CN1475561A

CN1475561A - 通过发酵生产l-赖氨酸的方法

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Publication number: CN1475561A
Application number: CNA031017762A
Authority: CN
Inventors: ֮; 儿岛宏之; 尾川由理; ��֦; 川村和枝; 佐野孝之辅
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-11-28
Publication date: 2004-02-18
Anticipated expiration: 2014-11-28
Also published as: AU690168B2; PL181614B1; AU1077095A; CN1125176C; HUT74961A; HU9601535D0; KR960706562A; HU219608B; JP3132487B2; PL314852A1; JP3132497B2; CZ291730B6; JPH11192088A; RU2202614C2; EP0733710A4; EP0733710A1; KR100345592B1; SK280629B6; MY133278A; CA2178589C

Abstract

一种埃希氏杆菌属细菌，其细胞中通过导入编码来自对L－赖氨酸反馈抑制具有脱敏突变的埃希氏杆菌的二氢吡啶二羧酸合成酶DNA和编码来自对L－赖氨酸反馈抑制具有脱敏突变的埃希氏杆菌的天冬氨酸激酶III DNA被转化；优选其中来自乳发酵短杆菌的二氢吡啶二羧酸还原酶基因和二氨基庚二酸脱氢酶基因(或琥珀酰基二氨基庚二酸转氨酶基因和琥珀酰基二氨基庚二酸脱酰酶基因)被进一步增强的埃希氏杆菌属细菌，培养在合适的培养基中，在其培养基中产生和聚集L－赖氨酸，并从中收集L－赖氨酸。

Description

通过发酵生产L-赖氨酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物工业，特别涉及到通过发酵生产L-赖氨酸的方法，以及用于此生产方法的DNA和微生物。

背景技术

在以前的技术中，当用发酵方法生产L-赖氨酸时，为了提高产率，使用从天然环境分离到的微生物菌株或从此菌株得到的人工突变菌株。已知很多生产L-赖氨酸的人工突变菌株。它们中的多数是S-2-氨基乙基半胱氨酸(ACE)抗性突变菌株，并属于短颈细菌属、棒状杆菌属、芽胞杆菌属或埃希氏杆菌属。而且已公开了用于提高氨基酸产率的各种技术，比如使用重组DNA的方法得到的转化体(United States Patent No.4,278,765)。

关于那些属于埃希氏杆菌属的菌株，例如在Japanese Patent Application Laid-openNo.56-18596、United States Patent No.4,346,170和Applied Microbiology and Biotechnology，15，227-231(1982)中叙述了用一种菌株生产L-赖氨酸的方法，此菌株中二氢吡啶二羧酸合成酶(此后有时缩写为“DDPS”)是被增强了的。然而，用于这些情况的DDPS是野生型的，它受到L-赖氨酸的反馈抑制。因此得不到足以令人满意的L-赖氨酸产率。意外地，上面提到的Applied Microbiology and Biotechnology，15，227-231(1982)描述了从75g/l葡萄糖得到3g/l L-赖氨酸盐酸盐的L-赖氨酸产率，其中计算出的消耗系数(从1g糖生产出的L-赖氨酸克数或其百分数)是0.04，或4％。

另一方面，Korean Patent Publication No.92-8382叙述了用属于埃希氏杆菌属的一种细菌生产L-赖氨酸的方法，其中导入来源于棒状杆菌属的一种细菌的DDPS，已知该方法不受L-赖氨酸的反馈抑制(消耗系数17％)。然而，用于棒状杆菌细菌生长的上限温度比用于埃希氏杆菌属细菌生长的上限温度低约10度。因而，如果将编码来自棒状杆菌属的DDPS的DNA导入一种埃希氏杆菌，应该在较低的温度下培养以便用来生产L-赖氨酸。所以，可以预见，难以显示出埃希氏杆菌属具有的生长温度高、生长速度快和L-赖氨酸产生速度快的优点。一般地，当来自异源有机体的基因被表达时，有时造成表达产物被蛋白酶水解并形成一不溶的包含体，可以预见与同源基因表达的情形相比有更多的困难。再者，当编码来自一种棒状杆菌的DDPS的DNA被导入一种埃希氏杆菌来工业化生产L-赖氨酸时，与使用导入同源基因重组体的情形相比需要更严密地调节，这与重组DNA的指导方针一致。

二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)是一种将天冬氨酸半醛和丙酮酸脱水缩合生成二氢吡啶二羧酸的酶。此反应位于天冬氨酸家族氨基酸生物合成中进入L-赖氨酸生物合成系统旁路入口处。因为天冬氨酸激酶存在于埃希氏杆菌属中，所以已知DDPS酶负责一个重要的调控位点。

DDPS由E.coli中称为dapA的基因编码。dapA已被克隆并已测得其核苷酸序列(Richaud，F.et al.，J.Bacteriol.，297(1986))。

此外，天冬氨酸激酶(此后有时缩写为“AK”)是一个用于催化天冬氨酸转变成β-磷天冬氨酸反应的酶，它是一个天冬氨酸家族氨基酸生物合成系统的主要调节酶。E.coli的AK有三种类型(AKI，AKII，AKIII)，其中两种是带有高丝氨酸脱氢酶(此后有时缩写为“HD”)的复合酶。其中一个复合酶是由thrA基因编码的AKI-HDI，另一个是由metLM基因编码的AKII-HDII。AKI易受苏氨酸和异亮氨酸的协同抑制并被苏氨酸抑制，而AKII被蛋氨酸抑制。

正相反，已知只有AKIII是一个单纯功能酶，它是一个命名为lysC基因的产物，并受到L-赖氨酸的抑制和反馈抑制。它们在细胞内活性的比例为AKI∶AKII∶AKIII＝约5∶1∶4。

如上所述，来自棒状杆菌属细菌的DDPS不受L-赖氨酸的反馈抑制。然而，当把它导入埃希氏杆菌属细菌以利用它来生产L-赖氨酸时，在培养温度上出现了问题。如能获得来自一种埃希氏杆菌的DDPS或AKIII的突变酶，且此酶不受L-赖氨酸的反馈抑制，预测能够通过使用一种埃希氏杆菌经发酵高效率地生产L-赖氨酸。可是，以前的文献没有描述过这样的DDPS突变酶，尽管有一篇关于AKIII突变酶的报道(Boy，E.，et al.，J.Bacteriol.，112，84(1972))，但是没有已知的实例提出这样一个突变酶可以提高L-赖氨酸的产率。

发明内容

本发明考虑到了前面提到的观点，其目的之一是获得来自埃希氏杆菌的DDPS和AKIII，它们对L-赖氨酸的反馈抑制充分脱敏，并提供一种通过比先前技术有很大改善的发酵法生产L-赖氨酸的方法。

为达到上面描述的目的而进行的孜孜不倦和重复研究的结果是，本发明者已成功地获得了编码一种埃希氏杆菌DDPS的DNA，在此细菌中对L-赖氨酸的反馈抑制是相当脱敏的。编码来自对L-赖氨酸的反馈抑制相当脱敏的E.coli DDPS的DNA在此有时被称作突变dapA或dapA^*。

本发明人进一步创造了一种锚定突变dapA和对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶的埃希氏杆菌。编码来自对L-赖氨酸的反馈抑制相当脱敏的E.coli天冬氨酸激酶的DNA在此有时被称作突变lysC或lysC^*。

本发明人进一步创造了一种锚定了突变dapA和突变lysC的埃希氏杆菌。并已发现通过在优选的培养基中培养前面提到的埃希氏杆菌可以产生和聚集相当数量的L-赖氨酸。

本发明更进一步发现，通过加强一种锚定了突变dapA和突变lysC的埃希氏杆菌的L-赖氨酸生物合成系统的其它基因，可以再提高L-赖氨酸的产率。

即本发明基于编码二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA，此合成酶来自一个具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变埃希氏杆菌。对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变用选自下组的突变作为例子，包括用缬氨酸残基取代第81位丙氨酸残基的突变，用酪氨酸残基取代第118位组氨酸残基的突变，以及用缬氨酸残基取代第81位的丙氨酸残基和用酪氨酸残基取代第118位的组氨酸残基的突变，所用编号是从二氢吡啶二羧酸合成酶氨基酸序列的N-端开始计数，此合成酶在序列列表的SEQID NO：4中有明确的表示。

本发明更是基于一种埃希氏杆菌，它通过导入其细胞内一个编码来自埃希氏杆菌的二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA而被转化，此种细菌具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变。对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变的例子是，用缬氨酸残基取代第81位丙氨酸残基的突变，用酪氨酸残基取代第118位组氨酸残基的突变，以及用缬氨酸残基取代第81位的丙氨酸残基和用酪氨酸残基取代第118位的组氨酸残基的突变，所用编号是从二氢吡啶二羧酸合成酶氨基酸序列的N-端开始，此合成酶在序列列表的SEQ ID NO：4中有明确的表示。

本发明进一步基于通过导入二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA转化埃希氏杆菌，该合成酶产生于具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏突变的埃希氏杆菌。对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变通过以下突变示例，用缬氨酸残基取代第81位丙氨酸残基的突变，用酪氨酸残基取代第118位组氨酸残基的突变，以及用缬氨酸残基取代第81位的丙氨酸残基和用酪氨酸残基取代第118位的组氨酸残基的突变，所用编号是从二氢吡啶二羧酸合成酶氨基酸序列的N-端开始，此合成酶在序列列表的SEQID NO：4中有明确的表示。

本发明还基于前面提到的埃希氏杆菌属的细菌，它锚定了对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶。通过导入来自一种具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏埃希氏杆菌的编码天冬氨酸激酶III的DNA的方法，来示范使埃希氏杆菌属的细菌锚定对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶的方法。

使天冬氨酸激酶III对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变示例如下，用天冬氨酸残基取代第323位甘氨酸残基的突变，用天冬氨酸残基取代第323位及408位甘氨酸残基的突变，用半胱氨酸残基取代第34位精氨酸残基及用天冬氨酸残基取代第323位甘氨酸残基的突变，用苯丙氨酸残基取代第325位亮氨酸残基的突变，用异亮氨酸残基取代第318位蛋氨酸残基的突变，用异亮氨酸残基取代第318位蛋氨酸残基及用蛋氨酸残基取代第349位缬氨酸残基的突变，用亮氨酸残基取代第345位丝氨酸残基的突变，用蛋氨酸残基取代第347位缬氨酸残基的突变，用异亮氨酸残基取代第352位苏氨酸残基的突变，用异亮氨酸残基取代第352位苏氨酸残基及用苯丙氨酸残基取代第369位丝氨酸残基的突变，用赖氨酸残基取代第164位谷氨酸残基的突变，用异亮氨酸残基取代第417位蛋氨酸残基及用酪氨酸残基取代第419位半胱氨酸残基的突变，所用编号是从天冬氨酸激酶III氨基酸序列的N-端开始，此酶在序列列表的SEQ ID NO：8中有明确的表示。

编码具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏突变、来自一种埃希氏杆菌的二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA以及编码具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏突变的天冬氨酸激酶III的DNA可以分别定位于一种埃希氏杆菌的染色体上，或定位于细胞中的同一个或分开的质粒上。而且也可将上述一种DNA定位于染色体上，另一种DNA定位于质粒上。

本发明还基于前面提到的埃希氏杆菌属，其中二氢吡啶二羧酸还原酶基因是被增强的。二氢吡啶二羧酸还原酶基因的增强可通过重组DNA的转化获得，该重组DNA通过将二氢吡啶二羧酸还原酶基因与在一种埃希氏杆菌中能自主复制的载体相连接构建的。

本发明还基于前面提到的埃希氏杆菌属，其中导入了增强的来自棒状杆菌，如乳发酵短杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶基因。来自棒状杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶基因的导入可通过重组DNA的转化获得，该重组DNA是通过此基因与在一种埃希氏杆菌中能自主复制的载体相连接构建的。

对于棒状杆菌，可以用产生谷氨酸的野生型菌株及其产生其它氨基酸的突变株为例说明，它们属于棒状杆菌或短杆菌属。更具体地说，黄色短杆菌、扩展短杆菌、谷氨酸棒状杆菌、百合棒状杆菌以及乳发酵短杆菌可以作为用于本发明的棒状杆菌的示例。

本发明而且基于埃希氏杆菌属的细菌，其中四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶基因和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶基因是被增强了的，而不是前面提到的二氨基庚二酸脱氢酶基因。这些基因的增强可以通过单个重组DNA或两个重组DNA的转化获得，这些重组DNA是通过将这些基因与在一种埃希氏杆菌中能自主复制的同一载体或不同载体相连接构建的。

本发明进一步提供一种生产L-赖氨酸的方法，该方法包括以下步骤，在适当的培养基中培养上面叙述的任意一种埃希氏杆菌，在其培养基中生产和聚集L-赖氨酸，以及从培养基中收集L-赖氨酸。

在本说明书中，编码DDPS或AKIII的DNA，或除其本身外还含有启动子的DNA有时被称为“DDPS基因”或“AKIII基因”。而且，对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变酶，以及编码此突变酶的DNA或除其本身外还含有启动子的DNA有时分别简称为“突变酶”和“突变基因”。进一步地，短语“使对L-赖氨酸反馈抑制脱敏”指对抑制基本上脱敏就足够，完全脱敏是不必要的。

以下将对本发明做详细地解释。

(1)编码本发明的突变二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)的DNA

编码本发明突变DDPS的DNA具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变，此DDPS被编码在编码野生型DDPS的DNA上。DDPS通过那些来自埃希氏杆菌属细菌举例说明，特别是来自E.coli的DDPS。DDPS突变成对L-赖氨酸反馈抑制脱敏通过下面例子说明：

(1)用缬氨酸残基取代第81位丙氨酸残基的突变；

(2)用酪氨酸残基取代第118位组氨酸残基的突变；以及

(3)用缬氨酸残基取代第81位的丙氨酸残基和用酪氨酸残基取代第118位的组氨酸残基的突变；

所用编号是从DDPS氨基酸序列的N-端开始，此合成酶在序列列表的SEQ IDNO：4中有明确的表示。

编码野生型DDPS的DNA不特别限制它是编码来自埃希氏杆菌属细菌的DDPS，该DNA通过编码表示于SEQ ID NO：4的氨基酸序列的DNA来具体示例，并且通过表示于SEQ ID NO：3的碱基序列中272-1147号碱基的序列进行进一步具体说明。在这些序列中，那些具有导致上述氨基酸残基取代的核苷酸序列突变的DNA是编码本发明中突变DDPS的。只要是编码相同的氨基酸残基，任何对应于被取代氨基酸残基的密码子都可用，特别是与其种类不相关的。而且假设具有的DDPS在依赖于不同细菌种类和细菌菌株的序列上有轻微的不同，那些在与酶活性不相关的位置上具有取代、消除或插入氨基酸残基的细菌，也包括在本发明的突变DDPS基因中。

获得这种突变基因的一种方法如下。首先，含有野生型或具有其它突变的DDPS基因的DNA，在体外经突变处理，突变处理后的DNA与一个载体DNA连接，该载体DNA适宜宿主获得重组DNA。重组DNA被导入宿主微生物以获得转化体。当表达突变DDPS的重组DNA从前面提到的转化体中被选择出来时，该转化体锚定一个突变基因。含有野生型或具有其它突变的DDPS基因的DNA之一，可与一个载体DNA连接，该载体DNA适宜宿主获得重组DNA。重组DNA然后在体外经突变处理，突变处理后的重组DNA被导入宿主微生物以获得转化体。表达突变DDPS的转化体从前面提到的转化体中被选择出来时，该转化体也锚定一个突变基因。

产生野生型酶的微生物也可进行突变处理，产生生产突变酶的突变株，然后该突变基因从突变株中获得。或者与野生型基因连接的重组DNA导入转化体经突变处理产生一个生产突变酶的突变株。当重组DNA从突变株回收后，前述的DNA中产生突变基因。

完成体外DNA突变处理的试剂以羟胺等示例。羟胺是一种化学突变处理试剂，它通过将胞嘧啶变为N⁴-羟基胞嘧啶引起从胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变。当微生物本身受突变处理时，可通过用紫外光照射或常用于人工突变的突变试剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸来完成。

只要是属于埃希氏杆菌属的微生物，用做含有野生型DDPS基因或上述某种突变的DDPS基因的DNA的供体微生物不会有问题。具体可使用由Neidhardt etal.(Neidhardt，F.C.et al.，Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，AmericanSociety for Microbiology，Washington D.C.，1208，table 1)编写的书中所描述的。例如，以E.coli JM109株和MC1061株举例说明。当一种野生株用作含DDPS基因的DNA的供体微生物时，可获得含野生型DDPS基因的DNA。

(1)野生型DDPS的制备

制备含DDPS的DNA的实例将描述如下。首先，具野生型dapA的E.coli，如MC1061株被培养以获得培养物。当上述微生物被培养时，可用与一般固体培养方法一致的方法进行培养，然而考虑到收集细菌过程中的效率，优选采用液体培养方法进行培养。使用的培养基中可加入一种或多种氮源如酵母提取物、胨、肉提取物、玉米浸液、大豆或小麦渗出液，一种或多种无机盐如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、氯化镁、氯化铁、硫酸铁或硫酸锰，并选择性适当加入糖物质和维生素等。培养基的初始pH调到6-8是适当的。培养在30-42℃进行4-24小时，振荡或静止培养等，优选37℃通过通气和搅拌进行深度培养。

如此获得的培养物在3,000r.p.m离心5分钟，得到E.coli MC1061株的细胞沉淀。通过例如Saito和Miura(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))或K.S.Kirby(Biochem.J.，64，405(1956))的方法从细胞沉淀中得到染色体DNA。

为了从如此获得的染色体DNA中分离DDPS基因，应制备一个染色体DNA文库。首先，染色体DNA用合适的限制性酶部分消化，获得各种片段的混合物。如果剪切程度通过酶切反应时间等控制，可使用多种限制性酶。如Sau3AI对染色体DNA的反应温度不低于30℃，优选37℃、酶浓度为1-10units/ml反应不同时间(1分钟-2小时)进行消化。

然后获得的DNA片段与埃希氏杆菌中的自主复制载体DNA连接以制备重组DNA。具体地说，产生的末端核苷酸序列与用于剪切染色体DNA的限制性酶Sau3AI产生的末端核苷酸序列互补的限制性酶，如BamHI，在温度不低于30℃、酶浓度为1-100units/ml与载体DNA反应至少1小时，优选1-3小时以完全消化和剪切载体DNA。然后，上述获得的染色体DNA片段混合物与已被剪切的载体DNA混合，用DNA连接酶，优选T4 DNA连接酶，在酶浓度为1-100uints/ml、4-16℃反应至少1小时，优选6-24小时以获得重组DNA。

得到的重组DNA用于转化一种埃希氏杆菌属的微生物，例如一种DDPS缺陷突变株如Escherichia coli K-12株，优选JE7627株(ponB704，dacB12，pfv+，tonA2，dapA，lysA，str，malA38，metB1，ilvH611，leuA371，proA3，lac-3，tsx-76)以制备染色体DNA文库。转化可通过D.M.Morrison(Methods in Enzymology 68，326(1979))的方法或将受体菌用氯化钙处理以增加DNA渗透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。JE7627株可以从国立遗传研究所(Mishima-shi，shizuoka-ken，Japan)得到。

具有DDPS基因重组DNA的菌株，从得到的染色体DNA文库中具增强DDPS活性的菌株，或由于DDPS基因缺陷导致的营养缺陷已补足的菌株获得。例如DDPS缺陷突变株需要二氨基庚二酸。因此，当此DDPS缺陷型突变株用作宿主时，含DDPS基因的DNA片段可通过分离能在不含二氨基庚二酸的培养基中生长的菌株，并从该菌株中回收重组DNA来获得。

确证带有DDPS基因的重组DNA的候选菌株是否真的锚定了已克隆DDPS基因的重组DNA，可以通过从候选菌株中制备细胞提取物，并从中制备粗酶溶液以证实DDPS活性是否已被提高来获得。测定DDPS酶活性的步骤可用Yugari etal.(Yugari，Y.和Gilvarg，C.，J.Biol.Chem.，240，4710(1962))的方法来完成。

含有DDPS基因的DNA被插入到载体DNA的重组DNA，可以用如P.Guerryet al.(J.Bacteriol.，116，1064(1973))或D.B.Clewell(J.Bacteriol.，110，667(1972))的方法从上面描述的菌株中分离出来。

野生型DDPS基因的制备也可以通过Saito和Miura等的方法，从在染色体上具有DDPS基因的菌株中制备染色体DNA，并用聚合酶链反应(见White，T.J.等；Trends Genet.，5，185(1989))的方法扩增DDPS基因来完成。用于扩增反应的DNA引物是那些与含DDPS基因的整个区域或部分区域的双链DNA的两个3′-端互补的DNA。当仅DDPS基因的部分区域被扩增时，必须用这样的DNA片段作为引物以进行含有来自染色体DNA文库的整个区域的DNA片段的筛选。当DDPS基因的整个区域被扩增时，包含带有扩增DDPS基因的DNA片段的PCR反应溶液要进行琼脂糖凝胶电泳，然后目标DNA片段被抽提出来。这样含DDPS基因的DNA片段得以回收。

DNA引物，在如E.coli(Richaud，F.etal.，J.Bacteriol.，297(1986))上已知的序列基础上适当地制备。具体地说，优选的是扩增包含编码DDPS基因的1150个碱基区域的引物，表示于SEQ ID NO：1和NO：2的两种引物是合适的。引物的合成可以用一般方法完成，如用亚磷酰胺法(见Tetrahedron Letters，22，1859(1981))经商业可得的DNA合成仪(如Applied Biosystems Inc.生产的DNASynthesizer Model 380B)合成。进一步，PCR可以用商业可得的PCR仪(如TakaraShuzo Co.，Ltd.生产的DNA Thermal Cycler Model PJ2000)，按与供应商提供的方法一致的方法用Tag DNA聚合酶(由Takara Shuzo Co.，Ltd.提供)来完成。

考虑到用PCR方法扩增DDPS基因，把突变导入到DDPS基因这样的操作变得容易了，然后DDPS基因与在埃希氏杆菌属细菌的细胞内自主复制的载体DNA连接，并导入埃希氏杆菌属细菌。所使用的载体、转化方法、DDPS基因存在的确证方法与前面提到的方法一样。

(2)突变导入到DDPS基因

完成象氨基酸残基的取代、插入和消除的突变方法，以重组体PCR方法(Higuchi，R.，61，in PCR Technology(Erlich，H.A.Eds.，Stockton press(1989)))和点特异致突变方法示例。通过使用这些方法可在目的位点引起目的突变。

而且，根据目的基因的化学合成，可以把突变或随机突变导入目的位点。

还可用另一种方法，其中位于染色体或质粒上的DDPS基因直接用羟胺处理(Hashimoto，T.和Sekiguchi，M.J.Bacteriol.，159，1039(1984))。将具有DDPS基因的埃希氏杆菌用紫外光照射的方法，或用化学试剂如N-甲基-N′-亚硝基胍或亚硝酸处理的方法可任选其一。根据这些方法可随机导入突变。

考虑到突变基因的选择方法，含有DDPS基因和载体DNA的DNA片段的重组DNA，首先直接用羟胺或其它试剂处理产生突变，然后用于转化，如E.coliW3110菌株。其次，转化的菌株在一种基本培养基如含S-2-氨乙基半胱氨酸(AEC)作为L-赖氨酸类似物的M9中培养。因为从重组DNA表达的DDPS受到AEC的抑制，锚定了含有野生型DDPS基因的重组DNA的菌株不能合成L-赖氨酸和二氨基庚二酸，并且生长被抑制。相反，锚定了含有对L-赖氨酸抑制脱敏DDPS基因的重组DNA的菌株有一种突变酶，在前面提到的不受AEC抑制的重组DNA中，此酶由DDPS基因编码。因此菌株能够在加入了AEC的基本培养基中生长。此现象能被用来选择一种菌株，此菌株生长上对作为L-赖氨酸类似物的AEC有抗性，并是一种锚定了含有抑制被脱敏的突变DDPS基因的重组DNA。

这样获得的突变基因可以作为重组DNA被导入到合适的宿主微生物中并表达。因而可获得锚定对反馈抑制脱敏的DDPS的微生物。宿主优选属于埃希氏杆菌属的微生物，可用E.coli作为示例。

也可以从重组DNA中获得突变DDPS基因片段，并插入到另一个载体中使用。在本发明中能使用的载体DNA优选质粒载体DNA，对此用pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219和pMW218示例。此外，也可以使用噬菌体DNA载体。

而且为了有效地表达突变DDPS基因，微生物中另一启动子如lac、trp和PL可被连接到编码突变DDPS的DNA序列上游，或者存在于DDPS基因的启动子被原样使用或扩增后使用。

另外，如上所述，突变基因可以插入到自主复制的载体DNA中，此载体DNA被插入到宿主中，并让它作为象质粒一样的染色体外DNA被宿主锚定。通过用转导、转座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))、Mu噬菌体(Japanese Patent Application Laid-open No.2-109985)或同源重组(Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.(1972))之一的方法，突变基因也可以被整合到宿主微生物的染色体中。

(2)用于本发明的编码突变天冬氨酸激酶III(AKIII)的DNA

用于本发明的编码突变AKIII的DNA，在编码野生型AKIII的DNA中，具有使编码AKIII对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏突变。使AKIII对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变示例如下：

(a)用天冬氨酸残基取代第323位甘氨酸残基的突变；

(b)用天冬氨酸残基取代第323位甘氨酸残基及用天冬氨酸残基取代第408位甘氨酸残基的突变；

(c)用半胱氨酸残基取代第34位精氨酸残基及用天冬氨酸残基取代第323位甘氨酸残基的突变；

(d)用苯丙氨酸残基取代第325位亮氨酸残基的突变；

(e)用异亮氨酸残基取代第318位蛋氨酸残基的突变；

(f)用异亮氨酸残基取代第318位蛋氨酸残基及用蛋氨酸残基取代第349位缬氨酸残基的突变；

(g)用亮氨酸残基取代第345位丝氨酸残基的突变；

(h)用蛋氨酸残基取代第347位缬氨酸残基的突变；

(i)用异亮氨酸残基取代第352位苏氨酸残基的突变；

(j)用异亮氨酸残基取代第352位苏氨酸残基及用苯丙氨酸残基取代第369位丝氨酸残基的突变；

(k)用赖氨酸残基取代第164位谷氨酸残基的突变；

(l)用异亮氨酸残基取代第417位蛋氨酸残基及用酪氨酸残基取代第419位半胱氨酸残基的突变；

所用编号是从AKIII氨基酸序列的N-端开始，此序列在序列列表的SEQ IDNO：8中有明确的表示。

编码野生型AKIII的DNA不被特别限制，为此以编码来自一种埃希氏杆菌如E.coli的DNA作为示例。具体以编码SEQ ID NO：8中氨基酸序列的DNA，以及用在SEQ ID NO：7定义的碱基序列中以碱基号584-1930代表的序列示例。E.coli的AKIII偶尔被lysC基因编码。

在这些序列中，在碱基序列上有突变而造成上述氨基酸残基取代的那些序列是编码本发明的突变AKIII的DNA。只要编码相同的氨基酸残基，不管其种类，可用相应于取代氨基酸残基有关的任何密码子。而且，有一些野生型AKIII氨基酸序列，根据菌种和菌株的不同而有轻微的不同。以某种方式，在与酶活性不相干的位置有氨基酸残基的取代、消除或插入的序列也包括在本发明的突变AKIII基因中。例如，在以后叙述的(SEQ ID NO：7)实施例2中得到的野生型lysC的碱基序列，与已经发表的E.coli K-12 JC411菌株的lysC序列，在6个位点有所不同(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，2611052(1986))。编码的氨基酸残基在其中2个位点不同(在JC411菌株的lysC中，第58位甘氨酸残基被半胱氨酸残基取代，以及第401位甘氨酸残基被丙氨酸残基取代，所用编号是从lysC氨基酸序列的N-端开始，此序列在SEQ ID NO：8中有明确的表示)。假如可以导入前述(a)到(l)的任何一个突变，甚至具有与E.coliK-12 JC411菌株中lysC相同序列的lysC是有希望得到的，这种具有突变的lysC对L-赖氨酸的反馈抑制是脱敏的。

获得编码对L-赖氨酸反馈抑制脱敏突变AKIII的DNA的方法如下。首先，含有野生型AKIII基因或有其它突变的AKIII基因的DNA经体外突变处理，突变处理后的DNA与适合宿主的载体DNA连接获得重组DNA。重组DNA被导入宿主微生物得到转化体。当从上面提到的转化体选择出表达突变AKIII的转化体，此转化体锚定了突变基因。含有野生型AKIII基因或具有另一突变的AKIII基因可与适合宿主的一种载体DNA连接得到重组DNA。该重组DNA然后经体外突变处理，突变处理后的重组DNA导入宿主微生物得到转化体。从上面的转化体中选择出表达突变AKIII的转化株时，它也锚定一种突变基因。

另外，产生野生型酶的微生物经突变处理生成产生突变酶的突变株，然后从此突变株中获得突变基因也是可以接受的。完成DNA直接突变处理的试剂以羟胺等示例。羟胺是一种化学突变处理试剂，它通过将胞嘧啶变为N⁴-羟基胞嘧啶引起从胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变。当微生物本身受突变处理时，可通过用紫外光照射或常用于人工突变的突变试剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)之一来完成。

只要是属于埃希氏杆菌属的微生物，任何一种均可用作含有野生型AKIII基因或具有上述另一种突变的AKIII基因的DNA的供体微生物。具体可使用由Neidhardt et al.(Neidhardt，F.C.et al.，Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1208，table 1)编写的书中所描述的。例如，以E.coli JM109株和MC1061株举例说明。当AKIII基因是从这些菌株中获得的时，染色体DNA的制备，染色体DNA文库的制备等可以用上述DDPS基因制备同样的方法完成。作为用于文库制备的宿主，优选使用在AKI，II，III上完全缺陷的菌株，如E.coli GT3菌株(从E.coli Genetic StockCenter(Connecticut，United States)获得)。

从获得的染色体DNA文库中，得到一种具有AKIII基因重组DNA的菌株，作为AKIII基因活性被升高的或营养缺陷型被补足的菌株。从候选菌株中制备细胞提取物，并从中制备粗酶溶液以证实AKIII活性。测定AKIII酶活性的步骤可用与Stadtman et al.(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N，LeBras，G.，和Robichon-Szulmajster，H.，J.Biol.Chem.，236，2033(1961))一致的方法来完成。

例如，当AK完全缺陷的突变株被用作宿主时，含有AKIII基因的DNA片段能通过分离转化菌株获得，此菌株能够在不含L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-蛋氨酸和二氨基庚二酸的培养基中生长，或在不含高丝氨酸和二氨基庚二酸的培养基中生长，并从菌株中回收重组DNA。

当AKIII基因通过PCR方法从染色体DNA扩增时，用于PCR反应的DNA引物，可基于如E.coli(Czssan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，261，1052(1986))中已知序列的基础上适当地制备。然而，扩增编码lysC基因的1347个碱基区域的引物是合适的，如具有表示于SEQ ID NO：1和NO：2的两种引物是合适的。

完成突变的方法，如象上面描述的那样获得AKIII基因中氨基酸残基的取代、插入和消除，以重组体PCR方法及点特异致突变方法等示例，与上面描述的DDPS基因的突变处理方法相同。

还可用另一种方法，其中位于染色体或染色体外重组DNA上的AKIII基因DNA直接用羟胺处理(Hashimoto，T.和Sekiguchi，M.J.Bacteriol.，159，1039(1984))。将在染色体或染色体外重组DNA上具有AKIII基因的埃希氏杆菌用紫外光照射的方法，或用化学试剂如N-甲基-N’-亚硝基胍或亚硝酸进行处理的方法可任选其一。

考虑到用于突变AKIII基因的选择方法，AK完全缺陷的菌株如E.coli GT3菌株，首先用重组DNA转化，此重组DNA含已经被突变处理的AKIII基因。其次，转化的菌株在一种基本培养基，如含相当量L-赖氨酸的M9中培养。因为只有一种AK受到L-赖氨酸的抑制，锚定了含有野生型AKIII基因的重组DNA的菌株不能合成L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸和二氨基庚二酸(DAP)，并且生长受到抑制。相反，锚定了对L-赖氨酸抑制脱敏AKIII基因的重组DNA的菌株能够在加入了相当量L-赖氨酸的基本培养基中生长。此现象能被用来选择菌株，此菌株生长上对L-赖氨酸或作为L-赖氨酸类似物的AEC有抗性，它是一种锚定了含有抑制被脱敏的突变AKIII基因的重组DNA。

这样获得的突变基因可以作为重组DNA被导入到合适的微生物(宿主)中并表达。因而可获得一种锚定了对反馈抑制脱敏的AKIII的微生物。

宿主优选属于埃希氏杆菌属的微生物，可用E.coli作为示例。

突变AKIII基因片段还可以从重组DNA获得，并插入到另一个载体中使用。本发明中能用的载体DNA优选质粒载体DNA，对此用pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219和pMW218示例。此外，也可以使用噬菌体DNA载体。

而且为了有效地表达突变AKIII基因，那些在微生物中起作用的其它启动子如lac、trp和PL可被连接到编码突变AKIII的DNA序列上游，或者存在于AKIII基因中的启动子被原样使用或扩增后使用。

另外，象上面叙述的，突变基因可以插入到自主复制的载体DNA中，此载体DNA被插入到宿主中，并让它作为象质粒一样的染色体外DNA被宿主锚定。通过用转导、转座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))、Mu噬菌体(Japanese Patent Application Laid-open No.2-109985)或同源重组(Experimentsin Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.(1972))之一的方法，突变基因可以被整合到宿主微生物的染色体中。

(3)按照本发明的L-赖氨酸生产

通过在优选培养基中培养细菌，在培养基中产生、聚集及收集L-赖氨酸，可以有效地生产L-赖氨酸，所用细菌通过导入如上获得的突变DDPS基因而被转化并允许锚定对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的AK。也就是，通过让埃希氏杆菌属细菌锚定突变DDPS和突变AKIII，能够有效地生产L-赖氨酸。

锚定对L-赖氨酸反馈抑制脱敏AK的埃希氏杆菌属细菌示例如下，通过将编码对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的AKIII的DNA整合到染色体DNA中来转化埃希氏杆菌属细菌，或通过将该DNA与埃希氏杆菌的细胞内自主复制的载体DNA连接构建的重组DNA导入细胞内来转化埃希氏杆菌属细菌。而且，对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的AK可以是野生型AK，它不受L-赖氨酸的反馈抑制，或此野生型AK以同样的方式被导入到埃希氏杆菌。而且，也可以通过埃希氏杆菌细胞的突变处理使突变株已经成为生产突变AKIII的埃希氏杆菌。

另一方面，为了通过把突变DDPS基因导入埃希氏杆菌属细菌获得转化，此突变DDPS基因可以被整合到染色体DNA以获得转化，或可以通过导入细胞内经与在埃希氏杆菌的细胞内自主复制的载体DNA连接构建的重组DNA而获得转化。

当突变DDPS基因和突变AKIII基因都被导入埃希氏杆菌属细菌时，两个突变基因可以被整合和锚定在埃希氏杆菌属细菌染色体DNA上，或者它们可以在细胞内作为染色体外DNA被锚定在同一个或分开的质粒上。当使用分开的质粒时，优选使用具有稳定分配机制的质粒以让它们中每一个相容地锚定在细胞内。而且分别可把其中一个突变基因整合并锚定在染色体DNA，另一个突变基因作为染色体外DNA被锚定在细胞内质粒上。当突变DDPS基因和突变AKIII基因被导入埃希氏杆菌属细菌时，两个基因导入的任何次序都可以。

通过加强埃希氏杆菌的二氢吡啶二羧酸还原酶基因，其中埃希氏杆菌中已经被导入了突变DDPS基因和突变AKIII基因，L-赖氨酸的产率可进一步提高。通过把来自棒状杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶基因导入到二氢吡啶二羧酸还原酶基因已被增强的埃希氏杆菌属细菌中，L-赖氨酸的产率仍可进一步被提高。此二氨基庚二酸脱氢酶基因应该被增强。另外，通过增强四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶基因和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶基因而不是导入二氨基庚二酸脱氢酶，L-赖氨酸的产率也能以相似的幅度被提高。

此处基因的增强是指作为每一个细胞基因表达产物的酶活性上的提高。具体地说，有以下示例：在细胞内基因拷贝数目上的增加；通过使用具有高表达效率的启动子及向基因内导入增强酶活性突变，在每一个基因表达量上有增强。为了增强细胞内基因的拷贝数目，此基因被插入到在埃希氏杆菌中能自主复制的载体上，并且埃希氏杆菌属细菌可以用此载体转化。此载体优选多拷贝型质粒。另外，用Mu噬菌体等整合到染色体DNA上的DNA的扩增可增加拷贝数目。考虑到质粒的使用，当质粒被用于突变DDPS基因和突变AKIII基因的导入时，具有稳定的分配机制的质粒被优选使用，其中这些质粒可共同稳定地锚定在细胞内。基因导入的任何顺序都可以。

下面将要解释一种机理，其中L-赖氨酸的产率能逐步地通过连续增强上面描述的L-赖氨酸生物合成系统的基因得到增加。包括许多反应的生物合成系统可以比作液体流过许多的具有不同粗细程度、顺序连接的导管。在此每一个导管代表一种酶，导管的粗细代表酶反应的速率。为了提高流过导管的液体量，加粗最细的导管是有效的。即使粗导管被进一步加粗，也不可能有作用。为了进一步增加流量，第二细的导管可加粗。从此观点出发，本发明者们尝试增强L-赖氨酸的生物合成系统。为此目的，如下面描述的实施例6所示，通过逐步导入E.coli中来自E.coli的L-赖氨酸生物合成系统的基因，L-赖氨酸生物合成系统的限速步骤的次序已被阐明。在这一阐述中，dapC(琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶基因)，dapD(四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶基因)，dapE(琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶基因)以及dapF(二氨基庚二酸差向异构酶基因)四个位于生物合成途径下游的基因被DDH基因取代，此DDH基因编码能够催化由这些基因产物自身参与反应的乳发酵短杆菌的DDH(二氨基庚二酸脱氢酶)。也就是，L-赖氨酸生物合成系统中酶的导入基因以及它们所编码的酶如下：

ppc：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶

aspC：天冬氨酸转氨酶

lysC：天冬氨酸激酶III

lysC^*：抑制被脱敏的天冬氨酸激酶III

asd：天冬氨酸半醛脱氢酶

dapA：二氢吡啶二羧酸合成酶

dapA^*：抑制被脱敏的二氢吡啶二羧酸合成酶

dapB：二氢吡啶二羧酸还原酶

DDH：二氨基庚二酸脱氢酶(来自乳发酵短杆菌)

lysA：二氨基庚二酸脱酰基酶

作为每个基因单独导入E.coli的结果，在导入了lysC^*，dapA或dapA^*的菌株中发现L-赖氨酸的产生，并且导入dapA^*的菌株显示出最高的L-赖氨酸产率。根据此结果，发现被dapA催化的反应是第一限速步骤。其次，当L-赖氨酸生物合成系统的每一个基因被导入到已导入dapA^*的菌株中时，lysC^*在提高L-赖氨酸产率上有最大的影响。这样发现lysC催化的反应是第二限速步骤。依同样的方法，发现dapB催化的反应是第三限速步骤，及DDH催化的反应是第四限速步骤。作为研究由dapC，dapD，dapE和dapF取代DDH的催化反应中的限速步骤的结果，发现dapD和dapE与限速有关。

获得E.coli中L-赖氨酸生物合成系统基因以及乳发酵短杆菌的DDH基因的方法将示例如下。

ppc基因能从质粒pS2(Sabe，H.et al.，Gene，31，279(1984))或具有此基因的pT2获得。含有ppc基因的DNA片段通过用AatII和AflII切割pS2获得。含有ppc基因的DNA片段也可通过用SamI和ScaI切割pT2获得。锚定了pT2的E.coliF15菌株(AJ12873)根据Budapest Treaty，以FERM BP-4732存放号存放在National Institute of Bioscience and Human Technology(邮政编码：305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)。

aspc基因能从具有此基因的质粒pLF4(Inokuchi，K.et al.，Nucleic Acids Res.，10，6957(1982))获得。含有Aspc基因的DNA片段通过用PvuII和StuI切割pLF4获得。

asd基因能从具有此基因的质粒pAD20(Haziza，C.et al.，EMBO，l，379(1982))获得。含有asd基因的DNA片段通过用AseI和ClaI切割pAD20获得。

用在已知dapB基因(Bouvier，J.et al.，J.Biol.Chem.，259，14829(1984))寡核苷酸序列的基础上制备的两种寡核苷酸引物(如SEQ ID NO：9，NO：10)，通过PCR方法扩增E.coli的染色体DNA，获得dapB基因。

用在已知谷氨酸棒状杆菌的DDH基因(Ishino，S.et al.，Nucleic Acids Res.，15，3917(1983))寡核苷酸序列的基础上制备的两种寡核苷酸引物(如SEQ IDNO：11，NO：12)，通过PCR方法扩增乳发酵短杆菌属的染色体DNA，获得DDH基因。

用在已知lysA基因(Stragier，P.et al.，J.Mol.Biol.，168，321(1983))寡核苷酸序列的基础上制备的两种寡核苷酸引物(如SEQ ID NO：13，NO：14)，通过PCR方法扩增E.coli的染色体DNA，获得lysA基因。

用在已知dapD基因(Richaud，C.et al.，J.Biol.Chem.，259，14824(1984))寡核苷酸序列的基础上制备的两种寡核苷酸引物(如SEQ ID NO：15，NO：16)，通过PCR方法扩增E.coli W3110菌株的染色体DNA，获得dapD基因。

用在已知dapE基因(Bouvier，J.et al.，J.Bacteriol.，174，5265(1992))寡核苷酸序列的基础上制备的两种寡核苷酸引物(如SEQ ID NO：17，NO：18)，通过PCR方法扩增E.coli DNA，获得dapE基因。

用在已知dapF基因(Richaud，C.et al.，Nucleic Acids Res.，16，10367(1988))寡核苷酸序列的基础上制备的两种寡核苷酸引物(如SEQ ID NO：19，NO：20)，通过PCR方法扩增E.coli染色体DNA，获得dapF基因。

在本发明中，任一种埃希氏杆菌可供用作宿主，只要突变DDPS基因、突变AKIII基因或L-赖氨酸生物合成系统的其它基因的启动子，或细胞内表达这些基因功能的启动子，以及被用作在其细胞内导入功能的载体DNA复制启始区，当突变DDPS基因、突变AKIII基因或L-赖氨酸生物合成系统的其它基因作为染色体外DNA被导入质粒时，这些启动子和复制启始区能够复制。

例如，用产生L-赖氨酸的E.coli，具体地是对L-赖氨酸类似物有抗性的突变株示例。赖氨酸类似物是这样一种物质，它抑制埃希氏杆菌的增殖，但是如果L-赖氨酸共存于培养基中，这种抑制是完全或部分脱敏的。例如，有噁溶菌素、赖氨酸异羟肟酸盐、AEC、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺等等。通过对埃希氏杆菌属微生物应用一般人工突变操作，获得对这些赖氨酸类似物有抗性的突变菌株。用于生产L-赖氨酸的菌株具体地由大肠杆菌AJ11442(以FERM BP-1543和NRRLB-12185编号存放；见Japanese Patent Application Laid-open No.56-18596或UnitedStates Patent No.4,346,170)示例。上面微生物的天冬氨酸激酶中，L-赖氨酸的反馈抑制是被脱敏的。

除此之外，例如，尚有产生L-苏氨酸的微生物作为示例，因为其天冬氨酸激酶被L-赖氨酸的抑制通常在产生L-苏氨酸的微生物中也是被脱敏的。作为大肠杆菌中生产L-苏氨酸的细菌，B-3996株目前已知具有最高的产率。B-3996菌株被存放在Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding的登记号RIA1867下。

根据本发明，用于锚定突变基因的转化体的培养基是一种一般培养基，它含有碳源、氮源、有机离子以及可任意选择的其它有机物。

作为碳源，有可能使用糖，如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解物；醇，如甘油或山梨醇；或有机酸，如富马酸、柠檬酸或琥珀酸。

作为氮源，有可能使用无机铵离子，如硫酸铵、氯化铵或磷酸铵；有机氮，如大豆水解物；氨气；或水合氨。

让需要的物质，如维生素B1和L-异亮氨酸或酵母提取物作为有机微量营养物以合适的数量存在于培养液中是合乎需要的。除以上的物质以外，如果需要加入少量硫酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。

优选在需氧条件下培养16-22小时。培养温度被控制在25℃到45℃，培养过程中pH被控制在5-8。无机或有机物，酸性或碱性物质以及氨气等可被用于pH调节。

从发酵液中收集L-赖氨酸，通常联合使用离子交换树脂法、沉淀法和其它已知的方法来完成。

附图说明

图1 显示pdapA1和pdapA2的制备步骤。

图2 显示L-赖氨酸对野生型和突变DDPS的抑制。

图3 显示用于具有双突变型dapA^*基因的质粒pdapAS824的制备步骤。

图4 显示pLYSC1和pLYSC2的制备步骤。

图5 羟胺处理后转化体的出现比率和突变比率。

图6 显示L-赖氨酸对野生型和突变AKIII的抑制作用。

图7 显示来自有dapA^*24的RSF1010的质粒RSF24P制备步骤。

图8 显示质粒pLLC^*80的制备步骤。

图9 显示来自有dapA^*24和lysC^*80的RSF1010的质粒RSFD80制备步骤。

图10 显示有dapA或dapA^*的质粒pdapA和pdapA^*的结构。

图11 显示有lysC或lysC^*80的质粒plysC和plysC^*的结构。

图12 显示有ppc的质粒pppc的结构。

图13 显示有aspC的质粒paspC的结构。

图14 显示有asd的质粒pasd的结构。

图15 显示有dapB的质粒pdapB的结构。

图16 显示有DDH的质粒pDDH的结构。

图17 显示有lysA的质粒plysA的结构。

图18 显示来自有dapA^*24、lysC^*80和dapB的RSF1010的质粒pCAB1制备步骤。

图19 显示来自有dapA^*24、lysC^*80、dapB和DDH的RSF1010的质粒pCBD2制备步骤。

图20 显示有dapD的质粒pdapD的结构。

图21 显示有dapE的质粒pdapE的结构。

图22 显示有dapF的质粒pdapF的结构。

图23 显示有dapD和dapE的质粒pMWdapDE1的制备步骤。

图24 显示有dapA^*24、lysC^*80、dapB、dapD和dapE的质粒pCABDE1的制备步骤。

具体实施方式

下面参考实施例将更具体地解释本发明。

实施例1：突变DDPS基因的制备

(1)野生型dapA基因的克隆

E.coli的dapA基因核苷酸序列已有报道(Richaud，F.et al.，J.Bacteriol.，297(1986))，且已知其可译框架(ORF)包括876个碱基对并编码包括292个氨基酸残基的蛋白。因为尚不知道此dapA基因是怎样被调控的，只含有SD序列和除启动子区域的ORF区域通过PCR方法被扩增和克隆。

E.coli K-12 MC1061菌株的总基因组DNA用与Saito和Miura(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))一致的方法提取。制备具有SEQ ID NO：1和NO：2所示序列的两种引物，按与Erlich et al.(PCR Technology，Stockton press(1989))一致的方法，用此引物完成PCR反应并扩增靶DNA。获得的DNA被插入到一个商业可购得的克隆载体pCR1000作为PCR片段(从Invitrogen，Ltd.，(California，theUnited States购买))。pCR1000含有一个lacZ启动子(Placz)，出售时处于lacZ启动子下游的一个部位被切开的状态。当通过把PCR片段连接到pCR1000的两个剪切末端之间获得的重组DNA被导入E.coli时，此PCR片段在lacZ启动子的控制下被转录。PCR片段与pCR1000连接后，获得两种质粒，它们是以正常方向连接的质粒pdapA1和以反方向连接的质粒pdapA2，因为dapA的转录方向是就lacZ启动子的转录方向而言的(图1)。

这些质粒被导入DDPS缺陷的E.coli JE7627菌株时，带有被导入质粒的菌株就补足了宿主JE7627对二氨基庚二酸的营养缺陷。因此确定插入到两种质粒的DNA片段含有编码活性DDPS的基因dapA。

通过把pdapA1导入野生型E.coli W3110菌株(从National Institute ofGenetics(Mishima-shi，Shizuoka-ken，Japan))获得的转化菌株被命名为W3110/pdapA1，通过把pdapA2导入E.coli W3110菌株获得的转化菌株被命名为W3110/pdapA2。这两种转化的菌株分别在基本培养基M9中培养，此基本培养基M9由含有加入了AEC作为赖氨酸类似物的下列物质组成。未导入质粒的W3110菌株也在同样的培养基中作为对照培养。这两种转化菌株和不含质粒的W3110菌株的生长被AEC抑制，但是其生长抑制可通过加入L-赖氨酸得到恢复。

(基本培养基M9)

A： (20×M9)

Na₂HPO₄·12H₂O 303g/L

KH₂PO₄ 60g/L

NaCl 10g/L

NH₄Cl 20g/L

B： 1MMgSO₄

C： 50％葡萄糖

D： 1g/L硫胺素

上表中的A、B、C和D被分别灭菌，并按比例A∶B∶C∶D∶水＝5∶0.1∶1∶0.1∶95混合。

(2)突变DDPS基因(dapA^*)的制备

假设一种菌株，它锚定了含编码对L-赖氨酸反馈抑制脱敏DDPS的dapA^*的质粒，能够在加入了足够量AEC的基本培养基M9中生长。那么通过它们对AEC的抗性，可选择出锚定了含dapA^*质粒的菌株。

为了有效地获得dapA^*，在(1)中制备的pdapA1和pdapA2上的dapA接受突变处理。

(1-2-1)用于锚定含dapA^*质粒菌株的选择条件的研究

上述获得的W3110/pdapA1菌株和W3110/pdapA2菌株分别在含不同AEC浓度的M9琼脂平板培养基上培养。检测AEC的生长抑制浓度，研究锚定了含dapA^*质粒的菌株的选择条件。

转化体在含有各种浓度AEC的M9培养基中的生长见表1。在表中，+代表转化体的生长，-代表不生长。

(表1)

AEC浓度 W3110/pdapA1 W3110/pdapA2

(mM)

250 - -

125 - -

60 - -

30 - -

15 + -

8 + +

4 + +

2 + +

pdapA1上dapA基因的转录方向与lacZ启动子的转录方向一致(图1)。因而发现即使dapA保持野生型，pdapA1上的dapA提供对相当高浓度AEC的抗性，因为dapA的表达量被lacZ启动子增加了；而pdapA2上的dapA基因具有较小的表达量并且在较低AEC浓度下便有生长抑制，因为转录方向与lacZ启动子相反，而dapA′s自身的启动子也是缺陷的(W3110/pdapA1株和W3110/pdapA2株分别在加入30mM和1.5mM时受到抑制)。同时加入L-赖氨酸生长抑制消除。

因此，pdapA2用作导入突变的目标。在基本培养基M9中加入60mM AEC制得的培养基用于选择锚定含dapA^*质粒的菌株。此培养基在下面的实施例1中称作“选择培养基”。

(1-2-2)用羟胺对pdapA2体外突变处理

质粒直接用羟胺处理体外突变处理方法，用于把突变导入到pdapA2质粒。

2μg DNA在0.4M羟胺(0.1M KH₂PO₄-1mM EDTA(pH6.0)：100μl，1M羟胺-1mM EDTA(pH6.0)：80μl，DNA：2μg，用水补充到总体积200μl)中于75℃处理1-4小时。处理后的DNA用玻璃粉纯化，导入到E.coli W3110，并被平铺在完全培养基上(L-肉汤：1％细菌培养用蛋白胨，0.5％酵母提取液，0.5％NaCl，1.5％琼脂)，形成克隆。它们在(1-2-1)描述的选择培养基上重复克隆，收集在选择培养基上形成的克隆。两次实验后，在总共36个菌落中获得候选突变质粒。

因而得到总共36个菌株中的候选菌株再点在选择培养基上，确认AEC抗性。

(1-2-3)dapA^*基因的分离和dapA^*产物的研究

突变pdapA2从上面描述的36个菌株中回收。一种dapA-缺陷型菌株JE7627分别用它们和野生型pdapA2转化。从每一个转化的菌株制备无细胞提取物，并测定DDPS的酶活性。

按如下方法制备无细胞提取物(粗酶溶液)。转化的菌株在2×TY培养基(1.6％细菌培养用蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl)中培养，当660nm处光密度(OD660)约0.8时收集。细胞沉淀在0℃条件下用0.85％NaCl洗涤，并悬浮在含400mM KCl的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中。细胞被超声破碎(0℃，200W，10分钟)。破碎的细胞溶液在0℃ 33krpm离心1小时得到上清液，向其中加入硫酸铵至80％饱和度并贮存在0℃过夜，然后离心。沉淀溶解于20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)-400mM KCl中。

DDPS的酶活性依据Yugari等的方法测定(Yugari，Y.and Gilvarg，C.，J.Biol.Chem.，240，4710(1962))。也就是，用分光光度计在37℃，270nm波长以时间-依赖方式，测定有以下组分的反应溶液的吸光度，从而测定产生的二氢吡啶二羧酸酯。无丙酮酸钠的反应系统用做空白。

(反应溶液的组成)

50mM 咪唑-HCl pH7.4

20mM L-天冬氨酸半醛

20mM 丙酮酸钠

酶溶液

水(补足)

总体积1.0ml

在DDPS酶活性的测定过程向酶反应溶液中加入各种浓度的L-赖氨酸，测定出L-赖氨酸的抑制程度。如图2所示，野生型DDPS受L-赖氨酸的抑制。在36种候选质粒中，有三种突变质粒，它们源自转化菌株，与野生型相比，带有的DDPS难以受L-赖氨酸抑制。它们分别被命名为pdapAS8、pdapAS9和pdapAS24。根据下面核苷酸序列的测定，显示出pdapAS8和pdapAS9有相同的突变。

受L-赖氨酸抑制的脱敏程度在三种被pdapAS8、pdapAS9和pdapAS24编码的突变DDPS中有所不同，然而，在所有三种菌株中受L-赖氨酸抑制是脱敏的。尽管酶的比活性可能受细胞生长环境和样品制备的影响，但是发现与野生型相比，任何情况下降低很少。所以，据此判断作为繁殖材料它们不会引起实质问题。

(1-2-4)突变dapA基因核苷酸序列的测定

通过DNA序列分析仪ABI Model 373A(Applied Biosystems Inc.生产)，按照一般方法测定突变dapA基因核苷酸序列。结果表明，在SEQ ID NO：3所示的野生型dapA基因的序列中，pdapAS8和pdapAS9的第487位的C变成了T，pdapAS24的第597位的C变成了T。因此，可见在SEQ ID NO：4所示DDPS的氨基酸序列中，pdapAS8和pdapAS9编码的DDPS中第81位丙氨酸残基变成了缬氨酸残基，pdapAS24编码的DDPS中第118位组氨酸残基变成了酪氨酸残基。

(1-2-5)双突变dapA的制备

如上所述获得两种突变dapA基因。为了证实附加于这些突变的抑制的脱敏是否起作用，制备含有带两种突变的突变dapA质粒。制备的步骤示于图3。获得的双突变质粒命名为pdapAS824。

实施例2：突变AKIII基因的制备

(1)野生型lysC基因的克隆

E.coli AKIII基因(lysC)的核苷酸序列已有报道(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，261，1052(1986))，且已知其可译框架(ORF)包括1347个碱基对，并编码包括449个氨基酸残基的蛋白。在这个基因中，存在一个操纵子，它受L-赖氨酸的抑制。所以为了去掉此操纵子区域，用PCR方法扩增和克隆仅含一个SD序列和ORF的区域。

E.coli K-12 MC1061菌株的总基因组DNA按照Saito和Miura(Biochem.Biophys.Acta.，72 619(1963))的方法来制备。具有在SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列的两种引物被制备出来，按照Erlich等(PCR Technology，Stocktonpress(1989))的方法完成PCR反应，扩增lysC基因。得到的DNA用BamHI和AseI消化，然后平头，插入到多拷贝载体pUC18的SmaI位点。此SmaI位点位于载体的lacZ启动子的下游端，当通过把DNA片段插入到pUC18的SmaI位点获得的重组DNA被导入E.coli时，插入的DNA片段在lacZ启动子的控制下通过通读方式转录。PCR片段插入到pUC18的SmaI位点，获得两种质粒，它们是以反方向插入的质粒pLYSC1和以正常方向插入的质粒pLYSC2，lysC的转录方向是根据lacZ启动子的转录方向而定的(图4)。

当这些质粒用于转化对AKI、II、III完全缺陷的E.coli GT3(thrA1016b，metLM1005，lysC1004)时，GT3对高丝氨酸和二氨基庚二酸的营养缺陷被补足。所以确定插入两种质粒的DNA片段含有编码活性AKIII的基因lysC。

将pLYSC1导入AK完全缺陷的菌株E.coli GT3而得到转化菌株命名为GT3/pLYSC1，将pLYSC2导入E.coli GT3而得到转化菌株命名为GT3/pLYSC2。相当数量的L-赖氨酸加入到基本培养基M9中，分别培养GT3/pLYSC1和GT3/pLYSC2菌株。两种GT3/pLYSC1和GT3/pLYSC2菌株均锚定了含有野生型lysC的质粒，其中质粒上lysC编码的AKIII是唯一的AK。作为唯一AK的野生型AKIII，在相当量的L-赖氨酸存在时受L-赖氨酸的抑制。所以此两种菌株不能合成L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸和二氨基庚二酸(DAP)，生长受到抑制。

(2)突变AKIII基因(lysC^*)的制备

假设一种菌株，它锚定了含有编码对L-赖氨酸反馈抑制脱敏AK的lysC^*的质粒，能够在加入了相当多量L-赖氨酸的基本培养基M9中生长。通过菌株对L-赖氨酸或作为L-赖氨酸类似物的AEC的生长抑制，选择出锚定了含lysC^*质粒的菌株。

为了有效地获得lysC^*，对(1)中制备的pLYSC1和pLYSC2上的lysC^*进行突变处理。

(2-2-1)对锚定了含lysC^*质粒的菌株的选择条件研究

GT3/pLYSC1菌株和GT3/pLYSC2菌株分别在含不同浓度L-赖氨酸或AEC的M9琼脂平板培养基上培养。检测L-赖氨酸或AEC的生长抑制浓度，研究锚定了含lysC^*质粒的菌株的选择条件。

转化体在含有各种浓度L-赖氨酸或AEC的M9培养基中的生长见表2。在表中，+表示转化体的生长，(表示略微生长，-表示不生长。

表2

生长和L-赖氨酸浓度

0 0.2 0.4 0.8 1.5 3 6 12 25 50 100 200(mM)

GT3/pLYSC1 + - - - - - - - - - - -

GT3/pLYSC2 + + + + + + + + + + ± -

生长和AEC浓度

0 0.2 0.4 0.8 1.5 3 6 12 25 50(mM)

GT3/pLYSC1 + - - - - - - - - -

GT3/pLYSC2 + ± ± ± ± ± - - - -

pLYSC2中lysC基因的转录方向与lacZ启动子的转录方向一致(图4)。因此发现即使lysC保持野生型，pLYSC2中的lysC基因仍对相当浓度的L-赖氨酸和AEC具抗性，因为其表达量被lacZ启动子增加；而pLYSC1中的lysC基因表达量较小，对较低浓度的L-赖氨酸和AEC具抗性，因为其转录方向与lacZ启动子方向相反，并且其自身的启动子也缺陷(GT3/pLYSC2菌株在加入100mM L-赖氨酸或3mM AEC时生长不受抑制，而GT3/pLYSC1菌株在加入0.2mM L-赖氨酸或AEC时生长被完全抑制)。已证明同时加入高丝氨酸和二氨基庚二酸可消除生长抑制。

因此，pLYSC1用于导入突变实验，加入10mM L-赖氨酸或0.2mM AEC的基本培养基M9用于选择含lysC^*的锚定质粒菌株。此培养基在下面的实施例2中称作“选择培养基”。

(2-2-2)用羟胺对pLYSC1体外突变处理

两种方法用于导入pLYSC1质粒的突变，它们是直接用羟胺处理质粒的体外突变处理方法，以及一种附加体内突变处理方法，在后一种方法中，锚定了质粒的细胞用亚硝基胍(NTG)处理，随后提取质粒以提供突变的多样性，即得到不同于用羟胺处理时从胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变。

(用羟胺体外突变处理)

2μg DNA在0.4M羟胺(0.1M KH₂PO₄-1mM EDTA(pH6.0)：100μl，1M羟胺-1mM EDTA(pH6.0)：80μl，DNA：2μg，用水补充到总体积200μl)中于75℃处理1-4小时。处理后的DNA用玻璃粉纯化，导入到AK完全缺陷型菌株E.coli GT3菌株，并被平铺在完全培养基上(L-肉汤：1％细菌培养用蛋白胨，0.5％酵母提取液，0.5％NaCl，1.5％琼脂)，形成克隆。它们在(2-2-1)描述的选择培养基上重复克隆，能够在选择培养基上生长的菌株选作候选菌株。转化体的出现比例和突变比例发现如图5所示那样进行。经过4小时处理，突变株以0.5-0.8％的相当高比例获得。

(体内NTG突变处理)

pLYSC1被导入E.coli MC1061中，对完整细胞进行NTG处理。处理后的细胞培养过夜以固定突变，然后提取质粒并导入到E.coli GT3中。即转化的菌株在2×TY培养基(1.6％细菌培养用蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl)中培养，当660nm(OD660)处光密度约0.3时收集，用下述TM缓冲液洗涤，然后悬浮于NTG溶液(NTG以0.2mg/ml的浓度溶解在TM缓冲液中)，并在37℃处理0-90分钟。细胞用TM缓冲液和2×TY培养液洗涤，然后在2×TY培养液中培养过夜以固定突变。随后从细胞中提取质粒DNA，并导入到E.coli GT3菌株。候选菌株的筛选用与体外突变相同的方式完成，得到赖氨酸抗性(Lys^R)和AEC抗性(AEC^R)的突变株。

(TM缓冲液)

Tris 50mM

马来酸 50mM

(NH₄)₂SO₄ 1g/L

MgSO₄·7H₂O 0.1g/L

Ca(NO₃)₂ 5mg/L

FeSO₄·7H₂O 0.25mg/L

pH用NaOH调至6.0。

如上所述获得的共180株候选菌株(羟胺处理：48株；NTG处理：132株)再次点在选择培养基上，得到153个AEC和L-赖氨酸抗性菌株。根据培养基内氨基酸聚集类型的不同，这153个菌株被分成14组，从每组选择代表性的菌株后，测定AK活性。通过羟胺处理得到的突变菌株和通过NTG处理得到的突变菌株，在AK活性上没有大的差异。所以以下的实验不对它们加以区分。

(2-2-3)lysC^*基因的分离和对lysC^*产物的研究

No.24，No.43，No.48，No.60，No.80，No.117，No.126，No.149，No.150，No.156，No.158，No.167，No.169和No.172被选择作为上面提到的14组的代表菌株。来自pLYSC1的突变质粒从每一个菌株中回收并分别被命名为pLYSC1^*24，pLYSC1^*43、pLYSC1^*48，pLYSC1^*60，pLYSC1^*80，pLYSC1^*117，pLYSC1^*126，pLYSC1^*149，pLYSC1^*150，pLYSC1^*156，pLYSC1^*158，pLYSC1^*167，pLYSC1^*169和pLYSC1^*172。用它们和野生型pLYSC1转化AK完全缺陷菌株GT3。从每一个转化的菌株制备无细胞提取液，并测定AKIII的酶活性。

按如下方法制备无细胞提取物(粗酶溶液)。转化的菌株在2×TY培养基中培养，当660nm处光密度(OD660)约0.8时收集。细胞在0℃条件下用0.02MKH₂PO₄(pH 6.75)-0.03M β-巯基乙醇洗涤，细胞超声破碎(0℃，100W，30分钟×4)。破碎的细胞溶液在0℃ 33krpm离心1小时得到上清液，向其中加入硫酸铵至80％饱和度。离心后，沉淀溶解于0.02M KH₂PO₄(pH 6.75)-0.03Mβ-巯基乙醇中，并贮存在0℃过夜。

AKIII的酶活性依据Stadtman等的方法测量(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.，和Ribichon-Szulmajster，H.，J.Biol.Chem.，236，2033(1961))。即具有以下组成的反应溶液在27℃保温45分钟，加入FeCl₃溶液(2.8N HCl 0.4ml+12％TCA 0.4ml+5％FeCl₃(6H₂O/0.1N HCl 0.7ml)至出现颜色，离心后测定上清液在540nm处的吸光度。活性由每分钟产生的异羟肟酸的量表示(1U＝1(mol/min)。摩尔吸光系数为600。反应溶液中除去天冬氨酸钾用做空白。

(反应溶液的组成)

反应混合物^*1 0.3ml

羟胺溶液^*2 0.2ml

0.1M天冬氨酸钾(pH 7.0)0.1ml

酶溶液

水(补足)

总体积1.0ml

^*1：1M Tris-HCl(pH 8.1)9ml+0.3M MgSO₄ 0.5ml+0.2M ATP(pH 7.0)5ml

^*2：8M羟胺溶液用前用KOH中和。

不同浓度的L-赖氨酸加入到酶反应溶液中以测定AK的酶活性，并检查L-赖氨酸的抑制程度。结果示于图6和表3。野生型和Nos.24，43，48，60，80，117和126示于图6A。Nos.149，150，156，158，167，169和172示于图6B。

如这些结果所示，野生型AKIII受L-赖氨酸的强烈抑制，L-赖氨酸约0.45mM时被抑制50％，5mM时被100％抑制。相反此时获得的突变AKIII具有不同程度的脱敏，然而L-赖氨酸的抑制在所有14种菌株中被脱敏。特别就Nos.24，80，117，169和172来说，甚至在100mM的L-赖氨酸几乎观察不到抑制，与野生型的相比，它们具有不少于200倍的50％-抑制浓度。可能受细胞生长条件和样品制备影响的每一种蛋白的比活性，在几乎所有情况，等于或大于野生型的比活性，其中导入突变所致的活性降低几乎没有问题(表3)。根据这一事实，推测AKIII的活性中心与L-赖氨酸的调节位点相互独立。表3中，抑制的脱敏程度(％)指100mM L-赖氨酸存在时AK的活性与反应溶液中无L-赖氨酸时AK活性的比值。热稳定性(％)指55℃处理1.5小时后的活性保持率。

表3

比活性(U/mg蛋白) 抑制的脱敏程度(％)^*1 热稳定性(％)^*2

Wild type 0.0247 0 18

No.117 0.0069 120 0

No.24 0.0218 100 30

No.80 0.0244 99 36

No.172 0.0189 97 0

No.169 0.0128 96 2

No.150 0.0062 77 25

No.126 0.0250 61 39

No.149 0.0256 59 9

No.167 0.0083 43 45

No.48 0.0228 38 42

No.60 0.0144 35 9

No.158 0.0224 22 42

No.156 0.0101 18 2

No.43 0.0212 17 0

^*1：100mM L-赖氨酸存在时AK的活性与元L-赖氨酸时AK活性的比值(％)

^*2：55℃处理1.5小时后的活性保持率(％)

随后检查突变酶的热稳定性。当试图改良酶以增加其活性时，所产生的酶在细胞内稳定保持是重要的。因为细胞内和细胞外蛋白酶活性的差异以及体外贮藏酶缓冲液的影响，体外测定存在一些问题。然而，为了方便，把体外研究突变AKIII的热稳定性作为一个参数。

从在不同条件下AKIII的失活温度研究的结果评估，测定55℃处理90分钟后活性保持的比率。如表3所示，有一半的酶比野生型好的多。一般地，突变酶与野生型相比常常是不稳定。然而，此次得到的一些突变AKIII酶在稳定性上优于野生型，并且实际应用中，多数对L-赖氨酸的生产相当有用。

(2-2-4)野生型lysC和突变lysC碱基序列的测定

此次获得的野生型lysC基因的核苷酸序列，依照一般方法用DNA序列仪ABIModel 373A(Applied Biosystems Inc.生产)测定(SEQ ID NO：7)。与已经发表的E.coli K-12 JC411菌株lysC的序列(Cassan，M.，Rarsot，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，261，1052(1986))相比，在六个位点发现差异(在氨基酸水平有两个位置)。预测六个位点的差异是由于所用菌株的不同。

按同样的方式，对存在于14种突变pLYSC1菌株中的lysC^*的碱基序列进行测定，并阐明其突变位点。结果示于表4。在此表中，圆括号中的表示基于核苷酸突变的氨基酸残基的突变。突变形式有12种，因为在14种菌株中有两组(No.4和No.167，No.24和No.80)具有完全一样的突变类型。关于突变类型，Nos.149，150，156，158，167，169和172经羟胺处理得到，Nos.24，43，48，60，80，117和126经NTG处理得到。然而，至于突变形式，任何一种突变都归属于从胞嘧啶到胸腺嘧啶突变，或由于非编码链上从胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变而造成的编码链上从鸟嘌呤到腺嘌呤突变。

表4：lysC^*突变点的测定

LysC^*突变类型诱变剂突变点(氨基酸变化)

No.126 N GGT-GA^*T(³²³Gly-Asp)

No.43 N GGT-GA^*T(³²³Gly-Asp)

GGC-GA^*C(⁴⁰⁸Gly-Asp)

No.149 H CGT-T^*GT(³⁴Arg-Cys)

GGT-GA^*T(³²³Gly-Asp)

No.48/167 N/H CTC-T^*TC(³²⁵Leu-Phe)

No.150 H ATG-ATA^*(³¹⁸Met-Ile)

No.172 H ⁷⁷⁵C-T(silent)

ATG-ATA^*(³¹⁸Met-Ile)

GTG-A^*TG(³⁴⁹Val-Met)

No.117 N TCA-TT^*A(³⁴⁵Ser-Leu)

No.158 H GTG-A^*TG(³⁴⁷Val-Met)

No.24/80 N/N ACC-AT^*C(³⁵²Thr-Ile)

No.169 H ⁹²³C-T(silent)

ACC-AT^*C(³⁵²Thr-Ile)

TCT-TT^*T(³⁶⁹Ser-Phe)

No.60 N ⁸⁵⁹G-A(silent)

GAA-A^*AA(¹⁶⁴Glu-Lys)

No.156 H ATG-ATA^*(⁴¹⁷Met-Ile)

TGT-TA^*T(⁴¹⁹Cys-Tyr)

²⁰¹⁴C-T(silent)

^*：H；羟胺处理，N；NTG处理。

实施例3：用导入了dapA ^* 的菌株发酵生产L-赖氨酸

为了用E.coli生产L-赖氨酸，如在日本专利申请Laid-open No.56-18596，美国专利No.4,346,170和Applied Microbiology and Biotechnology，15，227-231(1982)指出的，用于增强DDPS的宿主有天冬氨酸激酶是必需的，其中此激酶被改变为不受L-赖氨酸抑制。产生L-苏氨酸的细菌可作为这样的菌株示例。因为产生L-苏氨酸的E.coli，在目前已知的菌株中B-3996具有最高的产率。所以B-3996菌株被用作判定dapA^*的宿主。B-3996菌株染色体外锚定作为唯一质粒的pVIC40。详细情况见日本专利Laid-open No.3-501682(PCT)。此微生物被存放在Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding的登记号RIA1867下。

另一方面，存在于pdapAS24(其中第118位组氨酸残基被酪氨酸残基取代)的dapA^*被选作导入E.coli的dapA^*，从抑制的脱敏程度和酶的比活性来判定。首先，为了增加dapA^*的表达量和质粒的稳定性，已存在于pdapAS24的突变dapA^*(此后称作“dapA^*24”)连接到pVIC40的四环素抗性基因启动子的下游，获得的RSF24P如图7所示。

通过把质粒RSF24P导入到Ecoli JM109菌株而获得的菌株命名为AJ12395，它于1993年10月28日存放在National Institute of Bioscience and HumanTechnology of Agency of Industrial Science and Technology，以FERM P-13935号登记，在1994年11月1日根据Budapest Treaty从原存放处转移到国际存放处，并以FERM BP-4858号登记存放。锚定pdapAS8和pdapAS9的菌株未存放。然而，如上所述，在每一个质粒上dapA^*的所有突变点已被阐明。所以用Maniatis等(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular Cloning，Cold Spring harborLaboratory Press，1.21(1989))的方法，从上面所述存放细菌回收质粒，对那些本领域的技术人员是容易的，并通过定位诱变方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular Cloning，Cold Spring harbor Laboratory Press，15.63(1989))获得目标基因。

根据一般方法从B-3996菌株去掉pVIC40，B-399菌株作为无质粒菌株被得到。根据一般方法把质粒RSF24P导入到B-399菌株并获得B-99/RSF24P。判定B-399/RSF24P的L-赖氨酸产率。

另一方面，RSFP作为一个对照质粒被构建。也就是说，从如图7所示用BamHI和DraI双消化pVIC40得到的消化物中选出大的片段，并用DNA聚合酶Klenow片段对其平头。被平头的大片段自连接获得质粒RSFP。根据一般方法把RSFP导入到B-399菌株并获得B-399/RSFP。对B-399/RSFP也判定L-赖氨酸产率。

在48小时的培养时间和37℃温度条件下，用以下培养基，在114-116rpm的振荡中完成培养。结果示于表5。

(用于L-赖氨酸生产的培养基)

A：(NH₄)₂SO₄ 16g/L

KH₂PO₄ 1g/L

MgSO₄·7H₂O 1g/L

FeSO₄.7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·5H₂O 0.01g/L

酵母提取物(Difco) 2g/L

L-蛋氨酸 0.5g/L

L-苏氨酸 0.1g/L

L-异亮氨酸 0.05g/L

pH用KOH调到7.0，115℃高压灭菌10分钟。

(16/20体积)

B：20％葡萄糖(115℃高压灭菌10分钟)

(4/20体积)

C：药典CaCO₃(180℃干热灭菌2天)

(30g/L)

A和B以A∶B＝4∶1的比例混合，30g C加入到1L的混合物中并溶解，加入抗生素(链霉素：100μg/ml，卡那霉素：5μg/ml)。

表5

菌株 L-赖氨酸盐酸盐的产量

B-399/RSF24P 4.1g/L

B-399/RSFP 0g/L

实施例4：用导入了dapA ^* 和lysC ^* 的菌株发酵生产L-赖氨酸(I)

突变DDPS对L-赖氨酸产率的影响示于实施例3。为了得到进一步的改进，在实施例2中得到的突变AKIII基因允许与突变DDPS基因共存。与突变DDPS基因共存的突变AKIII基因选自No.80菌株(lysC^*80)，由酶活性、热稳定性等判定。

lysC^*80从质粒pLLC^*80(图8)切除后被使用，pLLC^*80通过在质粒HSG399的lacZ启动子的下游交替连接已存在于pLYSC1^*80的lysC^*制备(此后称作″lysC^*80″)，pHSG399(由Takara Shuzo Co.Ltd.生产)相对PUC18具有反向插入位点以增加lysC^*的表达量。pLLC^*80是一种为重排lysC^*80使其转录方向与lacZ启动子一致而制备的质粒，目的是改进L-赖氨酸的产率，因为pLYSC1^*80中lysC^*80的转录方向与lacZ启动子方向相反。

在示于图9的实施例3中，具有dapA^*和lysC^*的质粒RSFD80从pLLC^*80和RSF24P制备。RSFD80包括dapA^*24和lysC^*80，为使转录方向与tetP一致，它们排列于四环素抗性基因启动子(tetP)的下游。

RSFD80质粒被导入到E.coli JM109菌株，它被命名为AJ12396。AJ12396于1993年10月28日存放在National Institute of Bioscience and Human Technologyof Agency of Industrial Science and Technology，以FERM P-13936登记，在1994年11月1日根据Budapest Treaty从原存放处转移到国际存放处，并以FERMBP-4859号登记存放。锚定pLYSC1^*24，pLYSC1^*43，pLYSC1^*48，pLYSC1^*60，pLYSC1^*117，pLYSC1^*126，pLYSC1^*149，pLYSC1^*150，pLYSC1^*156，pLYSC1^*158，pLYSC1^*167，pLYSC1^*169和pLYSC1^*172的菌株未存放。然而，如上所述，在每一个质粒上lysC^*的所有突变点已被阐明。所以用Maniatis等(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular Cloning，Cold Spring harbor Laboratory Press，1.21(1989))的方法，从上述存放细菌回收质粒，对那些本领域的技术人员是容易的，通过定位诱变方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，MolecularCloning，Cold Spring harbor Laboratory Press，15.63(1989))获得目标基因。用一般方法把RSFD80导入到B-399菌株并获得B-399/RSFD80。判定B-399/RSFD80的L-赖氨酸产率。作为对照，也评价B-399/RSFP的L-赖氨酸产率。

在48小时的培养时间和37℃温度条件下，用实施例3中L-赖氨酸生产的同样培养基，在114-116rpm的振荡中完成培养。结果示于表6。

表6

菌株 L-赖氨酸盐酸盐的产量

B-399/RSFD80 9.2g/L

B-399/RSFP 0g/L

实施例5：用导入了dapA ^* 和lysC ^* 的菌株发酵生产L-赖氨酸(II)

在实施例4中已经证实，L-赖氨酸的产率可以通过让埃希氏杆菌锚定突变dapA基因和突变lysC基因得以改善。进行实验以证实当宿主被改变时，这一作用是否被保持。

E.coli W3110(tyrA)菌株被用作宿主。在European Patent PublicationNo.488424/92中对W3110(tyrA)菌株有详细的描述。下面将对它的制备方法作简要描述。E.coli W3110菌株从National Institute of Genetics(Mishima-shi，shizuoka-ken，Japan)获得。此菌株铺于含链霉素的LB平板上，通过选取形成克隆的菌株得到链霉素抗性菌株。选择出的链霉素抗性株与E.coli K-12 ME8424菌株混合，并于37℃条件下，在完全培养基(L-肉汤：1％细菌培养用蛋白胨，0.5％酵母提取液，0.5％NaCl)中静止培养15分钟以诱导结合。E.coli K-12ME8424菌株具有(HfrPO45，thi，relA1，tryA∷Tn10，ung-1，nadB)的遗传特征，它可从National institute of Genetics得到。

然后培养物铺在含链霉素、四环素和L-酪氨酸的完全培养基(L-肉汤：1％细菌培养用蛋白胨，0.5％酵母提取液，0.5％NaCl，1.5％琼脂)上，选取形成克隆的菌株。此菌株被命名为E.coli W3110(tyrA)菌株。

顺便一提，European Patent Publication No.488424/92描述了许多质粒导入W3110(tyrA)菌株形成的菌株。例如，导入质粒pHATerm获得的菌株被命名为E.coli W3110(tyrA)/pHATerm菌株，存放在National Institute of Bioscience andHuman Technology of Agency of Industrial Science and Technology，给定的登记号为FERM BP-3653。W3110(tyrA)菌株也可以通过从E.coli W3110(tyrA)/pHATerm菌株上清除质粒pHATerm获得。质粒的清除可根据一般方法完成。

在实施例4中得到的含dapA^*和lysC^*两者的质粒RSFD80被导入到如上获得的W3110(tyrA)，得到W3110(tyrA)/RSFD80。评价W3110(tyrA)/RSFD80的L-赖氨酸的产率。作为对照，RSFP按一般方法被导入到W3110(tyrA)菌株，并获得W3110(tyrA)/RSFP。对作为对照的W3110(tyrA)/RSFP也评价L-赖氨酸产率。

在48小时的培养时间和37℃温度条件下，用上面提到的用于L-赖氨酸生产的培养基，在114-116rpm的振荡中完成培养。结果示于表7。

表7

菌株 L-赖氨酸盐酸盐的产量

W3110(tyrA)/RSFD80 8.9g/L

W3110(tyrA)/RSFP 0g/L

实施例6：L-赖氨酸生物合成系统的限速步骤的分析和产生L-赖氨酸的埃希氏杆菌在L-赖氨酶产率上的改进

通过分析E.coli的L-赖氨酸生物合成系统的限速步骤和增强催化这些步骤的酶的基因，试图改进L-赖氨酸的产率。

(1)第一限速步骤的鉴定

(6-1-1)L-赖氨酸生物合成系统基因的制备

通过分离L-赖氨酸生物合成系统的各种基因、将这些基因导入E.coli并检测每一个基因对L-赖氨酸产率的影响，来鉴定限速步骤。导入的适合于L-赖氨酸生物合成系统的酶的基因以及被它们编码的酶如下。

ppc：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶

aspC：天冬氨酸转氨酶

lysC：天冬氨酸激酶III

lysC^*80：抑制脱敏的天冬氨酸激酶III

asd：天冬氨酸半醛脱氢酶

dapA：二氢吡啶二羧酸合成酶

dapA^*24：抑制脱敏的二氢吡啶二羧酸合成酶

dapB：二氢吡啶二羧酸还原酶

DDH：二氨基庚二酸脱氢酶(来自乳发酵短杆菌)

lysA：二氨基庚二酸脱酰基酶

从磷酸烯醇丙酮酸到L-赖氨酸的L-赖氨酸生物合成系统可由上面描述的基因完全包括。在原本E.coli具有的L-赖氨酸生物合成系统的基因中，dapC，dapD，dapE和dapF基因被编码乳发酵短杆菌DDH(二氨基庚二酸脱氢酶)的DDH基因取代，它能自身催化涉及这些基因产物的反应。E.coli K-12系列的W3110(tyrA)菌株被用作导入这些基因的宿主。

dapA和dapA^*24基因分别通过用EcoRI和KpnI(图10)从pdapA2和pdapAS24(见实施例1)切割获得。这些基因与被EcoRI和KpnI消化的pMW118连接得到pdapA和pdapA^*。lysC和lysC^*80基因分别通过用EcoRI和SphI从pLYSC1和pLLC^*80(见实施例2)切割获得。这些基因与被EcoRI和SphI消化的pMW119连接得到plysC和plysC^*(图11)。

ppc基因从有此基因的质粒pT2获得。pT2用SmaI和ScaI切割，平头末端，随后插入到pMW118的SmaI位点得到质粒pppC(图12)。锚定pT2的E.coliF15(AJ12873)存放在National Institute of Bioscience and Human Technology ofAgency of Industrial Science and Technology，以FERM BP-4732号登记。

aspC基因从具有此基因的质粒pLF4(Inokuchi，K.et al.，Nucleic Acids Res.，10，6957(1982))获得(图13)。pLF4被PvuII和StuI切割，平头末端，随后插入到pMW119的SmaI位点得到质粒paspC。

asdC基因从具有此基因的质粒pAD20(Haziza，C.et al.，EMBO，1，379(1982))获得。pAD20被AseI和ClaI切割，平头末端，随后插入到pMW118的SmaI位点得到质粒pasd(图14)。

用基于已知dapB基因核苷酸序列(Bouvier，J.et al.，J.Biol.Chem.，259，14829(1984))(图15) 制备的两种寡核苷酸引物(SEQ ID NO：9，NO：10)，通过PCR方法，从E.coli W3110菌株的染色体DNA扩增dapB基因得到dapB基因。得到的扩增DNA片段用AseI和DraI切割，平头末端，随后插入到pMW119的SmaI位点得到质粒pdapB。

用基于已知谷氨酸棒状杆菌(Ishino，S.et al.，Nucleic Acids Res.，15，3917(1987))的DDH基因核苷酸序列制备的两种寡核苷酸引物(SEQ ID NO：11，NO：12)，通过PCR方法，从乳发酵短杆菌的染色体DNA扩增DDH基因得到DDH基因。得到的扩增DNA片段用EcoT22I和AvaI切割，平头末端，随后插入到pMW119的SmaI位点得到质粒pDDH(图16)。

用基于已知lysA基因核苷酸序列(Stragier，P.et al.，J.Mol.Biol.，168，321(1983))制备的两种寡核苷酸引物(SEQ ID NO：13，NO：14)，通过PCR方法，lysA基因从E.coli W3110菌株的染色体DNA扩增lysA基因而得到。得到的扩增DNA片段用SplI和BclI切割，平头末端，随后插入到pMW118的SmaI位点得到质粒plysA(图17)。

通过用图中所示的限制酶切割来证实上面提到的每一个基因被克隆这一事实。用于克隆这些基因的载体pMW118和pMW119(经Nippon Gene生产)因为能够在E.coli细胞中与作为载体用于下述赖氨酸生产的质粒制备的RSF1010共存，并也具有稳定的分布机制而被选出。

(6-1-2)带有L-赖氨酸生物合成系统导入基因的E.coli的L-赖氨酸产率

E.coli W3110(tyrA)用含有上面描述的L-赖氨酸生物合成系统基因的每一个质粒转化，培养得到的转化体以进行L-赖氨酸生产。在培养温度37℃和114-116rpm的振荡条件下，用以下培养基，培养30小时。结果示于表8。

(培养基组成)

葡萄糖40g/L

MgSO₄·7H₂O 1g/L

(NH₄)₂SO₄ 16g/L

KH₂PO₄ 1g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·5H₂O 0.01g/L

酵母提取物(Difco) 2g/L

L-酪氨酸 0.1g/L

pH用KOH调到7.0，115℃高压灭菌10分钟(葡萄糖和MgSO₄·7H2O分别灭菌)。

药典CaCO₃ 25g/L

(180℃干热灭菌2天)

抗生素

(根据被导入质粒的种类，用链霉素20mg/L或氨苄青霉素50mg/L)

表8

菌株 L-赖氨酸盐酸盐的产量相对糖的产量(％)

W3110(tyrA) 0.08 0.2

W3110(tyrA)/pppc 0.08 0.2

W3110(tyrA)/paspC 0.12 0.3

W3110(tyrA)/plysC 0.08 0.2

W3110(tyrA)/plysC^* 2.27 5.57

W3110(tyrA)/pasd 0.12 0.3

W3110(tyrA)/pdapA 2.32 5.70

W3110(tyrA)/pdapA^* 3.63 8.90

W3110(tyrA)/pdapB 0.08 0.2

W3110(tyrA)/pDDH 0.08 0.2

W3110(tyrA)/plysA 0.12 0.3

plysC^*、pdapA或pdapA^*的导入使E.coli W3110(tyrA)变为产生L-赖氨酸。由于lysC产物和dapA产物两者都受L-赖氨酸的反馈抑制，可以推测这些酶在L-赖氨酸生物合成中是主要的调节点。被dapA产物催化的反应存在于L-苏氨酸、L-蛋氨酸和L-异亮氨酸生物合成系统以及L-赖氨酸生物合成系统的旁路位置，是L-赖氨酸固有生物合成系统的第一步。已有报道通过野生型dapA(Eur.J.Appl.Microbiol.biotechnol.，15，227(1982))的扩增，E.coli也能变成产生L-赖氨酸，这也已经从上述的结果得到证实。另一方面，因为当dapA^*作为抑制脱敏型基因被导入E.coli时，L-赖氨酸的产率被进一步提高，所以实施例3的结果再次得到证实。

以如实施例1中同样方法，从W3110(tyrA)，W3110(tyrA)/pdapA和W3110(tyrA)/pdapA^*中制备粗酶溶液，测定DDPS(二氢吡啶二羧酸合成酶)活性，并检测DDPS活性被L-赖氨酸抑制的程度。结果示于表9。

表9

菌株比活性×1 抑制的脱敏程度×2

W3110(tyrA) 0.0423 50

W3110(tyrA)/pdapA 0.2754 22.9

W3110(tyrA)/pdapA^* 0.1440 76.5

×1：(mols/min/mg蛋白)

×2：5mM L-赖氨酸存在时活性保持率(％)

抑制脱敏的dapA^*产物可能对L-赖氨酸生产有大的影响，因为它具有高抑制脱敏度，尽管它比野生型酶的比活性低(约1/2)。dapA产物的抑制脱敏作用的必要性在L-赖氨酸生产中表现出来。

另外，lysC^*对L-赖氨酸生产有影响这一事实可以考虑如下。第一速度限定步骤是一步其中HD(高丝氨酸脱氢酶：thrA或metLM的产物)与DDPS(dapA产物)竞争，以获得ASA(天冬氨酸-β-半醛)作为底物供给生物合成系统的旁路点，并且当dapA如上述被增强时，反应向L-赖氨酸生物合成的方向进行。另一方面，推测当ASA的供给量通过增强参与dapA更上游反应的lysC而增加时，与HD和DDPS有关的任一反应也得到促进，因而L-赖氨酸的产量也得以提高。然而，仅通过野生型lysC的增强极少获得此作用。这可能因为野生型AKIII(1ysC产物)受L-赖氨酸的抑制比野生型DDPS(5mM的L-赖氨酸存在时，AKIII和DDPS分别被抑制100％和80％)所受抑制更严格。

根据上述事实，可以判定通过具有较高赖氨酸生产效力的DDPS的反应是第一速度限定步骤，并推测通过AKIII的反应是第二速度限定步骤。

(2)第二速度限定步骤的鉴定

第二速度限定步骤通过增强导入dapA^*的菌株中L-赖氨酸生物合成系统的各种基因得到鉴定。为了使其它质粒当被导入锚定了含dapA^*的E.coli时能稳定地锚定，把dapA^*从dapA转移到RSF1010，并获得RSF24P(图7)。E.coli W3110(tyrA)被具有dapA^*的质粒RSF24P转化。

具有L-赖氨酸生物合成系统的基因质粒被导入E.coli W3110(tyrA)/RSF24P。两种质粒，即RSF24P和含L-赖氨酸生物合成系统的另一基因的质粒，在获得的每一个转化体中共存。用如(6-1-2)中相同的方法检查这些菌株的L-赖氨酸产率。结果示于表10。

表10

菌株 L-赖氨酸盐酸盐产量(g/L) 相对糖的产量(％)

W3110(tyrA)/RSF24P 3.63 8.9

W3110(tyrA)/RSF24P+pppc 3.67 9.0

W3110(tyrA)/RSF24P+paspC 3.59 8.8

W3110(tyrA)/RSF24P+plysC 3.42 8.4

W3110(tyrA)/RSF24P+plysC^* 9.17 22.5

W3110(tyrA)/RSF24P+pasd 3.75 9.2

W3110(tyrA)/RSF24P+pdapA 3.55 8.7

W3110(tyrA)/RSF24P+pdapA^* 3.46 8.5

W3110(tyrA)/RSF24P+pdapB 4.08 10.0

W3110(tyrA)/RSF24P+pDDH 3.67 9.0

W3110(tyrA)/RSF24P+plysA 3.55 8.7

结果仅在lysC^*发现了L-赖氨酸产率的显著增强效果。野生型lysC完全无效。如上所述，这可能因为L-赖氨酸的抑制是强烈的。所以证实了由lysC^*参与的反应是第二速度限定步骤。lysC^*被整合到RSF24P，得到RSFD80(图9)。按同样方法，lysC被整合到RSF24P，得到的质粒被命名为RSFD1。这些质粒被导入E.coli W3110(tyrA)中，制备粗酶溶液，用如(6-1-2)中相同的方法检查AK活性以及AK活性受L-赖氨酸的抑制程度。结果示于表11。

表11

测AK活性菌株比活性×1 抑制的脱敏程度×2

W3110(tyrA)/RSF24P 0.94 42.9

W3110(tyrA)/RSFD1 18.55 7.2

W3110(tyrA)/RSFD80 33.36 98.8

通过把lysC和lysC^*整合到RSF24P，锚定了这些质粒的菌株的AK比活性提高了20-30倍。E.coli有三种AK，lysC编码它们中的AKIII。然而，三种AK的总活性在上述实验中测定。在锚定插入了野生型lysC的RSFD1的菌株中，推测L-赖氨酸的抑制作用也变高，因为与对照(W3110(tyrA)/RSF24P)相比，AKIII所占的比例比AKI和AKIII所占比例要高，导致对L-赖氨酸产率增强无影响的迹象。另一方面，揭示出在锚定RSFD80的菌株中约100％的AKIII对抑制是脱敏的，这一事实对L-赖氨酸生产的改进是起作用的。

(3)第三速度限定步骤的鉴定

其次，L-赖氨酸生物合成系统的各种质粒被导入到E.coli W3110(tyrA)/RSF80，完成对L-赖氨酸生产的培养。培养结果示于表12。

表12

菌株 L-赖氨酸盐酸盐产量(g/L) 相对糖的产量(％)

W3110(tyrA)/RSFD80 9.17 22.5

W3110(tyrA)/RSFD80+pppc 8.97 22.0

W3110(tyrA)/RSFD80+paspC 9.05 22.2

W3110(tyrA)/RSFD80+plysC 8.56 21.0

W3110(tyrA)/RSFD80+plysC^* 8.15 20.0

W3110(tyrA)/RSFD80+pasd 8.35 20.5

W3110(tyrA)/RSFD80+pdapA 8.56 21.0

W3110(tyrA)/RSFD80+pdapA^* 8.15 20.0

W3110(tyrA)/RSFD80+pdapB 10.80 26.5

W3110(tyrA)/RSFD80+pDDH 8.56 21.0

W3110(tyrA)/RSFD80+plysA 8.48 20.8

对L-赖氨酸产率的增强作用仅在dapB中观察到，并且发现dapB参与的反应是第三速度限定步骤。所以把dapA导入RSFD80，并得到pCAB1(图18)。此质粒被导入E.coli W3110(tyrA)，制备粗酶溶液，并根据Tamir，H.和Gilvarg，C.J.Biol.Chem.，249，3034(1974)描述的方法测定DDPR(二氢吡啶二羧酸还原酶)的酶活性。以同样的方式，从只锚定RSFD80的菌株及锚定RSFD80和pdapB两者的菌株制备粗酶溶液，并测定DDPR的活性。结果示于表13.

表13

菌株比活性(μmols/min/mg蛋白)

W3110(tyrA)/RSFD80 0.027

W3110(tyrA)/RSFD80+pdapB 0.092

W3110(tyrA)/pCAB1 0.178

与对照(仅锚定RSFD80的菌株)相比，在锚定RSFD80和pdapB的菌株中DDPR活性增加约3倍，在锚定由dapB导入RSFD80得到的pCAB1的菌株中DDPR活性增加约6.5倍。根据W3110(tyrA)/RSFD80+pdapB和W3110(tyrA)/pCAB1都有相等的10.8g/l的L-赖氨酸聚集这一事实，判定提供了足够量的dapB为L-赖氨酸生产，速度限定步骤移到下一步。

(4)第四速度限定步骤的鉴定

用锚定lysC^*，dapA^*和dapB的质粒pCAB1来鉴定第四速度限定步骤。L-赖氨酸生物合成系统的各种质粒被导入E.coli W3110(tyrA)/pCAB1，完成对L-赖氨酸生产的培养。培养结果示于表14。

表14

菌株 L-赖氨酸盐酸盐产量(g/L) 相当于糖的产量(％)

W3110(tyrA)/pCAB1 10.80 26.5

W3110(tyrA)/pCAB1+pppc 11.00 27.0

W3110(tyrA)/pCAB1+paspC 10.88 26.7

W3110(tyrA)/pCAB1+plysC 10.60 26.0

W3110(tyrA)/pCAB1+plysC^* 10.39 25.5

W3110(tyrA)/pCAB1+pasd 10.19 25.0

W3110(tyrA)/pCAB1+pdapA 10.72 26.3

W3110(tyrA)/pCAB1+pdapA^* 10.80 26.5

W3110(tyrA)/pCAB1+pdapB 10.92 26.8

W3110(tyrA)/pCAB1+pDDH 12.23 30.0

W3110(tyrA)/pCAB1+plysA 10.60 26.0

仅在DDH观察到对L-赖氨酸产率的增强效应，并发现被DDH催化的反应是第四速度限定步骤。此外，在未导入DDH的菌株的培养肉汤中检测到的SDAP(N-琥珀酰基-L，L-α，ε-二氨基庚二酸)在导入DDH的菌株的培养肉汤中未检测到。SDAP的检测用TLC展开的方法完成(展开剂的组成；甲醇∶水∶10N HCl∶吡啶＝80∶17.5∶2.5∶10)(Bouvier，J.，Richaud，C.，Higgins，W.，Bogler，O.和Stragier，P.，J.Bacteriol.，174，5265(1992))。而且，在未导入DDH菌株的情况下肉汤的颜色是棕色，但在导入DDH菌株的情况下肉汤颜色变成黄色。所以DDH被整合到pCAB1来制备质粒pCABD2(图19)，并测定用这一质粒转化的E.coliW3110(tyrA)的DDH活性。DDH酶活性根据文献(Azizono，Haruo，Fermentation and Industry，45，964(1987))测定。结果示于表15。

表15

菌株比活性(μmols/min/mg蛋白)

W3110(tyrA)/pCAB1 0.000

W3110(tyrA)/pCAB1+pDDH 0.799

W3110(tyra)/pCABD2 2.214

由于DDH原本不存在于E.coli中，所以未测定对照(W3110(tyrA)/pCAB1)中DDH活性。锚定pCABD2(W3110(tyrA)/pCABD2)菌株的DDH比活性约是锚定pDDH(W3110(tyrA)/pCAB1+pDDH)菌株的2.5倍，然而，两种菌株都具有相等的L-赖氨酸聚集量(12.23g/l)。因而判断pCABD2的DDH表达量是足够的。

(5)dapC、dapD、dapE和dapF中的速度限定步骤分析

下一步，为了检测上述分析中dapC、dapD、dapE和dapF被DDH取代的限速顺序，首先将这些基因克隆。dapC没有克隆，因为对其碱基序列没有报道，但其余三种基因按PCR方法克隆。

用基于已知dapD基因寡核苷酸序列(Richaud，C.et al.，J.Biol.Chem.，259，14824(1984))制备的两种寡核苷酸引物(SEQ ID NO：15，NO：16)，通过PCR方法，从E.coli W3110株的染色体DNA扩增dapD基因得到dapD基因。得到的扩增DNA片段用Eco0109I和SacI酶切，平头末端，然后插入pMW118的SmaI位点得到质粒pdapD(图20)。

用基于已知dapE基因寡核苷酸序列(Bouvier，J.et al.，J.Bacteriol.，174，5265(1984))制备的两种寡核苷酸引物(SEQ ID NO：17，NO：18)，通过PCR方法，从E.coli W3110株的染色体DNA扩增dapE基因得到dapE基因。得到的扩增DNA片段用MunI和BglII酶切，平头末端，然后插入pMW118的SmaI位点得到质粒pdapE(图21)。

用基于已知dapF基因寡核苷酸序列(Richaud，C.et al.，Nucleic Acids Res.，16，10367(1988))制备的两种寡核苷酸引物(SEQ ID NO：19，NO：20)，通过PCR方法，从E.coli W3110株的染色体DNA扩增dapF基因得到dapF基因。得到的扩增DNA片段用PstI酶切，平头末端，然后插入pMW118的SmaI位点得到质粒pdapF(图22)。

上述得到的每种质粒导入W3110(tyrA)/pCAB1，进行培养以产生L-赖氨酸。在前面的实验中，除导入DDH前后L-赖氨酸产量的变化外，还可观察到培养基颜色的变化及是否存在中间体(SDAP)的聚集。因而也可用它们作为指标进行速度决定步骤的分析。结果见表16。

表16

菌株 L-赖氨酸盐酸盐相对肉汤 SDAP的

的产量(g/L) 糖的产量(％) 颜色聚集

W3110(tyra)/pCAB1 10.80 26.5 棕色 +

W3110(tyrA)/pCAB1+pdapD 11.08 27.2 黄色 +

W3110(tyrA)/pCAB1+pdapE 11.12 27.3 棕色 -

W3110(tyrA)/pCAB1+pdapF 10.96 26.9 棕色 +

W3110(tyrA)/pCABD2 12.23 30.0 黄色 -

通过增强dapD或dapE，L-赖氨酸的产量增加一点，但DDH没有过度。而且，发现肉汤颜色的变化和导入DDH后观察到的作为中间体的SDAP的聚集是相互独立的现象，dapD导致肉汤颜色的变化，而dapE导致SDAP的消失。dapE和SDAP之间的关系可从L-赖氨酸生物合成通路来假定判断。dapF的增加对改善L-赖氨酸产率没有作用。

从pdapE中切除dapE，将dapE插入pdapD制备含dapE和dapD的质粒pMWdapDE1(图23)。然后，从pMWdapDE1中切除含dapE和dapD的片段，插入pCAB1以制备pCABDE1(图24)。制备锚定pCAB1、pCABDE1或pCABD2的菌株和锚定pCABDE1与pdapF的菌株，通过培养这些菌株以产生L-赖氨酸。结果见表17。

表17

菌株 L-赖氨酸盐酸盐相对肉汤 SDAP的

的产量(g/L) 糖的产量(％) 颜色聚集

W3110(tyrA)/pCAB1 10.80 26.5 棕色 +

W3110(tyrA)/pCABDE1 12.23 30.0 黄色 -

W3110(tyrA)/pCABDE1+pdapF 11.82 29.0 黄色 -

W3110(tyrA)/pCABD2 12.23 30.0 黄色 -

发现L-赖氨酸产量、肉汤颜色以及是否存在SDAP聚集与通过联合增强dapD和dapE产生DDH相当。除此之外，发现进一步增强dapF对改善L-赖氨酸产率没有作用，而且dapF参与的反应不限速。上述结果可作如下解释。

导入pCAB1这一步后，中间体在SKAP(N-琥珀酰基-ε-酮基-L-α-氨基庚二酸)和SDAP两步聚集。在这些中间体中，SDAP在细胞外培养基中检测到。虽然未检测到SKAP，推测它们在细菌胞体中聚集。这种推测的理由归于肉汤颜色。不产生L-赖氨酸的野生型菌株(W3110(tyrA))等的肉汤颜色是黄色的。而当有生长负担时，可能由于溶菌等作用，肉汤变成棕色。推测SDAP有小的生长负担，因为SDAP释放到细胞外，于是，肉汤被改进，使得虽然当SKAP通过仅仅dapD的增强而代谢时SDAP的聚集量增加，肉汤仍为黄色。然而，即使dapD被增强，L-赖氨酸的聚集量不增加，除非更下游的dapE的限速作用脱敏。

(6)结论

根据上述结果，发现可通过以下步骤逐渐改进L-赖氨酸的产率：(1)导入dapA^*，(2)导入lysC^*，(3)增强dapB和(4)增强埃希氏杆菌的DDH或dapD和dapE。进而得到L-赖氨酸产率逐渐改进的E.coli。

(7)E.coli C菌株中L-赖氨酸生物合成系统的速度限定步骤分析

为了检验上述获得的结论是否适用于E.coli K-12系列以外的菌株，用上述同样方法分析E.coli C菌株(IFO 13891)的赖氨酸生物合成系统的速度限定步骤。培养条件与W3110(tyrA)相同，但培养基中不加L-酪氨酸。

(1)鉴定第一速度限定步骤

用含L-赖氨酸生物合成系统基因的质粒转化的E.coli C菌株(IFO 13891)，在产生L-赖氨酸的培养基中培养，并测量L-赖氨酸盐酸盐的产量。结果见表18。

表18

菌株 L-赖氨酸盐酸盐的产量(g/L) 相对糖的产量(％)

C 0.08 0.2

C/pppc 0.08 0.2

C/paspC 0.12 0.3

C/plysC 0.08 0.2

C/plysC^* 0.12 0.3

C/pasd 0.08 0.2

C/pdapA 0.32 0.8

C/pdapA^* 0.71 1.75

C/pdapE 0.12 0.3

C/pDDH 0.08 0.2

C/plysA 0.08 0.2

与W3110(tyrA)中的方式相同，通过导入野生型dapA，再导入抑制脱敏型dapA^*，C菌株也可在培养基中聚集L-赖氨酸。lysC^*对L-赖氨酸产率无影响。

(2)鉴定第二速度限定步骤

含dapA^*的质粒RSF24P导入E.coli C株，再导入含有L-赖氨酸生物合成系统基因的质粒。得到的转化体在产生L-赖氨酸的培养基中培养，并测定L-赖氨酸盐酸盐的产量。结果见表19。

表19

菌株 L-赖氨酸盐酸盐的产量(g/L) 相对糖的产量(％)

C/RSF24P 0.71 1.75

C/RSF24P+pppc 0.71 1.74

C/RSF24P+paspC 0.69 1.70

C/RSF24P+plysC 0.65 1.60

C/RSF24P+plysC^* 1.82 4.50

C/RSF24P+pasd 0.70 1.73

C/RSF24P+pdapA 0.71 1.75

C/RSF24P+pdapA^* 0.69 1.70

C/RSF24P+pdapB 0.99 2.45

C/RSF24P+pDDH 0.73 1.80

C/RSF24P+plysA 0.69 1.70

发现lysC^*甚至对被dapA^*转化的C菌株中L-赖氨酸产率的改善有影响，而且lysC^*参与的反应是第二速度限定步骤。

(3)鉴定第三速度限定步骤

含dapA^*和lysC^*的质粒RSFD80导入E.coli C菌株，再导入含L-赖氨酸生物合成系统基因的质粒，得到的转化体在培养基中培养以产生L-赖氨酸，测定L-赖氨酸盐酸盐的产量，结果见表20。

表20

菌株 L-赖氨酸盐酸盐的产量(g/L) 相对糖的产量(％)

C/RSFD80 1.82 4.5

C/RSFD80+pppc 1.74 4.3

C/RSFD80+paspC 1.82 4.5

C/RSFD80+plysC 1.91 4.7

C/RSFD80+plysC^* 1.74 4.3

C/RSFD80+pasd 1.82 4.5

C/RSFD80+pdapA 1.95 4.8

C/RSFD80+pdapA^* 1.91 4.7

C/RSFD80+pdapB 2.31 5.7

C/RSFD80+pDDH 2.15 5.3

C/RSFD80+plysA 1.95 4.8

与W3110株中的方式相同，只有dapB对改善L-赖氨酸产率有作用，并发现是第三速度限定步骤。

(4)鉴定第四速度限定步骤

含有dapA^*、lysC^*和dapB的质粒pCAB1导入E.coli C菌株，再导入含L-赖氨酸生物合成系统基因的质粒。得到的转化体在产生L-赖氨酸的培养基中培养，并测量L-赖氨酸盐酸盐的产量。结果见表21。

表21

菌株 L-赖氨酸盐酸盐的产量(g/L) 相对糖的产量(％)

C/pCAB1 2.31 5.7

C/pCAB1+pppc 2.23 5.5

C/pCAB1+paspC 2.35 5.8

C/pCAB1+plysC 2.27 5.6

C/pCAB1+plysC^* 2.19 5.4

C/pCAB1+pasd 2.23 5.5

C/pCAB1+pdapA 2.31 5.7

C/pCAB1+pdapA^* 2.27 5.6

C/pCAB1+pdapB 2.23 5.5

C/pCAB1+pDDH 2.59 6.4

C/pCAB1+plysA 2.19 5.4

与W3110株中的方式相同，只有DDH对改善L-赖氨酸产率有作用，并发现是第四速度限定步骤。

(5)分析dapC、dapD、dapE和dapF中的速度限定步骤

锚定pCAB1的E.coli C株中导入已锚定dapD、dapE或dapF而非DDH基因的质粒，并进行培养以产生L-赖氨酸。结果见表22。

表22

菌株 L-赖氨酸盐酸盐相对肉汤 SDAP的

的产量(g/L) 糖的产量(％) 颜色聚集

C/pCAB1 2.31 5.7 brown +

C/pCAB1+pdapD 2.43 6.0 yellow +

C/pCAB1+pdapE 2.35 5.8 brown -

C/pCAB1+pdapF 2.23 5.5 brown +

C/pCABDE1 2.59 6.4 yellow -

C/pCABDE1+pdapF 2.43 6.0 yellow -

C/pCABD2 2.59 6.4 yellow -

发现dapD和dapE的两步骤也以与W3110株相同的方式与菌株的速度限定有关。

如上所述，不同种类的K-12和C菌株具有相同的速度限定步骤。因而认为E.coli所有种类均适用于这样一个概念，即通过依次导入dapA^*和lysC^*并增加dapB和DDH(或dapD和dapE)，可逐步改善L-赖氨酸的产率。

工业适用性

依据本发明，已经得到一种来自埃希氏杆菌的DDPS突变基因，其中L-赖氨酸的反馈抑制被充分脱敏。通过向已锚定对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶的埃希氏杆菌导入该基因，可以获得比现有技术更改进的产生L-赖氨酸的菌株。

而且，L-赖氨酸产率可通过依次增强前述产生L-赖氨酸细菌的dapB和DDH(或dapD和dapE)，以逐步方式改进L-赖氨酸的产率。

序列列表(1)一般情报：(i)申请人：AJINOMOTO CO.，INC.(ii)发明名称：通过发酵生产L-赖氨酸的方法(iii)序列数：20(iv)通讯地址：

(A)收信人：

(B)街道：

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(D)州：

(E)国家：

(F)邮政编码：(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn(vi)当前申请日期：

(A)申请号：

(B)归档日期：

(C)分类：(vii)以前申请日期：

(A)申请号：

(B)归档日期：(viii)代理人/事务所：

(A)姓名：

(B)注册号：

(C)参考文献/摘要号：(ix)通信情况：

(A)电话：

(B)电传：(2)SEQ ID NO：1的说明：(i)序列特征：

(A)长度：20

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(A)长度：1197

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：染色体DNA(vi)来源：

(A)微生物：大肠杆菌

(B)菌株：MC1061(ix)特征：

名称/关键：引物转录产物

位置：248

鉴定方法：E(ix)特征：

名称/关键：CDS

位置：272..1150

鉴定方法：E(ix)特征：

名称/关键：引物结合

位置：27..46

鉴定方法：E(ix)特征：

名称/关键：引物结合

位置：1156..1175

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名称/关键：RBS

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鉴定方法：S(xi)序列说明：SEQ ID NO：3：(见p108页第32行到第109页41行)CCAGGCGACT GTCTTCAATA TTACAGCCGC AACTACTGAC ATGACGGGTG ATGGTGTTCA 60CAATTCCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG TGATCACCAG ATAATGTGTT GCGATGACAG 120TGTCAAACTG GTTATTCCTT TAAGGGGTGA GTTGTTCTTA AGGAAAGCAT AAAAAAAACA 180TGCATACAAC AATCAGAACG GTTCTGTCTG CTTGCTTTTA ATGCCATACC AAACGTACCA 240TTGAGACACT TGTTTGCACA GAGGATGGCC C ATG TTC ACG GGA AGT ATT GTC 292

Met Phe Thr Gly Ser Ile Val

1 5GCG ATT GTT ACT CCG ATG GAT GAA AAA GGT AAT GTC TGT CGG GCT AGC 340Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser

10 15 20TTG AAA AAA CTG ATT GAT TAT CAT GTC GCC AGC GGT ACT TCG GCG ATC 388Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile

25 30 35GTT TCT GTT GGC ACC ACT GGC GAG TCC GCT ACC TTA AAT CAT GAC GAA 436Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu

40 45 50 55CAT GCT GAT GTG GTG ATG ATG ACG CTG GAT CTG GCT GAT GGG CGC ATT 484His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp G1y Arg Ile

60 65 70CCG GTA ATT GCC GGG ACC GGC GCT AAC GCT ACT GCG GAA GCC ATT AGC 532Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser

75 80 85CTG ACG CAG CGC TTC AAT GAC AGT GGT ATC GTC GGC TGC CTG ACG GTA 580Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly Ile Val Gly Cys Leu Thr Val

90 95 100ACC CCT TAC TAC AAT CGT CCG TCG CAA GAA GGT TTG TAT CAG CAT TTC 628Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe

105 110 115AAA GCC ATC GCT GAG CAT ACT GAC CTG CCG CAA ATT CTG TAT AAT GTG 676Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val120 125 130 135CCG TCC CGT ACT GGC TGC GAT CTG CTC CCG GAA ACG GTG GGC CGT CTG 724Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu

140 145 150GCG AAA GTA AAA AAT ATT ATC GGA ATC AAA GAG GCA ACA GGG AAC TTA 772Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu

155 160 165ACG CGT GTA AAC CAG ATC AAA GAG CTG GTT TCA GAT GAT TTT GTT CTG 820Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu

170 175 180CTG AGC GGC GAT GAT GCG AGC GCG CTG GAC TTC ATG CAA TTG GGC GGT 868Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly

185 190 195CAT GGG GTT ATT TCC GTT ACG ACT AAC GTC GCA GCG CGT GAT ATG GCC 916His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala200 205 210 215CAG ATG TGC AAA CTG GCA GCA GAA GAA CAT TTT GCC GAG GCA CGC GTT 964Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val

220 225 230ATT AAT CAG CGT CTG ATG CCA TTA CAC AAC AAA CTA TTT GTC GAA CCC 1012Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro

235 240 245AAT CCA ATC CCG GTG AAA TGG GCA TGT AAG GAA CTG GGT CTT GTG GCG 1060Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala

250 255 260ACC GAT ACG CTG CGC CTG CCA ATG ACA CCA ATC ACC GAC AGT GGT CGT 1108Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg

265 270 275GAG ACG GTC AGA GCG GCG CTT AAG CAT GCC GGT TTG CTG T AAAGTTTAGG 1158Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu280 285 290GAGATTTGAT GGCTTACTCT GTTCAAAAGT CGCGCCTGG 1197(2)SEQ ID NO：4的说明：(i)序列特征：

(A)长度：292

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽(xi)序列说明：SEQ ID NO：4：Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys1 5 10 15Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val

20 25 30Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser

35 40 45Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu

50 55 60Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn65 70 75 80Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly

85 90 95Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln

100 105 110Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu

115 120 125Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu

130 135 140Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile145 150 155 160Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu

165 170 175Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu

180 185 190Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn

195 200 205Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu

210 215 220His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His225 230 235 240Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys

245 250 255Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr

260 265 270Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His

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290(2)SEQ ID NO：5的说明：(i)序列特征：

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Met Ser Glu Ile

1GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met

5 10 15 20AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT TTA GTT 691Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val

25 30 35GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CTG CTG GTC GCT TTA GCT 739Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala

40 45 50GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala Ile Arg

55 60 65AAC ATC CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT CTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val Ile

70 75 80CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GTT CTG GCA GAA 883Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr Val Leu Ala Glu 85 90 95 100GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG ACA GAT GAG CTG GTC AGC 931Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser

105 110 115CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu Ile Leu Arg Glu

120 125 130CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr

135 140 145AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1075Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala Ala Leu Ala Glu

150 155 160CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTC AAT GAA GGC TTA GTG ATC 1123Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val Ile165 170 175 180ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu

185 190 195GGC CGT GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA GCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu

200 205 210CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CCG GGC ATC TAC ACC 1267His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro Gly Ile Tyr Thr

215 220 225ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile Asp Glu Ile Ala

230 235 240TTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His245 250 255 260CCG GCA ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile Pro Val Phe Val

265 270 275GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys

280 285 290ACT GAA AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG 1507Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gln

295 300 305ACT CTG CTC ACT TTG CAC AGC CTG AAT ATG CTG CAT TCT CGC GGT TTC 1555Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe

310 315 320CTC GCG GAA GTT TTC GGC ATC CTC GCG CGG CAT AAT ATT TCG GTA GAC 1603Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn Ile Ser Val Asp325 330 335 340TTA ATC ACC ACG TCA GAA GTG AGC GTG GCA TTA ACC CTT GAT ACC ACC 1651Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr

345 350 355GGT TCA ACC TCC ACT GGC GAT ACG TTG CTG ACG CAA TCT CTG CTG ATG 1699Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln Ser Leu Leu Met360 365 370GAG CTT TCC GCA CTG TGT CGG GTG GAG GTG GAA GAA GGT CTG GCG CTG 1747Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu

375 380 385GTC GCG TTG ATT GGC AAT GAC CTG TCA AAA GCC TGC GGC GTT GGC AAA 1795Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys Gly Val Gly Lys

390 395 400GAG GTA TTC GGC GTA CTG GAA CCG TTC AAC ATT CGC ATG ATT TGT TAT 1843Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg Met Ile Cys Tyr405 410 415 420GGC GCA TCC AGC CAT AAC CTG TGC TTC CTG GTG CCC GGC GAA GAT GCC 1891Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Ala

425 430 435GAG CAG GTG GTG CAA AAA CTG CAT AGT AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT 1940Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe Glu

440 445ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA 2000ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT 2060ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA 2120TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC 2147(2)SEQ ID NO：8说明：(i)序列特征：

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20 25 30Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu

35 40 45Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu

50 55 60Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr65 70 75 80Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr

85 90 95Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp

100 105 110Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu

115 120 125Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys

130 135 140Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala145 150 155 160Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu

165 170 175Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg

180 185 190Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu

195 200 205Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro

210 215 220Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile225 230 235 240Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala

245 250 255Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile

260 265 270Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu

275 280 285Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu

290 295 300Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His305 310 315 320Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn

325 330 335Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr

340 345 350Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln

355 360 365Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu

370 375 380Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys385 390 395 400Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg

405 410 415Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro

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Claims

1.通过导入编码二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA至其细胞中而转化的一种埃希氏杆菌属细菌，该DNA来自具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变的埃希氏杆菌，并携带有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶。

2.按照权利要求1的埃希氏杆菌属细菌，它通过向细胞中导入一种编码来自对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变的埃希氏杆菌的天冬氨酸激酶IIIDNA，而携带有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶。

3.按照权利要求2的埃希氏杆菌属细菌，其中天冬氨酸激酶III对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变选自下面一组突变，即用天冬氨酸残基取代323位甘氨酸残基的突变，用天冬氨酸残基取代323位的甘氨酸残基并用天冬氨酸残基取代408位甘氨酸残基的突变，用半胱氨酸残基取代第34位精氨酸残基并用天冬氨酸残基取代第323位甘氨酸残基的突变，用苯丙氨酸残基取代第325位亮氨酸残基的突变，用异亮氨酸残基取代第318位蛋氨酸残基的突变，用异亮氨酸残基取代第318位蛋氨酸残基并用蛋氨酸残基取代第349位缬氨酸残基的突变，用亮氨酸残基取代第345位丝氨酸残基的突变，用蛋氨酸残基取代第347位缬氨酸残基的突变，用异亮氨酸残基取代第352位苏氨酸残基的突变，用异亮氨酸残基取代第352位苏氨酸残基并用苯丙氨酸残基取代第369位丝氨酸残基的突变，用赖氨酸残基取代第164位谷氨酸残基的突变，用异亮氨酸残基取代第417位蛋氨酸残基并用酪氨酸残基取代第419位半胱氨酸残基的突变，所用编号是从天冬氨酸激酶III氨基酸序列的N-端开始，此酶在序列列表的SEQ ID NO：8中有明确的表示。

4.按照权利要求1的埃希氏杆菌属细菌，其中二氢吡啶二羧酸还原酶基因是增强的。

5.按照权利要求4的埃希氏杆菌属细菌，它被一种重组DNA转化，该重组DNA是通过将二氢吡啶二羧酸还原酶与在埃希氏杆菌中能自主复制的载体相连而构建的。

6.按照权利要求4的埃希氏杆菌属细菌，其中导入已增强的来自棒状杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶基因。

7.按照权利要求6的埃希氏杆菌属细菌，它被一种重组DNA转化，该重组DNA是通过将来自棒状杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶基因与在埃希氏杆菌中能自主复制的载体相连接而构建的。

8.按照权利要求4的埃希氏杆菌属细菌，其中四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶基因和琥珀酰基二氨基庚二酸脱酰酶基因是增强的。

9.按照权利要求8的埃希氏杆菌属细菌，它被一种重组DNA或被通过将四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶基因和琥珀酰基二氨基庚二酸脱酰酶基因与埃希氏杆菌中能自主复制的相同或不同载体连接而构建的两种重组DNA转化。

10.一种生产L-赖氨酸的方法，包括下述步骤：在一种合适的培养基中培养按照权利要求1-9的埃希氏杆菌属细菌，以在其培养基中产生和聚集L-赖氨酸，并从中收集L-赖氨酸。