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Die
vorliegende Erfindung betrifft Reagenzien für enzymatische Verfahren zur
Bestimmung der Konzentration von Analyten in einer Körperflüssigkeitsprobe.
Insbesondere betrifft die Erfindung Reagenzien für Verfahren, bei denen die
Menge an einem oxidierten Coenzym in der umgesetzten Probe der Konzentration des
in der Probe vorliegenden Analyten direkt entspricht. Die Erfindung
betrifft außerdem
verbesserte Verfahren zur Durchführung
der Bestimmung der Analytenkonzentration.
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Analyte,
die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Reagenzien
bestimmt werden können,
umfassen Transaminasen, Ammoniak, Harnstoff, Lactat-Dehydrogenase,
Triglyceride und Salicylate.
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Aspartat-Aminotransferase
ist ein Enzym, das in hohen Konzentrationen in Herz, Leber, in den
roten Blutzellen und in der Skelettmuskulatur gefunden wird. Sie
katalysiert die folgende Reaktion: Aspartat
+ 2 – Oxoglutarat ⇌ Oxaloacetat
+ Glutamat
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Zunahmen
am Aspartat-Aminotransferase-Spiegel im Serum werden bei vielen
Lebererkrankungen festgestellt, bei denen es zu einem Abbau der
Leberzellen kommt, insbesondere z.B. bei Hepatitis. Eine Zunahme
der entsprechenden Spiegel lässt
sich auch bei Myocardinfarkten und bei Muskelerkrankungen feststellen.
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Das
Enzym Alanin-Aminotransferase wird in hohen Konzentrationen auch
in der Leber festgestellt und in einem geringeren Grad auch im Herzen,
in der Niere und in der Skelettmuskulatur. Es katalysiert die folgende
Reaktion: Alanin + 2 – Oxoglutarat ⇌ Pyruvat
+ Glutamat
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Zunahmen
am Spiegel dieses Enzyms im Serum stellt man auch gewöhnlich bei
Lebererkrankungen, insbesondere bei Hepatitis fest.
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Die
indirekte Quantifizierung der Enzyme, insbesondere der Transaminasen
Aspartat-Aminotransferase und Alanin-Aminotransferase in einer Körperflüssigkeitsprobe
kann die Kontrastierung einer "Blindprobe" gegen eine Probe
umfassen, bei der es zur enzymatischen Umwandlung eines mit dem
interessierenden Enzym verbundenen Analyten kommt.
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Zur
Erzielung der enzymatischen Umwandlung des Analyten lässt man
das substratspezifische Enzym (Transaminase) auf Enzymsubstrate
einwirken, die für
die Verwendung bei der Quantifizierung des interessierenden Enzyms
bekannt sind. Die Veränderung
in der Reaktionszusammensetzung im Hinblick auf die Blindprobe kann
nach verschiedenen Methoden berechnet werden, welche die Veränderung
in der Absorption der Zusammensetzung messen. Die Absorptionsänderung
korreliert direkt mit der Menge der in der Probe vorliegenden Transaminase.
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Obwohl
traditionelle Methoden wie die kolorimetrische Bestimmung sich als
adäquat
erwiesen haben, erwies sich die enzymatische Analyse als weit genauer,
zuverlässiger
und einfacher als die übrigen
Methoden, wenn es sich um die Bestimmung von Transaminasespiegeln
handelt.
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Eine
allgemein übliche
Methode der Quantifizierung der Transaminasen in einer Probe besteht
in einer kinetischen Anwendung einer gekuppelten Enzymreaktion.
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Im
Fall der Aspartat-Aaminotransferase (AST) wird das durch die AST
gebildete Oxaloacetat unter Aufnahme von Malat-Dehydrogenase (MDH)
in das Analysensystem in Malat umgewandelt.
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Dies
wird begleitet von der Oxidation des Coenzyms Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid
(NADH zu NAD+), was spektrofotometrisch
bei 340 nm verfolgt werden kann. Die Reaktionsabfolge ist dabei üblicherweise
wie folgt: L-Aspartat + 2 + Oxoglutarat ⇌ AST Oxaloacetat
+ L – Glutamat Oxaloacetat + NADH ⇌ MDH L – Malat + NAD+ Pyruvat der Probe + NADH ⇌ LDH Lactat + NAD+
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Die
dritte Reaktion ist erforderlich, um die mögliche Anwesenheit hoher Konzentrationen
an Pyruvat in Patientenproben zu beseitigen. Die Theorie für die hohen
Konzentrationen dem Enzym Lactat-Dehydrogenase (LDH) beruht darauf,
dass, falls in das Reagenz hohe Konzentrationen an Pyrivat aufgenommen
werden für den
Fall dass eine Patientenprobe eine hohe Pyruvatkonzentration aufweist,
die Anwesenheit von NADH und LDH das Pyruvat der Probe durch Umwandlung
in Lactat, das die Reaktion nicht stört, rasch eliminiert. Die Notwendigkeit,
das Reagenz mit LDH zu beschicken, um diese Nebenreaktion zu beseitigen,
kann die Beständigkeit
des Reagenz durch Aufnahme von mehr verunreinigenden Stoffen beeinflussen.
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Im
Fall von Alanin-Aminotransferase (ALT) wird das durch die ALT gebildete
Pyruvat durch Aufnahme von Lactat-Dehydrogenase in das Reaktionsgemisch
in Lactat umgewandelt. Dies wird begleitet von der Oxidation des
Coenzyms NADH zu NAD+, was wiederum spektrofotometrisch
bei 340 nm verfolgt werden kann. Die Reaktionsabfolge bei Verwendung
des Reagens ist dann Folgende: L-Alanin
+ 2 – Oxoglutarat ⇌ ALT Pyruvat
+ Glutamat Pyruvat + NADH ⇌ LDH Lactat + NAD+ Pyruvat der Probe + NADH ⇌ LDH Lactat + NAD+
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Die
Theorie und die Methodik der ALT-Messung ähnelt dem AST-Reagenz, wenn man
davon absieht, dass mit ALT lediglich ein endogenes Enzym, und zwar
LDH für
die Messung erforderlich ist (verglichen mit der LDH und MDH, die
im Fall von AST erforderlich sind). Auf diese Weise werden in die
ALT-Reagenzien weniger verunreinigende Stoffe aufgenommen, was im
allgemeinen bedeutet, dass die wiederhergestellte Lagerbeständigkeit
etwas länger
sein kann als bei AST-Reagenzien.
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Bei
beiden Reagenzien korreliert die Geschwindigkeit der NAD+-Bildung mit der Konzentration an Transaminase,
die ursprünglich
in der Probe enthalten ist.
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Harnstoff
ist das wichtigste stickstoffhaltige Stoffwechselprodukt des Proteinkatabolismus,
das in der Leber durch Leberenzyme synthetisiert und vorwiegend über die
Nieren ausgeschieden wird. Erhöhte
Harnstoffspiegel im Serum können
eine Folge beeinträchtigter
Nierenfunktion, Lebererkrankungen, Veränderungen in der Ernährung, Stauungsinsuffizienz,
Diabetes und Infektionen sein.
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Der
Harnstoffspiegel kann im menschlichen Serum und im menschlichen
Urin direkt oder indirekt nachgewiesen werden. Die Direktmethoden
umfassen gewöhnlich
Varianten der Fearon-Reaktion.
Bei diesem Reaktionssystem reagiert Diacetyl mit Harnstoff unter
Bildung des Chromogens Diazin, das spektrofotometrisch anhand seiner
starken Absorption bei 540 nm gemessen werden kann. Die häufigste
Methode zur Messung von Harnstoff im meschlichen Serum und menschlichen
Urin umfasst ein indirektes gekoppeltes enzymatisches Reaktionssystem.
Urease, das erste Enzym im Reaktionssystem, wird verwendet, um Harnstoff
in Ammonium- und Bicarbonat-Io nen umzuwandeln. Glutamat-Dehydrogenase
(GLDH), das zweite Enzym im Reaktionssystem kuppelt die NADH an
das Ammoniumion unter Bildung von NAD+ und
Glutamat. Diese Reaktion läßt sich
spektrofotometrisch bei 340 nm verfolgen, da das NADH in NAD+ umgewandelt wird. Das Ammoniumion kann
aber auch potentiometrisch oder konduktometrisch quantifiziert werden.
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Der
Reaktionsverlauf, wie er üblicherweise
zur Bestimmung der Harnstoffkonzentration verwendet wird, ist dabei
Folgender: Harnstoff + H2O → Urease 2NH3 + CO2 NH3 + α-Ketoglutarat + NADH → GLDH L-Glutamat
+ NAD+
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Die
Abnahme der Absorption bei 340 nm infolge der Umwandlung von NADH
in NAD+ wird gemessen. Das Messergebnis
ist dann proportional der Harnstoffkonzentration in der Ausgangsprobe.
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Die
Hauptquelle für
den zirkulierenden Ammoniak ist der Gastrointestinaltrakt. Ammoniak
wird in der Leber metabolisiert, wobei er im Krebs-Henseleit-Zyklus
in Harnstoff umgewandelt wird. Erhöhte Ammoniakspiegel im menschlichen
Serum sind sehr häufig
mit einer fortgeschrittenen Lebererkrankung verbunden. Hyperammonämie wirkt
toxisch auf das ZNS.
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Der
Ammoniakspiegel im menschlichen Serum wird meist direkt nach einem
einstufigen enzymatischen Verfahren gemessen, und zwar unter Verwendung
von Glutamat-Dehydrogenase. Bei dieser Reaktion wird die Umwandlung
des Ammoniaks, des α-Ketoglutarats
und des NADH (oder NADPH) in Glutamat und NAD+ (oder
NADP+) spektrophotometrisch bei 340 nm gemessen.
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Die üblicherweise
verwendete Reaktionsfolge zur Bestimmung der Ammoniakkonzentration
einer Probe ist dabei folgende: NH3 + α-Ketoglutarat
+ NADPH → GLDH L-Glutamat + NADP+
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Die
Abnahme der Absorption bei 340 nm infolge der Umwandlung von NADPH
in NADP+ wird gemessen. Das Messergebnis
ist dann proportional der Ammoniakkonzentration in der Patientenprobe.
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Historisch
gesehen besteht, wie oben angegeben, der Nachteil der Transaminase-Reagenzien
in der geringen wiederhergestellten Beständigkeit. Die Beständigkeit
dieser Reagenzien, insbesondere in Form eines einzelnen Probefläschchens,
ist gewöhnlich
auf etwa maximal einen Monat unter Tiefkühlbedingungen beschränkt. Der
Grund für
die Unbeständigkeit
könnte
sowohl auf dem Abbau endogener Komponenten in den Reagenzien als
auch in der Instabilität
des NADH in der Lösung
beruhen. Die Hauptgründe
für die
Instabilität des
NADH in der Lösung
hängen
unmittelbar mit der Anwesenheit endogener Reagenzenzyme zusammen, insbesondere
mit LDH und MDH im AST-Reagens und LDH im ALT-Reagens. Handelsübliche Präparate der endogenen
Enzyme MDH und LDH enthalten, ob sie nun tierischen oder mikrobiellen
Ursprungs sind, Verunreinigungen, die schließlich die wieder hergestellte
Beständigkeit
des NADH und damit die Beständigkeit
der Reagenzien beeinträchtigen.
Diese Verunreinigungen sind gewöhnlich
geringe Konzentrationen an AST und ALT, der Enzyme, die es zu messen
gilt, und an NADH-Oxidase,
von denen alle die Oxidation des NADH im Reagenz in Gang setzen.
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Der
pH des Reagenz kann ebenfalls seine Wirkung auf die Instabilität des NADH
haben, da dieses sich in Lösung,
insbesondere in saurem Medium rasch zersetzt. Die meisten Reagenzien
für die
Bestimmung der Transaminase werden innerhalb eines pH-Bereichs von
7,3 bis 8,0 formuliert. Je alkalischer das Reagenz ist, umso höher ist
auch die Beständigkeit
des NADH in der Lösung.
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Außerdem weisen
die Ammoniak- und Harnstoff-Reagenzien Beständigkeitsprobleme auf. Die
Beständigkeit
dieser Reagenzien in einem einzelnen Probefläschchen unter Tiefkühlbedingungen
ist gewöhnlich auf
maximal einen Monat im Fall von Ammoniak und zwei Monate im Fall
von Harnstoff beschränkt.
Die Ursache für
die Unbeständigkeit
könnte
auf der Beeinträchtigung
der endogenen Komponenten in den Reagenzien, der Instabilität des NADH
bzw. NADPH in der Lösung
und auf der Verunreinigung durch Ammoniak im Wasser, das zur Wiedeherstellung
des Reagenzpulvers verwendet wird, beruhen.
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Die
Hauptursachen für
die Unbeständigkeit
des NADH bzw. NADPH in der Lösung
beruhen unmittelbar auf der Anwesenheit endogener Reagenzenzyme.
Der pH des Reagenz kann ebenfalls seine Wirkung auf die Unbeständigkeit
des NADH bzw. NADPH haben, da diese sich in Lösung, insbesondere in saurem
Medium rasch zersetzen.
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NADPH
wird gewöhnlich
in Ammoniakreagenzien (bevorzugt gegenüber NADH) verwendet, um die Störung der
Analyse durch endogene Lactat-Dehydrogenase in Patientensera zu
vermeiden. Endogene Lactat-Dehydrogenase und Pyruvat aus einer Patientenprobe
reagieren spezifisch mit NADH, und zwar nach der folgenden Reaktion: Pyruvat der Probe + NADH ⇌ LDH Lactat + NAD+
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Die
Aufrechterhaltung des NADPH in Lösung
wird außerdem
durch die Anwesenheit von Verunreinigungen handelsüblicher
Präparate
von Glutamat-Dehydrogenase verursacht, was die Oxidation des NADPH im
Ammoniakreagenz auslöst.
In ähnlicher
Weise löst
auch die Anwesenheit von Verunreinigungen handelsüblicher
Präparate
von Urease und Glutamat-Dehydrogenase die Oxidation des NADH im
Harnstoffreagenz aus.
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Ein
Mittel zur Beseitigung dieser Schwierigkeit bezüglich der Beständigkeit
von NADH und NADPH in Lösung
ist die Erzeugung von reduziertem Coenzym im Reagens unmittelbar
vor seinem Einsatz.
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Ein
derartiges Verfahren wird in der australischen Patentanmeldung AU-A-61906/90
der Firma Hoffmann La Roche AG besonders im Hinblick auf ähnliche
enzymatische Systeme für
die Messung von Serumbicarbonat und -ammoniak beschrieben. Dabei
wird das reduzierte Coenzym in situ oder gleichzeitig mit oder vor
der Reoxidation des Coenzyms durch den Analyten, das Substrat und
spezifische Enzyme erzeugt. Dies erfolgt durch Aufnahme eines Enzyms
und eines Enzymsubstrats in das Reaktionsgemisch, was die Reduktion des
oxidierten Coenzyms ermöglicht.
Die spezifische, von F. Hoffmann La Roche AG geoffenbarte und bevorzugte
Reaktion ist dabei folgende:
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Dies
ermöglicht
die Herstellung von reduzierten Nicotinamid-Adenosin-Dinucleotid.
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Das
mit dieser Art der Erzeugung von NADH verbundene Problem besteht
darin, dass die Konfiguration eines beständigen Reagenz in einem einzigen
Probefläschchen
nicht möglich
ist.
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Bis
zu einem gewissen Grad hat F. Hoffmann La Roche AG dieses Problem
gelöst,
und zwar durch Aufteilung des Reagenzsystems auf zwei Probefläschchen.
Das erste Reagenz umfasst im Fall der Ammoniakquantifizierung NADP
+ und G-6-P und das zweite Reagenz α-Ketoglutarat,
G6PDH und GLDH. Die Bestimmungsreaktion verläuft dabei wie folgt:
wobei
(A) und (B) äquivalente
Alternativwege darstellen.
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Dieses
Reagenzsystem verursacht jedoch weiterhin Schwierigkeiten. Abgesehen
von der Tatsache, dass zwei Reagenzprobefläschchen erforderlich sind,
was Kosten und erfinderischen Aufwand erhöht und umweltbelastend ist,
sind sehr genaue Konzentrationen an Glucose-6-Phosphat erforderlich.
Außerdem
ist das System auf die Verwendung in spezifischen chemischen Analysatoren
beschränkt.
Sobald die Reagenzien miteinander vereinigt werden, kommt es zur
Erzeugung von NADH aus NAD+ infolge der
Erschöpfung
des Glucose-6-Phosphats. Aufgrund der Erschöpfung des Glucose-6-Phosphats
kann die Beständigkeit
des gemischten Reagenz stark beeinträchtigt werden, wenn die beiden
Reagenzien miteinander vermischt und nicht unmittelbar gebraucht
werden. Ist die Konzentration an Glucose-6-Phosphat nicht genau
eingestellt oder liegt ein Überschuss
vor, wird das Timing in Zusammenhang mit der Inkubation des Reagenz
kritisch. Die Ergebnisse können
fälschlich
auf niedrige Absorptionsänderungen
hinweisen und äußerst ungenau
sein.
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Eine
frühere
Lösung,
die ebenfalls die Messung von Analytenkonzentrationen betrifft und
in der
US-PS 4 394 449 ,
Modrovich, beschrieben wird, verwendet man Substrat/Enzym-Paare
zur Erzeugung des reduzierten Coenzyms, wie dies bei der Lösung von
Roche der Fall ist. In diesem Fall wird das Glucose-6-Phosphat jedoch
aus Glucose nach folgender Reaktion erzeugt:
D-Glucose + ATP → Hexokinase ADP + Glucose-6-Phosphat -
NAD+ reagiert dann mit dem gebildeten Glucose-6-Phosphat
in Anwesenheit des Enzyms Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase unter
Bildung von NADH. Modrovich nimmmt sowohl NADH als auch NAD+ in die Formulierung auf, so dass bei der
Oxidation bzw. beim Abbau von NADH das im Reagenz vorliegende NAD+ die Regeneration von NADH begünstigt.
Hier handelt es sich ebenfalls um ein Doppelprobefläschchenreagenz.
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Eine
frühe Alternative
wurde von Klose et al. in der US-PS 4 019 961 bereitgestellt. Diese
Erfindung beruht auf einzelnen unterschiedlichen Reaktionsstufen
und einem enzymatischen NADH-Regenerationssystem. Dieses hat den
Nachteil, dass es auf verschiedenen Reaktionsstufen und Trennstufen
beruht, was einen zeitaufwändigen
Test verursacht. Außerdem
ist dieses Reagenzsystem nur für
Substrate geeignet, die phosphoryliert werden können.
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Das
allgemeine Problem im Zusammenhang mit dem Mechanismus der Erzeugung
von NADH und NADPH, der von beiden Erfindungen beschrieben wird,
d.h. NAD+ +
Glucose-6-Phosphat → G-6-PDH NADH + 6-Phosphogluconolacton + H– besteht darin,
dass eine einstufige Reaktion unter Verwendung eines einzigen Probefläschchens
nicht möglich ist,
da sobald das Patientenserum dem Reagenz zugesetzt wird, zwei Reaktionen
gleichzeitig ablaufen:
- a) Abnahme der Absorption
aufgrund des NADH (oder NADPH), das in NAD+ (NADP+) umgewandelt wird, und
- b) Erzeugung von NADH (NADPH) aus NAD+ (NADP+), was zu einer Zunahme der Absorption führt.
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Diese
beiden Reaktionen laufen mit ähnlicher
Geschwindigkeit ab, was schließlich
zu einer fälschlichen
geringen Absorptionsänderung
und zu außerordentlich
ungenauen Ergebnissen führt.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung eines Reagenzsystems
für die
Bestimmung von Analytenkonzentrationen im Serum, das die Probleme
von Reagenzsystemen gemäß dem Stand der
Technik, wie sie für
die enzymatische Analyse von Analytenkonzentrationen in Seren verwendet
werden und auf der Oxidation eines Coenzyms beruhen, weitgehend
beseitigt, und zwar insbesondere Probleme, die mit der endogenen
bzw. exogenen Verunreinigung des Reagenz zusammenhängen. Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten
Verfahrens zur Bestimmung der Konzentration von Analytenspiegeln
in einer Patientenprobe, wobei dieses Verfahren die Probleme beseitigt,
die mit den bekannten Verfahren zusammenhängen, welche eine vorzeitige
Oxidation der Coenzym-Determinante und die Notwendigkeit der Verwendung
eines Mehrfachprobenfläschchensystems
zur Minimierung des Reagenzabbaus umfassen. Die WO 95/07999, die
vom Anmelder eingereicht worden war, offenbarte und beanspruchte
ein Reagenz für
die enzymatische Bestimmung der Bicarbonatspiegel im Serum eines
Patienten, wobei der Grad der Oxidation eines Coenzyms gemessen
wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz gegen Oxidation durch
ein Coenzym-Reduktionssystem stabilisiert wird, das ein Enzym- und
Substrat-Paar umfasst,
das so ausgewählt
wird, dass eine kontinuierliche Regeneration des Coenzyms im Verlaufe
der Lagerung des Reagenz möglich
wird, sowie eine Verbesserung in einem enzymatischen Verfahren zur
Bestimmung der Bicarbonatkonzentration des Serums in einer Körperflüssigkeitsprobe,
wobei der Grad der Oxidation eines Coenzyms gemessen wird und die
Verbesserung die Stabilisierung eines Reagenz umfasst, das ein Coenzym
gegen die Oxidation durch ein Coenzymreduktionssystem umfasst, das
seinerseits ein Enzym-und-Substrat-Paar umfasst, das so ausgewählt wird,
dass eine kontinuierliche Regeneration des Coenzyms im Verlauf der
Lagerung des Reagenz möglich
ist.
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Der
Anmelder hat nun gefunden, dass es bei Verwendung eines Reagenz
dieses Typs für
die enzymatische Bestimmung der Konzentration von Analyten im Allgemeinen
in Körperflüssigkeitsproben
und eines Coenzym-Reduktionssystems, bei dem kein freies Phosphat
erzeugt wird, es entscheidend ist, in das Reagenz freie Phosphationen
einzuarbeiten.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft somit ein Reagenz zur enzymatischen
Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einem Patienten,
wobei man den Oxidationsgrad eines Coenzyms misst, wobei das Reagenz
durch ein Coenzym-Reduktionssystem, das ein Enzym-und-Substrat-Paar
umfasst, das so ausgewählt ist,
dass damit eine kontinuierliche Regeneration Des Coenzyms während der
gesamten Lagerung des Reagenzs ermöglicht wird, gegen Oxidation
stabilisiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem
Coenzym-Reduktionssystem um ein System handelt, bei dem kein freies
Phosphat erzeugt wird, und dass dem Reagenz zu Beginn freies Phosphat
fehlt und freie Phosphationen in das Reagens eingebaut werden.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein enzymatisches Verfahren zur Bestimmung
der Konzentration eines Analyten in einer Körperflüssigkeitsprobe, wobei man den
Oxidationsgrad eines Coenzyms misst, wobei das Verfahren die Stabilisierung
eines das Coenzym umfassenden Reagens durch ein Coenzym-Reduktionssystem,
das ein Enzym-und-Substrat-Paar umfasst, das so ausgewählt ist,
dass damit eine kontinuierliche Regeneration des Coenzyms während der
gesamten Lagerung des Reagenz ermöglicht wird, gegen Oxidation
umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Coenzym-Reduktionssystem
um ein System handelt, bei dem kein freies Phosphat erzeugt wird,
und dass dem Reagenz zu Beginn freies Phosphat fehlt und freie Phosphationen
in das Reagenz eingebaut werden.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
die Verwendung eines Reagenz, wobei man den Oxidationsgrad eines Coenzyms
misst, zur enzymatischen Bestimmung der Konzentration eines Analyten,
ausgewählt
aus Transaminase, Aspartat-Transaminase, Alanin-Transaminase, Harnstoff und Ammoniak,
in einer Körperflüssigkeitsprobe,
wobei das Reagenz durch ein Coenzym-Reduktionssystem, das ein Enzym-und-Substrat-Paar
umfasst, das so ausgewählt
ist, dass damit eine kontinuierliche Regeneration des Coenzyms während der
gesamten Lagerung des Reagenz ermöglicht wird, gegen Oxidation
stabilisiert wird, wobei es sich bei dem Coenzym-Reduktionssystem
um ein System handelt, bei dem kein freies Phosphat erzeugt wird,
und dem Reagenz zu Beginn freies Phosphat fehlt und freie Phosphationen
in das Reagenz eingebaut werden.
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Die
Reagenzien können
insbesondere Reagenzien für
die enzymatische Bestimmung der Transaminase-Konzentration in einem
Patienten, die enzymatische Bestimmung der Aspartat-Transaminase-Konzentration
in einem Patienten, die enzymatische Bestimmung der Alanin-Aminotransferase-Konzentration
in einem Patienten, die enzymatische Bestimmung der Harnstoff-Konzentration in
einem Patienten oder die enzymatische Bestimmung der Ammoniak-Konzentration
in einem Patienten sein, wobei das Coenzym-Reduktionssystem in jedem
Fall ein Enzym-und-Substrat-Paar
umfasst, das so ausgewählt
ist, dass eine kontinuierliche Regeneration des Coenzyms im Verlauf
der Lagerung des Reagenz möglich
ist.
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Vorzugsweise
umfasst das Coenzym-Reduktionssystem ein Enzym und ein Substrat,
wobei das Enzym unvollständige
Spezifität
gegenüber
dem Substrat aufweist, was zu einer verminderten Geschwindigkeit der
Kreuzreaktivität
führt.
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Das
Reagenz ist vorzugsweise eine einzelne Probenfläschchen-Konfiguration.
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In
der vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck "unvollständige Spezifität" im Hinblick auf
Enzym-und-Substrat-Paare verwendet, bei denen das Substrat so ausgewählt wird,
dass es nicht das natürliche Substrat
des ausgewählten
Enzyms ist und damit weniger als 100% Kreuzspezifität für das betreffende
Enzym aufweist.
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Die
Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass durch Kupplung eines Enzyms
mit einem Substrat mit unvollständiger
Spezifität
füreinander
die Geschwindigkeit der Coenzym-Reduktion erheblich herabgesetzt wird.
Durch Verlangsamung der Reduktionsreaktion können die Hauptkomponenten des
Reagenz in einem einzigen Lagerungsprobefläschchen aufbewahrt werden,
wobei der Inhalt gegen Verunreinigung durch die geringe kontinuierliche
Regeneration des Coenzyms stabilisiert wird. Durch Verlangsamung
des Prozesses kann die Regeneration des NADH bzw. NADPH ablaufen,
ohne dass dadurch die Messung der Analyte beeinträchtigt wird.
Die Regeneration kann im Reagenz ablaufen, wenn dieses nicht im
Gebrauch ist, und die Geschwindigkeit, bei der die Regeneration
abläuft,
kann durch Einstellung der Art des gewählten Enzym/Substrat-Paares
und dessen Konzentrationen fein abgestimmt werden.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
der Erfindung wird ein Reagenz zur Verwendung bei einer enzymatischen
Bestimmung eines Analyten in einem Patienten bereitgestellt, wobei
man den Oxidationsgrad eines Coenzyms misst, dadurch gekennzeichnet,
dass das Reagenz gegen Oxidation durch ein Coenzym-Reduktionssystem
stabilisiert wird, das ein Enzym/Substrat-Paar umfasst, das so ausgewählt wird,
dass die Regene ration des Coenzyms mit einer Geschwindigkeit von
0,01–0,9
mAbs/min bei 340 nm abläuft.
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Vorzugsweise
liegt die Geschwindigkeit der Regeneration in einem Reagenz entsprechend
dieser Ausführungsform
der Erfindung bei 0,05–0,4
mAbs/min und insbesondere bei 0,05–0,25 mAbs/min bei Raumtemperatur
(18–25°C) und 340
nm.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung liegt der Grad der Spezifität zwischen dem Substrat und
dem Enzym des Coenzym-Reduktionssystems vorzugsweise unter 100%
und insbesondere unter 50% und ganz besonders bevorzugt unter 10%,
bezogen auf Äquimolarität. Im optimalen
Fall kann ein Enzym/Substrat-Paar mit einer Kreuzreaktivität von unter
5%, bezogen auf Äquimolarität, verwendet
werden.
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Die
Coenzyme, die vorzugsweise im erfindungsgemäßen Reagenz verwendet werden,
sind reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NADH) und reduziertes
Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADPH), obwohl Coenzymanaloga
wie Nicotinamid-Hypoxanthin-Dinucleotid-Phosphat
oder Thio-NADH ebenfalls verwendet werden können.
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Überraschenderweise
wurde gefunden, dass erfindungsgemäße Reagenzien einen weiteren
Vorteil aufweisen, was insbesondere für Ammoniak- und Harnstoff-Reagenzien
gilt. Die Konzentrationen an NADH und/oder NADPH werden in den Harnstoff-
und Ammoniak-Reagenzien durch die Anwesenheit von verunreinigendem
Ammoniak, das mit dem zur Wiederherstellung der Pulverreagenzien
verwendeten Wassers zugeführt
wird, erschöpft.
In ähnlicher
Weise erschöpft
der in der Luft enthaltene Ammoniak, der sich in flüssigen Harnstoff/Ammoniak-Reagenzien
mit der Zeit löst,
die NADH- und/oder NADPH-Spiegel. Die Anwesenheit eines verunreinigenden
Ammoniaks in Ammoniak- und Harnstoff-Reagenzien können nicht
nur zu ungenauen Bestimmungen des Harnstoffs und des Ammoniaks führen, sondern
können
auch bedeuten, dass die Reaktion mit α-Ketoglutarat und NADH in Gegenwart
von GLDH vor der Zugabe zu den Proben abläuft. Dies führt zu erschöpften Konzentrationen
an NADH oder NADPH und damit zu Irrtümern bei der Bestimmung der
Ammoniak- und Harnstoffkonzentrationen in den Proben. Dennoch ermöglicht die
vorliegende Erfindung die Entfernung des verunreinigenden Ammoniaks
sowie die Regeneration des NADH oder NADPH, was eine genaue Bestimmung
der Ammoniak- und Harnstoff-Konzentration in Patientenproben ermöglicht.
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Die
Enzyme, die vorzugsweise im Coenzym-Reduktionssystem für die Bestimmung
des Transaminase-Gehalts einer Serumprobe verwendet werden, können Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
(G-6-P-DH) oder Glucose-Dehydrogenase sein.
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Die
Enzyme, die vorzugsweise im Coenzym-Reduktionssystem für die Bestimmung
des Harnstoff- und Ammoniak-Gehalts einer Serumprobe verwenden werden,
können
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G-6-P-DH) oder Glucose-Dehydrogenase
sein.
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Enzyme
wie Formiat-Dehydrogenase, Glycerin-Dehydrogenase Leucin-Dehydrogenase,
L-Alanin-Dehydrogenase, 3α-Hydroxy-Steroid-Dehydrogenase,
L-Lactat-Dehydrogenase (aus Lactobacillus sp.) oder Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase
kommen ebenfalls in Frage. Das bevorzugte Enzym für Reagenzien
für die Bestimmung
des Spiegels von Transaminase/Ammoniak und Harnstoff ist die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase.
Diese kann aus jeder geeigneten Quelle wie z.B. aus Leuconostoc
mesenteroides, Bacillus stearothermophilus, Zymomonas mobilus oder
Hefe erhalten werden.
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Die
genannten Enzyme werden vorzugsweise aus mikrobiellen Quellen gewonnen.
Die Einarbeitung von Enzymen aus mikrobiellen Quellen in das Reagenz
ermöglicht
die Minimierung der Anwesenheit endogener Verunreinigungen wie NADH-Oxidase
und von Proteasen, die früher
die Beständigkeit
der Reagenzien stark beeinträchtigt
hatten. Die mikrobiellen Enzyme haben noch den weiteren Vorteil,
dass sie wärmebeständiger sind
und dadurch über
längere
Zeit in Lösung
beständig
sind.
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Eine
besonders bevorzugte Quelle für
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase ist Glucose-6-Phosphat aus Leuconostoc
mesenteroides. Wird Glucose-6-Phosphat aus Bacillus stearothermophilus
oder Zymomonas mobilus verwendet, ist die Reaktionsgeschwindigkeit
herabgesetzt. Wird in ähnlicher
Weise Hefe als Quelle für
die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase verwendet, muss das Coenzym
NADPH als Alternative zu NADH verwendet werden, da die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
aus Hefe nur für
NADP+ spezifisch ist. Die geeignete Menge
an Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
in den erfindungsgemäßen Reagenzien
variiert je nach der gewünschten
Regenerationsgeschwindigkeit. Bevorzugt für das AST-Reagenz ist jedoch
eine Menge von ca. 2000 E/l um einen Abbau über längere Zeit in Lösung zu
ermöglichen.
Für ALT
liegt die besonders bevorzugte Konzentration bei 2000 E/l. Eine
bevorzugte Konzentration für
das Harnstoffreagens liegt bei 2000 E/l und eine bevorzugte Konzentration
für das
Ammoniakreagens bei 3500 E/l.
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Berücksichtigt
man, dass die Wahl des Substrats und des Enzyms so erfolgen muss,
dass sie im Coenzym-Reduktionssystem füreinander unvollständige Spezifität aufweisen
müssen,
sind geeignete Substrate für
die Verwendung im erfindungsgemäßen Reagenz
Ribose-5-phosphat, Glucose-1-phosphat, 6-Phosphogluconsäure, 2-Deoxyglucose-6-phosphat,
2-Deoxy-2-fluorglucose-6-phosphat,
2-Deoxy-2-Chlorglucose-6-phosphat, 2-Deoxy-2,2 difluorglucose-6-phosphat,
2-O-Methylglucose-6-Phosphat, Mannose-6-phosphat, Glucosamin-6-phosphat,
3-Deoxyglucose-6-phosphat,
3-Deoxy-3-fluor-glucose-6-phosphat, 3-O-methylglucose-6-phosphat,
Allose-6-phosphat, Ahrose-6-phosphat, 4-Deoxy-4-fluorglucose-6-phosphat, Galactose-6-phosphat,
5-Thio-glucose-6-phosphat,
Phosphonat-Analoga, Glucose-6-stallat, β-D-Glucose, D-Galactose, 2-Deoxyglucose,
Arabinose, Xylose, 1-Sorbose, D-Mannose, D-Fructose, D-Lactose,
D-Sorbital, D-Mannit, Saccharose, Inosit und Maltose.
-
Bei
Verwendung von NADH als bevorzugtem Coenzym im Reagenz ist die bevorzugte
Enzym/Substrat-Kombination Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6-P-DH)/D-Glucose.
Bevorzugte alternative Substrate für D-Glucose sind solche, für die, bezogen
auf die Spezifität
zwischen Glucose-6-phosphat (G-6-P) und G-6-P-DH, die Reaktionsgeschwindigkeit
zwischen dem Enzym G-6-P-DH und dem ausgewählten Substrat unter 50%, vorzugsweise
unter 10% und insbesondere unter 5% liegt. Berücksichtigt man auch hier die
erforderliche Reaktionsgeschwindigkeit, liegt der für die erfindungsgemäßen Reagenzien
am besten geeignete und damit bevorzugte D-Glucose-Spiegel bei ca. 100
mmol/l, obwohl Spiegel von bis zu 1000 mmol/l auch in Frage kommen.
Die Löslichkeit
der D-Glucose im Reagenz wird jedoch bei diesen hohen Konzentrationen
problematisch.
-
Bei
Verwendung einer bevorzugten Kombination von D-Glucose/Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase gelangen
die Kaliumphosphationen in die Zusammensetzung in Form von Dikaliumphosphat.
Je nach der erwünschten
Regenerationsgeschwindigkeit kann eine unterschiedliche Konzentration
an Phosphationen als geeignet erscheinen. Liegt die Konzentration
an D-Glucose beispielsweise
bei ca. 100 mmol/l (Schwankungen zwischen 20 und 200 mmol/l sind
möglich)
und liegt die entsprechende Konzentration an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
bei ca. 2000 E/l (Schwankungen zwischen 500 und 3500 E/l sind möglich),
kann sich die Konzentration an Phosphationen zwischen 2,0 mmol/l
und 20 mmol/l bewegen. Die Zunahme der Konzentration an Phosphationen
erhöht
die Regenerationsgeschwindigkeit. Die bevorzugte Konzentration an
zugesetzten Phosphationen liegt bei ca. 10 mmol/l für AST und
bei ca. 5 mmol für
ALT. Für
das Harnstoffreagenz liegt die bevorzugte Phosphation-Konzentration
bei ca. 5 mmol und bei ca. 5 mmol für das Ammoniak-Reagenz.
-
Gelangt
die bevorzugte Kombination aus D-Glucose und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
zum Einsatz oder jedes andere System, bei dem kein freies Phosphat
erzeugt wird, ist es entscheidend, die freien Phosphationen in das
Reagenz einzuarbeiten. Insbesondere erforderlich sind die freien
Phosphationen für
die Bildung eines nichtspezifischen Komplexes mit D-Glucose zur
Initiierung der Regeneration in Anwesenheit von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase.
-
Eine
bevorzugte Alternative für
die Verwendung von D-Glucose/G-6-P-DH ist die Verwendung von Glucose-Dehydrogenase
(GLD) entsprechend der nachfolgenden Reaktion, worin D-Glucose das
zu 100% reaktive Substrat darstellt: D-Glucose
+ NAD+ → GLD D-Glucono-δ-lacton + NADH + H+
-
Wird
Glucose-Dehydrogenase als Enzym verwendet, sind die bevorzugten
Substrate für
die Reduktion des NAD-Coenzyms und ihr relativer Grad der Kreuz-Reaktivität verglichen
mit D-Glucose Folgende:
-
-
Die
obigen Zahlenwerte stellen die Reaktionsgeschwindigkeit dar, bezogen
auf Glucose-Dehydrogenase in Anwesenheit des natürlichen Substrats 1β-D-Glucose.
-
Verwendet
man andererseits Glycerin-Dehydrogenase (GLY.DH) als Enzym, sind
die geeigneten Substrate für
die Reaktion Glycerin + BAD+ → GLY.DH Dihydroxyaceton + NADH + H+ und ihre Aktivität gegenüber Glycerin
(100%) folgende:
-
-
Wird
Leucin-Dehydrogenase (LD) als Enzym entsprechend der Reaktion Substrat + NAD+ + H2O ⇌ L.D α-Ketoisocaproat
+ NH3 + NADH + H+ verwendet,
sind geeignete Substrate und ihre Aktivität, bezogen auf N-Leucin (100%)
folgende:
-
-
Wird
L-Alanin-Dehydrogenase (A.D) als Enzym für ein Reaktionssystem verwendet,
das dem für
Leucin-Dehydrogenase ähnelt,
ist folgendes Substrat bei einer auf L-Alanin (100%) bezogenen Aktivität geeignet:
-
-
3α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase
(H.DH) kann ebenfalls als Enzym in der Kombination mit den unten
aufgeführten
Substraten verwendet werden. Ihre Aktivitäten, bezogen auf Cholinsäure, sind
dabei folgende:
-
-
Wird
als Enzym L-Lactat-Dehydrogenase (LDH) aus Lactobacillus sp. in
der Reaktion
verwendet, sind geeignete
Substrate und ihre auf L-Lactat bezogene Aktivität folgende:
-
-
Ist
NADP+ das Coenzym, wie z.B. aus Hefe, sind
die bevorzugten Substrat/Enzym-Kombinationen folgende:
-
-
-
Die
obigen Zahlenwerte stellen die relative Reaktivität in Bezug
auf ein G-6-P-DH/G-2-P-Paar dar.
-
Bei
Verwendung von NADP+ als Coenzym ist es
auch möglich,
als Enzym/Substrat Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase mit Dihydroxyacetonphosphat
zu kombinieren.
-
Wie
in der Einleitung der Beschreibung angegeben, sind die übrigen Erfordernisse
für ein
erfindungsgemäßes Reagenz
im Hinblick auf die Verwendung zur Bestimmung der AST-Spiegel im
Serum Lactat-Dehydrogenase, Nicotinamid-Adenin-dinucleotid, reduziertes
(NADH), Malat-Dehydrogenase (MDH), Aspartat und 2-Oxoglutarat. Im
Fall von ALT ist Malat-Dehydrogenase nicht erforderlich und anstelle
von Aspartat ist L-Alanin erforderlich. Im Fall des Harnstoffreagens
sind auch Urease und α-Ketoglutarat
erforderlich, obwohl α-Ketoglutarat
auch für
das Ammoniakreagenz erforderlich ist.
-
Aspartat
ist in Form einer Reihe von Salzen zugänglich, wie z.B. in Form von
Natrium- und Kaliumsalzen. Das erfindungsgemäß bevorzugte Salz ist das Kaliumsalz,
da es leichter löslich
ist und weniger hydratisiert als das Natriumsalz. Ein Konzentrationsbereich,
der für
die erfindungsgemäßen Reagenzien
in Frage kommt, liegt bei 180 bis 240 mmol/l. Besonders bevorzugt
ist eine Endkonzentration von ca. 200 mmol/l, was dem von der IFCC
empfohlenen Spiegel entspricht.
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Der
Bereich für
2-Oxoglutarat, der für
die erfindungsgemäßen Reagenzien
bevorzugt ist, liegt bei ca. 1–15
mmol/l. Es muss jedoch festgestellt werden, dass hohe Konzentrationen
an diesem Substrat die Menge an NADH einschränken könnten, die der Zusammensetzung
zugesetzt wird, da 2-Oxoglutarat bei 340 nm absorbiert wird und
damit eine Hintergrundabsorption für die NADH-Absorption abgibt.
Durch Einschränkung
der Men ge an zugesetztem 2-Oxoglutarat zur Zusammensetzung kann
das Reagenz bei den meisten Spektralanalysegeräten ohne Schwierigkeiten verwendet
werden. Eine bevorzugte Konzentration dieses Substrats für AST- und
ALT-Reagenzien liegt bei ca. 12 mmol/l, was wiederum dem vom IFCC
empfohlenen Spiegel entspricht. Für die Harnstoff- und Ammoniakreagenzien
liegt die bevorzugte Konzentration bei ca. 7,5 mmol/l.
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Die
Menge an Alanin im ALT-Reagenz hängt
bis zu einem gewissen Grad von der Löslichkeit dieser Komponente
ab. Ein bevorzugter Bereich liegt insbesondere bei 200–500 mmol/l,
obwohl am oberen Ende des Bereichs keine spürbare Zunahme an katalytischer
Aktivität
festgestellt wird. Die am meisten bevorzugte Konzentration dieses
Substrats liegt bei ca. 400 mmol/l aus Gründen der Löslichkeit dieses Substrats.
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Die
Konzentration des Coenzyms im Reagenz hängt von folgenden Faktoren
ab:
Die für
die Messung erforderliche Linearität,
Wellenlänge,
Volumenverhältnis von
Probe zu Reagenz und gewähltes
photometrisches System des Analysators.
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Im
Allgemeinen verbessert die Zunahme des Probenvolumens die Empfindlichkeit,
setzt jedoch die Linearität
der erzielten Werte herab, wohingegen die Abnahme des Probenvolumens
die Linearität
auf Kosten der Empfindlichkeit erhöht.
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Die
bevorzugte Wellenlänge
für die
Messung liegt bei 320–400
nm, die Coenzymkonzentration sollte jedoch so eingestellt werden,
dass die Absorption vorzugsweise 2,0 A nicht überschreitet. Die bevorzugte
Wellenlänge
der Absorption liegt erfindungsgemäß bei 340 nm.
-
MDH
wird bevorzugt aus mikrobiellen Quellen gewonnen, um das Risiko
einer endogenen Verunreinigung zu begrenzen und da es außerdem bessere
Ergebnisse im Hinblick auf die Wärmebeständigkeit
aufweist. Die geeigneten Konzentrationen liegen in einem Bereich
von 150–1500
E/l und insbesondere von 200–800
E/l. Die erfindungsgemäß besonders
bevorzugte Konzentration liegt bei ca. 250 E/l.
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Beim
AST-Reagenz nimmt LDH an der Entfernung des endogenen Probenpyruvats
teil. Dem erfindungsgemäßen AST-Reagenz
wurde vorzugsweise so viel LDH zugesetzt, dass bei einem Verhältnis von
Probe zu Reagenz von 1:10 eine 1,0 mmol/l-Pyruvatprobe innerhalb
einer Minute gereinigt wurde. Diese Konzentration lag bei ca. 2000
E/l.
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Beim
ALT-Reagenz nimmt das LDH an zwei Reaktionen teil, und zwar (i)
an der gekuppelten Enzymreaktion für die Messung des ALT und (ii)
an der Entfernung des endogenen Probenpyruvats. Die Konzentration
des zugesetzten LDH entsprach der beim AST-Reagenz. Auch hier entfernte
das Reagenz bis zu 1,0 mmol/l-Probenpyruvat in 1 Minute. Die Hauptreaktion
kann dann nach 1 Minute ohne Störung
durch endogenes Probenpyruvat gemessen werden. Die minimale Konzentration
an LDH für
die Entfernung des endogenen Pyruvats wurde mit ca. 1500 E/l ermittelt.
Die bevorzugte Menge, die dem erfindungsgemäßen ALT-Reagenz zugesetzt wird,
betrug ca. 2000 E/l.
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Beim
Harnstoffreagenz beträgt
die bei einem pH von 8,5 erforderliche minimale Urease-Aktivität als das
nicht geschwindigkeitsbegrenzende Enzym beim kinetischen Testmodus
ca. 5000 E/l. Höhere
Mengen können
aufgenommen werden, um die Langzeitbeständigkeit des Reagenz zu steigern.
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Die
bevorzugte Art der Analytmessung beim Harnstoff- und Ammoniakreagenz
beruht auf kinetischen Prinzipien. Da Glutamat-Dehydrogenase (GLDH)
das geschwindigkeitsbegrenzende Enzym in der Formulierung ist, ist
der Spiegel der in das Reagenz aufgenommenen GLDH-Aktivität kritisch
für die
Linearität
der Analyse. Der Spiegel der erforderlichen GLDH-Akti vität variiert
in Abhängigkeit
vom pH des Reagenzsystems. Der geeignete Bereich für die GLDH-Aktivität liegt
zwischen 250 und 10.000 E/l. Die am besten geeigneten Enzyme sind
solche mikrobiellen Ursprungs, da das handelsübliche GLDH-Präparat
aus tierischen Quellen gewöhnlich
weniger beständig
ist und als Verunreinigung eher hohe Konzentrationen an NADH-Oxidase-Aktivität aufweisen
kann. Die bevorzugte GLDH-Aktivität liegt
für das
Harnstoffreagenz bei pH 8,50 bei ca. 500 E/l und beim Ammoniakreagenz
bei einem pH 8,50 bei ca. 8500 E/l.
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Die
erfindungsgemäßen Reagenzien
können
zusätzlich
zum Coenzymreduktionssystem noch weitere essentielle Substrate und
Enzyme enthalten, wie sie für
die Ermittlung der Analytkonzentration erforderlich sind, sowie
Konservierungsmittel, Chelatbildungsmittel, Tenside, Proteaseinhibitoren,
Puffer, Cofaktoren, Bakterizide und andere Komponenten, die die
Beständigkeit
erhöhen,
die erfindungsgemäßen Eigenschaften
materiell jedoch nicht beeinflussen.
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Die
primären
Kriterien für
die Auswahl eines Puffers sind die gute Pufferkapazität bei dem
gewählten pH
bei minimaler Bindung des zweiwertigen Kations. Der pH und das Puffersystem
für die
AST- und ALT-Reagenzien werden entsprechend den Empfehlungen der
International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) für die Messung
von Transaminasen gewählt.
Eine allgemeine Faustregel ist, dass ein Puffer als wirksam angesehen
werden kann, wenn der pKa ± 1,0
pH E unter dem gewählten
pH beträgt.
Ein bevorzugter pH des erfindungsgemäßen Reagenz liegt bei 7–9. Für Aspartat-Transaminase
liegt die optimale katalytische Aktivität bei ca. pH 7,0–8,2 bei
30°C. Der
besonders bevorzugte pH für
das AST-Reagenz liegt bei ca. 8,1 ± 0,1 bei 20°C, da bei
diesem pH NADH beständig
ist. Für
das ALT-Reagenz liegt die maximale katalytische Aktivität in einem
pH-Bereich von ca. 7,3–7,9
bei 20°C,
der besonders bevorzugte pH liegt bei 7,7 bei 20°C. Bei diesen bevorzugten pH-Werten
wird ein Kompromiss erreicht zwischen der optimalen Enzym-Aktivität und der
Beständigkeit
der Enzyme und dem Coenzym in Lösung.
Ein geringerer pH kann zu einem erhöhten Abbau des Coenzyms führen.
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Das
bevorzugte Puffersystem für
das Harnstoffreagenz ist Tris bei einem pH 8,50, obwohl auch der pH-Bereich
von 7,5–9,5
in Frage kommt. Die bevorzugte Pufferkonzentration für eine wirksame
Pufferkapazität beträgt 100 mM
Tris, obwohl auch ein Bereich von 20 bis 200 mM möglich ist.
Für dieses
Reagenzsystem kommt ein weiter Bereich weiterer Puffer in Frage,
die eine wirksame Pufferkapazität
innerhalb eines pH-Bereichs
von 7,5–9,5
aufweisen.
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Das
bevorzugte Puffersystem für
das Ammoniakreagenz ist Tris bei einem pH 8,5–9,5, obwohl auch der pH-Bereich
von 7,5–9,5
in Frage kommt. Die bevorzugte Pufferkonzentration für eine wirksame
Pufferkapazität
beträgt
100 mM Tris, obwohl auch ein Bereich von 20 bis 200 mM möglich ist.
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Geeignete
Puffer für
das AST- und ALT-Reagenz sind HEPES, 4-Morpholin-Propansulfonsäure (MOPS)
oder 2-(Tris(hydroxymethyl)methylamino]-1-ethansulfonsäure (TES)
oder Diethanolamin oder weitere GOOD-Puffer, Tricin, Bicin, TEA
und TAPS, TAPSO und POPSO. Der bevorzugte erfindungsgemäße Puffer
ist Tris mit einer Gesamtkonzentration von vorzugsweise 30–150 mmol/l,
und insbesondere von ca. 70–100 mmol/l,
obwohl eine Konzentration von 80 mmol/l bevorzugt wird. Bei höheren Pufferkonzentrationen
wird AST zunehmend inhibiert. Man stellt fest, dass Phosphatpuffer
die Geschwindigkeit der Zersetzung des NADH zu erhöhen und
die Verbindung von Pyridoxal-5-phosphat (P-5-P) mit dem Transaminase-Apoenzym
zu inhibieren scheinen. Die zu testende Probe kann mit jedem beliebigen
Verdünnungsmittel
verdünnt
werden, gegebenenfalls mit deionisiertem Wasser oder physiologischer
Kochsalzlösung.
Zusätzlich
zu den oben erwähnten
für AST-
und ALT-Reagenzien geeigneten Puffern kommen noch die folgenden
GOOD-Puffer für
das Ammoniak- und Harnstoffreagenz in Frage: CAPSO, CHES und AMPSO.
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Als
Konservierungsmittel kommen Natriumazid (NaN3),
Hydroxybenzoesäure,
Gentamicin, Thymol und quecksilberfreie Konservierungsmittel der
Firma Boehringer Mannheim wie Methylisothiazolon in Frage. Die geeignete
Konzentration ist dabei so zu wählen,
dass das Konservierungsmittel seine Konservierungseigenschaften
für wenigstens
6–8 Monaten
bei der Lagerung bei 2–8°C ohne Inhibierung
der im Reagenz enthaltenen Enzyme beibehält. Ein geeigneter Konzentrationsbereich,
der die genannten Kriterien erfüllt,
liegt bei 0,1–1,0
g/l.
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Als
nichtspezifische Stabilisatoren kommt eine Reihe von Chelatbildungsmitteln
wie EDTA, EGTA, N-(2-Hydroxyethylethylendiamintriessigsäure (HEDTA)
usw. in Frage. Für
die erfindungsgemäßen AST-
und ALT-Reagenzien wird bevorzugt EDTA bei einer Konzentration von
ca. 2,0–10,0
mmol/l verwendet, um das 2-Oxoglutarat zu stabilisieren. Dieses
erhält
man sowohl als Tetranatriumsalz als auch als Kaliumsalz, das erfindungsgemäß bevorzugte
Salz ist jedoch das Dinatriumsalz. Bei den Harnstoff- und Ammoniak-Reagenzien liegt
das EDTA in einem Bereich von 0,2 bis 10 mM vor. Eine besonders
bevorzugte Konzentration an EDTA beträgt 1 mM.
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In
die erfindungsgemäßen Reagenzien
können
auch noch Enzymstabilisatoren aufgenommen werden. Ein bevorzugter
Stabilisator ist proteasefreies Rinderserumalbumin. Weitere geeignete
Stabilisatoren sind Rinder-γ-Globulin,
N-Acetylcystein und Glycerin.
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Gegebenenfalls
können
auch geeignete Entschäumungsmittel
zugesetzt werden. Als Tenside kommen Zwitterionen-Tenside und nichtionische
Tenside bei Konzentrationen in Frage, welche die in den Reagenzien
enthaltenen Enzyme nicht inhibieren.
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Die
vorliegende Erfindung gewährleistet
ferner eine Verbes serung eines enzymatischen Verfahrens zur Bestimmung
der Konzentration eines Analyten in einer Körperflüssigkeitsprobe, wobei man den
Oxidationsgrad eines Coenzyms misst, wobei die Verbesserung die
Stabilisierung eines das Coenzym umfassenden Reagenz durch ein Coenzym-Reduktionssystem,
das ein Enzym-und-Substrat-Paar umfasst, das so ausgewählt ist,
dass damit eine kontinuierliche Regeneration des Coenzyms während der
gesamten Lagerung des Reagenz ermöglicht wird, gegen Oxidation
umfasst.
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Die
Erfindung gewährleistet
ferner eine Verbesserung eines enzymatischen Verfahrens zur Bestimmung
der Transaminase-Konzentration
in einer Körperflüssigkeitsprobe,
wobei man den Oxidationsgrad eines Coenzyms misst, wobei die Verbesserung
die Stabilisierung eines das Coenzym umfassenden Reagenz durch ein
Coenzym-Reduktionssystem, das ein Enzym-und-Substrat-Paar umfasst, das so ausgewählt ist,
dass damit eine kontinuierliche Regeneration des Coenzyms während der
gesamten Lagerung des Reagenz ermöglicht wird, gegen Oxidation
umfasst.
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Die
Erfindung gewährleistet
ferner eine Verbesserung eines enzymatischen Verfahrens zur Bestimmung
der Aspartat-Aminotransferase-Konzentration in einer Körperflüssigkeitsprobe,
wobei man den Oxidationsgrad eines Coenzyms misst, wobei die Verbesserung
die Stabilisierung eines das Coenzym umfassenden Reagenz durch ein
Coenzym-Reduktionssystem, das ein Enzym-und-Substrat-Paar umfasst,
das so ausgewählt
ist, dass damit eine kontinuierliche Regeneration des Coenzyms während der
gesamten Lagerung des Reagenz ermöglicht wird, gegen Oxidation
umfasst.
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Die
Erfindung gewährleistet
ferner eine Verbesserung eines enzymatischen Verfahrens zur Bestimmung
der Alanin-Aminotransferase-Konzentration in einer Körperflüssigkeitsprobe,
wobei man den Oxidationsgrad eines Coenzyms misst, wobei die Verbesserung
die Stabilisierung eines das Coenzym umfassen den Reagenz durch ein
Coenzym-Reduktionssystem, das ein Enzym-und-Substrat-Paar umfasst,
das so ausgewählt
ist, dass damit eine kontinuierliche Regeneration des Coenzyms während der
gesamten Lagerung des Reagenz ermöglicht wird, gegen Oxidation
umfasst.
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Die
Erfindung gewährleistet
ferner eine Verbesserung eines enzymatischen Verfahrens zur Bestimmung
der Harnstoff-Konzentration in einer Körperflüssigkeitsprobe, wobei man den
Oxidationsgrad eines Coenzyms misst, wobei die Verbesserung die
Stabilisierung eines das Coenzym umfassenden Reagenz durch ein Coenzym-Reduktionssystem,
das ein Enzym-und-Substrat-Paar umfasst, das so ausgewählt ist,
dass damit eine kontinuierliche Regeneration des Coenzyms während der
gesamten Lagerung des Reagenz ermöglicht wird, gegen Oxidation
umfasst.
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Die
Erfindung gewährleistet
ferner eine Verbesserung eines enzymatischen Verfahrens zur Bestimmung
der Ammoniak-Konzentration in einer Körperflüssigkeitsprobe, wobei man den
Oxidationsgrad eines Coenzyms misst, wobei die Verbesserung die
Stabilisierung eines das Coenzym umfassenden Reagenz durch ein Coenzym-Reduktionssystem,
das ein Enzym-und-Substrat-Paar
umfasst, das so ausgewählt
ist, dass damit eine kontinuierliche Regeneration des Coenzyms während der
gesamten Lagerung des Reagenz ermöglicht wird, gegen Oxidation
umfasst.
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Gemäß einem
bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren
weisen das Enzym des Enzym/Substrat-Paars unvollständige Spezifität für das Substrat
auf, wodurch die Geschwindigkeit der Kreuz-Reaktivität zwischen Enzym und Substrat
herabgesetzt wird.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfasst das Coenzym-Reduktionssystem ein Enzym und
ein Substrat mit einer wechselseitigen Spezifität, bezogen auf die Spezifität des Enzyms
für sein
natürliches
Substrat, von unter 100%, vorzugsweise von unter 50% und insbesondere
von unter 10%. Besonders bevorzugt liegt die Spezifität des Enzym/Substrat-Paars
füreinander,
bezogen auf die Spezifität
des Enzyms für
sein natürliches
Substrat, bei unter 5% und insbesondere bei ca. 2%.
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Die
Wahl des Coenzyms, des Substrats und des Enzyms können je
nach dem zu bewertenden Analyten unter denen ausgewählt werden,
wie sie oben in Bezug auf die erfindungsgemäßen Reagenzien erwähnt wurden.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung sind die bevorzugten Komponenten für das Coenzymreduktionssystem
das zur Bestimmung der Analytkonzentration verwendet wird, NADH,
G-6-P-DH und D-Glucose,
so dass folgende Regeneratiaonsreaktion abläuft: D-Glucose + NAD+ → G-6-P-DH NADH
+ Gluconolacton
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Aufgrund
der geringen Spezifität
von G-6-P-DH für
Glucose läuft
diese Regenerationsreaktion nur langsam ab und konkurriert daher
nicht mit den Hauptreaktionen, die an der Bestimmung der Analytkonzentrationen
beteiligt sind.
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BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfasst das ALT-Reagenz im Wesentlichen folgende Komponenten:
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-
Außerdem sind
noch vorzugsweise TRIS-Puffer, TRIS HCl, EDTA-Dinatrium, Rinderserum-Albumin und Natriumazid
enthalten.
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Nachfolgend
ist ein erfindungsgemäß formuliertes
ALT-Reagenz angegeben:
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfasst das ALT-Reagenz im Wesentlichen folgende Komponenten:
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-
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Die
Formulierung wird auf 10% eingeengt, um eine Verdünnung der
Probe zu ermöglichen.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfasst das AST-Reagenz folgende Komponenten:
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Außerdem sind
noch vorzugsweise TRIS-Puffer, TRIS HCl, EDTA-Dinatrium, Rinderserum-Albumin und Natriumazid
enthalten.
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Nachfolgend
ist ein erfindungsgemäß formuliertes
AST-Reagenz angegeben:
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Nachfolgend
ist ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäß formuliertes AST-Reagenz
angegeben:
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Die
Formulierung wird auf 10% eingeengt, um eine Verdünnung der
Probe zu ermöglichen.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfasst das Harnstoff-Reagenz im Wesentlichen folgende
Komponenten:
-
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Nachfolgend
ist ein erfindungsgemäß formuliertes
Harnstoff-Reagenz
angegeben:
-
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Nachfolgend
ist ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäß formuliertes Harnstoff-Reagenz
angegeben:
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Nachfolgend
ist ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäß formuliertes Ammoniak-Reagenz
angegeben:
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Außerdem sind
noch vorzugsweise TRIS-Puffer, TRIS HCl, EDTA-Dinatrium, Rinderserum-Albumin und Natriumazid
enthalten.
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Nachfolgend
ist ein erfindungsgemäß formuliertes
AST-Reagenz angegeben:
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Nachfolgend
ist ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäß formuliertes Ammoniak-Reagenz
angegeben:
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Obwohl
die erfindungsgemäßen Reagenzien
bevorzugt in einem einzigen Probefläschchen formuliert werden,
ist auch eine Formulierung in zwei Probenfläschchen möglich. Die Regenerationskomponente
der Formulierung braucht nur in eines der Probenfläschchen
gegeben zu werden. Die IFCC empfiehlt insbesondere, dass für ALT- und
AST-Reagenzien das 2-Oxoglutarat als getrennte Komponente zum Rest
der Formulierung formuliert wird. Das Reagens A (unter Ausschluss
des 2-Oxoglutarats) kann mit der Patientenprobe während 5–10 Minuten
inkubiert werden, währenddessen
sämtliche
Nebenreaktionen bis zum Ende ablaufen. Nach der Inkubierung kann
das 2-Oxoglutarat zugesetzt werden, um die Hauptreaktion in Gang
zu setzen. Alternativ zur Verwendung von 2-Oxoglutarat als Starterkomponente
kann auch noch Aspartat und Alanin auf dieselbe Weise verwendet
werden, da die Anwesenheit von 2-Oxoglutarat
das AST oder ALT vor der Inaktivierung während der Nebenreaktionen schützt. Das
Regenerationssystem, das das noch getrennte Enzym/Substrat-Paar
umfasst, sollte der Komponente des Zweiprobenfläschchensystems, das NADH enthält, zugesetzt werden.
-
Bei
Verwendung eines Zweiprobenfläschchensystems
ist zu empfehlen, dass die Formulierung P-5-P enthält, da während der
Inkubation in Anwesenheit der Probe die Zugabe des P-5-P zum Serum
die Apoenzyme aktiviert und die Messungen der gesamten katalytischen
Aktivitätskonzentrationen
von AST und ALT im Serum ermöglicht,
vorausgesetzt dass die Sättigung
mit P-5-P vollständig
ist. Die bevorzugte P-5-P-Konzentration für die Verwendung in einem Zweiprobenfläschchensystem
beträgt
ca. 80 bis 120 μmol/l,
vorzugsweise 100 μmol/l.
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Beispiel 1
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Die
Beständigkeit
von vier konkreten, erfindungsgemäß formulierten Reagenzien wurde
wie folgt getestet: FORMULIERUNG: AST-Reagenz: TABELLE
7A
| TRIS-Puffer | 3,78
g/l |
| TRIS-HCl | 8,95
g/l |
| Aspartat | 37,88
g/l |
| α-Ketoglutarat,
Na-Salz (wasserfrei) | 2,51
g/l |
| Natriumazid | 0,50
g/l |
| Rinderserum-Albumin | 1,0
g/l |
| NADH·Na23H2O | 0,199
g/l |
| EDTA-Dinatrium | 2,04
g/l |
| Dikaliumphosphat
(K2HPO4) | 0,87
g/l |
| D-Glucose | 18,016
g/l |
| G-6-PDH
(L. mesenteroides) | 3500
E/l |
| D-LDH
(mikrobiell) | 2000
E/l |
| MDH
(mikrobiell) | 650
E/l |
TABELLE
7B
| TRIS-Puffer | 4,35
g/l |
| TRIS-HCl | 8,31
g/l |
| L-Aspartat,
K-Salz | 37,88
g/l |
| α-Ketoglutarat,
Na-Salz (wasserfrei) | 2,51
g/l |
| Natriumazid | 0,50
g/l |
| Rinderserum-Albumin | 0,50
g/l |
| NADH,
Na2·3H2O | 0,234
g/l |
| EDTA-Dinatrium | 1,86
g/l |
| Dikaliumphosphat(K2HPO4) | 1,74
g/l |
| D-Glucose | 18,016
g/l |
| G-6-PDH
(Toyobo) Luconostoc mesenteroides | 2000
E/l |
| LDH | 2000E/l |
| MDH
(mikrobiell) | 200
E/l |
ALT-Reagenz: TABELLE
8A
| TRIS-Puffer | 2,18
g/l |
| TRIS
HCl | 11,0
g/l |
| L-Alanin | 39,2
g/l |
| α-Ketoglutaarat,
Na-Salz (wasserfrei) | 2,51
g/l |
| Natriumazid | 0,50
g/l |
| Rinderserum-Albumin | 1,0
g/l |
| NADH·Na23H2O | 0,199
g/l |
| EDTA-Dinatrium | 2,04
g/l |
| Dikaliumphosphat
(K2HPO4) | 0,87
g/l |
| D-Glucose | 18,016
g/l |
| G-6-PDH
(Luconostoc mesenteroides) | 3500
E/l |
| LDH
(mikrobiell) | 3000
E/l |
TABELLE
8B
| TRIS-Puffer | 3,27
g/l |
| TRIS
HCl | 11,03
g/l |
| L-Alanin | 39,2
g/l |
| α-Ketoglutarat,
Na-Salz (wasserfrei) | 2,51
g/l |
| Natriumazid | 0,50
g/l |
| Rinderserum-Albumin | 0,50
g/l |
| NADH,
Na23H2O | 0,234
g/l |
| EDTA-Dinatrium | 1,86
g/l |
| Dikaliumphosphat
(K2HPO4) | 0,87
g/l |
| D-Glucose | 18,016
g/l |
| G-6-PDH
(Luconostoc mesenteroides) | 2000
E/l |
| LDH
(mikrobiell) | 4000
E/l |
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LAGERUNGSBEDINGUNGEN:
-
- Abgedeckt und gekühlt
(2–8°C)
-
SPEKTROPHOTOMETRISCHE
PARAMETER (Shimadzu PC 2101):
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- Reaktionstemperatur 37°C
- Volumenverhältnis
von Probe zu Reagenz 1:10 bis 1:25
- Wellenlänge
340 nm
- Küvettenweglänge 1 cm
-
Die
lag-Phase der Messung beträgt
ca. 1 Minute oder weniger und die Dauer für die Messung bis zu 3 Minuten
nach der lag-Phase.
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Die
obigen spektrophotometrischen Parameter wurden verwendet zur Bestimmung
von:
Ausgangsabsorption des Reagenz bei 340 nm und Regenerationsgeschwindigkeit
bei 20°C
(ausgedrückt
in mAbs/min)
Cobas Mira wurde verwendet, um die Rückgewinnung
an Kontrollstandards zu ermitteln.
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Dabei
wurden folgende Ergebnisse erzielt:
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Die
nachfolgenden Tabellen 10A und 10B belegen die fortgesetzte Funktionalität des AST-
und ALT-Reagenz in Verlaufe von 7 Monaten. Für jeden Versuch wurde ein hoher
und niedriger Pool an AST- und ALT-Serum verwendet, wobei frisch
hergestelltes Reagenz einerseits und ein bei 8°C gelagertes Reagenz andererseits
zu unterschiedlichen Zeitpunkten verwendet wurden.
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TABELLE
10B: Gewinnung
der Kontrollsera für
das AST und ALT-Reagenz aus Tabelle 7B und 8B
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Aus
den obigen Ergebnissen geht hervor, dass die Regeneration des AST-
und ALT-Reagenz bei abgedeckter Lagerung bei 2–8°C eine Beständigkeit von wenigstens 6–7 Monaten
bewirkt.
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Das
Reagenz muss eine Anfangsabsorption von 1,0 Å aufweisen, um funktionell
zu sein. Nach 7 Monaten weist das Reagenzs noch eine Absorption
von wenigstens 1,0 Å auf.
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Aus
den Ergebnissen in Tabelle 10A und 10B geht klar hervor, dass keine
signifikanten Unterschiede bei der Rückgewinnung der Kontrollsera,
erhalten aus Frischreagenz, verglichen mit dem bei 8° bis zu 29
Wochen gelagerten Reagenz festzustellen sind. Die Ergebnisse in
Tabelle 11A und 11B zeigen, dass das AST- und ALT-Reagenz unter
Anwendung der Coenzymregenerationstechnologie noch nach 31 Wochen
bei einer Lagerung bei 8°C
den Linearitätsanforderungen
entsprechen.
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Die
Aufnahme des erfindungsgemäßen Regenerationssystems
führt zu
einer Steigerung der wiederhergestellten Beständigkeit eines Serums für das abgedeckte
AST- und ALT-Messreagenz von 1 Monat bei 2–8°C auf wenigstens 6–8 Monate
bei 2–8°C.
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Beispiel 2
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Es
wurden Harnstoff-Reagenzien mit den in Tabelle 5B beschriebenen
Komponenten hergestellt, nur wurden in die Formulierungen 0,33 mM
NADH aufgenommen und die Konzentration an D-Glucose wurde für eines
der Reagenzien auf 20 mM herabgesetzt.
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Die
auf diese Weise hergestellten Formulierungen hatten einen pH von
8,5. Als Kontrolle diente eine übliche
Harnstoffreagenzformulierung. Die Reagenzien wurden mit einer Konzentration
von 0,156 mM Ammoniak hergestellt, das in das Reagenzsystem (bei
der Endkonzentration) als Verunreinigung aufgenommen wurde. Diese
Konzentration an Ammoniakverunreinigungen reicht aus, um 0,15 mM
NADPH in den entsprechenden Reagenzien zu verbrauchen, was 0,93
Absorptionseinheiten bei 340 nm entspricht. Nach Abschluss der Reaktion,
d.h. der Entfernung des Ammoniaks in der Reagenzformulierung, wurde
die Absorption der einzelnen Lösungen,
die in verschlossene Küvetten
gegeben worden waren, über
längere
Zeit mit Hilfe eines Shimadzu-Spektrophotometers bei 340 nm und
bei einer Temperatur von 20°C überwacht.
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Die
in 1 dargestellten Ergebnisse zeigen die zeitabhängige Regeneration
des NADH aus NAD+ in der erfindungsgemäßen Harnstoffreagenzformulierung
nach der Verunreinigung mit 0,15 mM Ammoniak.
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In 1 zeigen:
Das
Feld A die NADH-Regeneration für
ein übliches
Harnstoffreagenz,
das Feld B die NADH-Regeneration eines Harnstoffreagenz,
das 5 mM Na-Phosphat, 2000 E/l G-6-PDH und 20 mM D-Glucose enthält und
das
Feld C die NADH-Regeneration eines Harnstoffreagenz, das 5 mM K-Phosphat,
2000 E/l G-6-PDH und 100 mM D-Glucose enthält.
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Nach
48 Stunden bei 20°C
konnte das übliche
Reagenz kein NADH mehr regenerieren, das nach der Verunreinigung
mit Ammoniak verbraucht worden war. Nach ebenfalls 48 Stunden hatte
das erfindungsgemäße Harnstoffreagenz
mit 20 mM D-Glucose 0,23 Absorptionseinheiten bzw. 0,04 mM NADH
regeneriert. Nach 48 Stunden hatte das erfindungsgemäße Harnstoffreagenz
mit 100 mM D-Glucose 0,70 Absorptionseinheiten bzw. 0,11 mM NADH
regeneriert. Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des beschriebenen Reagenz,
die Erschöpfung
an NADH im Harnstoffreagenz nach der Verunreinigung des Reagenz
mit Ammoniak zu beseitigen.
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-
In
Tabelle 12 sind die maximalen Geschwindigkeiten der NADH-Regeneration in den
jeweiligen Harnstoffreagenzien dargestellt. Beim üblichen
Harnstoffreagenz zeigte sich im Verlaufe der Zeit nach der Entfernung
des verunreinigenden Ammoniaks ein langsamer Verlust an Absorption.
Bei der erfindungsgemäßen Formulierung
stieg die Geschwindigkeit der NADH-Regeneration zusammen mit dem
Anstieg der Konzentration an D-Glucose im Reagenz an.
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Mit
den Komponenten, wie sie oben in Tabelle 6B beschrieben wurden,
wurden Ammoniakreagenzien hergestellt, nur wurde das Verhältnis von
Tris zu Tris-HCl-Puffer (100 mM Gesamtpuffer) so variiert, dass pH-Werte
des Reagenz im Bereich von 8,0–9,3
erzielt wurden. In den Ammoniakreagenzien wurde auch eine Endkonzentration
von 0,2 mM NADPH verwendet. Es wurde auch ein Kontrollammoniakreagenz
hergestellt, das keine D-Glucose
und kein Kaliumpohosphat bzw. G-6-PDH aufwies.
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Die
Reagenzien wurden mit einer Konzentration von 0,1 mM Ammoniak hergestellt,
das in das Reagenzsystem (bei der Endkonzentration) als Verunreinigung
aufgenommen wurde. Diese Konzentration an Ammoniakverunreinigungen
reicht aus, um 0,1 mM NADPH in den entsprechenden Reagenzien zu
verbrauchen, was 0,62 Absorptionseinheiten bei 340 nm entspricht.
Nach Abschluss der Reaktion, d.h. der vollständigen Entfernung des Ammoniaks
aus den Reagenzien, wurde die Absorption der einzelnen Lösungen,
die in verschlossene Küvetten
gegeben worden waren, über
längere
Zeit mit Hilfe eines Shimadzu-Spektrophotometers bei
340 nm und bei einer Temperatur von 20°C überwacht.
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Die
in 2 dargestellten Ergebnisse zeigen die zeitabhängige Regeneration
von NADPH aus NADP in erfindungsgemäßen Ammoniakreagenzformulierungen
in einem pH-Bereich von 8,0–9,3
nach Verunreinging mit 0,1 mM Ammoniak. Die NADPH-Regeneration nach
der Aufhellung des verunreinigenden Ammoniaks war innerhalb von
24 Stunden nach der Verunreinigung durch Ammoniak bei 20°C abgeschlossen.
In Tabelle 13 sind die maximalen Geschwindigkeiten der NADPH-Regeneration
in den jeweiligen Ammoniakreagenzien dargestellt. Bei einem üblichen
Ammoniakreagenz bei einem pH von 8,0 verblieb die Absorption der
Lösung in
einem Bereich zwischen 0,6 und 0,65 bei einem langsamen Verlust
an Absorption. Bei den erfindungsgemäßen Formulierungen war bei
allen untersuchten pH-Werten die Geschwindigkeit der NADPH-Regeneration ziemlich ähnlich.
Die maximale Geschwindigkeit der NADPH-Regeneration lag bei einem
pH von 8,50. Diese Ergebnisse zeigen deutlich das Vermögen der
oben beschriebenen Erfindung, die NADPH-Erschöpfung im Ammoniak-Reagenz nach
der Verunreinigung des Reagenz mit Ammoniak zu beseitigen.
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Beispiel 3
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Geschwindigkeit des Verlustes
an NAD(P)H in Ammoniak- und
Harnstoffreagenzien
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A Harnstoffreagenz
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Es
wurden mit einer Formulierungszusammensetzung, wie sie in Tabelle
5B beschrieben wird, Harnstoffreagenzien bei den nachfolgenden Variationen
hergestellt. Die Endkonzentration an NADH in den Reagenzformulierungen
betrug 0,25 mM. Der pH des Harnstoffreagenz wurde durch Variieren
des Verhältnisses von
Tris zu Tris-HCl (100 mM Gesamtpuffer) eingestellt. Es wurden auch
Kontrollharnstoffreagenzlösungen ohne
D-Glucose, Phosphat und G-6-PDH hergestellt.
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Die
Absorption der Probelösungen
der Reagenzien, die in verschlossenen Küvetten bei 20 ± 2°C gelagert
wurden, wurde bei 340 nm überwacht.
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Die
Abnahme der Absorption der Harnstoffreagenzlösungen im Verlaufe der Lagerung
bei 20 ± 2°C, überwacht
bei 340 nm, ist in Tabelle 14 dargestellt. Daraus geht hervor, dass
sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit des erfindungsgemäßen Coenzymregenerationssystems
die Lösungen
bei einem pH von 8,0 rascher an Absorption verlieren als bei einem
pH von 8,5. Bei der erfindungsgemäßen Formulierung ist die Geschwindigkeit
des Absorptionsverlustes der Reagenzlösung ebenfalls erheblich geringer.
Erhöhter
pH und die Einarbeitung des erfindungsgemäßen Coenzymregenerationssystem
ver mindern mit anderen Worten erheblich die Geschwindigkeit des
Verschwindens des NADPH aus der Harnstoffreagenzlösung.
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Es
muss festgestellt werden, dass, während ein Anstieg des pH-Werts
auf über
8,5 ebenfalls die Beständigkeit
des NADH begünstigt,
verlieren handelsübliche
Urease- und Dehydrogenase-Enzyme zunehmend an Beständigkeit
und Aktivität
in der Reagenzformulierung. Es ist somit eine Ausgewogenheit bezüglich des pH's der Reagenzformulierung
erforderlich, so dass eine entsprechende Enzymaktivität und -beständigkeit aufrechterhalten
werden können,
wobei gleichzeitig auch eine vertretbare NADH-Beständigkeit
erreicht wird. Auf dieser Basis wird eine Reagenzformulierung mit
einem pH von annähernd
8,5 bevorzugt.
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-
B AMMONIAKREAGENZ
-
Es
wurden mit einer Formulierungszusammensetzung, wie sie in Tabelle
6B beschrieben wird, Ammoniakreagenzien bei den nachfolgenden Variationen
hergestellt. Der pH des Ammonia reagenz wurde durch Variieren des
Verhältnisses
von Tris zu Tris-HCl (100 mM Gesamtpuffer) eingestellt. Die Endkonzentration
an NADPH in den Ammoniakreagenzlösungen
betrug 0,2 mM. Es wurden auch Kontrollammoniakreagenzlösungen ohne
D-Glucose, Phosphat
und G-6-PDH hergestellt.
-
Die
Absorption der Probelösungen
der Reagenzien, die in verschlossenen Küvetten bei 20 ± 2°C gelagert
wurden, wurde bei 340 nm überwacht.
-
Die
Abnahme der Absorption der Ammoniakreagenzlösungen im Verlaufe der Lagerung
bei 20°C, überwacht
bei 340 nm, ist in Tabelle 15 dargestellt. Daraus geht hervor, dass
sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit des erfindungsgemäßen Coenzymregenerationssystems
die Lösungen
unter Verminderung des pH rascher an Absorption verlieren. In den
erfindungsgemäßen Formulierungen
war jedoch die Geschwindigkeit des Absorptionsverlustes der Regenerationslösung ebenfalls
erheblich geringer. Erhöhter
pH und die Einarbeitung des erfindungsgemäßen Coenzymregenerationssystems
vermindern mit anderen Worten erheblich die Geschwindigkeit des
Verschwindens des NADPH aus der Ammoniakreagenzlösung.
-
Es
muss festgestellt werden, dass, während ein Anstieg des pH-Werts
ebenfalls die Beständigkeit
des NADPH begünstigt,
verliert bei einem pH von über
8,5 die handelsübliche
Glutamat-Dehydrogenase zunehmend an Beständigkeit und Aktivität in der
Reagenzformulierung. Es ist somit eine Ausgewogenheit bezüglich des
pH's der Reagenzformulierung
erforderlich, so dass eine entsprechende Enzymaktivität und -beständigkeit aufrechterhalten
werden können,
wobei gleichzeitig auch eine vertretbare NADPH-Beständigkeit
erreicht wird. Auf dieser Basis wird eine Reagenzformulierung mit
einem pH von annähernd
8,5–9,0
bevorzugt.
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Beispiel 4
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Funktionalität der Ammoniak-
und Harnstoffreagenzien
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A Harnstoffreaganzien
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Das
Harnstoffreagenz wurde entsprechend der Komponentenliste in Tabelle
5B in An- und Abwesenheit von D-Glucose, Phosphat und G-6-PDH hergestellt.
Die Endkonzentration an NADH in den Reagenzformulierungen betrug
jedoch 0,25 mM. Die Linearität
der Reagenzien wurde mit Verichem/normale Kontrolle/abnormale Kontrolle,
mit Hilfe des Instruments Roche
®COBAS
MIRA
TM bei den nachfolgend angegebenen Parametern
verglichen:
| Reaktionstemperatur | 37°C |
| Volumenverhältnis von
Probe zu Reagenz | 1:100 |
| Wellenlänge | 340
nm |
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Die
in Tabelle 16 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass das Harnstoffreagenz
beim erfindungsgemäßen bei
einem pH von 8,50 bis zum höchsten
Niveau der getesteten Harnstoffkontrollprobe (Verichem-Spiegel E
bei 37,4 mM Harnstoff) linear ist, wobei die Messwerte innerhalb
von 5% der angegebenen Konzentration schwanken. Das erfindungsgemäße Harnstoffreagenz
passt auch genau in die Abweichung des Wertes für die normalen und anormalen
Harnstoffkontrollproben.
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B Ammoniakreagenz
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Das
Ammoniakreagenz wurde entsprechend der Komponentenliste in Tabelle
6B in An- und Abwesenheit von D-Glucose, Phosphat und G-6-PDH hergestellt.
Die Linearität
der Reagenzien wurde mit wässrigen Ammoniakkontrollen
mit Hilfe des Instruments Roche
®COBAS
MIRA
TM bei den nachfolgend angegebenen Parametern
verglichen:
| Reaktionstemperatur | 37°C |
| Volumenverhältnis von
Probe zu Reagenz | 1:10 |
| Wellenlänge | 340
nm |
-
Die
in Tabelle 17 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass das Ammoniakreagenz
beim erfindungsgemäßen pH von
8,50 bis zum höchsten
Niveau der getesteten Ammoniakkontrollprobe (1200 μM Ammoniak)
linear ist, wobei die Messwerte innerhalb von 5% der angegebenen
Konzentration schwanken.
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Beispiel 5
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Das
Harnstoffreagenz kann entsprechend der unten angegebenen Formulierungskonfiguration
als Doppelprobenfläschchen
konfiguriert werden. Das relative Volumen der Zugabe des Reagenz
des Probenfläschchens
A und des Probenfläschchens
B, das zur Erzielung des kombinierten Reagenz erforderlich ist,
beträgt
5:1 für
Probenfläschchen
A zu Probenfläschchen
B.
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Ammoniakreagenz, 2 Probenfläschchen
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Das
Ammoniakreagenz kann entsprechend der unten angegebenen Formulierungskonfiguaration
in Zweiprobenfläschchenform
konfiguriert werden. Das zur Erzielung des kombinierten Reagenz
erforderliche Volumenverhältnis
für die
Zugabe von Probenfläschchen
A-Reagenz und Probenfläschchen
B-Reagenz beträgt
5:1. In der beispielhaften Formulierung wird NADH anstelle von NADPH
verwendet. Schließlich
wird LDH zur Entfernung des störenden
Probenpyruvats des Patienten vor Beginn der Hauptanalysenreaktion
in das Probenfläschchen
A aufgenommen.
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