CN1856792A

CN1856792A - 影响物质生产的代谢流量的测定方法

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Publication number: CN1856792A
Application number: CNA2004800272636A
Authority: CN
Inventors: S·凡迪恩; 岩谷真太郎; 臼田佳弘; 松井和彥; 植田拓嗣; 辻雄一郎
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-07-29
Filing date: 2004-07-29
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2024-07-29
Also published as: EP1651758B1; PL1651758T3; WO2005010175A1; EP1649403A2; KR20060026436A; RU2337140C2; DK1651758T3; KR20060056970A; KR101208480B1; BRPI0413030A; US20090148915A1; BRPI0413007B1; BRPI0413007A; US7809511B2; ATE397059T1; JP4665451B2; WO2005010794A3; DE602004014158D1; EP1651758A1; ZA200510144B

Abstract

通过以下步骤测定影响细胞进行物质生产的代谢流量：1)基于底物到目标产物的生化反应式建立化学计量矩阵；2)从所有代谢流量中选择与化学计量矩阵自由度相同数量的独立代谢流量作为自由流量；3)建立足够数量的自由流量的随机组合进行统计分析，并基于化学计量矩阵从各建立的组合计算代谢流量分布；4)通过多元统计分析，从计算出的代谢流量分布获得回归方程，其包括最小数量的显示与物质生产相关的自由流量；5)基于所得回归方程中的系数确定至少一种影响物质生产的代谢流量。

Description

影响物质生产的代谢流量的测定方法

技术领域

本发明涉及影响物质生产的代谢流量的测定方法、使用该测定方法构建菌株的方法、执行该测定方法的程序和存储程序的记录介质。

背景技术

代谢流量分析，又被称为流量平衡分析，是通过建立细胞内生化反应的化学计量模型和线性优化，预测细胞内代谢流量分布的技术。这项技术已被用于研究微生物生化反应系统的能力，或预测不同外界条件下胞内代谢流量的分布(非专利文件1、2和3)。构建大肠杆菌(Escherichia coli)的化学计量模型也有报道(非专利文件4和5)。也已知在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)生产赖氨酸的代谢工程中使用这种化学计量模型的实例(非专利文件6)。此外，报道了大量的代谢流量分析的理论性和实验性方法，以及它们的应用(非专利文件7、8，专利文件1、2和3)。专利文件1公开了基于化学计量模型预测生长必需基因的方法。专利文件2公开了遗传或进化改变细胞以赋予细胞最优功能的技术。此外，专利文件3公开了将定性动力学信息的限制、定性控制信息的限制和基于不同条件下DNA微点阵实验数据的限制应用于化学计量模型的方法。尽管所有这些方法都是预测更多所需的胞内代谢流量分布的方法，但是没有任何一种方法公开理论上预测作为目标的流量，以直接提高细胞的物质生产。

<非专利文件l>

Varma，A.和Palsson，.B.O.Appl.Environ.Microbiol.60：3724-3731，1994

<非专利文件2>

Schilling，C.H.等，Biotechnol.Prog.，15：288-295，1999

<非专利文件3>

Schilling，C.H.等，Biotechnol.Prog.，15：296-303，1999

<非专利文件4>

Pramanik，J.和Keasling，J.D.，Biotechnol.Bioeng.，56：398-421，1997

<非专利文件5>

Ibarra，R.U.等，Nature，420：186-189，2002

<非专利文件6>

Vallino，J.J.和Stephanopoulos，G.，Biotechnol.Bioeng.，41：633-646，1993

<非专利文件7>

Wiechert，W.，Journal of Biotechnology，94：37-63，2002

<非专利文件8>

Wiechert，W.，Metabolic Engineering，3：195-205，2001

<专利文件1>

国际申请号WO00/46405

<专利文件2>

国际申请号WO02/061115

<专利文件3>

国际申请号WO02/055995

发明公开

本发明提供了一种方法，通过使用胞内代谢流量分析预测修饰细胞的有效方法，以提高目标产物或生物量的产率，和使用细胞如微生物细胞生产物质(如氨基酸、有机酸和核酸)中产物的生产力。更具体而言，本发明提供了影响物质生产的代谢流量的测定方法、使用该测定方法生产细菌菌株的方法、执行该测定方法的程序和储存程序的记录介质。

考虑到上述目的，本发明的发明者们进行了艰苦的研究，最终他们发现可如下测定影响物质生产的代谢流量：基于底物到目标产物(待生产物质)的生化反应式计算化学计量矩阵的自由度，选择与该自由度相同数量的自由流量；基于该化学计量矩阵，从足够进行统计分析的数量的各自由流量随机组合计算代谢流量分布；基于统计分析，从计算出的代谢流量分布得到回归方程，其包含最小数量的与物质生产相关的自由流量。基于上述发现实现了本发明，至少包括如下：

(1)一种用于测定至少一种影响使用细胞生产物质的代谢流量的方法，该方法包括如下步骤：

1)基于底物到目标产物的生化反应式建立化学计量矩阵，

2)从所有代谢流量中选择与化学计量矩阵自由度相同数量的独立代谢流量作为自由流量，

3)建立足够数量的自由流量的随机组合进行统计分析，并基于化学计量矩阵从各建立的组合计算代谢流量分布，

4)通过多元统计分析，从计算出的代谢流量分布获得回归方程，其包括最小数量的显示与物质生产相关的自由流量，

5)基于所得回归方程的系数确定至少一种影响物质生产的代谢流量。

(2)(1)的方法，其中该统计分析为多元线性回归分析。

(3)(1)或(2)的方法，其中细胞为有能力产生氨基酸、核酸或有机酸的微生物细胞。

(4)一种用于构建具有物质生产能力的菌株的方法，其包括修饰菌株，以至在通过(1)-(3)任一项定义的方法测定的影响物质生产的代谢流量中，或在任何属于相同独立代谢流量组(包括该代谢流量)的代谢流量中，当代谢流量显示与物质生产正相关时增加其相应活性，或当代谢流量显示与物质生产负相关时降低其相应活性，或两者兼有。

(5)一种生产物质的方法，包括将通过(4)中定义的方法构建的菌株培养于培养基中，以在培养基或细菌细胞中生产和累积物质，并从培养基或细胞中收集物质，其中物质为氨基酸、核酸或有机酸。

(6)一种用于测定至少一种影响使用细胞生产物质的代谢流量的程序，该程序允许计算机执行代谢流量测定方法，包含以下程序：

1)基于底物到目标产物的生化反应式建立化学计量矩阵，

5)基于回归方程中获得的系数确定至少一种影响物质生产的代谢流量。

(7)一种计算机可读的记录介质，其记录了(6)中定义的程序。

附图简述

图1是用5000个随机流量分布的数据组将赖氨酸的生产显示为不同自由流量值的函数的图形。赖氨酸产率显示为(a)异柠檬酸裂合酶流量、(b)苹果酸酶流量和(c)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶流量。

图2是将赖氨酸的生产显示为5000个随机流量分布的数据组在方程2中的值的函数图形。输入值为基于10mmol/小时葡萄糖流量，以mmol/小时为单位的流量值。

图3显示代谢流量测定程序的流程图。

图4显示pMW118-attL-Tc-attR和pMW118-attL-Cm-attR的结构。

图5显示pMW-intxis-ts的结构。

实施本发明的最佳方式

下文将详细解释说明本发明。

<1>本发明的测定方法

本发明的测定方法是测定影响使用细胞进行物质生产的代谢流量的方法。

用于本发明的代谢流量被表述为代谢反应速率(流量)，其来源于胞内生化反应的化学计量模型和代谢产物之间的质量作用定律；同时，本文使用的代谢流量分布由所有的代谢流量组成，其中每一个代谢流量被指定到各生化反应。

用于本发明的细胞并没有特别限制，只要它用于物质生产。其实例包括各种培养的细胞、真菌、酵母、各种细菌等。优选为有能力产出有用化合物如氨基酸、核酸或有机酸的微生物细胞。作为有能力产生氨基酸、核酸或有机酸的微生物，优选使用大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus bacteria)、棒状杆菌(coryneformbacteria)等。更优选使用具有氨基酸生产能力和/或有机酸生产能力的微生物。这种微生物有能力产生有用的化合物，例如，显示于EP-A1016710的大肠杆菌，显示于JP-A 2003-259861的芽孢杆菌，显示于WO 00/18935的棒状杆菌。基于可通过本发明获得的影响物质生产的代谢流量的信息，修饰微生物，以提高它的物质生产能力。

在本发明测定方法的第一步中，基于底物到目标物质产物的生化反应式建立化学计量矩阵。

生化反应指在细胞内胞内代谢物通过酶促反应转变的过程，并根据生物类型被编到不同的数据库。例如Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes(KEGG，www.genome.ad.jp/kegg/)可供查询参考。

底物通常是被细胞作为碳源使用的物质，其实例包括葡萄糖、蔗糖、果糖等。

物质产物不仅包括单一种类的代谢产物，而且包括代谢产物的聚集体，例如生物量(细胞体)。物质生产通常被评价为物质的生产速率。具体而言，当目标物质是生物量时，它被评价为生物量产率。生物量产率代表了从底物如葡萄糖转化为细胞组分如蛋白、碳水化合物、核酸或脂类的效率。

化学计量矩阵是通常用于代谢流量分析的矩阵，可以通过用于代谢流量分析的典型方法，列举底物到目标物质产物的生化反应式来建立。这种方法是熟知的，假定胞内代谢中间体是准稳态(Savinell，J.M.和Palsson，B.O.J.，Theor.Biol.，154：421-454，1992；Vallino，J.J.和Stephanopoulos，G.，Biotechnol.Bioeng.，41：633-646，1993)。当列出反应式时，通过假定一系列没有分支的反应为一个反应，或假定在反应之前和之后由该反应以高代谢速率转化的多个代谢产物为一个代谢产物等等，可简化反应途径。当物质生产是生物量时，可以通过列出生成细胞成分的生化反应来描述化学计量矩阵。

在本发明测定方法的第二步中，从所有代谢流量中选择与上述化学计量矩阵自由度相同数量的独立代谢流量作为自由流量。

独立流量是一组流量，其在以化学计量方程式表示的代谢网络系统中应指定为唯一定义的流量。

设置自由流量的方法并没有特别限制，只要可选择与待分析的系统的自由度相同数量的独立代谢流量。尽管可证实任意选择的流量的独立性，也可以使用由Reder提出的SIMS矩阵(稳定状态体内代谢化学计量矩阵)(Reder，C.J.，Theor.Biol.，135：175-201，1988)。在这种方法中，基于上述生化反应式确定独立的代谢流量组，从中选择与上述化学计量矩阵自由度相同数量的一组代谢流量，并从每个选择的代谢流量组中选出一个代谢流量作为自由流量。在流量组中测定特异组以保证组中的任何流量都可变化而不影响其它组中的流量。因此，有可能从各组中选择一个流量作为独立的自由流量。当从一组流量中选择一个自由流量时，优选选择接近分支点的流量。

在本发明测定方法的第三步中，建立数量足以进行统计分析的自由流量随机组合，并基于上述化学计量矩阵从建立的各组合中计算代谢流量分布。

通过给予先前步骤中选择的自由流量以随机值，可建立自由流量的随机组合，以建立不同流量分布组合的数据组。给予自由流量随机值的方法并没有特别限定，只要选择的方法在特定的界限内产生自由流量的组合。设定所述特定的界限是为了在稍后计算中得到生物学可行的值。假如自由流量的数值与指定的化学计量矩阵的自由度相同，则可以解出唯一的一个代谢流量分布。通常使用逆矩阵对矩阵进行求解，并且优选将所有流量都标准化为，例如，一定量的底物。当底物是葡萄糖时，所有的流量值可用如每摄入10mmol葡萄糖的值来表示。如上描述的从随机自由流量值得到的代谢流量分布的解必须具有生物学意义。也就是说，所有不可逆反应的流量必须大于等于0，形成生物量的流量必须大于等于0。为得到更多所需自由流量的组合，也可增加基于使用细胞生产物质的理论和/或经验性知识的条件。待建立的组合的数量，也就是待计算的具有生物学意义的流量分布数量，并无特别限定，只要它足够进行统计分析。一个自由流量通常使用三个或五个值。因此，当有n个自由流量时，组合的数目大约是一个自由流量值的数量的n次幂。例如，当一个自由流量使用3个值时，就有3至3的n次幂(3ⁿ)个组合。也就是，对七个自由流量(n＝7)可使用约2200个组合。或者，在有生物学意义的流量分布的数据组中，各自由流量值的数量可以根据选择的自由流量或另外的条件变化，对于n个自由流量，可使用组合的数量为总计约3至3的n次幂(3ⁿ)到约5至5的n次幂(5ⁿ)。为获得如此数量的有生物学意义的流量分布的解，典型从使用一个自由流量6-10个值的随机自由流量组合开始，也就是6至6的n次幂(6ⁿ)到10至10的n次幂(10ⁿ)个自由流量的组合。

在本发明的测定方法的第四步中，通过多元统计分析，从代谢流量分布(代谢流量分布的数据组)获得回归方程，其包括最小数量的显示与物质生产相关的自由流量。

通过从先前步骤中获得的自由流量的随机组合计算流量分布数据组，对数据组进行多元统计分析，可以获得回归方程，其包括最小量的显示与物质生产相关的自由流量。可使用任何技术进行多元统计分析(包括多元非线性回归分析和多元线性回归分析)，只要选择的技术可检验自由流量组合与物质生产之间的相关性。但是，多元线性回归分析是有用的。这种方法描述于，例如，Kachigan，S.K.，第四章，多元统计分析中的回归分析(Regression Ahalysis in MultivariateStatistical Analysis)，第二版，Radius Press，New York，pp.160-193。

表述“显示物质生产相关”意指可决系数显著大，“显著大”通常意味着可决系数R²为0.8或更高，优选为0.9或更高。

包括最小数量的显示与物质生产相关的自由流量(项(term))的回归方程，可通过连续变化项数来获得。这种方程显示最大可决系数(包括各项数)，并能选择包括最小项数、显示显著大可决系数的回归方程。或者，可获得带有某一项以外所有项的回归方程，以检验除去该项所引起的可决系数的下降程度；重复这个过程，将显示引起可决系数小程度下降以外的项作为全部项；当不能再得到与物质生产相关的回归方程时，可选择之前得出的回归方程。

尽管这些数学过程可单独编程，但它们可通过市售数学计算程序轻易的完成，例如MatLab(商品名，MathWorks)和Mathematical(商品名，Wolfram Research)。

在本发明测定方法的第五步中，根据获得的回归方程中的系数确定影响物质生产的代谢流量。

自由流量有助于使用细胞如微生物进行物质生产，尤其是在物质生产中重要的生物量产率或产物物质产率，这种贡献可通过利用先前步骤获得的回归方程确定。也就是，在回归方程中出现的自由流量可确定为影响物质生产的自由流量。此外，因为回归方程中的系数代表贡献的大小，具有相当大的可决系数的自由流量(当标准化流量时，相对系数绝对值大的自由流量)可被确定为极大影响物质生产的代谢流量。

本发明的测定方法可提供对改进菌株重要的信息，即哪些自由流量极大影响目标物质的生产，无论自由流量对目标物质的生产产生正面或负面影响。还可预测出需要改变以有利影响目标产物的产率和生产力的流量。

<2>本发明的构建方法

本发明的构建方法为用于构建具有物质生产能力的菌株的方法。该方法包括修饰细菌菌株，以至在通过本发明测定方法确定的影响物质生产的代谢流量中，或者任何属于包括该代谢流量的相同独立代谢流量组的代谢流量中，当代谢流量显示与物质生产正相关时相应的活性增强，和/或当代谢流量显示与物质生产负相关时相应的活性减弱。

除了由本发明的测定方法确定的代谢流量，也可以改变引起任何代谢流量的活性，该代谢流量属于包括该代谢流量的相同独立代谢流量组，因为认为包括在相同代谢流量组中的代谢流量具有相同的效应。然而，预期实际代谢工程技术的难易和酶活性变化的效应强度都根据引起流量的酶而变化。假如考虑改进生产细菌的劳动和效果，可预期接近分支点的流量将是有效的。例如，在戊糖磷酸途径中，预期选择葡糖-6-磷酸脱氢酶与选择转羟乙醛酶一样有效。

已知各种方法用于改变引起特定流量的活性。对于增强酶活性的方法，已知通过使用染色体外DNA如质粒增加编码酶的基因的拷贝数、或增加染色体拷贝数、在编码酶的基因的启动子中引入突变以增强活性、使用更强的启动子取代。对于减弱酶活性的方法，已知破坏编码酶的基因或者在该基因中引入突变以减弱活性、在编码酶的基因的启动子中引入突变以减弱活性、使用更弱启动子取代该启动子。通过这些方法，可以改变引起特定流量的活性，以提高目标产物的产率和生产力。例如，如随后实施例中所描述的，可预期在使用大肠杆菌的赖氨酸生产中，通过增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，可构建出赖氨酸生产能力提高的细菌菌株，国际公开WO01/53459公开了通过增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性提高赖氨酸产生的实例。因此，已证实基于本发明测定方法的本发明构建方法极其有用。

<3>本发明的生产方法

本发明的方法为生产氨基酸、核酸或有机酸的方法，其包括以下步骤：在培养基中培养具有氨基酸、核酸或有机酸生产能力的细菌，导致在培养基或细菌细胞中累积氨基酸、核酸或有机酸，并从培养基或细胞中收集氨基酸、核酸或有机酸。本文使用的术语“核酸”是指核苷或核苷酸。

用于本发明的培养基可以是典型用于使用微生物发酵生产氨基酸、核酸或有机酸的培养基。假如需要，也可使用包含碳源、氮源、无机离子和其它有机成分的普通培养基。对于碳源，可使用各种糖类如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物，各种醇如甘油和山梨醇，各种有机酸如延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸。对于氮源，可使用各种无机铵盐如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮如大豆水解物，氨气和氨水等。对于微量有机营养素，希望添加需要的物质如维生素B₁、高丝氨酸或酵母提取物等。此外，也可添加微量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子。用于培养的培养基可以是合成培养基或天的培养基，只要该培养基包含碳源、氮源和无机离子，假如需要，包含微量有机营养素。

优选在需氧条件下进行培养，在24-37℃温度、pH 5-9下培养1-7天。可使用无机酸或有机酸或碱性物质(例如氨气)等调节培养物的pH。可通过常规的方法如离子交换树脂方法、沉淀和其它已知的方法或其组合，从培养基中收集氨基酸、核酸或有机酸。当氨基酸、核酸或有机酸在细胞中累积时，通过超声波等破碎细胞，并通过离心去除细胞碎片获得上清，从中可通过离子交换树脂方法等等收集氨基酸、核酸或有机酸。

<4>本发明的程序

本发明也提供了执行本发明测定方法的程序。本发明的程序为用于测定至少一个影响使用细胞进行物质生产的代谢流量的程序，该程序允许计算机执行包括以下步骤的代谢流量测定方法：

1)基于底物到所需目标产物的生化反应式建立化学计量矩阵，

2)从所有代谢流量中选择与化学计量矩阵自由度相同数目的独立代谢流量作为自由流量，

3)建立足够数量的自由流量的随机组合用于统计分析，并基于化学计量矩阵从各建立的组合计算代谢流量分布，

4)通过多元统计分析，从计算出的代谢流量分布获得回归方程，其包括最小数量的与物质生产相关的自由流量，

5)基于所得到的回归方程中的系数确定至少一种影响物质生产的代谢流量。

此外，本发明的另一方面涉及计算机可读的记录介质，其特征为它记录了上述程序。

本发明程序的流程图显示在图3中。各过程都是执行本发明测定方法中步骤1)-5)的各步的过程。依据常用编程方法可建立允许计算机执行这些过程的程序。

此外，本发明的程序也可被存储在计算机可读的记录介质中。本文使用的术语“记录介质”包括任何“可移动物理介质”如软盘(注册商标名)、磁光盘、ROM、EPROM、EEPROM、CD-ROM、MO和DVD，任何“固定物理介质”如设置在各种计算机系统中的ROM、RAM和HD，以及用以临时存储程序的“通信介质”如通信电路和载波，用于经LAN、WAN和Internet代表的网络传输程序。

此外，该“程序”是一种处理数据的程序，其以任意语言或操作符号编写，它的格式如源代码或二进制码没有限制。该“程序”没有必要限定于单个程序，包括包含两个或更多模块或库的分布式结构中描述的程序，或通过与操作系统(OS)代表的单个程序联合来实现它的功能。众所周知的配置和程序可用作特定的配置，用于读取存储于记录介质中的程序、读取过程、读取之后的安装过程等等，各装置显示于实施例中。

实施例

通过参考实施例进一步详细描述本发明。

实施例1

关于L-赖氨酸的代谢流量的测定

(1)建立化学计量矩阵

通过假定胞内代谢中间体的准稳态，构建用于计算代谢流量的化学计量方程(Savinell，J.M.和Palsson，B.O.J.，Theor.Biol.，154：421-454，1992；Vallino，J.J.和Stephanopoulos，G.，Biotechnol.Bioeng.，41：633-646，1993)。这个模型包括的反应式显示于表2中。表1列出了本发明所用的略写的说明。合并一些无分支的反应以简化公式。因为磷酸戊糖途径很复杂，将其用两个公式表示。生物量的成分比例使用报道的数据(Neidhardt，F.C.et al.，Physiology of the Bacterial Cell.，Sinauer Associates，Massachusetts，1990)，生物量通过使用反应式[68]表示。这个模型中化学计量矩阵的自由度为7。

表1

3PG 3-磷酸-D-甘油酸

AcCoA 乙酰辅酶A

AcOH 乙酸

aVIVA A-酮-异戊酸

aKG 2-酮戊二酸

Ala 丙氨酸

ALC 乙酰羟酸

Arg 精氨酸

ASA 天冬氨酸半醛

Asn 天冬酰胺

Asp 天冬氨酸

CHR 分支酸

Cit 柠檬酸

CO2 二氧化碳

CoA 辅酶A

Cys 半胱氨酸

DDP 二氢吡啶二羧酸

E4P 赤藓糖-4-磷酸

F6P 果糖-6-磷酸

FBP 二磷酸果糖

Form 甲酸

Fum 延胡索酸

G6P 葡萄糖-6-磷酸

GAP 磷酸甘油醛

Glc 葡萄糖

Gln 谷氨酰胺

Glu 谷氨酸

Gly 甘氨酸

Glyox 乙醛酸

His 组氨酸

Hse 高丝氨酸

Ile 异亮氨酸

Ind 吲哚甘油磷酸

Isoci 异柠檬酸

Leu 亮氨酸

Lys 赖氨酸

Lysext 赖氨酸产物(胞外)

Mal 苹果酸

Met 甲硫氨酸

mDAP 内消旋二氨基庚二酸

mTHF 四氢叶酸甲酯

NH3 氨

OAA 草酰乙酸

PEP 磷酸烯醇式丙酮酸

Phe 苯丙氨酸

PPA 预苯酸

Pro 脯氨酸

PRPP 磷酸核糖焦磷酸

Pyr 丙酮酸

R5P 核糖-5-磷酸

Ribu5P 5-磷酸核酮糖

SDAP N-琥珀酰-L-2，6-二氨基庚二酸

SKA 莽草酸

Sed7P D-景天庚酮糖-7-磷酸

Ser 丝氨酸

Suc 琥珀酸

SucCoA 琥珀酰辅酶A

THDP 四氢吡啶二羧酸

THF 四氢叶酸

Thr 苏氨酸

Trp 色氨酸

Tyr 酪氨酸

Val 缬氨酸

X5P 5-磷酸木酮糖

表2使用的反应式列表。可逆反应标记有r。

[1] Glc+PEP--＞G6P+Pyr

[2] G6P+2NADP--＞Ribu5P+2NADPH+CO2

[3]r Ribu5P--＞R5P

[4]r Ribu5P--＞X5P

[5]r X5P+R5P--＞Sed7P+GAP

[6]r Sed7P+GAP--＞E4P+F6P

[7]r X5P+E4P--＞F6P+GAP

[8]r G6P--＞F6P

[9]r F6P+ATP--＞FBP+ADP

[10]r FBP--＞2GAP

[11]r GAP+NAD+ADP--＞3PG+NADH+ATP

[12]r 3PG--＞PEP

[13] PEP+ADP--＞Pyr+ATP

[14] Pyr+NAD+CoA--＞AcCoA+NADH+CO2

[15] PEP+CO2--＞OAA

[16] AcCoA+ADP--＞AcOH+ATP+CoA

[17] AcCoA+OAA--＞Cit+CoA

[18]r Cit--＞Isocit

[19]r Isocit+NADP--＞aKG+NADPH+CO2

[20] aKG+NADPH+NH3--＞Glu+NADP

[21] aKG+NAD+CoA--＞SucCoA+NADH+CO2

[22]r SucCoA+ADP--＞Suc+ATP+CoA

[23]r Suc+FAD--＞Fum+FADH

[24]r Fum--＞Mal

[25]r Mal+NAD--＞OAA+NADH

[26] OAA+Glu--＞Asp+aKG

[27] Asp+ATP+NADPH--＞ASA+ADP+NADP

[28] ASA+Pyr--＞DDP

[29] DDP+NADPH--＞THDP+NADP

[30] THDP+SucCoA+Glu--＞SDAP+aKG+CoA

[31] SDAP--＞mDAP+Suc

[32] mDAP--＞Lys+CO2

[33]r Glu+ATP+NH3--＞Gln+ADP

[34] Glu+2NADPH+ATP--＞Pro+2NADP+ADP

[35] Glu+5ATP+NADPH+Gln+Asp+AcCoA+CO2--＞Arg

+5ADP+NADP+aKG+Fum

[36] ASA+NADPH--＞Hse+NADP

[37] Hse+SucCoA+Cys+mTHF--＞Met+Suc+CoA+THF+

Pyr+NH3

[38] Hse+ATP--＞Thr+ADP

[39] Thr+Glu+NADPH+Pyr--＞Ile+aKG+NADP+NH3+

CO2

[40]r 3PG--＞Ser

[41]r Ser+THF--＞Gly+mTHF

[42]r PEP+E4P+NADPH--＞SKA+NADP

[43] CHR--＞PPA

[44] PPA+NAD+Glu--＞Tyr+NADH+CO2+Akg

[45] PPA+Glu--＞Phe+CO2+aKG

[46] CHR+R5P+2ATP+Gln--＞Ind+Glu+Pyr+CO2+GAP

+2ADP

[47] 2Pyr--＞ALC

[48] aIVA+Glu--＞Val+aKG

[49] Val+Pyr--＞ALA+aIVA

[50] aIVA+AcCoA+NAD+Glu--＞Leu+NADH+CO2+aKG

+CoA

[51] PRPP+ATP+Gln+Glu+2NAD--＞His+ADP+Glu+

aKG+2NADH

[52] Ser+AcCoA+H2S--＞Cys+AcOH

[53] SKA+PEP+ATP--＞CHR+ADP

[54] Ind+Ser--＞Trp

[55] ALC+NADPH--＞aIVA+NADP+CO2

[56]r NADH--＞NADPH

[57] 2NADH+O2+2ADP--＞2ATP+2NAD

[58] 2FADH+O2+ADP--＞ATP+2FAD

[59]r Asp+2ATP+NH3--＞Asn+2ADP

[60] Isocit--＞Glyox+Succ

[61] AcCoA+Glyox--＞Mal+CoA

[62] Mal+NAD--＞Pyr+CO2+NADH

[63]r R5P+2ATP--＞PRPP+2ADP

[64] mTHF+NADP--＞NADPH+THF+Form

[65] NAD+Gly+THF--＞mTHF+NADH+CO2+NH3

[66] ATP--＞ADP

[67] Lys--＞Lysext

[68]生物量合成(如下描述)

RNA(21.33％)

3.47PRPP+5.02Gln+-5.02Glu+3.08Gly+6.17Asp+32.41ATP+-32.41ADP+6.17mTHF+-6.17THF+3.09NAD+-3.09NADH+6.17NADP+-6.17NADPH+1.16CO2+-3.47Fum+-3.86NH3

DNA(3.23％)

3.37PRPP+4.88Gln+-4.88Glu+3Gly+6Asp+31.5ATP+-31.5ADP+7.12mTHF+-7.12THF+3NAD+-3NADH+3.75NADP+-3.75NADPH+1.12CO2+-3.37Fum+-3.75NH3

磷脂(9.47％)

20.8AcCoA+-20.8CoA+1.95GAP+0.65Ser+44.2ATP+-44.2ADP+38.35NADH+-38.35NAD+-0.65CO2

肽聚糖(2.60％)

1.94F6P+1.94AcCoA+-1.94CoA+1.94Gln+-1.94Glu+2.91Ala+0.97PEP+0.97Lys+6.97ATP+-6.97ADP+0.97NADPH+-0.97NADP+-0.97CO2

脂多糖(3.54％)

0.91R5P+0.91F6P+0.91PEP+15.47AcCoA+-0.91AcOH+-0.91Glu+0.91Gln+32.76ATP+12.74NADH

蛋白(57.23％)

0.77Gly+0.96Ala+0.67Val+0.85Leu+0.44Ile+0.44Ser+0.48Thr+0.30Phe+0.26Tyr+0.01Trp+0.15Cys+0.22Met+0.54Lys+0.46Arg+0.16His+0.46Asp+0.52Glu+0.46Asn+0.52Gln+0.34Pro

糖原(2.60％)

F6P+ATP

(2)自由流量的选择和其随机组合的建立

依据Reder的方法(Reder，C.J.，Theor.Biol.，135：175-201，1988)测定特定的流量组。从各组中选择接近分支点的流量。表3显示了七个选择的自由流量。通过指定这7个流量可获得流量平衡的唯一解。

表3

获得随机流量分布的自由流量列表

反应编码	酶名称或反应途径名称
反应编码	酶名称或反应途径名称	2	葡糖-6-磷酸脱氢酶
15	PEP羧化酶	2	葡糖-6-磷酸脱氢酶
15	PEP羧化酶	16	乙酸分泌

60	异柠檬酸裂合酶(乙醛酸循环)
60	异柠檬酸裂合酶(乙醛酸循环)	62	苹果酸酶
64	甲酸分泌	62	苹果酸酶
64	甲酸分泌	66	ATP酶

从7个随机自由流量的约300,000个组合的值中，去除任何超过可逆反应极限的组合，以及显示的赖氨酸和生物量的值均没有超越阈水平的组合，阈水平定为每个最大值的20％。结果是，在有生物学意义的特定区域中创建了5000个代谢流量分布的数据组。基于10mmol葡萄糖摄取的值表示这些结果，建立了一个具有5000行(对应随机流量分布)和68列(对应反应流量)的矩阵。

(3)通过多元分析进行相关分析并确定影响物质生产的代谢流量

进行了压缩(condensed)矩阵的多元线性回归，其包括对应7个自由流量的列的Z分。使用MatLab统计工具包的逐步回归函数进行多元线性回归。使用这项技术，可用7个自由流量的线性函数衍生生物量或赖氨酸生产。对这7个流量进行鉴定导致系统状态的唯一定义。因此，假如所有的7项都用作参数，相关系数就变为1，表明完全符合。然而，用比方程中项数少的项数通常可得到相对有利的拟合。为了尝试项的各种组合，通过使用MatLab程序的逐步回归函数选择对包含项的各数量显示最佳拟合的方程。就生物量产率而言，仅用异柠檬酸裂合酶(ICL)、苹果酸酶(MEZ)、PEP羧化酶(PEPC)和ATP酶4项获得R²＝0.980的拟合。当项的数目进一步减少时，R²值显著降低，不可能获得任何合理拟合。当标准化反应流量至每10mmol葡萄糖摄取值并用作输入时，精确的方程如下表示：

方程1)生物量产率＝1.552-0.194(ICL)+0.184(MEZ)-0.194(PEPC)-0.011(ATP酶)。

赖氨酸产率可用包括相同4个参数的模型拟合，获得R²＝0.997的结果。此外，甚至当除去ATP酶这项时，R²仅下降至0.856，仍然是较好的拟合。因此，赖氨酸模型使用以下3个参数。

方程2)赖氨酸产率＝-1.694+1.176(ICL)-1.095(MEZ)+1.162(PEPC)

最后，用流向生物量和赖氨酸的C原子总数定义的总碳产率(C原子)，通过如下方程，仅用ATP酶这项的拟合度达到R²＝0.956。

方程3)C原子＝34.3-0.314(ATP酶)

这些结果揭示生物量产率与苹果酸流量正相关，赖氨酸生产与PEP羧化酶流量和异柠檬酸裂合酶(乙醛酸循环)的流量正相关。图1和图2可显示该回归分析的有效性。当分开考虑异柠檬酸裂合酶流量和苹果酸酶流量时，没有发现与L-赖氨酸生产的相关性，如图1(a)和(b)所示。但是，如图2所示，当将这些流量作为回归方程2)的一部分考虑时，可观察到相关性，并且效果变得明显。因此，利用这项技术可揭示代谢流量间不可见的联系。提高显示正相关流量的活性和削弱显示负相关流量的活性可提高目标产物的产率。也就是说，从这个结果中可得到改进细菌菌株的方针，提高PEP羧化酶或异柠檬酸裂合酶活性或削弱显示负相关性的苹果酸酶活性对L-赖氨酸生产有效。事实上，在国际公开WO01/53459中公开了在利用大肠杆菌生产赖氨酸中通过提高PEP羧化酶活性，构建了显示产赖氨酸能力提高的细菌菌株的实例，并因此支持了本发明的有效性。

实施例2

关于L-苏氨酸的代谢流量的测定

用实施例1中同样的方法，选出关于L-苏氨酸的对包含项的各数量都拟合得最好的方程。就生物量产率而言，仅异柠檬酸裂合酶(ICl)、苹果酸酶(MEZ)、PEP羧化酶(PEPC)和ATP酶4项得到R²＝0.986的拟合度。

方程4)生物量产率＝1.260-0.101(ICL)+0.093(MEZ)-0.101(PEPC)-0.009(ATP酶)

苏氨酸产率可用包含同样3个参数的模型来拟合，获得R²＝0.937的结果。

方程5)苏氨酸产率＝-1.432+1.090(ICL)-1.080(MEZ)+1.087(PEPC)

这些结果揭示生物量产率与苹果酸酶流量正相关，苏氨酸生产与PEP羧化酶和异柠檬酸裂合酶(乙醛酸循环)的流量正相关。因此，关于苏氨酸生产，可得到改进细菌菌株的方针，提高PEP羧化酶或异柠檬酸裂合酶活性或削弱显示负相关性的苹果酸酶活性对L-苏氨酸生产有效。

实施例3

构建苹果酸酶缺陷的L-赖氨酸生产细菌

菌株WC196用作生产L-赖氨酸的大肠杆菌菌株，其具有AEC(S-(2-氨乙基)半胱氨酸)抗性(国际公开号WO 96/17930)。

来源于大肠杆菌的苹果酸酶包括以NAD为辅酶的酶(EC 1.1.1.38)和以NADP为辅酶的酶(EC 1.1.1.40)两种。这两种酶各自由sfcA和b2463基因编码。

联用“Red-driven integration”法和切除系统方法缺失sfcA和b2463基因，“Red-driven integration”法最初由Datsenko和Wanner开发(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)，切除系统方法来自λ噬菌体(J.Bacteriol.2002Sep；184(18)：5200-3.Interactions betweenintegrase和excisionase in the phage lambda excisive nucleoproteincomplex.Cho EH，Gumport RI，Gardner JF.)。依据“Red-drivenintegration”法，通过使用PCR产物一步就可构建基因破坏的菌株，该PCR产物通过使用合成的寡核苷酸引物获得，引物被设计为在5’端包含部分靶基因，在3’端包含部分抗生素抗性基因。此外，通过进一步联用来自λ噬菌体的切除系统与red-driven integration法，可去除整合的抗生素抗性基因。

(1)sfcA基因的破坏

使用质粒pMW118-attL-Cm-attR作为PCR模板(其制备如下描述)。将λ噬菌体的附着位点基因attL和attR以及cat基因(抗生素抗性基因)插入PMW118(TaKaRa Bio)，获得pMW118-attL-Cm-attR。以attL-cat-attR的顺序插入这些基因。attL的序列显示于SEQ ID NO：5，attR序列显示于SEQ ID NO：6。

使用SEQ ID NO：1和2所示的引物进行PCR，并且引物具有对应于attL和attR 3’末端的序列，在5’末端具有对应于sfcA基因部分的序列。

在琼脂糖凝胶上纯化扩增的PCR产物，并通过电穿孔引入含有显示温度敏感型复制的质粒pKD46的大肠杆菌WC196。pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)包括λ噬菌体(GenBank/EMBL检索号J02459，31088-33241)的2,154nt DNA片段，含有在阿拉伯糖可诱导P_araB启动子控制下的编码λRed同源重组系统Red重组酶的基因(γ、β和核酸外切酶基因)。对于PCR产物整合入菌株WC196的染色体，pKD46是必需的。

用于电穿孔的感受态细胞如下制备。大肠杆菌WC196在含有100mg/l氨苄西林的LB培养基中30℃下培养过夜，使用5ml含有氨苄西林(50mg/l)和L-阿拉伯糖(1mM)的SOB培养基稀释100倍(Sambrook，J.等，″Molecular Cloning A Laboratory Manual，SecondEdition″，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。稀释后的菌液在30℃下通气培养，直到OD₆₀₀变为约0.6，然后浓缩100倍。使用10％甘油洗涤细胞三次以制备准备用于电穿孔的细胞。使用70μl感受态细胞和约100ng PCR产物进行电穿孔。向进行电穿孔的细胞添加1ml SOC培养基(Sambrook，J.等，″Molecular Cloning A LaboratoryManual，Second Edition″，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。37℃下培养细胞2.5小时，然后37℃下平板培养于含有25mg/l Cm(氯霉素)的L-琼脂培养基上，以选择Cm抗性的重组体。然后，在含有Cm的L-琼脂培养基上42℃下传代培养2次以去除pKD46质粒。获得的菌落测试氨苄西林抗性。得到一株对氨苄西林敏感的不含有pKD46的菌株。

通过氯霉素抗性基因鉴定的缺失sfcA基因的突变体经PCR证实。所得的sfcA缺陷菌株被命名为WC196ΔsfcA∷att-cat。

使用辅助质粒pMW-intxis-ts(其制备如下所述)清除整合入sfcA基因的att-cat基因。pMW-intxis-ts包含编码λ噬菌体整合酶的基因(Int)(SEQ ID NO：7)和编码切割酶的基因(Xis)(SEQ ID NO：9)，并表现温度敏感性复制。通过引入pMW-intxis-ts，由于识别染色体上的attL(SEQ ID NO：5)和attR(SEQ ID NO：6)而发生重组，attL和attR之间的抗生素抗性基因被切除，导致只有attL或attR序列保留在染色体上的结构。

菌株WC196ΔsfcA∷att-cat的感受态细胞按照常规方法制备，用辅助质粒pMW-intxis-ts转化，在含有50mg/l氨苄西林的L-琼脂培养基上30℃下平板培养，以选择氨苄西林抗性的菌株。

细胞于42℃下在L-琼脂培养基上传代培养两次以去除pMW-intxis-ts质粒。对获得的菌株测试氨苄西林抗性和氯霉素抗性。获得一株对氨苄西林和氯霉素敏感的无att-cat和pMW-intxis-ts的菌株。这株菌株被命名为WC196ΔsfcA。

(2)破坏b2463基因

依据方法(1)，除了使用引物SEQ ID NO：3和4作为引物用于破坏b2463外，使菌株WC196和WC196ΔsfcA中的b2463缺失。因此，获得菌株WC196Δb2463和WC196ΔsfcAΔb2463。获得的菌株WC196ΔsfcAΔb2463被命名为WC196Δmez。

(3)制备PCR模板和辅助质粒

如下制备PCR模板pMW118-attL-Cm-attR和辅助质粒pMW-intxis-ts：

(3-1)pMW118-attL-Cm-attR

从pMW118-attL-Tc-attR出发构建质粒pMW118-attL-Cm-attR。连接以下4个DNA片段：

1)携带attL的BelII-EcoRI-DNA片段(120bp)(SEQ ID NO：5)，其通过使用寡核苷酸P1和P2(SEQ ID NO：11和12)作为引物(这些引物含有BglII和EcoRI核酸内切酶的辅助识别位点)，PCR扩增大肠杆菌W3350(含有λ噬菌体)染色体的相应序列获得；

2)携带attR的PstI-HindIII-DNA片段(182bp)(SEQ ID NO：6)，其通过使用寡核苷酸P3和P4(SEQ ID NO：13和14)作为引物(这些引物含有PstI和HindIII核酸内切酶的辅助识别位点)，PCR扩增大肠杆菌W3350(含有λ噬菌体)染色体的相应序列获得；

3)pMW118-ter_rrnB的BglII-HindIII大片段(3916bp)。通过连接三个DNA片段获得pMW118-ter_rrnB：

●携带pMW118的AatII-EcoRI pol片段的大片段(2359bp)，使用EcoRI限制性核酸内切酶消化pMW118，使用DNA聚合酶I的Klenow片段处理，然后使用AatII限制性核酸内切酶消化；

●携带抗氨苄西林的bla基因(Ap^R)的pUC19的AatII-BglII小片段(1194bp)，通过使用寡核苷酸P5和P6(SEQ ID NO：15和16)作为引物(这些引物含有AatII和BglII核酸内切酶的辅助识别位点)，PCR扩增pUC19质粒的相应序列获得；

●转录终止子ter_rrnB的BglII-PstI pol小片段(363bp)，通过使用寡核苷酸引物P7和P8(SEQ ID NO：17和18)作为引物(这些引物含有BglII和PstI核酸内切酶的辅助识别位点)，PCR扩增大肠杆菌MG165染色体的相应区域获得；

4)pML-Tc-ter_thrL的EcoRI-PstI的小片段(1388bp)(SEQ ID NO：23)，包括四环素抗性基因和转录终止子ter_thrL，pML-Tc-ter_thrL用以下方式获得：

●用XbaI和BamHI限制性内切酶消化pML-MSC(2001#5)，然后连接大片段(3342bp)和携带终止子ter_thrL的XbaI-BamHI片段(68bp)，该片段通过使用寡核苷酸引物P9和P10(SEQ IDNO：19和20)作为模引物(这些引物含有XbaI和BamHI核酸内切酶的辅助识别位点)，PCR扩增大肠杆菌MG1655染色体的相应区域获得，这个反应的产物即为pML-ter_thrL质粒；

●然后用KpnI和XbaI限制性内切酶消化pML-ter_thrL，用DNA聚合酶I的Klenow片段处理后，与含有四环素抗性基因的pBR322的EcoRI-Van91I小片段(1317bp)连接(EcoRI和Van91I限制性内切酶消化pBR322，再用DNA聚合酶I的Klenow片段处理得到)，该反应产物为质粒pML-Tc-ter_thrL；

如此即获得pMW118-attL-Tc-attR。

将pMW118-attL-Tc-attR的BamHI-XbaI大片段(4413bp)与包含P_A2启动子(T7噬菌体的早期启动子)、氯霉素抗性(Cm^R)的cat基因、转录终止子ter_thrL和attR的BglII-XbaI人工DNA片段(1162bp)连接，构建pMW118-attL-Cm-attR。该人工DNA片段(SEQ ID NO：24)按以下方法制备：

1.使用KpnI和XbaI限制性核酸内切酶消化pML-MSC(2001#5)，并与包括启动子P_A2(噬菌体T7的早期启动子)的KpnI-XbaI小片段(120bp)连接，该片段通过以寡核苷酸P11和P12(SEQ ID NO：21和22)为引物(这些引物含有KpnI和XbaI核酸内切酶的辅助识别位点)，PCR扩增噬菌体T7DNA的相应区域获得，该反应的产物为质粒pML-P_A2-MCS；

2.然后从pML-P_A2-MCS缺失XbaI位点，该反应的产物为质粒pML-P_A2-MCS(XbaI^-)；

3.然后将pML-PA2-MCS(XbaI^-)的BglII-HindIII小片段(928bp)(其包含启动子P_A2(噬菌体T7的早期启动子)和氯霉素抗性cat基因(Cm^R))与包含转录终止子ter_thrL和attR的pMW118-attL-Tc-attR的HindIII-HindIII小片段(234bp)连接；

4.使用寡核苷酸P9和P4(SEQ ID NO：19和14)作为引物(这些引物含有HindII和XbaI核酸内切酶的辅助识别位点)，通过PCR扩增连接反应的混合物，获得需要的人工DNA片段(1156bp)。

(3-2)pMW-intxis-ts

首先，使用λ噬菌体DNA(“Fermentas”)作为模板，扩增两种DNA片段。第一种片段包括nt 37168-38046(SEQ ID NO：33)的区域，并且也包含编码cI阻遏物、启动子Prm和Pr的基因，以及cro基因的前导序列。使用P1’和P2’寡核苷酸(SEQ ID NO：25和26)作为引物获得这个片段。第二种片段带有λ噬菌体的xis-int基因，并包含nt27801-29100(SEQ ID NO：34)的区域。寡核苷酸P3’和P4’(SEQ ID NO：27和28)作为引物用于它的扩增。所有的引物都含有合适的核酸内切酶识别位点。

获得的携带cI阻遏物的PCR扩增片段使用限制性核酸内切酶ClaI消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段处理，然后使用EcoRI限制性核酸内切酶消化。第二种PCR扩增片段使用EcoRI和PstI限制性核酸内切酶消化。然后使用BglII核酸内切酶消化pMWPlaclacI-ts质粒，使用DNA聚合酶I的Klenow片段处理，然后使用PstI限制性核酸内切酶消化。从琼脂糖凝胶中洗脱出pMWPlaclacI-ts的载体片段，与消化的PCR扩增片段连接。

质粒pMWPlaclacI-ts是pMWPlaclacI的衍生物，由以下部分组成：1)BglII-HindIII-人工DNA片段，其包括在P_lacuv5启动子控制下的lacI基因和T7噬菌体10号基因的RBS；2)携带氨苄西林抗性基因(Ap^R)的AatII-BglII-DNA片段，其通过使用寡核苷酸P5’和P6’(SEQID NO：29和30)作为引物(这些引物含有AatII和BglII核酸内切酶的辅助识别位点)，PCR扩增pUC19质粒的相应序列获得；3)AatII-HindIII-片段，其包含先前构建的重组质粒pMW118-ter_rrnB的AatII-PvuI片段。后一质粒按以下方式构建：使用含有合适核酸内切酶识别位点的寡核苷酸P7’和P8’(SEQ ID NO：31和32)作为引物，通过PCR扩增大肠杆菌MG1655染色体的相应区域，获得携带终止子ter_rrnB的PstI-HindIII DNA片段。在连接之前，使用PvuI或PstI核酸内切酶各自限制性消化pMW118质粒和ter_rrnB DNA片段(互补物，SEQ ID NO：35)，使用DNA聚合酶I的Klenow片段处理以获得平末端，然后使用AatII或HindIII核酸内切酶限制性消化。为构建pMWPlaclacI-ts变体，用质粒pMAN997的AatII-EcoRV片段取代pMWPlaclacI质粒的AatII-EcoRV片段，前一AatII-EcoRV片段包含pSC101复制子的基因座par、ori和repA^ts基因。

实施例4

构建苹果酸酶缺陷的L-苏氨酸生产菌株

从菌株VKPM B-5318构建sfcA^-和b2463^-缺陷的菌株。该VKPMB-5318菌株在1989年11月19日保藏在俄罗斯国立工业微生物收藏中心(VKPM，GNII Genetika)，检索号VKPM B-5318。

用与实施例3中相同的方式，使用“Red-driven integration”法，获得一株苹果酸酶(mez)基因(sfcA，b2463)缺陷的菌株。即，使用与实施例3中相同的“Red-driven integration”法，除了使用菌株B-5318而不是菌株WC196以外，获得sfcA^-或b2463^-缺陷的菌株突变体，其由氯霉素抗性基因鉴定。破坏sfcA的菌株B-5318被命名为B-5318ΔsfcA。破坏b2463的菌株被命名为B-5318Δb2463。以与实施例3中相同的方式，使用“Red-driven integration”和切除系统方法，获得具有已破坏sfcA和b2463基因的菌株B-5318，B-5318ΔsfcAΔb2463。菌株B-5318ΔsfcAΔb2463被命名为B-5318Δmez。

实施例5

评价苹果酸酶缺陷的菌株

<5-1>评价b2463缺陷的L-苏氨酸生产菌株

菌株B-5318Δb2463和B-5318各自培养于含有20mg/L硫酸链霉素和25mg/L硫酸卡那霉素的LB琼脂培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠和15g/L琼脂)上，37℃下培养24小时，将平板上的1/5细菌细胞接种于含有20mg/L硫酸链霉素和25mg/L硫酸卡那霉素的50ml LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和5g/L氯化钠)，40℃、144rpm下预培养3.5小时。

在完成预培养之后，预培养菌液被接种入装有300ml主培养基的1L发酵罐中，接种量为主培养基的10％体积，40℃和pH 7.0下进行主培养。主培养基的组分如下所示：

表4

主培养基的组分

葡萄糖 100g/L

酵母提取物 1.8g/L

FeSO₄·7H₂O 18mg/L

MnSO₄·4H₂O 18mg/L

KH₂PO₄ 1.0g/L

MgSO₄·7H₂O 0.36g/L

(NH₄)₂SO₄ 4.5g/L

NaCl 0.6g/L

硫酸链霉素 20m/L

硫酸卡那霉素 25mg/L

在培养期间通过加入氨气调节pH至7.0。

待加入的糖消耗后，通过液相色谱测量L-苏氨酸的量。结果显示于表5中。

当使用b2463缺陷的菌株B-5318Δb2463时，与对照菌株B-5318相比苏氨酸的产率增加。

表5

菌株	L-苏氨酸的发酵产率(％)
菌株	L-苏氨酸的发酵产率(％)	B-5318B-5318Δb2463	31.432.1

<5-2>评价sfcA缺陷的L-苏氨酸生产菌株

以与<5-1>相同的方式培养菌株B-5318ΔsfcA和B5318。

待加入的糖消耗后，通过液相色谱测量L-苏氨酸量。结果显示于表6中。

当使用b2463-缺陷的菌株B-5318ΔsfcA时，与对照菌株B-5318相比苏氨酸的产率增加。

表6

菌株	L-苏氨酸的发酵产率(％)
菌株	L-苏氨酸的发酵产率(％)	B-5318B-5318ΔsfcA	31.432.2

<5-3>评价sfcA和b2463缺陷的L-赖氨酸生产菌株

依据常规方法，使用用于赖氨酸生产的包含dapA、dapB和dapC基因的质粒pCABD2(国际公开号WO 01/53459)转化菌株WC196、WC196ΔsfcA和WC196Δb2463，以获得菌株WC196/pCABD2、WC196ΔsfcA/pCABD2和WC196Δb2463/pCABD2。

将菌株WC196/pCABD2、WC196ΔsfcA/pCABD2和WC196Δb2463/pCABD2在37℃下培养于含有20mg/L链霉素的L培养基(如下描述)，直到培养基的OD₆₀₀为约0.6。然后，向培养物中添加与培养物等量的40％甘油溶液。搅拌之后，将混合物分成合适等分，保藏于-80℃。保藏的等分被称为为甘油原液。

解冻菌株的甘油原液，每100μl均匀涂布于含有20mg/L链霉素的L平板上，并37℃下培养24小时。从获得平板的1/8上获取细菌细胞，接种于20mL含有20mg/L链霉素的发酵培养基(如下描述)，37℃下摇床培养约16小时。培养之后，通过Biotech Analyzer AS210(Sakura Seiki)测量累积在培养基中的赖氨酸量和残留的葡萄糖量。

累积的L-赖氨酸和扣除细胞后的产率的结果显示在表7中。扣除细胞后的产率是通过扣除用于细菌细胞形成的糖量而计算的产率，其计算基于假设消耗掉糖的50％用于形成细菌细胞。从结果中看出，与对照菌株WC196/pCABD2相比，菌株WC196ΔsfcA/pCABD2和WC196Δb2463/pCABD2的细胞扣除产率增加。

表7

菌株		干细胞重量(g/L)	扣除细胞后的产率(％)
菌株				宿主	质粒
WC196	pCABD2			宿主	质粒	2.5	100.0
WC196	pCABD2	WC196ΔsfcAWC196Δb2463	pCABD2pCABD2	2.32.2	101.6104.7	2.5	100.0

用于评价sfcA或b2463缺陷的L-赖氨酸生产菌株的培养基如下描述。使用的试剂从Wako Pure Chemicals或Nakarai Tesque获得，除非另有说明。使用的培养基组分显示如下。使用NaOH或HCl调节所有培养基的pH。

表8

(L培养基)

细菌用胰蛋白胨(DIFCO) 10g/L

酵母提取物(DIFCO) 5g/L

NaCl 5g/L

pH 7.0

[120℃下蒸气灭菌20分钟]

(L琼脂培养基)

L培养基

细菌用琼脂(DIFCO) 15g/L

[120℃下蒸气灭菌20分钟]

(大肠杆菌的L-赖氨酸生产培养基)

葡萄糖 40g/L

硫酸铵 24g/L

磷酸二氢钾 1.0g/L

七水合硫酸镁 1.0g/L

七水合硫酸亚铁(II) 0.01g/L

四水合硫酸锰 0.01g/L

酵母提取物 2.0g/L

碳酸钙(药典) 30g/L

[使用氢氧化钾调节至pH 7.0，115℃下蒸气灭菌10分钟，前提条件是葡萄糖和MgSO₄·7H₂O分开灭菌]

实施例6

评价苹果酸酶缺陷的菌株(Δmez)

<6-1>评价苹果酸酶缺陷的L-苏氨酸生产菌株

将菌株B-5318Δmez和B-5318各自在含有20mg/L硫酸链霉素和25mg/L硫酸卡那霉素的LB琼脂培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl和15g/L琼脂)上37℃下培养24小时，从一个平板上获取细菌细胞，悬浮于5ml LB液体培养基中(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和5g/L NaCl)。将0.5ml悬液接种于50ml含有20mg/L硫酸链霉素和25mg/L硫酸卡那霉素的LB液体培养基，39℃、144rpm下预培养4小时。

完成预培养后，预培养菌液接种入装有300ml主培养基的1L发酵罐中，接种量为主培养基的10％体积，在39℃和pH 7.0进行主培养。主培养基组分如下所示：

表9

[主培养基组分]

葡萄糖 27g/L

酵母提取物 1.8g/L

FeSO₄·7H₂O 18mg/L

MnSO₄·4H₂O 18mg/L

KH₂PO₄ 1.5g/L

MgSO₄·7H₂O 0.36g/L

(NH₄)₂SO₄ 4.5g/L

NaCl 0.6g/L

硫酸链霉素 20mg/L

硫酸卡那霉素 25mg/L

在培养期间通过添加氨气调节pH至7.0。

待加入的糖消耗和耗尽后，添加600g/l葡萄糖水溶液。

主培养24小时之后，通过液相色谱测量L-苏氨酸的量。结果显示于表10中。

当使用苹果酸酶缺陷的菌株B-5318Δmez时，与对照菌株B-5318相比苏氨酸的产率增加。

表10

菌株	L-苏氨酸的发酵产率
菌株	L-苏氨酸的发酵产率	B-5318B-5318Δmez	35.938.3

<6-2>评价苹果酸酶缺陷的L-赖氨酸生产菌株

依据常规方法使用用于赖氨酸生产的质粒pCABD2(国际公开号WO 01/53459)转化菌株WC196和WC196Δmez，以获得菌株WC196/pCABD2和WC196Δmez/pCABD2。

将菌株WC196/pCABD2和WC196Δmez/pCABD2在37℃下培养于含有20mg/L链霉素的L培养基(同实施例5<5-3>中使用的)，直到培养基的OD₆₀₀变为约0.6。然后，向培养物中添加与培养物等量的40％甘油溶液。搅拌之后，将混合物分成合适等分，保藏于-80℃。保藏的等分被称为为甘油原液。

解冻菌株的甘油原液，每100μl均匀涂布于含有20mg/L链霉素的L平板上，并37℃下培养24小时。从获得平板的1/8上获取细菌细胞，接种于20mL含有20mg/L链霉素的发酵培养基(同实施例5<5-3>中使用的)，37℃下摇床培养约48小时。培养之后，通过BiotechAnalyzer AS210(Sakura Seiki)测量累积在培养基中的赖氨酸量和残留的葡萄糖量。

累积的L-赖氨酸和扣除细胞后的产率的结果显示在表11中。基于假设消耗的糖的50％用于形成细菌细胞，计算扣除细胞后的产率。从结果中看出，与对照菌株WC196/pCABD2相比，菌株WC196Δmez/pCABD2的扣除细胞后的产率增加。

表11

菌株		干细胞重量(g/L)	扣除细胞后的产率(％)
菌株				宿主	质粒
WC196	pCABD2			宿主	质粒	5.2	100.0
WC196	pCABD2	WC196Δmez	pCABD2	5.8	103.4	5.2	100.0

工业实用性

依据本发明，可有效测定影响物质生产的代谢流量，因此可提供改进细菌的指导。此外，也可提供基于这种指导改进细菌菌株的方法。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

<120>影响物质生产的代谢流量的测定方法

<130>C2500PC4076

<150>JP 2003-202842

<151>2003-07-29

<160>35

<210>1

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

aatatctttc agttccggca gtaccatacc ttcgcctgaa gcctgctttt ttat 54

<210>2

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

agcatggaag aacgccgtaa cttcaacctg ctggggcgct caagttagta taaa 54

<210>3

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

cgacgggcag tcagaagaac caaagttgga gtgcgatgaa gcctgctttt ttat 54

<210>4

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gacattgaag ttgacgaact cgacccggac aaatttcgct caagttagta taaa 54

<210>5

<211>120

<212>DNA

<213>λ噬菌体

<400>5

agatcttgaa gcctgctttt ttatactaag ttggcattat aaaaaagcat tgcttatcaa 60

tttgttgcaa cgaacaggtc actatcagtc aaaataaaat cattatttga tttcgaattc 120

<210>6

<211>184

<212>DNA

<213>λ噬菌体

<400>6

ctgcagtctg ttacaggtca ctaataccat ctaagtagtt gattcatagt gactgcatat 60

gttgtgtttt acagtattat gtagtctgtt ttttatgcaa aatctaattt aatatattga 120

tatttatatc attttacgtt tctcgttcag cttttttata ctaacttgag cgtctagaaa 180

gctt 184

<210>7

<211>1071

<212>DNA

<213>λ噬菌体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1071)

<400>7

atg gga aga agg cga agt cat gag cgc cgg gat tta ccc oct aac ctt 48

Met Gly Arg Arg Arg Ser His Glu Arg Arg Asp Leu Pro Pro Asn Leu

1 5 10 15

tat ata aga aac aat gga tat tac tgc tac agg gac cca agg acg ggt 96

Tyr Ile Arg Asn Asn Gly Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asp Pro Arg Thr Gly

20 25 30

aaa gag ttt gga tta ggc aga gac agg cga atc gca atc act gaa gct 144

Lys Glu Phe Gly Leu Gly Arg Asp Arg Arg Ile Ala Ile Thr Glu Ala

35 40 45

ata cag gcc aac att gag tta ttt tca gga cac aaa cac aag cct ctg 192

Ile Gln Ala Asn Ile Glu Leu Phe Ser Gly His Lys His Lys Pro Leu

50 55 60

aca gcg aga atc aac agt gat aat tcc gtt acg tta cat tca tgg ctt 240

Thr Ala Arg Ile Asn Ser Asp Asn Ser Val Thr Leu His Ser Trp Leu

65 70 75 80

gat cgc tac gaa aaa atc ctg gcc agc aga gga atc aag cag aag aca 288

Asp Arg Tyr Glu Lys Ile Leu Ala Ser Arg Gly Ile Lys Gln Lys Thr

85 90 95

ctc ata aat tac atg agc aaa att aaa gca ata agg agg ggt ctg cct 336

Leu Ile Asn Tyr Met Ser Lys Ile Lys Ala Ile Arg Arg Gly Leu Pro

100 105 110

gat gct cca ctt gaa gac atc acc aca aaa gaa att gcg gca atg ctc 384

Asp Ala Pro Leu Glu Asp Ile Thr Thr Lys Glu Ile Ala Ala Met Leu

115 120 125

aat gga tac ata gac gag ggc aag gcg gcg tca gcc aag tta atc aga 432

Asn Gly Tyr Ile Asp Glu Gly Lys Ala Ala Ser Ala Lys Leu Ile Arg

130 135 140

tca aca ctg agc gat gca ttc cga gag gca ata gct gaa ggc cat ata 480

Ser Thr Leu Ser Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ile Ala Glu Gly His Ile

145 150 155 160

aca aca aac cat gtc gct gcc act cgc gca gca aaa tca gag gta agg 528

Thr Thr Asn His Val Ala Ala Thr Arg Ala Ala Lys Ser Glu Val Arg

165 170 175

aga tca aga ctt acg gct gac gaa tac ctg aaa att tat caa gca gca 576

Arg Ser Arg Leu Thr Ala Asp Glu Tyr Leu Lys Ile Tyr Gln Ala Ala

180 185 190

gaa tca tca cca tgt tgg ctc aga ctt gca atg gaa ctg gct gtt gtt 624

Glu Ser Ser Pro Cys Trp Leu Arg Leu Ala Met Glu Leu Ala Val Val

195 200 205

acc ggg caa cga gtt ggt gat tta tgc gaa atg aag tgg tct gat atc 672

Thr Gly Gln Arg Val Gly Asp Leu Cys Glu Met Lys Trp Ser Asp Ile

210 215 220

gta gat gga tat ctt tat gtc gag caa agc aaa aca ggc gta aaa att 720

Val Asp Gly Tyr Leu Tyr Val Glu Gln Ser Lys Thr Gly Val Lys Ile

225 230 235 240

gcc atc cca aca gca ttg cat att gat gct ctc gga ata tca atg aag 768

Ala Ile Pro Thr Ala Leu His Ile Asp Ala Leu Gly Ile Ser Met Lys

245 250 255

gaa aca ctt gat aaa tgc aaa gag att ctt ggc gga gaa acc ata att 816

Glu Thr Leu Asp Lys Cys Lys Glu Ile Leu Gly Gly Glu Thr Ile Ile

260 265 270

gca tct act cgt cgc gaa ccg ctt tca tcc ggc aca gta tca agg tat 864

Ala Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Ser Ser Gly Thr Val Ser Arg Tyr

275 280 285

ttt atg cgc gca cga aaa gca tca ggt ctt tcc ttc gaa ggg gat ccg 912

Phe Met Arg Ala Arg Lys Ala Ser Gly Leu Ser Phe Glu Gly Asp Pro

290 295 300

cct acc ttt cac gag ttg cgc agt ttg tct gca aga ctc tat gag aag 960

Pro Thr Phe His Glu Leu Arg Ser Leu Ser Ala Arg Leu Tyr Glu Lys

305 310 315 320

cag ata agc gat aag ttt gct caa cat ctt ctc ggg cat aag tcg gac 1008

Gln Ile Ser Asp Lys Phe Ala Gln His Leu Leu Gly His Lys Ser Asp

325 330 335

acc atg gca tca cag tat cgt gat gac aga ggc agg gag tgg gac aaa 1056

Thr Met Ala Ser Gln Tyr Arg Asp Asp Arg Gly Arg Glu Trp Asp Lys

340 345 350

att gaa atc aaa taa 1071

Ile Glu Ile Lys

355

<210>8

<211>356

<212>PRT

<213>λ噬菌体

<400>8

Met Gly Arg Arg Arg Ser His Glu Arg Arg Asp Leu Pro Pro Asn Leu

1 5 10 15

Tyr Ile Arg Asn Asn Gly Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asp Pro Arg Thr Gly

20 25 30

Lys Glu Phe Gly Leu Gly Arg Asp Arg Arg Ile Ala Ile Thr Glu Ala

35 40 45

Ile Gln Ala Asn Ile Glu Leu Phe Ser Gly His Lys His Lys Pro Leu

50 55 60

Thr Ala Arg Ile Asn Ser Asp Ash Ser Val Thr Leu His Ser Trp Leu

65 70 75 80

Asp Arg Tyr Glu Lys Ile Leu Ala Ser Arg Gly Ile Lys Gln Lys Thr

85 90 95

Leu Ile Ash Tyr Met Ser Lys Ile Lys Ala Ile Arg Arg Gly Leu Pro

100 105 110

Asp Ala Pro Leu Glu Asp Ile Thr Thr Lys Glu Ile Ala Ala Met Leu

115 120 125

Asn Gly Tyr Ile Asp Glu Gly Lys Ala Ala Ser Ala Lys Leu Ile Arg

130 135 140

Ser Thr Leu Ser Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ile Ala Glu Gly His Ile

145 150 155 160

Thr Thr Ash His Val Ala Ala Thr Arg Ala Ala Lys Ser Glu Val Arg

165 170 175

Arg Ser Arg Leu Thr Ala Asp Glu Tyr Leu Lys Ile Tyr Gln Ala Ala

180 185 190

Glu Ser Ser Pro Cys Trp Leu Arg Leu Ala Met Glu Leu Ala Val Val

195 200 205

Thr Gly Gln Arg Val Gly Asp Leu Cys Glu Met Lys Trp Ser Asp Ile

210 215 220

Val Asp Gly Tyr Leu Tyr Val Glu Gln Ser Lys Thr Gly Val Lys Ile

225 230 235 240

Ala Ile Pro Thr Ala Leu His Ile Asp Ala Leu Gly Ile Ser Met Lys

245 250 255

Glu Thr Leu Asp Lys Cys Lys Glu Ile Leu Gly Gly Glu Thr Ile Ile

260 265 270

Ala Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Ser Ser Gly Thr Val Ser Arg Tyr

275 280 285

Phe Met Arg Ala Arg Lys Ala Ser Gly Leu Ser Phe Glu Gly Asp Pro

290 295 300

Pro Thr Phe His Glu Leu Arg Ser Leu Ser Ala Arg Leu Tyr Glu Lys

305 310 315 320

Gln Ile Ser Asp Lys Phe Ala Gln His Leu Leu Gly His Lys Ser Asp

325 330 335

Thr Met Ala Ser Gln Tyr Arg Asp Asp Arg Gly Arg Glu Trp Asp Lys

340 345 350

Ile Glu Ile Lys

355

<210>9

<211>219

<212>DNA

<213>λ噬菌体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(219)

<400>9

atg tac ttg aca ctt cag gag tgg aac gca cgc cag cga cgt cca aga 48

Met Tyr Leu Thr Leu Gln Glu Trp Asn Ala Arg Gln Arg Arg Pro Arg

1 5 10 15

agc ctt gaa aca gtt cgt cga tgg gtt cgg gaa tgc agg ata ttc cca 96

Ser Leu Glu Thr Val Arg Arg Trp Val Arg Glu Cys Arg Ile Phe Pro

20 25 30

cct ccg gtt aag gat gga aga gag tat ctg ttc cac gaa tca gcg gta 144

Pro Pro Val Lys Asp Gly Arg Glu Tyr Leu Phe His Glu Ser Ala Val

35 40 45

aag gtt gac tta aat cga cca gta aca ggt ggc ctt ttg aag agg atc 192

Lys Val Asp Leu Asn Arg Pro Val Thr Gly Gly Leu Leu Lys Arg Ile

50 55 60

aga aat ggg aag aag gcg aag tca tga 219

Arg Asn Gly Lys Lys Ala Lys Ser

65 70

<210>10

<211>72

<212>PRT

<213>λ噬菌体

<400>10

Met Tyr Leu Thr Leu Gln Glu Trp Asn Ala Arg Gln Arg Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser Leu Glu Thr Val Arg Arg Trp Val Arg Glu Cys Arg Ile Phe Pro

20 25 30

Pro Pro Val Lys Asp Gly Arg Glu Tyr Leu Phe His Glu Ser Ala Val

35 40 45

Lys Val Asp Leu Asn Arg Pro Val Thr Gly Gly Leu Leu Lys Arg Ile

50 55 60

Arg Asn Gly Lys Lys Ala Lys Ser

65 70

<210>11

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P1

<400>11

ctagtaagat cttgaagcct gcttttttat actaagttgg 40

<210>12

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P2

<400>12

atgatcgaat tcgaaatcaa ataatgattt tattttgact g 41

<210>13

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P3

<400>13

atgccactgc agtctgttac aggtcactaa taccatctaa g 41

<210>14

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P4

<400>14

accgttaagc tttctagacg ctcaagttag tataaaaaag ctgaac 46

<210>15

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P5

<400>15

ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgc 38

<210>16

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P6

<400>16

taacagagat ctcgcgcaga aaaaaaggat ctcaaga 37

<210>17

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P7

<400>17

aacagagatc taagcttaga tcctttgcct ggcggcagta gcgcgg 46

<210>18

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P8

<400>18

ataaactgca gcaaaaagag tttgtagaaa cgcaa 35

<210>19

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P9

<400>19

agtaattcta gaaagcttaa cacagaaaaa agcccg 36

<210>20

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P10

<400>20

ctagtaggat ccctgcagtg gtcgaaaaaa aaagcccgca ctg 43

<210>21

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P11

<400>21

atcgaggtac cagatctccg gataagtaga cagcctg 37

<210>22

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P12

<400>22

gaaggtctag agcgcccggt tgacgctgct ag 32

<210>23

<211>1388

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆的DNA片段EcoRI-PstI，包含四环素抗性基因(pBR322的小EcoRI-Van91I片段)和转录终止子ter_thrL

<400>23

gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt 60

aaattgctaa cgcagtcagg caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct 120

cggcaccgtc accctggatg ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct 180

cttgcgggat atcgtccatt ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct 240

atatgcgttg atgcaatttc tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg 300

ccgccgccca gtcctgctcg cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc 360

gaccacaccc gtcctgtgga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc 420

cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg 480

ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg 540

gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg 600

cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc 660

gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat 720

cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc 780

gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc 840

gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac 900

caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta 960

cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc 1020

ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga 1080

ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcactgg 1140

accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg 1200

gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag 1260

ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg ctaacggatt caccactcca 1320

actagaaagc ttaacacaga aaaaagcccg cacctgacag tgcgggcttt ttttttcgac 1380

cactgcag 1388

<210>24

<211>1162

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>包含人工DNA片段的克隆DNA片段，包含启动子PA2(噬菌体T7的早期启动子)、氯霉素抗性cat基因(CmR)、转录终止子ter_thrL和attR

<400>24

agatctccgg ataagtagac agcctgataa gtcgcacgaa aaacaggtat tgacaacatg 60

aagtaacatg cagtaagata caaatcgcta ggtaacacta gcagcgtcaa ccgggcgctc 120

tagctagagc caagctagct tggccggatc cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa 180

tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac 240

attttgaggc atttcagtca gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata 300

ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc 360

acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg 420

agctggtgat atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa 480

cgttttcatc gctctggagt gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt 540

cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga 600

atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg 660

ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg 720

acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg 780

tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat 840

ttttttaagg cagttattgg tgcccttaaa cgcctggtgc tacgcctgaa taagtgataa 900

taagcggatg aatggcagaa attcgtcgaa gcttaacaca gaaaaaagcc cgcacctgac 960

agtgcgggct ttttttttcg accactgcag tctgttacag gtcactaata ccatctaagt 1020

agttgattca tagtgactgc atatgttgtg ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat 1080

gcaaaatcta atttaatata ttgatattta tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt 1140

tatactaact tgagcgtcta ga 1162

<210>25

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P1’

<400>25

ctaatatcga tgaagattct tgctcaa 27

<210>26

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P2’

<400>26

gcgttgaatt ccatacaacc tccttagtac atgc 34

<210>27

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P3’

<400>27

gtactagaat tcgtgtaatt gcggagactt tgcg 34

<210>28

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P4’

<400>28

aatagcctgc agttatttga tttcaatttt gtcccactcc c 41

<210>29

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P5’

<400>29

ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgc 38

<210>30

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P6’

<400>30

taacagagat ctagcgcaga aaaaaaggat ctcaaga 37

<210>31

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P7’

<400>31

ataaactgca gcaaaaagag tttgtagaaa cgcaa 35

<210>32

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P8’

<400>32

aacagaagct ttttgcctgg cggcagtagc gcgg 34

<210>33

<211>879

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆的DNA片段，包含cI抑制基因和启动子区

<400>33

tcgatgaaga ttcttgctca attgttatca gctatgcgcc gaccagaaca ccttgccgat 60

cagccaaacg tctcttcagg ccactgacta gcgataactt tccccacaac ggaacaactc 120

tcattgcatg ggatcattgg gtactgtggg tttagtggtt gtaaaaacac ctgaccgcta 180

tccctgatca gtttcttgaa ggtaaactca tcacccccaa gtctggctat gcagaaatca 240

cctggctcaa cagcctgctc agggtcaacg agaattaaca ttccgtcagg aaagcttggc 300

ttggagcctg ttggtgcggt catggaatta ccttcaacct caagccagaa tgcagaatca 360

ctggcttttt tggttgtgct tacccatctc tccgcatcac ctttggtaaa ggttctaagc 420

tcaggtgaga acatccctgc ctgaacatga gaaaaaacag ggtactcata ctcacttcta 480

agtgacggct gcatactaac cgcttcatac atctcgtaga tttctctggc gattgaaggg 540

ctaaattctt caacgctaac tttgagaatt tttgcaagca atgcggcgtt ataagcattt 600

aatgcattga tgccattaaa taaagcacca acgcctgact gccccatccc catcttgtct 660

gcgacagatt cctgggataa gccaagttca tttttctttt tttcataaat tgctttaagg 720

cgacgtgcgt cctcaagctg ctcttgtgtt aatggtttct tttttgtgct catacgttaa 780

atctatcacc gcaagggata aatatctaac accgtgcgtg ttgactattt tacctctggc 840

ggtgataatg gttgcatgta ctaaggaggt tgtatggaa 879

<210>34

<211>1290

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆的DNA片段，包含int-xis基因

<400>34

attatttgat ttcaattttg tcccactccc tgcctctgtc atcacgatac tgtgatgcca 60

tggtgtccga cttatgcccg agaagatgtt gagcaaactt atcgcttatc tgcttctcat 120

agagtcttgc agacaaactg cgcaactcgt gaaaggtagg cggatcccct tcgaaggaaa 180

gacctgatgc ttttcgtgcg cgcataaaat accttgatac tgtgccggat gaaagcggtt 240

cgcgacgagt agatgcaatt atggtttctc cgccaagaat ctctttgcat ttatcaagtg 300

tttccttcat tgatattccg agagcatcaa tatgcaatgc tgttgggatg gcaattttta 360

cgcctgtttt gctttgctcg acataaagat atccatctac gatatcagac cacttcattt 420

cgcataaatc accaactcgt tgcccggtaa caacagccag ttccattgca agtctgagcc 480

aacatggtga tgattctgct gcttgataaa ttttcaggta ttcgtcagcc gtaagtcttg 540

atctccttac ctctgatttt gctgcgcgag tggcagcgac atggtttgtt gttatatggc 600

cttcagctat tgcctctcgg aatgcatcgc tcagtgttga tctgattaac ttggctgacg 660

ccgccttgcc ctcgtctatg tatccattga gcattgccgc aatttctttt gtggtgatgt 720

cttcaagtgg agcatcaggc agacccctcc ttattgcttt aattttgctc atgtaattta 780

tgagtgtctt ctgcttgatt cctctgctgg ccaggatttt ttcgtagcga tcaagccatg 840

aatgtaacgt aacggaatta tcactgttga ttctcgctgt cagaggcttg tgtttgtgtc 900

ctgaaaataa ctcaatgttg gcctgtatag cttcagtgat tgcgattcgc ctgtctctgc 960

ctaatccaaa ctctttaccc gtccttgggt ccctgtagca gtaatatcca ttgtttctta 1020

tataaaggtt agggggtaaa tcccggcgct catgacttcg ccttcttccc atttctgatc 1080

ctcttcaaaa ggccacctgt tactggtcga tttaagtcaa cctttaccgc tgattcgtgg 1140

aacagatact ctcttccatc cttaaccgga ggtgggaata tcctgcattc ccgaacccat 1200

cgacgaactg tttcaaggct tcttggacgt cgctggcgtg cgttccactc ctgaagtgtc 1260

aagtacatcg caaagtctcc gcaattacac 1290

<210>35

<211>351

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ter_rrnB片段(互补物)

<400>35

caaaaagagt ttgtagaaac gcaaaaaggc catccgtcag gatggccttc tgcttaattt 60

gatgcctggc agtttatggc gggcgtcctg cccgccaccc tccgggccgt tgcttcgcaa 120

cgttcaaatc cgctcccggc ggatttgtcc tactcaggag agcgttcacc gacaaacaac 180

agataaaacg aaaggcccag tctttcgact gagcctttcg ttttatttga tgcctggcag 240

ttccctactc tcgcatgggg agaccccaca ctaccatcgg cgctacggcg tttcacttct 300

gagttcggca tggggtcagg tgggaccacc gcgctactgc cgccaggcaa a 351

Claims

1.一种测定至少一种影响使用细胞进行物质生产的代谢流量的方法，所述方法包括如下步骤：

1)基于底物到目标产物的生化反应式建立化学计量矩阵，

5)基于所得回归方程中的系数确定至少一种影响物质生产的代谢流量。

2.权利要求1的方法，其中所述统计分析为多元线性回归分析。

3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞为有能力产生氨基酸、核酸或有机酸的微生物细胞。

4.一种构建具有物质生产能力的细菌菌株的方法，所述方法包括修饰菌株，以至在由权利要求1-3任一项定义的方法测定的影响物质生产的代谢流量中，或在任何属于包括该代谢流量的相同独立代谢流量组的代谢流量中，当代谢流量显示与物质生产正相关时增加相应活性，或当代谢流量显示与物质生产负相关时减弱相应活性，或两者兼有。

5.一种生产物质的方法，所述方法包括将通过权利要求4中定义的方法构建的细菌菌株培养于培养基中，以在培养基或细菌细胞中生产和累积物质，并从培养基或细胞中收集物质，其中所述物质为氨基酸、核酸或有机酸。

6.一种测定至少一种影响使用细胞进行物质生产的代谢流量的程序，所述程序允许计算机执行代谢流量的测定方法，所述方法包括以下步骤：

1)基于底物到目标产物的生化反应式建立化学计量矩阵，

3)建立足够量的自由流量的随机组合进行统计分析，并基于化学计量矩阵从各建立的组合计算代谢流量分布，

7.一种计算机可读的记录介质，所述介质记录了权利要求6中定义的程序。