒する酵素を含む、13〜15のいずれかに記載の方法。
[17] 前記AMPからADP又はATPを生成する反応を触媒する酵素が、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ(PPDK)、アデニル酸キナーゼ(ADK)又はピルビン酸ウォータージキナーゼ(PWDK)である、16に記載の方法。
[18] 血液関連サンプル又は血液関連器具の清浄度を測定する方法であって、AMPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を使用する、前記方法。
[19] 生体関連サンプル又は生体関連器具の清浄度を測定する方法であって、AMPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を使用する、前記方法。
[20] 前記AMPからATPを生成する反応を触媒する酵素が、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ(PPDK)又はピルビン酸ウォータージキナーゼ(PWDK)であり、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素が、ADP依存性ヘキソキナーゼ又はアピラーゼである、18又は19に記載の方法。
[21] 前記血液関連サンプルが、血液が付着又は残留する可能性のあるサンプルである、或いは前記血液関連器具が、血液が付着又は残留する可能性のある器具である、13及び15〜18及び20のいずれかに記載の方法。
[22] 前記生体関連サンプルが、含まれるATPが分解された可能性のある生体由来の物質が付着又は残留する可能性のあるサンプルである、或いは前記生体関連器具が、含まれるATPが分解された可能性のある生体由来の物質が付着又は残留する可能性のある器具である、14〜17及び19〜20のいずれかに記載の方法。
[23] 前記生体関連サンプルが、汗が付着又は残留する可能性のあるサンプルである、或いは前記生体関連器具が、汗が付着又は残留する可能性のある器具である、22に記載の方法。
[24] 前記血液関連器具又は生体関連器具が、内視鏡である、13〜20のいずれかに記載の方法。
ある実施形態において、本発明のキットは、ルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む。この場合、マグネシウム、マンガン、カルシウムなどの金属イオンも含まれうる。当業者であれば用いる酵素に応じて金属イオンの濃度を決定することができる。必要なルシフェラーゼによりATP、O2及びルシフェリンはAMP、ピロリン酸、CO2及びオキシルシフェリンに変換され、このとき発光がもたらされる。ルシフェラーゼは、天然ルシフェラーゼでもよく、遺伝子工学的に操作された組換えルシフェラーゼ変異体であってもよい。ルシフェラーゼ変異体は、部位特異的突然変異導入又はランダム突然変異導入されたものであってもよい。他の機能を有するタンパク質との融合タンパク質でもよい。ルシフェラーゼ変異体は、耐熱性が向上したもの、界面活性剤耐性が向上したもの等、所望の性質を有するものでありうる。
ルシフェリンは、用いるルシフェラーゼにより基質として認識されるものであればどのようなものでもよく、天然のもの又は化学合成されたものでもよい。また任意の公知のルシフェリン誘導体を用いることもできる。ルシフェリンの基本骨格はイミダゾピラジノンであり、多くの互変異性体がある。ルシフェリンとしては、ホタルルシフェリンが挙げられる。ホタルルシフェリンはホタルルシフェラーゼ(EC 1.13.12.7)の基質である。ルシフェリン誘導体は特開2007−91695、特表2010−523149(国際公開2008/127677号)等に記載されているものであり得る。
ある実施形態において、本発明の方法は、ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素を使用する。ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素により、系に存在するADPはATPに変換される。次いで、ATPがルシフェラーゼによりAMPに変換されるとともに発光が生じる。
ピルビン酸キナーゼ(EC 2.7.1.40)は、解糖系においてホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に変換し、その際、ADPがATPに変換される。この反応はギブスエネルギーが負の発エルゴン反応であり、天然の条件下では不可逆的である:
PEP+ADP→ピルビン酸+ATP
逆方向の反応は、糖新生において、ピルビン酸カルボキシラーゼ及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが触媒し、ATP及びピルビン酸からPEP及びADPを生じる。細胞抽出を行うと、系には種々の酵素が混在し、上記反応は両方向進行しうる。その際、ホスホエノールピルビン酸が高濃度に存在するとADPがATPに変換され得る。また、ホスホエノールピルビン酸のみならずピルビン酸キナーゼが系に存在すれば、よりADPがATPに変換されると考えられる。特に限定されないが、例えば、ウサギ、ラット、ニワトリ等の動物、酵母、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)などの微生物由来のものを用いることができる。
酢酸キナーゼ(EC 2.7.2.1)は陽イオンの存在下で、ATP及び酢酸と、ADP及びアセチル化リン酸との間の変換を触媒する:
ATP+酢酸←→ADP+アセチル化リン酸
酢酸キナーゼ(AK)は別名をATP:酢酸ホスホトランスフェラーゼ、アセチルキナーゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。生体内ではATP及び酢酸から、ADP及びアセチル化リン酸を生じ、最終的にはアセチルCoAを生成する反応を促進する。系にアセチルCoAから生じたアセチル化リン酸及びADPが存在する場合、これを酢酸及びATPに変換しうる。特に限定されないが、微生物由来の例えばエシェリシア・コリ(Escherichia coli)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、コストリジウム・パスツーリアナム(Costridium pasteurianum),ラクトバチルス・デリュブルッキー(Lactobacillus delbruckii)、ヴェイロネラ・アルカレッセンス(Veillonella alcalescence)由来のものを用いることができる。
クレアチンキナーゼ(EC 2.7.3.2)は、クレアチン及びATPと、クレアチンリン酸及びADPとの間の変換反応を媒介する:
クレアチン+ATP←→クレアチンリン酸+ADP
クレアチンキナーゼ(CK)は別名をクレアチンホスホキナーゼ(CPK)又はホスホクレアチンキナーゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。通常、動物の筋肉などではクレアチン及びATPからクレアチンリン酸及びADPを生じる。しかしながらこの反応は可逆反応であり、系にクレアチンリン酸及びADPが高濃度で存在すると、反応は逆方向に進行し、クレアチン及びATPが生じうる。生体内では細胞質性クレアチンキナーゼは2つのサブユニットB又はMから構成される。したがってサブユニットの組み合わせにより3種のアイソザイム、CK-MM、CK-BB及びCK-MBが存在しうる。アイソザイムパターンは組織によって異なるが、本発明ではどのような組み合わせも使用可能である。特に限定されないが、動物由来のものが使用でき、例えば、ウサギ、ニワトリ、ウシ、ブタ、コイ、ナマズ、カエル由来のものが挙げられる。
ポリリン酸キナーゼ(EC 2.7.4.1)は、ポリリン酸(PolyPn)及びADPを、ポリリン酸(PolyPn-1)及びATPに変換する反応を触媒する:
ADP+PolyPn←→ATP+PolyPn-1
ポリリン酸キナーゼ(PPK)は別名をATP:ポリリン酸ホスホトランスフェラーゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。PPKは生体内では酸化的リン酸化に関与する。系にポリリン酸(n)及びADPが存在する場合、これをポリリン酸(n-1)及びATPに変換しうる。特に限定されないが、例えば、エシェリシア・コリ(Escherichia coli)、酵母、コリネバクテリウム・ゼロシス(Corynebacterium xerosis)等の微生物由来のものが使用できる。
リボフラビンキナーゼ(EC 2.7.1.26)は、FMNKとも記載され、リボフラビン及びATPを、リン酸リボフラビン(FMN)及びADPに変換する反応を触媒する:
ATP+リボフラビン←→ADP+FMN
リボフラビンキナーゼはATP:リボフラビン5'-ホスホトランスフェラーゼ(フラボキナーゼともいう)に属する。特に限定されないが、例えば、微生物や動物由来のものを用いることができ、例えば、酵母、ラット、マメ(Phaseolus radiatus)由来のものが挙げられる。
ホスホフルクトキナーゼ1(EC 2.7.1.11)は、PFK1とも記載され、フルクトース-6-リン酸(Fru6P)及びATPを、フルクトース-1,6-ビスリン酸(Fru1,6-BP)及びADPに変換する反応を触媒する:
Fru6P+ATP←→Fru1,6-BP+ADP
ホスホフルクトキナーゼ1はホスホフルクトキナーゼに属する。本明細書ではホスホフルクトキナーゼ1をFru-1,6BPKと記載することがある。特に限定されないが、動物や微生物由来のものを用いることができ、例えば微生物由来のものは、パン酵母、ビール酵母、クロストリジウム・パスツーリアナム(Clostridium pasteurianum)、エシェリシア・コリ(Escherichia coli)、バチルス・リチェニフォルミス(Bacillus licheniformis)由来のものが挙げられる。
フルクトースビスホスファターゼ(EC 3.1.3.11)は、FBPaseとも記載され、フルクトース-1,6-ビスリン酸(Fru1,6-BP)及びADPをフルクトース-6-リン酸(Fru6P)及びATPに変換する反応を触媒する:
Fru1,6-BP+ADP←→Fru6P+ATP
フルクトースビスホスファターゼはFBP、FBP1とも記載されることがある。特に限定されるものではないが、動物、植物、微生物由来のものを用いることができ、例えばウサギやニワトリ由来のものが挙げられる。
ピルビン酸−リン酸ジキナーゼ(EC 2.7.9.1)はATP、ピルビン酸、及びオルトリン酸と、アデノシン一リン酸(AMP)、ホスホエノールピルビン酸(PEP)及びピロリン酸(PPi)との間の反応を触媒する:
ATP+ピルビン酸+リン酸←→AMP+PEP+PPi
ピルビン酸−リン酸ジキナーゼ(PPDK)は別名をATP:ピルビン酸,リン酸ホスホトランスフェラーゼ、ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ、ピルビン酸リン酸リガーゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。PPDKは通常、ピルビン酸をPEPに変換し、そのプロセスでATPが1分子消費されAMPに変換される。反応は次の3つの可逆反応に分けられる。
1.酵素PPDKがATPに結合し、AMPに変換と二リン酸化PPDKを生じる。
2.二リン酸化PPDKが無機リン酸に結合し、二リン酸と一リン酸化PPDKを生じる。
3.一リン酸化PPDKがピルビン酸に結合し、PEPを生じるとともにPPDKを再び生じる。
このとき、系に存在するPEP濃度が高いと反応は以下のように逆方向に進行する。
3.PEPがPPDKに結合し、一リン酸化PPDK及びピルビン酸を生じる。
2.二リン酸と一リン酸化PPDKから二リン酸化PPDKと無機リン酸が生じる。
1.二リン酸化PPDKとAMPからPPDKとATPが生じる。
アデニル酸キナーゼ(EC 2.7.4.3)は、アデニレートキナーゼとも呼ばれ、金属イオンの存在下で、以下の反応を触媒する:
ATP+AMP←→2ADP
この反応は可逆的である。ADKは、AMPからADPを生成する反応を触媒する酵素の一例である。ADKをPK等と組み合わせると、ADPはATPに変換されるため、結果としてATP及びADP及びAMPを測定することができる。
ピルビン酸ウォータージキナーゼ(EC 2.7.9.2)は次の反応を触媒する:
ATP+ピルビン酸+H2O←→AMP+ホスホエノールピルビン酸(PEP)+リン酸(P)
ピルビン酸ウォータージキナーゼは別名を、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ;ピルビン酸ウォータージキナーゼ(リン酸化);PEPシンテターゼ; ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ;ホスホエノールピルビックシンテターゼ;ホスホピルベートシンテターゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。
ある実施形態において、本発明のキットはRNA分解酵素を含んでもよい。またある実施形態において、本発明の方法は、RNA分解酵素を使用してもよい。なお、ここでいうRNA分解酵素は、サンプルに由来しないRNA分解酵素を意味する。
ADP依存性ヘキソキナーゼ(EC 2.7.1.147)は、ADP特異的ヘキソキナーゼとも呼ばれ、以下の反応を触媒する:
D-グルコース+ADP←→D-グルコース-6-リン酸+AMP
アピラーゼ(EC 3.6.1.5)は、アデノシンジホスファターゼ、ADPアーゼ、ATPジホスファターゼ、又はATPジホスホヒドロラーゼとも呼ばれ、以下の2つの反応を触媒する:
ATP+H2O←→ADP+リン酸(P)
ADP+H2O←→AMP+リン酸(P)
本発明の方法は、ホスホエノールピルビン酸(PEP)を使用しうる。場合により系に過剰量のPEPを添加することで、系に存在するATPやAMPの測定を促進しうる。使用するPEPの濃度としては、終濃度として、0.001mM〜4500mM、例えば2.1mMが挙げられる。
本発明の方法は、ピロリン酸(PPi)を使用しうる。場合により系に過剰量のPPiを添加することで、系に存在するATPやAMPの測定を促進しうる。使用するPPiの濃度としては、終濃度として、0.001mM〜2000mM、例えば0.2mMが挙げられる。
本明細書において、生体関連サンプルとは、含まれるATPが分解された可能性のある生体由来の物質が付着した可能性のあるあらゆるサンプルを包含する。また本明細書において、生体関連サンプルは、ATP分解酵素を含み得るあらゆる生体関連サンプルを包含する。本明細書において、生体関連器具とは、含まれるATPが分解された可能性のある生体由来の物質が付着又は残留する可能性のあるあらゆる器具をいう。また本明細書において、生体関連器具は、ATP分解酵素及びヒト由来の物質が付着若しくは残留する可能性のあるあらゆる器具を包含する。本明細書において生体関連サンプル又は生体関連器具についての環境とは、特に断らない限り、含まれるATPが分解された可能性のある生体に由来する液が付着したり残留しうる環境をいう。該環境としては、衣類、手袋などの保護用具、手、指、寝台、スイッチ、ドアノブ、ベッド柵、ナースコールボタン、手すり、洗面所、洗面器、便所、便器等が挙げられるがこれに限らない。こうした環境から取得されたサンプルも本明細書にいう生体関連サンプルに包含されるものとする。生体由来の物質はヒト又は動物由来であり得る。ある実施形態において生体由来の物質はヒトに由来するものである。ある実施形態において生体関連サンプルは非ヒト動物由来サンプルを含まずヒト由来サンプルを含むものである。ある実施形態において、生体関連器具は非ヒト動物関連器具を含まず人体関連器具を含むものである。
本明細書において、血液関連サンプルとは、血液が付着した可能性のあるあらゆるサンプルを包含する。本明細書において、血液関連器具とは血液が付着又は残留する可能性のあるあらゆる器具をいう。血液関連器具の例として、血液が付着又は残留する可能性のある医療器具をいう。これらの例として、手術器具、内視鏡(例えば、食道、胃及び十二指腸の検査に用いる上部内視鏡、直腸及び大腸の検査に用いる下部内視鏡、又はダブルバルーン小腸内視鏡、好ましくは下部内視鏡)、カテーテル、メス、患者の身体に挿入するチューブ、患者の身体に挿入する器具、手術器具洗浄槽、及び医療器具洗浄環境等が挙げられる。本明細書において血液関連サンプル又は血液関連器具についての環境とは、特に断らない限り、血液が付着したり残留しうる環境をいう。該環境としては、手術台、洗浄槽、衣類、手袋などの保護用具、手、指、寝台、手すり、洗面所、洗面器、及び医療関連施設が挙げられる。他には事故現場や傷害事件現場、血痕捜索が行われる現場も挙げられる。こうした環境から取得されたサンプルも本明細書にいう血液関連サンプルに包含されるものとする。血液の由来はヒト又は動物であり得る。ある実施形態において血液はヒト由来である。ある実施形態において血液は、食品に関連する動物肉や魚肉由来の血液を含まない。
以下にルシフェラーゼを用いたアッセイ方法を説明する。条件は例示的なものである。 以下を含むATP測定試薬を調製する。
MES 1 mM
酢酸マグネシウム 5.1 mM
ピロリン酸カリウム 0.15 mM
ホスホエノールピルビン酸カリウム 2.1 mM
ルシフェリン 0.8 mM
トリシン 25 mM
ルシフェラーゼ 12.5 μg protein/ml(280nmにおける吸光度をルシフェラーゼ濃度(mg protein/mL)とする。)
上記のATP測定試薬0.1mLにATPを含む試料溶液0.1mLを添加し発光を測定する。発光量の測定は、既知のルミノメーター(ベルトールド社CentroLB960或いはLumat3 LB9508や、キッコーマンバイオケミファ社ルミノメーター等)を用いて測定しうる。発光は、ある基準を定めて、それに対する相対発光単位(RLU)と記載することができる。ATP濃度が既知の基質溶液を用いて検量線を作成する。次いで、ATP濃度未知の試料溶液に上記のATP測定試薬を添加し同じ条件で発光を測定する。
以下にATP+ADPのアッセイ方法を説明する。条件は例示的なものである。
以下を含むATP+ADP測定試薬を調製する。
MES 1 mM
酢酸マグネシウム 5.1 mM
ピロリン酸カリウム 0.15 mM
ホスホエノールピルビン酸カリウム 2.1 mM
ルシフェリン 0.8 mM
トリシン 25 mM
ルシフェラーゼ 12.5 μg protein/ml(280nmにおける吸光度をルシフェラーゼ濃度(mg protein/mL)とする。)
PK 25 U/mL
以下にATP+ADPのアッセイ方法を説明する。条件は例示的なものである。
以下を含むATP+ADP測定試薬を調製する。
MES 1 mM
酢酸マグネシウム 5.1 mM
ピロリン酸カリウム 0.15 mM
ホスホエノールピルビン酸カリウム 2.1 mM
ルシフェリン 0.8 mM
トリシン 25 mM
ルシフェラーゼ 12.5 μg protein/ml(280nmにおける吸光度をルシフェラーゼ濃度(mg protein/mL)とする。)
AK 25 U/mL
以下にATP+AMPアッセイ方法を説明する。条件は例示的なものである。
以下を含むATP+AMP測定試薬を調製する。
MES 1 mM
酢酸マグネシウム 5.1 mM
ピロリン酸カリウム 0.15 mM
ホスホエノールピルビン酸カリウム 2.1 mM
ルシフェリン 0.8 mM
トリシン 25 mM
ルシフェラーゼ 12.5 μg protein/ml(280nmにおける吸光度をルシフェラーゼ濃度(mg protein/mL)とする。)
PPDK 2 U/mL
以下にATP+AMP+ADPアッセイ方法を説明する。条件は例示的なものである。
以下を含むATP、AMP+ADP測定試薬を調製する。
MES 1 mM
酢酸マグネシウム 5.1 mM
ピロリン酸カリウム 0.15 mM
ホスホエノールピルビン酸カリウム 2.1 mM
ルシフェリン 0.8 mM
トリシン 25 mM
ルシフェラーゼ 12.5 μg protein/ml(280nmにおける吸光度をルシフェラーゼ濃度(mg protein/mL)とする。)
PK 25 U/mL
PPDK 2 U/mL
代替法として、上記において、PPDKに代えて、PWDKを使用しうる(2U/mL)。この場合、ピロリン酸カリウムの代わりにリン酸を使用する。
以下にATP+AMP+ADPアッセイ方法を説明する。条件は例示的なものである。
以下を含むATP、AMP+ADP測定試薬を調製する。
MES 1 mM
酢酸マグネシウム 5.1 mM
ピロリン酸カリウム 0.15 mM
ホスホエノールピルビン酸カリウム 2.1 mM
ルシフェリン 0.8 mM
トリシン 25 mM
ルシフェラーゼ 12.5 μg protein/ml(280nmにおける吸光度をルシフェラーゼ濃度(mg protein/mL)とする。)
PK 25 U/mL
ADK 500 U/mL
以下にATP+AMP+ADPアッセイ方法を説明する。条件は例示的なものである。
以下を含むATP、AMP+ADP測定試薬を調製する。
MES 1 mM
酢酸マグネシウム 5.1 mM
ピロリン酸カリウム 0.15 mM
ホスホエノールピルビン酸カリウム 2.1 mM
ルシフェリン 0.8 mM
トリシン 25 mM
ルシフェラーゼ 12.5 μg protein/ml(280nmにおける吸光度をルシフェラーゼ濃度(mg protein/mL)とする。)
ADP依存性ヘキソキナーゼ 30 U/mL+グルコース 10 mM又はアピラーゼ 1 U/m
PPDK 2 U/mL
血液由来サンプルに含まれるATP分解の経時変化を調べるために、ルシフェリン及びヘイケボタル由来ルシフェラーゼ(キッコーマンバイオケミファ社、カタログ番号61314)を含む発光試薬を使用した。PKはBiozyme Laboratories社製(カタログ番号PK3)を使用した。PPDKは特許文献4に記載のものを使用した。発光試薬の組成は以下のとおりである。発光試薬のpHは7.7とした。
加熱によるATP分解の評価
簡単に説明すると、pH 4、7又は11のATP溶液を80℃で所定時間加熱した。加熱後のサンプルに含まれるATP、ATP+AMP、又はATP+AMP+ADPを測定した。ATP+ADPの量は、(ATP+AMP+ADP)の値から(ATP+AMP)の値を減算し、ATPの値を加算することにより決定した。
0.05molフタル酸(pH4.0)
0.05molリン酸(pH6.9)
0.05molグリココール、0.05mol塩化ナトリウム、0.05mol水酸化ナトリウム(pH11.3)
次いで加熱用のサンプルを調製した:
ATP溶液(1mM) 0.05mL
各種緩衝液 10mL
終濃度 5×10-3mM
これを小分けにして80℃で保存し、各時間でサンプリングした。その後、測定までは冷凍保存した。次いで測定のために、各ATP溶液を滅菌超純水で100倍希釈した:
0.99mL 滅菌超純水
0.01mL ATP溶液
これをルミテスターC-110(キッコーマンバイオケミファ社)を用いて測定した。サンプリング数はn=2であった:
0.1mL 発光試薬(ATP測定試薬、ATP+AMP測定試薬又はATP+ADP+AMP測定試薬)
0.01mL 種々のpHで各時間保存したATP溶液
なお、発光試薬の組成は以下のとおりである。
サンプルに含まれるATP+ADPの量は、ルシフェラーゼ及びPKを用いて測定することもできる。
手順としては、まず以下の緩衝液を調製する:
0.05molフタル酸(pH4.0)
0.05molリン酸(pH6.9)
0.05molグリココール、0.05mol塩化ナトリウム、0.05mol水酸化ナトリウム(pH11.3)
次いで加熱用のサンプルを調製する:
ATP溶液(1mM) 0.05mL
各種緩衝液 10mL
終濃度 5×10-3mM
これを小分けにして80℃で保存し、各時間でサンプリングする。その後、測定までは冷凍保存する。次いで測定のために、各ATP溶液を滅菌超純水で100倍希釈する:
0.99mL 滅菌超純水
0.01mL ATP溶液
これをルミテスターC-110(キッコーマンバイオケミファ社)を用いて測定する。
0.1mL 発光試薬(ATP+ADP測定試薬)
0.01mL 種々のpHで各時間保存したATP溶液
なお、ATP+ADPは濃度既知の標準品から検量線を予め作成しておくこともできる。
0.1ml 発光試薬(ATP+ADP測定試薬)
0.01ml 種々の濃度のATP又はADP溶液
発光時の溶液中のATP及びADPのmol量を計算し、検量線を作成した。結果を図5及び6に示す。
唾液におけるATP分解の経時変化
ATPを含む測定対象に唾液が混入した場合を想定し、Saliva Collection Aid(SALIMETRICS)を用いて回収した唾液を200倍希釈になるように、0.2μMのATP溶液に添加し、唾液サンプルとした。
0.1mL 発光試薬(ATP測定試薬、ATP+AMP測定試薬又はATP+ADP+AMP測定試薬)
0.01mL 唾液サンプル
なお、発光試薬の組成は実施例2の表2に記載したとおりである。
結果を図7に示す。ATPのみを測定した場合は、ATP分解のため、正確な測定が難しいことが分かった。一方で、ATP及びAMPを測定すると、より正確な測定を行うことができ、ATP、AMP及びADPを測定すると、さらに正確な測定を行うことができることが分かった。
内視鏡におけるATP分解の経時変化
下部内視鏡(オリンパス社製、使用済)を、40cm綿棒LuciSwab 3.2-400(キッコーマンバイオケミファ社製)で拭き取り、5%グルコース溶液に懸濁したものを滅菌超純水にて4倍希釈し、内視鏡サンプルとした。これを以下の比率で発光試薬と混合し、ルミテスターC-110(キッコーマンバイオケミファ社)を用いて測定した。
0.1mL 発光試薬(ATP測定試薬、ATP+AMP測定試薬、又はATP+ADP+AMP測定試薬)
0.01mL 内視鏡サンプル
なお、発光試薬の組成は実施例2の表2に記載したとおりである。
ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素を用いるATP+ADP+AMPの測定系の構築
実施例2の表2のATP+AMP測定用発光試薬に、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素であるADP依存性ヘキソキナーゼ(旭化成ファーマ、T-93 ADP-HKTII)とグルコースを加え、ATP+ADP+AMPの測定が可能かを調べた。
発光試薬の組成は以下の通りである。
0.1ml 発光試薬
0.01ml 種々の濃度のATP、ADP、又はAMP溶液
発光時の溶液中のATP、ADP、及びAMPのmol量を計算し、検量線を作成した。結果を図9−1〜9−3に示す。
発光試薬の組成は以下の通りである。
これらの結果は、AMPからATPを生成する反応を触媒するPPDKと、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素を併用することで、ATP+ADP+AMPの測定が可能であることを示している。
Claims (24)
- 血液関連サンプル又は血液関連器具の清浄度を測定するためのキットであって、ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を含む、前記キット。
- 生体関連サンプル又は生体関連器具の清浄度を測定するためのキットであって、ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を含む、前記キット。
- ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素が、ピルビン酸キナーゼ(PK)、酢酸キナーゼ(AK)、クレアチンキナーゼ(CK)、ポリリン酸キナーゼ(PPK)、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、グリセロールキナーゼ、フルクトキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、リボフラビンキナーゼ、及びフルクトースビスホスファターゼからなる群より選択される、請求項1又は2に記載のキット。
- さらに、AMPからADP又はATPを生成する反応を触媒する酵素を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のキット。
- 前記AMPからADP又はATPを生成する反応を触媒する酵素が、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ(PPDK)、アデニル酸キナーゼ(ADK)又はピルビン酸ウォータージキナーゼ(PWDK)である、請求項4に記載のキット。
- 血液関連サンプル又は血液関連器具の清浄度を測定するためのキットであって、AMPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を含む、前記キット。
- 生体関連サンプル又は生体関連器具の清浄度を測定するためのキットであって、AMPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を含む、前記キット。
- 前記AMPからATPを生成する反応を触媒する酵素が、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ(PPDK)又はピルビン酸ウォータージキナーゼ(PWDK)であり、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素が、ADP依存性ヘキソキナーゼ又はアピラーゼである、請求項6又は7に記載のキット。
- 前記血液関連サンプルが、血液が付着又は残留する可能性のあるサンプルである、或いは前記血液関連器具が、血液が付着又は残留する可能性のある器具である、請求項1、3〜6及び8のいずれか1項に記載のキット。
- 前記生体関連サンプルが、含まれるATPが分解された可能性のある生体由来の物質が付着又は残留する可能性のあるサンプルである、或いは前記生体関連器具が、含まれるATPが分解された可能性のある生体由来の物質が付着又は残留する可能性のある器具である、請求項2〜5及び7〜8のいずれか1項に記載のキット。
- 前記生体関連サンプルが、汗が付着又は残留する可能性のあるサンプルである、或いは前記生体関連器具が、汗が付着又は残留する可能性のある器具である、請求項10に記載のキット。
- 前記血液関連器具又は生体関連器具が、内視鏡である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のキット。
- 血液関連サンプル又は血液関連器具の清浄度を測定する方法であって、ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を使用する、前記方法。
- 生体関連サンプル又は生体関連器具の清浄度を測定する方法であって、ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を使用する、前記方法。
- ADPからATPを生成する反応を触媒する酵素が、ピルビン酸キナーゼ(PK)、酢酸キナーゼ(AK)、クレアチンキナーゼ(CK)、ポリリン酸キナーゼ(PPK)、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、グリセロールキナーゼ、フルクトキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、リボフラビンキナーゼ、及びフルクトースビスホスファターゼからなる群より選択される、請求項13又は14に記載の方法。
- さらに、AMPからADP又はATPを生成する反応を触媒する酵素を含む、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記AMPからADP又はATPを生成する反応を触媒する酵素が、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ(PPDK)、アデニル酸キナーゼ(ADK)又はピルビン酸ウォータージキナーゼ(PWDK)である、請求項16に記載の方法。
- 血液関連サンプル又は血液関連器具の清浄度を測定する方法であって、AMPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を使用する、前記方法。
- 生体関連サンプル又は生体関連器具の清浄度を測定する方法であって、AMPからATPを生成する反応を触媒する酵素、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び金属塩を使用する、前記方法。
- 前記AMPからATPを生成する反応を触媒する酵素が、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ(PPDK)又はピルビン酸ウォータージキナーゼ(PWDK)であり、ADPからAMPを生成する反応を触媒する酵素が、ADP依存性ヘキソキナーゼ又はアピラーゼである、請求項18又は19に記載の方法。
- 前記血液関連サンプルが、血液が付着又は残留する可能性のあるサンプルである、或いは前記血液関連器具が、血液が付着又は残留する可能性のある器具である、請求項13及び15〜18及び20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生体関連サンプルが、含まれるATPが分解された可能性のある生体由来の物質が付着又は残留する可能性のあるサンプルである、或いは前記生体関連器具が、含まれるATPが分解された可能性のある生体由来の物質が付着又は残留する可能性のある器具である、請求項14〜17及び19〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生体関連サンプルが、汗が付着又は残留する可能性のあるサンプルである、或いは前記生体関連器具が、汗が付着又は残留する可能性のある器具である、請求項22に記載の方法。
- 前記血液関連器具又は生体関連器具が、内視鏡である、請求項13〜20のいずれか1項に記載の方法。
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