CN100430487C - 单一稳定烟酰胺辅酶液体试剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于应用还原型烟酰胺辅酶(NADH或NADPH)测定体液样本中被测物的酶法测定试剂，本发明所指的酶法测定试剂是加入氧化型烟酰胺辅酶以及与之相应的酶和底物系统，将氧化型辅酶缓慢徨还原为还原型烟酰胺辅酶，当被还原的还原型烟酰胺辅酶达到一定的浓度时，本发明所指的酶法试剂就可达到测定被测物的目的。这类试剂包括丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等。该系统由于不断生成测定所需的NADH或NADPH，从而大大提高了试剂的稳定性，并大大降低试剂的生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及采用还原型烟酰胺辅酶(NADH或NADPH)测定试剂及其制法。
背景技术
采用还原型烟酰胺辅酶(NADH或NADPH)测定体液样本中的被测物是一个广泛使用的方法，试剂中NADH或NADPH的氧化程度，与样本中被测物的浓度成正比。根据样本中不同的被测物，采用相应的酶反应机制，经过酶与底物反应，试剂中NADH或NADPH被氧化，反应系统的吸光度发生变化，通过测定反应系统的吸光度变化值，就可计算出来本中被测物的浓度。
例如血浆样本中氨浓度的测定，血浆中的氨在谷氨酸脱氨酶作用下与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸盐，同时NADPH被氧化为NADP+，反应系统在340nm处的吸光度值下降，通过测定340nm处吸光度的下降值。就可以算出样本中氨的浓度。
再例如血清样本中丙氨酸氨基转移酶浓度的测定，样本中丙氨酸氨基转移酶催化丙氨酸氨基转换至α-氧代戊二酸，生成丙酮酸和L-谷氨酸；生成的丙酮酸被试剂中的乳酸脱氢酶还原为L-乳酸，同时NADH被氧化为NAD，反应系统在340nm处的吸光度值下降。通过测定340nm处吸光度的下降值，就可以计算出样本中丙氨酸氨基转移酶的浓度。
L-丙氨酸+α-氨代戊二酸→丙酮酸+L-谷氨酸
丙酮酸+NADH→L-乳酸+NAD+
但是由于NADH或NADPH在这类酶试剂中不稳定，实际应用中多采用干粉试剂或液体双试剂。干粉试剂通过保持试剂的干燥状态，试剂的水分含量一般低于20％，保持NADH或NADPH的稳定；液体双试剂通过调整含有NADH或NADPH试剂部分的PH值，这部分试剂PH值一般在7.5-11.5之间，保持NADH或NADP的稳定。
NADH或NADPH在液体单一试剂的应用中，Joseph De Giorgio等发明了在测定试剂中加入NADH或NADPH的再生酶系统，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其非专一性底物葡萄糖，将试剂保存过程中NADH或NADPH，被氧化生成的NAD或NADP再缓慢还原为NADH或NADPH，从而保持测定试剂中有效的NADH或NADPH浓度。在他们的专利中，测定试剂生产或配制时不加入NAD或NADP，仍然按照传统的试剂生产或配制方法，加入NADH或NADPH，嵌入的再生酶系统仅仅用于NADH或NADPH氧化后的单向再生，并不生成新的NADH或NADPH。
Richard A，Kaufman等利用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其专一性底物葡萄糖-6-磷酸，在试剂测定过程中原位快速生成还原型辅酶，用于被测物的测定，其生成的速率需要大于被被测物酶系统再氧化的速率。被测物的测定是在生成还原型辅酶的同时或以后进行的，试剂中葡萄糖-6-磷酸的摩尔浓度低于用于生成还原型辅酶的氧化型辅酶的摩尔浓度，因此测定试剂配制成单一液体试剂后，生成的NADH或NADPH与普通测定试剂中一样不稳定。该方法多用于液体双试剂。在他们的专利中，相对于被测物酶系统将还原后的辅酶再氧化的速率，生成还原型辅酶的速率不可能以绝对快的速率完成，因此，测定样本中被测物含量时需要测定已知浓度的标准样本进行对照计算，从而求出样本中被测物的含量。采用这一方法在实际应用中很难对体液样本中的酶含量进行测定。
发明内容
本发明的在目的在于提供一种稳定性好，成本低的烟酰胺辅酶试剂及其制法。
本发明的测定试剂生成或配制时加入酶-底物-NAD或酶-底物-NADP系统，测定试剂中有效的NADH或NADPH含量是由该系统生成的。本发明应用还原型烟酰胺辅酶(NADH或NADPH)测定体液样本中被测物的酶法测定试剂，其特点是在生产或配制过程中，本发明所指的酶法测定试剂不加入该还原型烟酰胺辅酶，而是加入氧化型烟酰胺辅酶(NAD或NADP)，通过试剂内内嵌的酶-底物-NAD或酶-底物-NADP系统缓慢循环将氧化型辅酶还原为还原型烟酰胺辅酶，当被还原的还原型烟酰胺辅酶达到一定的浓度时，本发明所指的酶法试剂就可应用于测定被测物的浓度。由于内嵌的酶和底物系统还原NAD或NADP的速率显著低于被测物及其测定酶或底物系统对NADH或NADPH的氧化速率，因此该内嵌的酶和底物系统不影响被测物的测定反应。
本发明同时公开了一种节约和改良的测定试剂配制和生产方法，由于试剂生产配制时不使用NADH或NADPH，从而大大降低了试剂的原料成本。采用这一生产方法配制的试剂包括丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等。
本发明同时公开了一种改良的测定试剂，这类试剂包括丙氨酸氨基转酶试剂、天门冬氨酸氨基转酶试剂、尿素试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等。
试剂测定中可采用的NADH和NADPH的生成系统，包括葡萄糖脱氢酶-葡萄糖-NAD系统、乳酸脱氢酶-丙酮酸-NAD系统、甘油脱氢酶-甘油-NAD系统、以及(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-NAD或(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-NADP系统等。为了有效地降低NADH或NADPH的生成速率。不影响试剂的测定性能，可以对上述生成系统中的底物浓度进行调整，使其生成(还原)NADHA或NADPH的速率在测定被测物时不影响NADH或NADPH的氧化速率。例如，葡萄糖脱氢酶-葡萄糖-NAD系统可调整为乳酸脱氢酶-葡萄糖脱氢酶-木糖-NAD系统、乳酸脱氢酶-丙酮酸-NAD系统可调整为乳酸脱氢脱氢酶-α-酮戊二酸-NAD系统、甘油脱氢酶-甘油-NAD系统可调整为甘油脱氢酶-乙二醇-NAD系统、以及(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-NAD或(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-NADP系统可调整为(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-NAD或(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-NADP系统可调整为(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-NAD或(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-NADP系统等。考虑到测定样本时样本中可能含有的底物物质影响到NADH或NADPH的生成速率，进而影响被测物的测定反应，上述各系统中优选用的系统为(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-NAD或(葡萄糖-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-NADP系统。
本发明中的还原型辅酶生成系统生成的还原型辅酶在达到一定的浓度后，即可与试剂其它测定成份一起进行被测物的浓度测定，此时还原型辅酶生成系统可以已经完全成了还原型辅酶的生成反应，也可以仍在继续生成还原型辅酶。这一特点保证了采用本发明可以配制或生产出单一稳定的液体试剂。本发明中还原型辅酶生成系统生成还原型辅酶的速率可以是任何不干扰测定反应的速率，可以采用的生成有效NADH或NADPH浓度的反应速率平衡时间为0.03-365天内之间，生成的还原型辅酶的吸光度在0.5-5.0范围之内，波长340nm，光径10mm；生成速率时间小于0.01天，生成系统会影响测定系统的测定性能，生成速率时间大于365天，测定试剂的配制非常困难。更为合适的生成速率时间是在1-30天之内，生成的还原型辅酶的吸光度为0.8-3.0，波长340nm，光径10mm，优先采用的生成速率时间是在1-7天内，生成的还原型辅酶的吸光度为1.1-2.5，波长340nm，光径10mm。葡萄糖-6-磷脱氢酶的浓度范围在100-100000U/L之间，更为合适的范围在1000-10000U/L之间，优先选用的范围在2000-8000U/L范围之间。葡萄糖浓度的选择范围较大，较为合适的范围在1-500mM之间，优先选用的范围在0.20-0.50mM之间。
本发明配制的测定试剂，其中的NADH或NADPH的含量，也可采用本发明中的还原型辅酶生成系统部分生成，其它部分仍然采用传统方法加入，以缩短还原型辅酶的生成时间，有利于灵活适应剂的市场供应。
还原型辅酶生成系统可以结合测定试剂，加入缓冲液、防腐剂、重金属络合剂、表面活性剂和酶稳定剂。常用的缓冲液包括Tris缓冲液、咪唑缓冲液、二乙醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Good’s缓冲液：如HEPES、TES、BES、TAPS、TAPSO、POPSO、DIPSO、MOPS、MOPSO、PIPES、HEPPSO、TRICINE、AMPD、CHES、AMPSO、CAPSO等，其中Tris缓冲液的应用较为普遍，本发明中优先选用的缓冲液为Tris缓冲液，缓冲液的浓度一般选择在10-200mM范围之内，50-100mM范围更加适合。可以优先采用的防腐剂为叠氮钠，采用其他生物防腐剂则更好。重金属络合剂包括EDTA、EGTA、HEDTA等，本发明中优先选用的重金属络合剂为EDTA。本发明中酶稳定剂采用牛血清白蛋白，甘露糖醇，磷酸盐用于稳定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶并提高其反应活性。必要时，试剂中可以加入表面活性剂，如TritonX-100等。
采用本发明配制酶法试剂时，可以配制成单一液体试剂，也可根据需要配制成液体双试剂。由于不使用NADH或NADPH，试剂配制要求简单，可以不考虑原料的溶解顺序。建议试剂在配制时，先将一般化合物称量完毕并加入配制容器，再加入配制所需的纯水，轻轻搅拌至完全溶解，再加入其它活性成分和酶蛋白，轻轻搅拌至完全溶解，密封后置2-8℃，让还原型辅酶生成系统缓慢生成NADH或NADPH。当NADH或NADPH的生成量达到一定的浓度时，试剂就可用于测定。配制液体双试剂时，采用的还原型辅酶生成系统，如(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-NAD或(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-NADP应在同一试剂部分。
举例1：配制丙氨酸氮基转移酶试剂、由下述组份按每升的含量组成，
Tris缓冲液PH7.15，37℃， 10～158g
L～丙氨酸 34.0～45.0g
乳酸脱氢酶 2000～5000u
α～酮戊二酸 0.5～3.5g
EDT A.Na2.2H2O 1.0～0.3g
NAD 0.1～0.3g
D～葡萄糖 15.0～21.0g
葡萄糖～6～磷酸脱氢酶(明串珠菌属)， 1000～4000u
磷酸氢二钾 0.3～1.3g
叠氮钠 0.1～1.0g
根据上述配制试剂溶液的方法，以上丙氨酸氨基转移酶试剂配制完成后，置2～8℃，1～3天，试剂空白吸光度≥1.10，340nm，10mm光径.测定样本时，采用速率法，样本试剂为1∶12，温度37℃，延迟时间90秒，测定时间180秒，读数次数≥6点.
举例2：配制天门冬氨酸氨基转移酶试剂，由下述组份按每升的含量组成，
Tris缓冲液PH7.50，37℃， 10-15g
L～天门冬氨酸 34.0-43.0g
苹果酸脱氢酶 100-600u
乳酸脱氢酶 1000-4000u
α～酮戊二酸 0.5-4.5g
EDTA.Na2.2H2O 1.0-3.0g
NAD 0.1-0.3g
D～葡萄糖 15.0-21.0g
葡萄糖～6～磷酸脱氢酶(明串珠菌属) 1000-4500u
磷酸氢二钾 0.3-2.0g
叠氮钠 0.1-1.0g
根据上述配制试剂溶液的方法，以上天门冬氨酸氨基转移酶试剂配制完成后，置2～8℃，1～5天，试剂空白吸光度≥1.20，340nm，10mm光径.测定样本时，采用速率法，样本试剂为1∶12，温度37℃，延迟时间90秒，测定时间180秒，读数次数≥6点.
举例3：配制尿素试剂，由下述组份按每升的含量组成，
Tris缓冲液PH7.50，37℃， 10.0～15.0g
α～酮戊二酸 0.5～3.5g
牛血清二酸 0.05～5.0
二磷酸腺苷钾盐 0～0.8
谷氨酸脱氢酶(微生物来源) 500～6000u
脲酶 5000～15000u
NAD 0.1～0.3g
D～葡萄糖 3～21g
葡萄糖～6～磷酸脱氢酶(明串珠菌属) 1000～4000m
磷酸氢二钾 0.3～2.0g
EDT A.Na2.2H2O 0.1～0.1g
叠氮钠 0.1～1.0g
根据上述配制试剂溶液的方法，以上尿素试剂配制完成后，置2-8℃，1-7天，试剂空白吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。测定样本或校准品时，采用两点法，样本试剂比为1∶100，温度37℃，延迟时间30秒，测定时间120秒，读数在测定时间内选择2个有效点。
举例4：配制氨试剂，由下述组份按每升的含量组成，
Tris缓冲液PH8.0，37℃， 10.0～1 5.0g
α～酮戊二酸 0.5～3.5g
牛血清白蛋白 0.05～5.0g
二磷酸腺苷钾盐 0～1.5g
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源) 1000～6000u
NADP 0.1～0.35g
D～葡萄糖 3～21g
葡萄糖～6磷酸脱氢酶(明串珠菌属) 1000～4000u
磷酸二氢钾 0.5～2.0g
EDT A.Nα2.2H2O 0.1～1.0g
叠氮钠 0.1～1.0g
根据上述配制试剂溶液的方法，以上氨试剂配制完成后置2-8℃1-7天，试剂空后吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。测定样本或校准品时，采用两点法，样本试剂比为1∶10，温度37℃，延迟时间0秒，测定时间120秒，读数在测定时间内选择2个有效点。
举例5：配制肌酐液体双试剂，由下述组份按每升的含量组成，
试剂1：
Tris缓冲液PH8.0，37℃， 10.0～15.0g
α～酮戊二酸， 0.5～3.5g
牛血清白蛋白， 0.05～5.0g
二磷酸腺苷钾盐 0～1.5g
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源) 1000～6000u
NADP 0.1～0.5g
D～葡萄糖 3～21g
葡萄糖～6磷酸脱氢酶(明串珠菌属) 1000～4000u
磷酸二氢钾 0.3～2.0g
EDT A.Na2.2H2O 0.1～1.0g
叠氮钠 0.1～1.0g
根据上述配制试剂溶液的方法，以上氨试剂配制完成后，置2-8℃1-7天，试剂空后吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。
试剂2：
Tris缓冲液PH8.0，37℃， 10.0～15.0g
α～酮戊二酸 0.5～3.5g
牛血清白蛋白 0.05～5.0g
二磷酸腺苷钾盐 0～1.5g
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源) 1000～6000
EDT A.Na2.2H2O 0.1～1.0g
肌酐亚氨基脱氢酶 500～4000
甘露糖醇 3～15g
叠氮钠 0.1～1.0g
根据上述配制试剂溶液的方法，配置肌酐试剂2，置2-8℃保存，测定样本时，采用两点法，试剂1∶样本∶试剂2的比例为200∶20∶50，温度37℃，试剂1加样本或样准品后在测定温度孵育300秒，加入试剂2开始测定，延迟时间0秒，测定时间120秒，读数在测定时间内选择2个有效点。
肌酐试剂优选选用液体双试剂型有利于排除样本中氨的干扰。根据本发明的原理，肌酐试剂也可配制成液体单一试剂，此时测定时，样本中氨的干扰被忽略。
举例6：配制二氧化碳试剂，由下述组份按每升的含量组成，
Tris缓冲液，PH8.0，37℃， 10.0～15.0g
磷酸烯醇式丙酮酸 0.1～0.5g
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 200～1000u
苹果酸脱氢酶 500～3000u
牛血清白蛋白 0.05～5.0g
硫酸镁 0.5～3.0g
草氨酸钠 0.1～0.4g
NADH 0.1～0.35g
NAD 0.1～0.35g
D～葡萄糖 3～21g
葡萄糖～6磷酸脱氢酶(明串珠菌属)2000～10000u
磷酸二氢钾 0.3～20g
叠氮钠 0.1～1.0g
根据上述配制试剂溶液的方法，以上二氧化碳试剂配制完成后，置2-8℃密闭静置1-7天，试剂空后吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。测定样本或校准品时，采用终点法，样本试剂比为1∶200，温度37℃，测定时间300秒，体液样本或样准品加入试剂后立刻读取第1点吸光度值，300秒时读取第2点吸光度值。
具体实施例
实施例1：配制丙氨酸氮基转移酶试剂、由下述组份按每升的含量组成，
Tris缓冲液 100mM PH7.15，37℃，
L～丙氨酸 500mM，
乳酸脱氢酶 2.7ku/L，
α～酮戊二酸 15mM，
EDTA.Na2.2H2O 60mM
NAD 0.27mM
D～葡萄糖 50mM.
葡萄糖～6～磷酸脱氢酶(明串珠菌属) 3700U/L，
磷酸氢二钾 5mM
叠氮钠 1.5mM
根据上述试剂溶液的方法，以上丙氨酸氨基转移酶试剂配制完成后，置2～8℃，1～3天，试剂空白吸光度≥1.10，340nm，10mm光径.测定样本时，采用速率法，样本试剂为1∶12，温度37℃，延迟时间90秒，测定时间180秒，读数次数≥6点.
实施例2：配制天门冬氨酸氨基转移酶试剂，由下述组份按每升的含量组成，
Tris缓冲液 80mM，PH7.50，37℃，
L～天门冬氨酸 240mM，
苹果酸脱氢酶 600U/L
乳酸脱氢酶 1000U/L
a～酮戊二酸 12mM，
EDTA.Na2.2H2O 6mM
NAD 0.28mM
D～葡萄糖 80mM.
葡萄糖～6～磷酸脱氢酶(明串珠菌属) 3700U/L，
磷酸氢二钾 5mM
叠氮钠 1.5mM
根据上述配制试剂溶液的方法，以上天门冬氨酸氨基转移酶试剂配制完成后，置2～8℃，1～5天，试剂空白吸光度≥1.20，340nm，10mm光径.测定样本时，采用速率法，样本试剂为1∶12，温度37℃，延迟时间90秒，测定时间180秒，读数次数≥6点.
实施例3：配制尿素试剂，由下述组份按每升的含量组成，
Tris缓冲液PH7.50，37℃， 14.54g
α～酮戊二酸 1.43g
牛血清二酸 5.0g
二磷酸腺苷钾盐 0.65
谷氨酸脱氢酶(微生物来源) 550u
脲酶 12000u
NAD 0.192g
D～葡萄糖 18.0g
葡萄糖～6～磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700u
磷酸氢二钾 0.87g
EDTA.Na2.2H2O 0.37g
叠氮钠 0.26g
根据上述配制试剂溶液的方法，以上尿素试剂配制完成后，置2-8℃1-7天，试剂空白吸光度≥1.20，340nm，10mM光径。测定样本或校准品时，采用两点法，样本试剂比为1∶100，温度37℃，延迟时间30秒，测定时间120秒，读数在测定时间内选择2个有效点。
实施例4：配制氨试剂，由下述组份按每升的含量组成，
Tris缓冲液PH8.0，37℃， 12.0g
α～酮戊二酸 1.43g
牛血清白蛋白 5.0g
二磷酸腺苷钾盐 1.25g
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源) 4500u
NADP 0.29g
D～葡萄糖 7.21g
葡萄糖～6磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700u
磷酸二氢钾 0.68g
EDTA.Na2.2H2O 0.37g
叠氮钠 0.455g
根据上述配制试剂溶液的方法，以上氨试剂配制完成后置2-8℃1-7天，试剂空后吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。测定样本或校准品时，采用两点法，样本试剂比为1∶10，温度37℃，延迟时间0秒，测定时间120秒，读数在测定时间内选择2个有效点。
实施例5：配制肌酐液体双试剂，由下述组份按每升的含量组成，
试剂1：
Tris缓冲液PH8.0，37℃， 12.0g
α～酮戊二酸 1.43g
牛血清白蛋白 5.0g
二磷酸腺苷钾盐 1.0g
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源) 3500u
NADP 0.36g
D～葡萄糖 7.21g
葡萄糖～6磷酸脱氢酶(明串珠菌属) 3700u
磷酸二氢钾 0.68g
EDTA.Na2.2H2O 0.372g
叠氮钠 0.455g
根据上述配制试剂溶液的方法，以上氨试剂配制完成后，置2-8℃1-7天，试剂空后吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。
试剂2：
Tris缓冲液PH8.0，37℃， 12.1g
α～酮戊二酸 1.43g
牛血清白蛋白 5.0g
二磷酸腺苷钾盐 1.0g
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源) 3500u
EDTA.Na2.2H2O 0.372g
肌酐亚氨基脱氢酶 1100u
甘露糖醇 10.02g
叠氮钠 0.455g
根据上述配制试剂溶液的方法，配置肌酐试剂2，置2-8℃保存，测定样本时，采用两点法，试剂1∶样本∶试剂2的比例为200∶20∶50，温度37℃，试剂1加样本或样准品后在测定温度孵育300秒，加入试剂2开始测定，延迟时间0秒，测定时间120秒，读数在测定时间内选择2个有效点。
肌酐试剂优选选用液体双试剂型有利于排除样本中氨的干扰。根据本发明的原理，肌酐试剂也可配制成液体单一试剂，此时测定时，样本中氨的干扰被忽略。
实施例6：配制二氧化碳试剂，由下述组份按每升的含量组成，
Tris缓冲液PH8.0，37℃， 6.06g
磷酸烯醇式丙酮酸 0.17g
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 500u
苹果酸脱氢酶 1250u
牛血清白蛋白 5.0g
硫酸镁 2.46g
草氨酸钠 0.28g
NADH 0.08g
NAD 0.3g
D～葡萄糖 18.0g
葡萄糖～6磷酸脱氢酶(明串珠菌属)7500u
磷酸二氢钾 0.68g
叠氮钠 0.5g
根据上述配制试剂溶液的方法，以上二氧化碳试剂配制完成后，置2-8℃密闭静置1-7天，试剂空后吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。测定样本或校准品时，采用终点法，样本试剂比为1∶200，温度37℃，测定时间300秒，体液样本或样准品加入试剂后立刻读取第1点吸光度值，300秒时读取第2点吸光度值。
上述实施例1-6试剂配制完成后，其应用方法与相关领域中的普通试剂应用方法相同，在此不再赘述。
上述实施例1-6试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理及其应用，本发明并不局于上述举例的应用范围；此外，在本发明相关领域中的专业技术人员，可以根据本发明的原理和方法配制出与之类似的各种测定试剂，但并不脱离出本发明的原理和应用范围。
Claims (1)
1、一种单一稳定的烟酰胺辅酶液体试剂的制备方法，其特征在于：在生产或配置过程中，该液体试剂中不加入还原型烟酰胺辅酶，而是加入氧化型烟酰胺辅酶，通过试剂内嵌的酶-底物-NAD或酶-底物-NADP系统缓慢循环将氧化型辅酶还原生成为，用于检测的还原型烟酰胺辅酶。
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