CZ291730B6 - Kódová DNA pro enzym, bakterie z rodu Escherichia coli a způsob výroby L-lysinu - Google Patents

Abstract

K dov DNA pro enzym dihydrodipikolin tsyntet zu z bakterie z rodu Escherichia s mutac pro desenzibilaci inhibice L-lysinem v d sledku zp tn vazby, kter p°edstavuje sou st °eÜen , m e b²t pou ita k transformaci bakteri z rodu Escherichia, kter pak mohou produkovat v tÜ mno stv L-lysinu. eÜen spo v tak v bakteri ch z rodu Escherichia, kter byly transformov ny uvedenou k dovou DNA nebo k dovou DNA pro mutovanou aspartokin zu III, rovn desenzibilovanou proti inhibici L-lysinem. Sou st °eÜen tvo° rovn zp sob v²roby L-lysinu p stov n m t chto transformovan²ch bakteri .\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká kódové DNA pro enzym dihydrodipikolinát syntetázu, bakterií zrodu Escherichia coli a způsobu výroby L-lysinu fermentací.

Dosavadní stav techniky

V případě, že se L-lysin vyrábí fermentativními postupy, užívají se mikrobiální kmeny, izolované z přírodního prostředí nebo také mutované kmeny, získané z takových přirozených kmenů ke zvýšení produktivity postupu. Je známo velké množství umělých mutovaných kmenů, produkujících L-lysin. Většina z nich jsou mutované kmeny, odolné působení S-2-aminoethylcysteinu, AEC a náležejí do rodů Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus nebo Escherichia. Mimoto byly pro zvýšení produkce aminokyselin navrženy různé postupy, například s použitím transformovaných kmenů s užitím rekombinantní DNA, například podle US 4 278 765.

Pokud jde o bakterie, které je možno řadit do rodu Escherichia, popisuje například zveřejněná japonská patentová přihláška č. 56-18596, US č. 4 346 170 a publikace Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227-231, 1982 způsob produkce L-lysinu při použití bakteriálního kmene se zvýšeným množstvím dihydrodipikolinátsyntetázy (enzym se někdy označuje zkratkou DDPS). Avšak DDPS, použitá v těchto případech je divokého typu a postup proto trpí inhibicí produkce L-lysinu v důsledku zpětné vazby. Nebylo proto možno dosáhnout dostatečné produktivity pro produkci L-lysinu. Publikace Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227-231, 1982 popisuje výrobu L-lysinu, při níž je možno získat 3 g/1 L-lysinhydrochloridu z 75 g/1 glukózy, přičemž koeficient spotřeby (počet gramů L-lysinu, získaný z 1 g cukru) je 0,04 nebo 4 %.

Na druhé straně zveřejněná korejská patentová přihláška č. 92-8382 popisuje způsob výroby L-lysinu při použití bakterie zrodu Escherichia, současně se však užije DDPS z bakterií, náležejících do rodu Corynebacterium, u tohoto rodu totiž nedochází k inhibici produkce L-lysinu na základě zpětné vazby (koeficient spotřeby je 17 %). Avšak horní hranice teploty, při níž ještě mohou růst bakterie zrodu Corynebacterium, je přibližně o 10 °C nižší než horní hranice teploty, při níž mohou růst bakterie z rodu Escherichia. To znamená, že kultivaci by bylo zapotřebí uskutečnit při nižší teplotě v případě, že se do mikroorganismu z rodu Escherichia zavádí kódová DNA pro DDPS z bakterie z rodu Corynebacterium, má-li být tento mikroorganismus využit pro výrobu L-lysinu. Lze tedy předpokládat, že bude obtížné využít výhody bakterií rodu Escherichia při jejich testování při vyšší teplotě, při níž je růst těchto bakterií rychlý a rychlost produkce L-lysinu je proto také vysoká. Obvykle v případě, že dochází k expresi genu z heterologního organismu, může docházet k rozkladu produktu této exprese proteázou a ke tvorbě nerozpustného inkluzního tělíska. Obecně to znamená, že je zapotřebí počítat s většími obtížemi než v případě exprese homologního genu. Mimoto v případě, že se kódová DNA pro DDPS z bakterií rodu Corynebacterium přenese do bakterií rodu Escherichia za účelem průmyslové produkce L-lysinu, je zapotřebí dodržet přísnější předpisy než při použití homologního genu, tak jak to odpovídá obecným předpisům pro použití DNA, získané rekombinací.

Dihydrodipikolinátsyntetáza, DDPS je enzym, který dehydratuje a kondenzuje semialdehyd kyseliny asparagové a kyseliny pyrohroznové za vzniku kyseliny dihydrodipikolonové. Tato reakce tedy probíhá na počátku systému pro biosyntézu L-lysinu ve skupině kyseliny asparagové. Je známo, že uvedený enzym má své důležité místo jako aspartokináza v bakteriích z rodu Escherichia.

Pro DDPS je kódovým řetězcem gen, označovaný depA v Escherichia coli. Tento gen byl klonován a byl také stanoven jeho nukleotidový řetězec, který byl popsán v Richaud F. a další,

J. Bacteriol., 297, 1986.

Aspartokináza (někdy se uvádí zkratkou AK) je enzym, který katalyzuje reakci, při níž dochází k přeměně kyseliny asparagové na kyselinu beta-fosfoasparagovou, která je hlavním řídicím enzymem v biosyntetickém systému aminokyselin ze skupiny kyseliny asparagové. E. coli obsahuje tři typy tohoto enzymu, AKI, ΑΚΠ a AKIII, dva z těchto enzymů jsou komplexní enzymy s homoserindehydrogenázou, HD. Jeden z těchto enzymů je AKI-HDI, kódem pro tento enzym je gen thrA, druhým z těchto enzymů je AKII-HDII a kódovým řetězcem je gen metLM. AKI je potlačena threoninem a izoleucinem a k její inhibici může dojít působením threoninu, kdežto k potlačení AKII může dojít v přítomnosti methioninu.

Je známo, že pouze AKIII je enzymem s jedinou funkcí. Jde o produkt genu, označovaného jako LysC a k potlačení a zpětné inhibici L-lysinem může ve většině případů docházet. Poměr nitrobuněčné účinnosti uvedených enzymů je přibližně AKLAKILAKIII = 5:1:4.

Jak již bylo uvedeno, DDPS z bakterií, náležejících k rodu Corynebacterium nepodléhá inhibici L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Avšak v případě, že se kódový řetězec pro tento enzym uloží do bakterií, náležejících k rodu Escherichia za účelem využití pro výrobu L-lysinu, vzniká problém, týkající se teploty při kultivaci získaného mikroorganismu. Je možno očekávat, že L-lysin je možno účinně produkovat fermentací při využití bakterií z rodu Escherichia v případě, že by bylo možno získat mutovaný enzym DDPS nebo AKIII, který by pocházel z bakterie rodu Escherichia, nepodléhající inhibici L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Takový· mutovaný enzym však v případě DDPS ještě nebyl v literatuře popsán a přestože existuje jeden literární údaj, týkající se mutovaného enzymu AKIII v publikaci Boy E. a další, J. Bacteriol., 112, 84, 1972, dosud není znám žádný příklad, potvrzující, že by takovým mutovaným enzymem bylo možno zlepšit produktivitu výroby L-lysinu.

Podstata vynálezu

Na základě svrchu uvedených úvah byly vyvíjeny snahy získat DDPS a AKIII z bakterií rodu Escherichia s dostatečnou desenzibilací inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby a tak dosáhnout při výrobě L-lysinu fermentací zvýšené produktivity ve srovnání se známými postupy.

V důsledku pracných a opakovaných zkoušek bylo nakonec možno získat kódovou DNA pro DDPS z bakterie z rodu Escherichia s dostatečnou desenzibilací inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Kódová DNA pro DDPS z Escherichia coli s desenzibilací inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby se někdy označuje jako mutanta dapA nebo dapA*.

Dále byla získána bakterie z rodu Escherichia, obsahující uvedenou mutantu dapA a aspartokinázu se svrchu uvedenými vlastnostmi, pokud jde o inhibici L-lysinem. Kódová DNA inhibice L-lysinem dostatečně odstraněna se někdy uvádí jako mutanta lysC nebo lysC*.

Dále byla získána bakterie zrodu Escherichia, obsahující mutant dapA i mutantu LysC. Bylo prokázáno, že pěstováním takové bakterie ve výhodném živném prostředí je možno produkovat a v živném prostředí nahromadit velmi značné množství L-lysinu.

Mimoto bylo prokázáno, že produktivitu při výrobě L-lysinu uvedenými postupy je možno ještě dále zlepšit zařazením dalších genů do systému pro biosyntézu L-lysinu v bakteriích z rodu Escherichia, které již obsahují mutantu dapA i mutantu lysC.

Podstatu vynálezu tedy tvoří kódová DNA pro enzym dihydrodipikolinátsyntetázu z bakterie z rodu Escherichia s mutací pro desenzibilací L-lysinem v důsledku zpětné vazby, v níž se

-2CZ 291730 B6 mutace pro desenzibilaci inhibice L-lysinem volí z mutace, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu, mutace, při níž je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu a mutace, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu a současně je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu, počínaje vždy od N-zakončení řetězce aminokyselin dihydrodipikolonátsyntetázy, definovaného řetězcem č. 4.

Podstatu vynálezu tvoří také bakterie z rodu Escherichia. transformovaná kódovou DNA pro enzym dihydrodipikolinátsyntetázu z bakterie rodu Escherichia a obsahující mutaci, která způsobuje desenzibilaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Tato mutace může být například mutace, při níž dochází k náhradě alaninového zbytku v poloze 81 zbytkem valinu, mutace, při níž dochází k náhradě zbytku histidinu v poloze 118 zbytkem tyrosinu a mutace, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu a současně je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu, počítáno od N-terminálního konce řetězce aminokyselin pro uvedený enzym, který bude dále v seznamu řetězců zařazen jako řetězec č. 4.

Součást podstaty vynálezu tvoří také bakterie zrodu Escherichia, produkující enzym aspartokinázu, rovněž odolný proti inhibici L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Aby produkovala bakterie z rodu Escherichia aspartokinázu s uvedenými vlastnostmi, je nutno uložit do buněk takového mikroorganismu kódovou DNA pro aspartokinázu III z bakterií rodu Escherichia s mutací, která způsobuje desenzibilaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby.

Mutace aspartokinázy III k dosažení svrchu uvedeného účelu spočívá například v náhradě glycinového zbytku v poloze 323 zbytkem kyseliny asparagové nebo může být zbytek glycinu v poloze 323 nahrazen zbytkem kyseliny asparagové a současně může být zbytek glycinu v poloze 408 nahrazen rovněž zbytkem kyseliny asparagové, další možná mutace s požadovaným výsledkem spočívá v náhradě zbytku argininu v poloze 34 zbytkem cysteinu a současně v náhradě zbytku glycinu v poloze 323 zbytkem kyseliny asparagové, další vhodnou mutací je náhrada zbytku leucinu v poloze 325 zbytkem fenylalaninu nebo je možno nahradit zbytek methioninu v poloze 318 zbytkem izoleucinu, další mutací s požadovaným výsledkem je náhrada methioninového zbytku v poloze 318 zbytkem izoleucinu a současně náhrada zbytku valinu v poloze 349 zbytkem methioninu, dále je možno uskutečnit mutaci, při níž je zbytek šeřinu v poloze 345 nahrazen zbytkem leucinu, mutaci, při níž je zbytek valinu v poloze 347 nahrazen methioninu, mutaci, při níž je zbytek therioninu v poloze 352 nahrazen zbytkem izoleucinu, mutaci, při níž je zbytek threoninu v poloze 352 nahrazen zbytkem izoleucinu a současně je zbytek šeřinu v poloze 369 nahrazen zbytkem fenylalaninu, mutaci, při níž je zbytek kyseliny glutamové v poloze 164 nahrazen zbytkem lysinu nebo mutaci, při níž je zbytek methioninu v poloze 417 nahrazen zbytkem izoleucinu a současně je zbytek cysteinu v poloze 419 nahrazen zbytkem tyrosinu, počítáno vždy od N-terminálního konce řetězce aminokyselin pro aspartokinázu III, tak jak je definován řetězcem č. 8 v seznamu řetězců.

Kódovou DNA pro dihydrodipikolinátsyntetázu z bakterií z rodu Escherichia s mutací, způsobující desenzibilaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby a kódovou DNA pro aspartokinázu III, mutovanou za týmž účelem je možno uložit na chromozom bakterie z rodu Escherichia nebo do buněk při použití jediného plazmidu nebo oddělených plazmidů pro DNA pro každý z uvedených enzymů. Je také možno uložit jednu z uvedených DNA na chromozom a druhou DNA ve formě plazmidu.

Součástí řešení je rovněž získání bakterií z rodu Escherichia s výhodným uložením genu pro dihydrodipikolinát reduktázu. Zesílení tohoto genu je možno dosáhnout tak, že se k transformaci užije rekombinantní DNA, konstruovaná vazbou genu pro dihydrodipikolinát reduktázu na vektor, autonomně replikovatelný v buňkách bakterií z rodu Escherichia.

Součástí podstaty vynálezu jsou také bakterie z rodu Escherichia s uloženým genem pro diaminopimelátdehydrogenázu z coryneformních bakterií, například z Brevibacterium lactofermentum. Výhodné uložení genu pro diaminopimelátdihydrogenázu ze svrchu uvedených bakterií je možno

-3 CZ 291730 B6 uskutečnit tak, že se k transformaci užije rekombinantní DNA, získaná vazbou genu na vektor s autonomní možností replikace v bakteriích, náležejících k rodu Escherichia. Z coryneformních bakterií je možno uvést některé divoké kmeny, produkující bakterií je možno uvést některé divoké kmeny, produkující kyselinu glutamovou a mutované kmeny, produkující jiné aminokyseliny a náležející do rodu Corynebacterium nebo do rodu Brevibacterium. Jako příklad bakterií, použitelných pro účely vynálezu je možno uvést Brevibacterium flavum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium glutamicum a Corynebacterium lilium a také Brevibacterium lactofermentum.

Součást podstaty vynálezu tvoří také bakterium z rodu Escherichia s obsahem výhodně uloženého genu pro tetrahydrodipikolinátsukcinylázu a genu pro sukcinyldiaminopimelátdeycylázu místo svrchu uvedeného genu pro diaminopimelátdehydrogenázu. Výhodného uložení je možno dosáhnout tak, že se k transformaci užije jediná rekombinantní DNA nebo dvě takové DNA, zkonstruované vazbou uvedených genů na stejné nebo odlišné vektory s možností autonomní replikace v bakteriích z rodu Escherichia.

Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby L-lysinu, při němž se pěstuje kterákoliv ze svrchu popsaných bakterií z rodu Escherichia ve vhodném živném prostředí do nahromadění L-lysinu v kultuře s následnou izolací L-lysinu z fermentační kultury.

V dalším textu bude kódová DNA pro DDPS nebo AKIII nebo DNA s obsahem promotoru někdy označována jako DDPS gen nebo AKIII gen. Mimoto může být mutovaný enzym s desenzibilovanou inhibicí L-lysinem v důsledku zpětné vazby označován jako mutovaný enzym a kódová DNA pro tento enzym nebo DNA, navíc obsahující promotor může být označována jako mutovaný gen. Pokud jde o desenzibilaci, znamená to pouze, že inhibice byla dostatečně odstraněna, pro účely vynálezu není nezbytné, aby byla odstraněna úplně.

V dalších odstavcích budou podrobněji popsána jednotlivá výhodná provedení vynálezu.

1. Kódová DNA pro mutantu dihydrodipikolinátsyntetázy, DDPS podle vynálezu

Kódová DNA pro mutovanou DDPS podle vynálezu obsahuje mutace, způsobující desenzibilaci inhibice DDPS L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Jde o DDPS z bakterií z rodu Escherichia, zvláště o DDPS z Escherichia coli. Jako mutace DDPS ke svrchu uvedenému účelu je možno uvést:

1) Mutaci, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu,

2) mutaci, při níž je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu a

3) mutaci, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu a mimoto je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu, počítáno od N-terminálního konce DDPS v řetězci aminokyselin pro tento enzym, který bude dále v seznamu řetězců uveden jako řetězec č. 4.

Výběr kódové DNA pro divoký typ DDPS není nijak zvláště omezen za předpokladu, že běží o kódový řetězec pro DDPS z bakterie, která náleží do rodu Escherichia, takový řetězec je například uveden jako řetězec č. 4 a dále konkrétně definován řetězcem bází č. 272 a 1 147 v řetězci bází, který bude dále uveden jako řetězec č. 3. V těchto řetězcích jsou řetězce podle vynálezu takové řetězce, které v nukleotidovém řetězci obsahují mutaci, způsobující náhradu zbytků aminokyselin ve svrchu uvedeném smyslu za vzniku mutovaného enzymu podle vynálezu. Je možno užít jakýkoliv kodon, odpovídající zbytku aminokyseliny, který má být do řetězce uložen, jediným předpokladem je, aby šlo o kód pro uvedený zbytek aminokyselin. Mimoto je možno předpokládat, že se jednotlivé řetězce DDPS budou od sebe poněkud lišit

-4CZ 291730 B6 v závislosti na rozdílech mezi jednotlivými čeleděmi a rody bakterií, avšak takové řetězce, které obsahují vypuštěné nebo přidané zbytky aminokyselin v polohách, na nichž účinnost enzymu nezávisí, jsou rovněž zahrnuty do rozsahu vynálezu.

Mutovaný gen je možno získat následujícím způsobem. Nejprve se uskuteční mutace kódové DNA pro divoký typ DDPS nebo se vytvoří gen s příslušnou mutací in vitro a získaný řetězec DNA s příslušnou mutací se pak uloží do vektoru, vhodného pro zvoleného hostitele a takto připravená DNA se užije k transformaci hostitelského mikroorganismu za vzniku transformovaných bakterií. Z transformantů se izolují ty kolonie, u nichž dochází k expresi mutované DDPS, což je důkazem, že transformovat obsahuje mutovaný gen. Je také možno postupovat tak, že se uloží do vektoru, vhodného pro zvoleného hostitele DNA s obsahem divokého typu DDPS nebo genu pro DDPS získaná mutovaná DNA se pak použije pro transformaci hostitelského mikroorganismu za vzniku transformantů. Z těchto transformantů se pak izoluje kolonie, u níž dochází k expresi mutovaného genu pro DDPS, což je důkazem, že mikroorganismus obsahuje mutovaný gen.

Je také možno postupovat tak, že se mutací podrobí přímo mikroorganismus, produkující enzym divokého typu za vzniku mutovaného kmene, produkujícího mutovaný enzym a z tohoto mutovaného kmene je pak možno získat mutovaný gen. Je také možno připravit transformanty, do nichž byla uložena rekombinantní DNA, navázaná na gen divokého typu a pak vytvořit mutovaný kmen, produkující mutovaný enzym. Pak je možno z tohoto kmene rekobinantní DNA izolovat a tak získat mutovaný gen.

Činidlo, užité pro uskutečnění mutace DNA in vitro je například hydroxylamin a podobné látky. Hydroxylamin je chemické látka, kterou je možno vyvolat mutaci z cytosinu na thiman tak, že se cytosin přemění na N⁴-hydroxycytosin. V případě, že se mé. vyvolat mutace přímo u mikroorganismu, je možno použít ultrafialového světla nebo je možno volit chemickou látku, obvykle užívanou pro tyto účely, jako je N-methyl-N-nitro-N-nitroizoguanidin, NTG nebo kyselina dusitá.

Jako dárce DNA s obsahem divokého typu genu pro DDPS, popřípadě s další mutací, tak jak bylo svrchu popsáno, je možno užít jakýkoliv mikroorganismus za předpokladu, že náleží do rodu Escherichia. Je například možno použít mikroorganismuy, popsané v publikaci Neidhardt F. C. a další, Escherichia coli a Salmonella typhimurium, Američan Society for Microbiology, Washington D. C., 1 208, tabulka 1. Jako příklad je možno uvést kmeny E. coli JM109 a MC1061. V případě, že se jako dárce DNA užije mikroorganismus, obsahující gen pro DDPS, je možno získat gen pro divoký typ DDPS.

1) Příprava divokého genu DDPS

Dále bude popsán příklad získání DNA s obsahem genu pro DDPS. Nejprve se pěstuje E. coli s obsahem divokého typu dapA, například kmen MC1061. V případě tohoto pěstování je možno mikroorganismus pěstovat na pevném živném prostředí, avšak s výhodou se mikroorganismus pěstuje v kapalném živném prostředí vzhledem k vyšší účinnosti a možnosti získat větší množství bakterií. Je možno použít živné prostředí, obsahující jeden nebo větší počet zdrojů dusíku, jako extrakt z kvasnic, pepton, extrakt z masa, kukuřičný výluh nebo výluh ze sóji nebo pšenice, mimoto má živné prostředí obsahovat anorganické soli, jako dihydrogenfosforečnan draselný, hydrogenfosforečnan draselný, síran hořečnatý, chlorid sodný, chlorid hořečnatý, chlorid železitý, síran železitý nebo síran manganatý a další soli a popřípadě ještě cukry, vitaminy a podobně. Počáteční pH živného prostředí se upraví na hodnotu 6 až 8. Mikroorganismus se pěstuje 4 až 24 hodin při teplotě 30 až 42, s výhodou 37 °C za provzdušnění a míchání, může jít o třepací kulturu, stacionární kulturu a podobně.

Získaná kultura se odstředí, například při 3 000 ot/min po dobu 5 minut, čímž se získá usazenina kmene E. coli MC1061. DNA z chromozomů je možno z této usazeniny získat například

-5CZ 291730 B6 způsobem podle publikace Saito a Muira, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, 1963 nebo způsobem podle publikace K. S. Kirby, Biochem. J., 64, 405, 1956.

Aby bylo možno získat z takto připravené chromozomální DNA gen pro DDPS, připraví se banka chromozomální DNA. Nejprve se tato DNA částečně rozštěpí vhodným restrikčním enzymem za vzniku směsi různých fragmentů. Je možno použít širokou škálu restrikčních enzymů v případě, že je stupeň štěpení řízen dobou štěpení a podobně. Například enzym Sau3AI se nechá reagovat s chromozomální DNA při teplotě nejméně 30, s výhodou 37 °C při obsahu enzymu 1 až 10 jednotek/ml po různou dobu v rozmezí 1 minuta až 2 hodiny.

Pak se získané fragmenty DNA uloží do vektoru, schopného autonom,ní replikace v bakteriích rodu Escherichia, čímž se připraví rekombinantní DNA. Restrikční enzym, vytvářející na terminální nukleotidové sekvenci zakončení, komplementární k zakončení, která byla vytvořena restrikčním enzymem Sau3AI, použitým k rozštěpení chromozomální DNA, například BamHI, použitým k rozštěpení chromozomální DNA, například BamHI se nechá působit na DNA vektoru při teplotě nejméně 30 °C a při koncentraci enzymu 1 až 100 jednotek/ml po dobu nejméně 1 hodina, s výhodou 1 až 3 hodiny k úplnému rozštěpení. Pak se směs fragmentů chromozomální DNA smísí s rozštěpenou DNA vektoru a působí se DNA-ligázou, s výhodou T4 DNA-ligázou při teplotě 4 až 16 °C při koncentraci enzymu 1 až 100 jednotek/ml po dobu nejméně 1 hodiny, s výhodou 6 až 24 hodin, čímž se získá rekombinantní DNA.

Takto získaná DNA se užije k transformaci mikroorganismu z rodu Escherichia, například mutovaného kmene, kteiý produkuje DDPS, jako Escherichia coli kmen K-12, s výhodou kmen JE7627 (ponB704, dacB12, pfv⁺, tonA2, dapA, lysA, str, malA38, metBl, i!vH611, leuA371, proA3, lac-3, tsx-76) k získání banky chromozomální DNA. Transformaci je možno uskutečnit například způsobem podle publikace D. M. Morrison, Methods in Enzymology, 68, 326, 1979 nebo postupem, při němž se na transformované bakteriální buňky působí chloridem vápenatým pro zvýšení permeability pro DNA podle publikace Mandel M. a Higa A., J. Mol. Biol., 53, 159, 1970. Kmen JE7627 je možno získat zNational Institute of Genetics, Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonsko.

Bakteriální kmen, obsahující rekombinantní DNA genu pro DDPS se získá z kmenů se zvýšenou účinností DDPS nebo z kmenů, u nichž byl chybějící gen pro DDPS doplněn z banky chromozomální DNA. Mutovaný kmen, jemuž chybí DDPS například vyžaduje kyselinu diaminopimelovou. To znamená, že v případě, že se takto mutovaný kmen užije jako hostitelský mikroorganismus, je možno fragment DNA s obsahem genu pro DDPS získat izolací bakteriálního kmene, který se stane schopným růstu na prostředí, které neobsahuje kyselinu diaminopimelovou a z tohoto bakteriálního kmene je pak možno izolovat příslušnou rekombinantní DNA.

Skutečnost, zda určitý kmen s obsahem rekombinantní DNA, obsahující gen pro DDPS skutečně obsahuje rekombinantní DNA s klonovaným genem pro DDPS, je možno ověřit tak, že se připraví buněčný extrakt z tohoto kmene a z tohoto extraktu roztok enzymu tak, aby bylo možno potvrdit nebo vyloučit zvýšení účinnosti DDPS. Účinnost tohoto enzymu je možno měřit způsobem podle publikace Yugari Y. a Gilvarg C., J. Biol. Chem., 240, 4 710, 1962.

Rekombinantní DNA s obsahem genu pro DDPS je možno izolovat z DNA vektoru ve svrchu uvedeném bakteriálním kmenu, například způsobem podle publikace P. Guerry a další, J. Bacteriol., 116, 1 064,1973 nebo podle publikace D. B. Clewell, J. Bacteriol., 110, 667,1972.

Gen pro DDPS divokého typu je možno získat také tak, že se připraví chromozomální DNA z kmene, v němž se gen pro DDPS nachází na chromozomu, postupuje se způsobem podle publikace Saito a Miura nebo podobně a gen pro DDPS se amplifikuje pomocí PCR-reakce podle publikace White T. J. a další, Trends Genet., 5, 185, 1989. Primery DNA pro použití při amplifikační reakci jsou primery, komplementární k oběma 3'-zakončením DNA s dvojitým řetězcem

-6CZ 291730 B6 s obsahem celé oblasti nebo části genu pro DDPS. V případě, že se amplifikuje pouze část genu pro DDPS, je zapotřebí použít takové fragmenty DNA jako primery, aby bylo možno uskutečnit sériové zkoušky s fragmentem DNA, obsahujícím celou oblast z banky chromozomální DNA. V případě, že se amplifikuje celá oblast genu pro DDPS, podrobí se roztok po uskutečnění PCRreakce včetně fragmentů DNA s obsahem amplifíkováného genu pro DDPS elektroforéze na agarózovém gelu a příslušný fragment DNA se extrahuje. Tímto způsobem je možno izolovat fragment DNA, který obsahuje gen pro DDPS.

DNA primery je možno připravit na bázi sekvence, známé pro Escherichia coli podle Richaud F. a další, J. Bacteriol., 297, 1986. Výhodné jsou zejména primery, s jejichž použitím je možno amplifikovat kódovou oblast genu DDPS, obsahující 1 150 bází a dva typy primerů, které budou dále uvedeny v seznamu řetězců jako řetězce č. 1 a 2. Tyto primery je možno syntetizovat běžnými postupy, například fosfoamiditovou metodou podle Tetrahedron Letters, 22,1 859, 1981 při použití běžně dodávaného syntetizátoru DNA (například Model 380D, Applied Biosystems lne.). Mimoto je možno PCR-reakci provést při použití běžně dodávaného zařízení (například DNA Thermal Cycler Model PJ2000, Takara Shuzo Co., Ltd.), při použití Taq DNA polymerázy (Takara Shuzo Co., Ltd.) podle pokynů výrobce.

Při použití genu DDPS, amplifikovaného pomocí PCR se stávají různé manipulace, například zavedení mutace snadnými v případě, že je tento gen uložen do vektoru, schopného autonomní replikace v bakteriích z rodu Escherichia a vektor je užit k transformaci bakterií z tohoto rodu. Při tomto postupuje možno použít tentýž vektor, způsob transformace i ověření přítomnosti genu pro DDPS jako svrchu.

2) Zavedení mutace do genu pro DDPS

Způsobem, vhodným pro zavedení mutace, například náhrady, zařazení nebo vyjmutí zbytku aminokyseliny je například PCR podle publikace Higuchi R.. 61, PCR Technology, Erlich H. A., Eds., Stockton Press, 1989 a cílená mutace podle publikací Kramer W. a Frits H. J., Meth. In Enzymol., 154, 367, 1987. Tímto způsobem je možno uskutečnit jakoukoliv určitou mutaci v předem stanoveném místě.

Při chemické syntéze určitého genu je možné zavést náhodnou mutaci do určitého místa.

Mimoto je možno na gen DDPS na chromozomu nebo v plazmidu přímo působit hydroxylaminem podle publikace Hashimoto T. a Sekiguchi M. J., Bacteriol., 159, 1 039, 1984. Je také možno použít postupu, při němž se bakterie z rodu Escherichia, obsahující gen pro DDPS ozařují ultrafialovým světlem neboje možno užít postup, založený na působení chemických látek, jako N-methyl-N'-nitrozoguanidinu nebo kyseliny dusité. Pomocí těchto postupů je možno zavést náhodné mutace.

Pokud jde o selekci bakterií s mutovaným genem, postupuje se tak, že je nejprve rekombinantní DNA s obsahem fragmentu DNA z genu pro DDPS a DNA vektoru podrobí vyvolání mutace působením hydroxylaminu a podobně a pak se tato DNA užije například k transformaci E. coli, kmene W3110. Transformované geny se pěstují na minimálním živném prostředí, například M9 s obsahem S-2-aminoethylcysteinu, AEC, jako analogu L-lysinu. Kmeny, obsahující rekombinantní DNA s divokým genem pro DDPS nemohou syntetizovat L-lysin a kyselinu diaminopimelovou DAP a jejich růst je potlačen vzhledem ktomu, že DDPS je po expresi z rekombinantní DNA inhibována působením AEC. Na druhé straně kmen, který obsahuje rekombinantní DNA s obsahem genu pro DDPS, v němž byla inhibice L-lysinem desenzitizována produkuje mutovaný enzym, pro nějž je kódem gen pro DDPS ve svrchu uvedené rekombinantní DNA, v tomto případě k inhibici působením AEC nedochází. To znamená, že tyto klony jsou schopné růst na minimálním živném prostředí s obsahem AEC. Tento jev je možno využít k selekci kmenů, které rostou i na prostředí s obsahem AEC jako

-Ί analogu L-lysinu, což je důkazem přítomnosti mutovaného genu pro DDPS, v němž došlo k desenzibilaci inhibice.

Takto získaný mutovaný gen je pak možno uložit ve formě rekombinantní DNA do vhodného hostitelského mikroorganismu a dosáhnout jeho exprese. Je tedy možno získat mikroorganismus, který obsahuje gen pro DDPS s desenzibilaci inhibice v důsledku zpětné vazby. Hostitelským kmenem je s výhodou mikroorganismus, který náleží do rodu Escherichia, jako příklad je možno uvést E. coli.

Je také možno postupovat tak, že se mutovaný fragment genu pro DDPS vyjme z rekombinantní DNA a uloží do jiného vektoru pro další použití. DNA vektoru pro použití pro účely vynálezu je s výhodou DNA plazmidu, jako příklady je možno uvést plazmidy pUC19, p(JC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 a pMW219. Mimoto je možno užít také DNA fágu.

Aby bylo možno dosáhnout účinné exprese mutovaného genu pro DDPS, je možno zařadit proti směru exprese genu od kódového řetězce DNA pro mutovaný DDPS další promotor, který je možno uplatnit v mikroorganismu, jako lac, trp nebo PL nebo je možno použít promotor, obsažený v genu DDPS jako takový neboje možno promotor amplifikovat.

Mimoto, jak již bylo popsáno svrchuje možno mutovaný gen uložit do DNA vektoru, schopného autonomní replikace v hostiteli a uložit tento vektor mimo chromozomy, například ve formě plazmidu. Mutovaný gen je možno také integrovat do chromozomu hostitelského mikroorganismu při použití transdukce nebo transposonu podle publikace Berg D. E. a Berg C. M., Biol/Technol., 1, 417, 1983, fágu Mu podle zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-109 985 nebo při použití homologní rekombinace podle publikace Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor La., 1972.

2. Kódová DNA pro mutantu aspartokinázy III, AKIII

Kódová DNA pro mutantu AKIII podle vynálezu obsahuje mutaci, způsobující desenzibilaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby, tak jak k ní dochází v AKIII divokého typu. Mutace se svrchu uvedeným účinkem zahrnují například následující mutace:

a) mutace, při níž se zbytek glycinu v poloze 323 nahradí zbytkem kyseliny asparagové,

b) mutace, při níž se zbytek glycinu v poloze 323 nahradí zbytkem kyseliny asparagové a zbytek glycinu v poloze 408 se nahradí zbytkem kyseliny asparagové,

c) mutace, při níž se zbytek argininu v poloze 34 nahradí zbytkem cysteinu a zbytek glycinu v poloze 323 se nahradí zbytkem kyseliny asparagové,

d) mutace, při níž se zbytek leucinu v poloze 325 nahradí zbytkem fenylalaninu,

e) mutace, při níž se zbytek methioninu v poloze 318 nahradí zbytkem izoleucinu,

f) mutace, při níž se zbytek methioninu v poloze 318 nahradí zbytkem izoleucinu a zbytek valinu v poloze 349 se nahradí zbytkem methioninu,

g) mutace, při níž se zbytek šeřinu v poloze 345 nahradí zbytkem leucinu,

h) mutace, při níž se zbytek valinu v poloze 347 nahradí zbytkem methioninu,

i) mutace, při níž se zbytek threoninu v poloze 352 nahradí zbytkem izoleucinu,

-8CZ 291730 B6

j) mutace, při níž se zbytek threoninu v poloze 352 nahradí zbytkem izoleucinu a zbytek šeřinu v poloze 369 se nahradí zbytkem fenylalaninu,

k) mutace, při níž se zbytek kyseliny glutamové v poloze 164 nahradí zbytkem lysinu a

l) mutace, při níž se zbytek methioninu v poloze 417 nahradí zbytkem izoleucinu a zbytek cysteinu v poloze 419 se nahradí zbytkem tyrosinu, počítáno vždy od N-terminálního konce AKIII v řetězci aminokyselin pro AKIII, tak jak je dále v seznamu řetězců definován řetězcem č. 8.

Kódový řetězec DNA pro AKIII divokého typu není nijak zvláště omezen v případě, že kódová DNA má svůj původ v bakterii, náležející do rodu Escherichia, například E. coli. Konkrétně je možno uvést kódovou DNA pro řetězec aminokyselin, který je definován následujícím řetězcem č. 8, uvedeným v seznamu řetězců a řetězec, odpovídající bázím 584 až 1 930 v sekvenci bází, která je uvedena jako řetězec č. 7. Kódovým řetězcem pro AKIII z E. coli je gen lysC.

Ve svrchu uvedených řetězcích jsou kódovými sekvencemi DNA pro mutovaný enzym AKIII podle vynálezu ty sekvence, které obsahují v sekvenci bází takovou mutaci, která způsobí náhradu svrchu uvedených zbytků aminokyselin svrchu uvedenými určitými zbytky. Jakýkoliv kodon, který odpovídá zbytku aminokyseliny, která má být použita jako náhradní aminokyselina, je možno užít bez ohledu na jeho typ za předpokladu, že jde o kód pro uvedený zbytek aminokyseliny. Mimoto existují řetězce, v nichž se zbytky aminokyselin poněkud odlišují od řetězce divokého typu AKIII v závislosti na rozdílech u různých čeledí nebo kmenů bakterií. Použít je možno takové řetězce, které obsahují jiné aminokyseliny nebo aminokyseliny navíc nebo vypuštěné aminokyseliny v polohách, na nichž není závislá enzymatická účinnost enzymu. Tyto řetězce rovněž spadají do rozsahu vynálezu. Například sekvence bází genu lysC divokého typu, která bude dále popsána v příkladu 2 (řetězec č. 7) se liší od zveřejněného řetězce pro lysC pro kmen E. coli K-12 JC411 v šesti polohách podle publikace Cassan M., Parsot C., Cohen G. N. a Patte J. C. Biol. Chem. 261, 1 052, 1986. Zbytky aminokyselin se odlišují ve dvou místech, v lysC kmene JC411 je zbytek glycinu v poloze 58 nahrazen zbytkem cysteinu a zbytek glycinu v poloze 401 je nahrazen zbytkem alaninu, počítáno od N-terminálního konce v řetězci aminokyselin lysC, tak jak je definován řetězcem č. 8. Je možno očekávat, že kteroukoliv ze svrchu uvedených mutací a) až 1) je možno dosáhnout desenzibilace inhibice L-lysinem i v řetězci lysC kmene E. coli K-12 JC411.

Kódovou DNA pro mutantu AKIII s desenzibilací inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby je možno připravit následujícím způsobem. Nejprve se DNA, která obsahuje gen pro AKIII divokého typu nebo gen pro AKIII sjinou mutací, podrobí in vitro zavedení mutace a po uskutečnění této mutace se DNA uloží do vektoru, vhodného pro zvoleného hostitele za vzniku rekombinantní DNA. Takto připravená DNA se pak uloží do hostitelského mikroorganismu za vzniku transformantů. Z těchto transformantů se pak izoluje transformant, u nějž dochází k expresi genu pro mutantu AKIII, což znamená, že je obsažen mutovaný gen. Je také možno postupovat tak, že se DNA, která obsahuje gen pro AKIII divokého typu, nebo gen pro AKIII sjinou mutací uloží do DNA vektoru, vhodného pro předpokládaného hostitele za vzniku rekombinantní DNA. Tato DNA se pak podrobí tvorbě mutace in vitro a po uskutečnění mutace se DNA uloží do hostitelského mikroorganismu, čímž vzniknou transformanty. Jeden z nich, u nějž dochází k expresi genu pro mutantu AKIII se izoluje, tento transformant obsahuje mutovaný gen.

Je také možno postupovat tak, že se mikroorganismus, který produkuje enzym divokého typu podrobí tvorbě mutace, čímž se vytvoří mutovaný kmen, u nějž dochází k produkci mutovaného enzymu a pak se z tohoto kmenu izoluje mutovaný gen. Jako příklad činidla pro tvorbu přímé mutace DNA je možno uvést hydroxylamin a podobné látky. Hydroxylamin je látka, užívaná pro tvorbu mutací chemickým působením a vyvolává mutaci z cytosinu na thymin tak, že se cytosin

-9CZ 291730 B6 mění na N⁴-hydroxycytosin. V případě, že se mutace provádí přímo na mikroorganismu, je možno tento mikroorganismus ozářit ultrafialovým světlem nebo na něj působit chemickou látkou, obvykle užívanou pro tvorbu mutací, jako je například N-methyl-N'-nitro-N-nitrozoguanidin, NTG.

Jako mikroorganismus pro izolaci DNA s obsahem genu pro AKIII divokého typu nebo genu pro AKIII s jinou mutací, tak jak bylo svrchu popsáno, je možno užít jakýkoliv organismus za předpokladu, že náleží do rodu Escherichia. Zvláště je možno užít mikroorganismy, popsané v publikaci Neidhardt F. F. a další, Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Američan Society for Microbiology, Washington D. C., 1 208, tabulka 1. Jako příklad je možno uvést kmeny E. coli JMI09 a MC1061. V případě, že se gen pro AKIII izoluje z těchto kmenů, je možno připravit DNA z chromozomů, banku z této DNA a podobně stejným způsobem jako DNA pro gen pro DDPS, tak jak již bylo svrchu popsáno. Jako kmen bakterií pro přípravu banky je výhodné použít kmen, jemuž zcela chybí AKI, II a III, například kmen E. coli GT3, který je možno získat z E. coli Genetic Stock Center, Connecticut, US.

Ze získané banky chromozomální DNA se získá bakteriální kmen s rekombinantní DNA genu pro AKIII jako kmen, v němž je účinnost AKIII zvýšena, nebo jako kmen, v němž byla doplněna auxotrofie. Z těchto kmenů se připraví buněčné extrakty a surové roztoky enzymu tak, aby bylo možno potvrdit účinnost AKIII. Měření účinnosti enzymu AKIII je možno uskutečnit způsobem podle publikace Stadtman E. R., Cohen G. N., LeBras G. a Robichon-Szulmajster H., J. Biol. Chem., 236,2 033, 1961.

Například v případě, že se jako hostitelský kmen užije mutovaný kmen, jemuž zcela chybí enzymy typu AK, je možno připravit fragment DNA, obsahující gen pro AKIII izolací transformovaného kmene, který se stane schopným růst na živném prostředí, které neobsahuje L-lysin, L-threonin, L-methionin nebo kyselinu diaminopimelovou nebo na prostředí, které neobsahuje homoserin a kyselinu diaminopimelovou a z tohoto bakteriálního kmene se pak izoluje rekombinantní DNA.

V případě, že se gen pro AKIII amplifikuje z chromozomální DNA při použití PCR, je možno primeiy DNA, které mají být použity pro PCR-reakci, připravit například na bázi sekvence, známé pro E. coli podle publikace Cassan M., Parsot C., Cohen G. N. a Patte J. C., J. Biol. Chem., 261, 1 052, 1986. Primery, schopné amplifikovat oblast, obsahující 1 348 bází kódového řetězce genu lysC je rovněž možno použít a vhodné jsou například dva primery, jejichž sekvence budou uvedeny dále jako řetězce č. 5 a 6.

Postup pro tvorbu mutace, jako náhradu, zařazení nebo vypuštění zbytku aminokyseliny v genu pro AKIII je možno uskutečnit například pomocí PCR, cílenou tvorbou mutace a podobně obdobným způsobem, jakým byly získány mutace genu pro DDPS, tak jak bylo popsáno svrchu.

V průběhu chemické syntézy určitého genu je také možno zařadit mutace nebo jakékoliv náhodné mutace do předem určeného místa.

Mimoto je možno také postupovat tak, že se na DNA genu pro AKIII na chromozomu nebo extrachromozomální rekombinantní DNA přímo působí hydroxylaminem podle publikace Hashimoto T. a Sekiguchi M., J. Bacteriol., 159, 1 039, 1984. Mimoto je možno také použít postup, při němž se bakterie, náležející do rodu Escherichia a obsahující gen pro AKIII na chromozom nebo obsahující extrachromozomální rekombinantní DNA ozařují ultrafialovým světlem nebo se na tyto bakterie působí k vyvolání mutace chemickou látkou, například N-methyl-N'-nitrozoguanidinem nebo kyselinou dusitou.

Pokud jde o způsob selekce mutovaného genu pro AKIII, postupuje se tak, že se nejprve kmen, jemuž zcela chybí AK, například kmen E. coli GT3 transformuje při použití rekombinantní DNA, která obsahuje gen pro AKIII po zavedení mutace. Pak se takto transformované kmeny pěstují na

-10CZ 291730 B6 minimálním živném prostředí, například M9, obsahujícím větší množství L-lysinu. Kmeny, které obsahují rekombinantní DNA s genem AKIII divokého typu nejsou schopné syntetizovat L-threonin, L-izoleucin, L-methionin a kyselinu diaminopimelovou, DAP a jejich růst je potlačen vzhledem k tomu, že pouze jeden typ AK je inhibován L-lysinem, Na druhé straně kmen, který obsahuje rekombinantní DNA s mutovaným genem pro AKIII s desenzibilací inhibice působením L-lysinu by měl růst na minimálním živném prostředí, obsahující větší množství L-lysinu. Tuto skutečnost je možno využít k selekci kmenů, jejich růst je odolný proti působení L-lysinu nebo AEC jako analogu L-lysinu, jde tedy o kmen, obsahující DNA s mutovaným genem pro AKIII s mutací ve svrchu uvedeném smyslu.

Takto získaný mutovaný gen je možno uložit ve formě rekombinantní DNA do vhodného hostitelského mikroorganismu a dosáhnout jeho exprese. Tímto způsobem je tedy možno získat mikroorganismus, který obsahuje gen pro AKIII s desenzibilací inhibice v důsledku zpětné vazby.

Hostitelem je svýhodou mikroorganismus zrodu Escherichia, jako příklad je možno uvést E. coli.

Je také možno postupovat tak, že se vyjme z rekombinantní DNA fragment mutovaného genu pro AKIII a tento fragment se uloží do jiného vektoru pro další použití. DNA, kterou je možno pro účely vynálezu použít je s výhodou DNA plazmidu, jako příklady je možno uvést plazmidy pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMWl 18, pMW219 a pMW218. Mimoto je k uvedenému účelu možno použít také DNA fágu.

Aby bylo možno dosáhnout účinné exprese genu pro mutovanou AKIII, je možno proti směru exprese od kódového řetězce DNA pro mutovaný enzym zařadit další promotor, vhodný pro zvolený mikroorganismus, například lac, trp a PL nebo promotor, obsahující gen pro AKIII může být použit jako takový nebo po amplifíkaci.

Mimoto, jak již bylo svrchu uvedeno, je možno mutovaný gen uložit do vektoru, schopného autonomní replikace a uložit do hostitele jako extrachromozomální DNA, například ve formě plazmidu. Dále je možno mutovaný gen integrovat do chromozomu hostitelského mikroorganismu s použitím transdukce, transpozomu podle publikace Berg D. E. a Berg C. M., Bio/Technol., 1, 417, 1983, fágu Mu podle zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-109 985 nebo je možno použít homologní rekombinanci podle publikace Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab., 1972.

3. Výroba L-lysinu

L-lysin je možno účinně připravovat tak, že se v živném prostředí s výhodným složením pěstuje bakterie, transformovaná uložením mutovaného genu pro DDPS, získaného svrchu uvedeným způsobem a produkující AK, desenzitizovanou proti inhibici L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Dojde k produkci a nahromadění L-lysinu v živném prostředí a L-lysin je pak možno izolovat. Zejména je možno dosáhnout účinné produkce této aminokyseliny tak, že se připraví bakterie zrodu Escherichia, produkující oba mutované enzymy, jak mutovanou DDPS, tak mutovanou AKIII.

Bakterie, náležející do rodu Escherichia a obsahující gen pro svrchu uvedeným způsobem mutované enzymy jsou bakterie, transformované tak, že do jejich DNA chromozomů byla integrována kódová DNA pro AKIII s mutací, způsobující desenzibilací inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby, nebo transformované tak, že se do buněk uloží rekombinantní DNA, konstruovaná vazbou DNA na DNA vektoru, schopného autonomní replikace v buňkách bakterií z rodu Escherichia. Mimoto může být enzym, v němž byla desenzitizována inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby enzym, divokého typu nebo je možno gen pro takový enzym uložit do bakterií rodu Escherichia svrchu uvedeným způsobem. Dále je přijatelný také mutovaný kmen

- 11 CZ 291730 B6 bakterií zrodu Escherichia, který byl přímo mutován zpracováním buněk tak, že produkuje mutovaný enzym AKIII.

Na druhé straně je možno k dosažení transformace mutovaným genem pro DDPS přímo integrovat v bakteriích rodu Escherichia gen pro mutovanou DDPS do chromozomální DNA nebo je možno transformace dosáhnout tak, že se do buněk uloží rekombinantní DNA, zkonstruovaná navázáním mutovaného genu pro DDPS a DNA vektoru, schopného autonomní replikace v buňkách bakterií z rodu Escherichia.

V případě, že se do bakterie z rodu Escherichia uloží jak gen pro mutovanou DDPS, tak gen pro mutovaný enzym, AKIII, mohou být oba mutované geny integrovány do chromozomální DNA bakterií z rodu Escherichia, nebo mohou být uloženy oba geny do stejného plazmidu nebo do různých plazmidů jako extrachromozomální DNA. V případě, že se pro každý gen užije jiný plazmid, je výhodné použít plazmidy se stálým mechanismem distribuce tak, aby došlo k jejich kompatibilními uložení do buněk. Mimoto je možno jeden z mutovaných genů integrovat do chromozomální DNA a druhý uložit do buněk ve formě plazmidu jako extrachromozomální DNA. V případě, že se do bakterií z rodu Escherichia uloží mutovaný gen pro DDPS a mutovaný gen pro enzym AKIII, je uvedené geny možno do bakterií uložit v jakémkoliv pořadí.

Produktivitu výroby L-lysinu je možno dále zlepšit tak, že se vytvoří příznivé podmínky pro gen pro dihydrodipikolinát reduktázu v bakterii z rodu Escherichia, do níž byl uložen mutovaný gen pro DDPS a mutovaný gen pro AKIII. Produktivitu výroby L-lysinu je pak možno ještě dále zvýšit tak, že se do bakterie, náležející do rodu Escherichia, do níž byl za výhodných podmínek uložen gen pro dihydrodipikolinát reduktázu, uloží ještě gen pro diaminopimelátdehydrogenázu, pocházející z koryneformní bakterie. Tento gen pro diaminopimelátdehydrogenázu by měl být rovněž výhodně uložen. Mimoto je produktivitu výroby L-lysinu možno zlepšit podobným způsobem také tak, že se místo genu pro diaminopimelátdehydrogenázu za výhodných podmínek uloží gen pro sukcinyldiaminopimeláttransaminázu a gen pro sukcinyldiaminopimelátdeacylázu.

Zesílení působení genu, uloženého za výhodných podmínek se týká zvýšení účinnosti enzymu, který je produktem exprese tohoto genu v buněčném materiálu. Může jít o zvýšení počtu kopií genů v buňkách, o zvýšení exprese genu při použití promotoru s vysokou účinností pro expresi a k zavedení mutace, zvyšující účinnost enzymu. Aby bylo možno zvýšit počet kopií genu v buňce, uloží se gen do vektoru, schopného autonomní replikace v bakteriích rodu Escherichia a bakterie se tímto vektorem transformují. S výhodou jde o plazmid ve větším počtu kopií. Počet kopií je však možno zvýšit také amplifikací DNA, integrované do chromozomální DNA při použití fágu Mu a podobně. Pokud jde o použití plazmidu, v případě ukládání mutovaného genu pro DDPS a mutovaného genu pro AKIII se s výhodou užijí plazmidy se stabilním distribučním mechanismem. Uvedené geny je možno do buněk ukládat v jakémkoliv zvoleném pořadí.

Dále bude popsán mechanismus, jímž je možno zvýšit produktivitu výroby L-lysinu postupně zesílením působení genů v systému pro biosyntézu této aminokyseliny. Biosyntetický systém, který je tvořen celou řadou reakcí je možno přirovnat ke kapalině, která protéká potrubím, tvořeným řadou trubic s různým průsvitem, zařazeným do série. Každá trubice odpovídá jednotlivému enzymu a její průsvit odpovídá rychlosti enzymatické reakce. Aby bylo možno zvýšit množství protékající kapaliny, je velmi účinné zvýšit průsvit nejužší trubice. Požadovaného účinku není možno dosáhnout tím, že se ještě zvětší průsvit trubice s velkým průsvitem. Aby bylo dále možno zvýšit průtok, je pak zapotřebí zvýšit průsvit druhé nejužší trubice. Na základě takového hlediska byly činěny pokusy o zlepšení systému pro biosyntézu L-lysinu. K tomuto účelu byl osvětlen systém pro biosyntézu L-lysinu tak, aby byla stanovena reakční rychlost v jednotlivých stupních, jak je uvedeno v příkladu 6. Postup spočíval v tom, že do E. coli byly postupně ukládány geny,, jejichž produkty se účastní biosyntézy lysinu, byly použity geny zE. coli. Pak byly postupně nahrazeny čtyři geny, dapC (gen pro tetrahydrodipikolinátsukcinylázu), dapD (gen pro sukcinyldiaminopimeláttransaminázu), depE (gen pro sukcinyldiaminopimelátdeacylázu) a dapF (gen pro diaminopimelátepimerázu) v průběhu

- 12CZ 291730 B6 biosyntézy genem pro DDH (diaminopimelátdehydrogenázu) z Brevibacterium lactofermentum, enzym katalyzuje reakce, jíž se účastní produkty těchto genů. Dále budou uvedeny uložené geny pro enzymy biosyntetického systému pro výrobu L-lysinu a odpovídající enzymy.

ppc: karboxyláza kyseliny fosfoenolpyrohroznové aspC: aspartátaminotransferáza lysC: aspartokináza III lysC*: aspartakináza III s desenzibilovanou inhibicí asd: aspartát semialdehyddehydrogenáza dapA: dihydrodipikolinátsyntetáza dapA*: dihydrodipikolinátsyntetáza s desenzibilovou inhibicí dapB: dihydrodipikolinátreduktáza

DDH: diaminopimelátdehydrogenáza, získaná z Brevibacterium lactofermentum lysA: diaminopimelátdekarboxyláza.

V důsledku ukládání jednotlivých genů do Escherichia coli bylo možno prokázat produkci L-lysinu u kmenů, do nichž byly uloženy geny lasC*, dapA nebo dapA*, přičemž kmen, obsahující dapA* produkoval nejvyšší množství L-lysinu. Na základě těchto výsledků bylo zjištěno, že reakce, katalyzovaná enzymem dapA má pro rychlost produkce zásadní význam.

V případě, že každý svrchu uvedených genů pro systém biosyntézy L-lysinu, byl ukládán do kmene, který již obsahoval dapA*, měl gen lysC* největší účinek na zvýšení produktivity výroby L-lysinu. Je tedy zřejmé, že reakce, katalyzovaná produktem genu lysC, byla další určující reakce. Stejným způsobem bylo prokázáno, že reakce, katalyzovaná produktem genu dapB měla třetí pořadí důležitosti, přičemž čtvrté pořadí náleželo reakci, katalyzované DDH. Mimoto bylo v důsledku zjištění reakční rychlosti v jednotlivých stupních u reakcí, katalyzovaných dapC, dapD, dapE a dapF po jejich nahrazení DDH prokázáno, že dapD a dapE určují rychlost produkce.

Dále budou uvedeny příklady získání genů ze systému pro biosyntézu L-lysinu z E. coli a genu pro DDH z Brevibacterium lactofermentum.

Gen získaný ppc je možno získat z plazmidu pS2, který byl popsán v Sabe H. a další, Gene, 31, 279, 1984 nebo z plazmidu pT2, který tento gen obsahuje. Fragment DNA, obsahující gen ppc se získá rozštěpením plazmidu pS2 působením enzymů AatlII a AflII. Fragment DNA s obsahem genu ppc je možno získat také rozštěpením plazmidu pT2 enzymy Smál a Scal. Kmen E. coli F15, AJ12873, obsahující plazmid pT2 byl uložen do mezinárodní sbírky kultur National Instritute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, poštovní kód 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko, pod číslem FERM BP-4732 na základě Budapešťské úmluvy.

Gen aspC je možno získat z plazmidu pLF4, popsaného v Inokuchi K. a další, Nucleic Acids Res., 10, 6 957, 1982, který tento gen obsahuje. Fragment DNA s obsahem tohoto genu je možno získat rozštěpením plazmidu pLF4 působením enzymů PvuII a Stul.

-13 CZ 291730 B6

Gen asd je možno získat z plazmidu pAD20 z publikace Haziza C. a další, EMBO, 1, 379, 1982, který tento gen obsahuje. Fragment DNA s obsahem uvedeného genu je možno získat rozštěpením plazmidu pAD20 enzymy Asel a Clal.

Gen dapB je možno získat amplifikací chromozomální DNA E. coli při použití metody PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů, tak jak jsou uvedeny například řetězcem č. 9 a 10 v seznamu řetězců. Tyto primery byly připraveny na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapB, tak jak byla uvedena v Bouvier J. a další, J. Biol. Chem., 259, 14 829,1984.

Gen pro DDH je možno získat amplifikací chromozomální DNA z Brevibacterium lactofermentum při použití PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů, například s řetězci 11 a 12 z následujícího seznamu řetězců, primery byly připraveny na základě známé nukleotidové sekvence uvedeného genu z Corynebacterium glutamicum podle Ishibo S. a další, Nucleic Acids Res., 15,3 917, 1987.

Gen lysA je možno získat amplifikací chromozomální DNA z E. coli při použití metody PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů, například s řetězcem č. 13 a 14 z dále uvedeného seznamu, primery se připraví na bázi nukleotidové sekvence známého genu lysA podle Stragier P. a další, J. Mol. Biol., 168, 321, 1983.

Gen dapD je možno připravit amplifikací chromozomálnáí DNA z kmene E. coli W3110 při použití metody PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů, například s řetězcem č. 15 a 16 z následujícího seznamu řetězců, primery se připraví na bázi známé nukleotidové sekvence genu dapD podle Richaud C. a další, j. Biol. Chem., 259, 14 824, 1984.

Gen dapE se získá amplifikací DNA zE. coli při použití metody PCR a dvou typů oligoneukletidových primerů, například s řetězcem č. 17 a 18, primery byly připraveny na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapE podle Bouvier J. a další, J. Bacteriol., 174, 5 265, 1992.

Gen dapF je možno připravit amplifikací chromozomální DNA z E. coli při použití metody PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů, například s řetězcem č. 19 a 20 z dále uvedeného seznamu řetězců, primery se připraví na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapF podle Richaud C. a další, Nucleic Acids Rea., 16,10 367, 1988.

Při provádění způsobu podle vynálezu je jako hostitele možno použít jakoukoliv bakterii, náležející do rodu Escherichia za předpokladu, že se do plazmidu jako extrachromozomální DNA uloží promotor mutovaného genu pro DDPS, mutovaného genu pro AKIII nebo jiného genu ze systému pro biosyntézu L-lysinu nebo jiný promotor, který umožní expresi funkce uvedených genů v buněčném materiálu a také počátek replikace DNA vektoru, který má být uložen do buněk tak, aby došlo k replikaci po uložení mutovaného genu pro DDPS, mutovaného genu pro AKIII nebo jiného genu ze systému pro biosyntézu L-lysinu do buněk.

Například je možno uvést mutovaný kmen E. coli,. produkující L-lysin a současně odolný proti analogům L-lysinu, Analogem lysinu se rozumí sloučenina, která způsobuje inhibici proliferace bakterií, náležejících do rodu Escherichia, avšak v těchto případech je toto potlačení zcela nebo částečně desenzibilováno v případě, že se současně v prostředí nachází L-lysin. Z analogů je možno uvést například oxalysin, lysinhydroxamát, AEC, gama-methyllysin, alfa-chlorkaprolaktam a podobně. Mutované kmeny s odolností proti analogům lysinu je možno připravit tak, že se mikroorganismus z rodu Escherichia zpracuje vyvoláním běžné umělé mutace. Jako bakteriální kmen, vhodný pro použití při výrobě L-lysinu je možno uvést kmen E. coli AJ11442, uložený do sbírky FERM pod číslem BP-1543 a do sbírky NRRL pod číslem B-12185, kmeny jsou uvedeny ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 156-18596 a v US patentovém spisu č. 4 346 170. V případě aspartokinázy ze svrchu uvedeným mikroorganismů je desenzibilováno inhibice L-lysinem na základě zpětné vazby.

- 14CZ 291730 B6

Jako příklad je však možno uvést také mikroorganismy, které produkují L-threonin vzhledem ktomu, že inhibice jejich aspartokinázy působením L-lysinu je obvykle také desenzibilována. Jako bakterie, produkující L-threonin a náležející k E. coli, je možno uvést kmen B-3996 jako kmen s dosud nejvyšší známou produktivitou. Tento kmen byl uložen ve veřejné sbírce kultur Research Institute for Genetics and Industial Microorganism Breeding pod číslem RIA 1867.

Živným prostředím, které je možno užít pro pěstování transformovaného mikroorganismu s mutovaným genem podle vynálezu, je běžné prostředí s obsahem zdroje uhlíku, zdroje dusíku, organických iontů a popřípadě dalších složek.

Jako zdroj uhlíku je možno použít cukry, například glukózu, laktózu, galaktózu, fruktózu nebo hydrolyzát škrobu, alkoholy, například glycerol nebo sorbitol nebo organické kyseliny, například kyselinu fumarovou, citrónovou nebo jantarovou.

Jako zdroje dusíku je možno použít anorganické amonné soli, například síran amonný, chlorid amonný nebo fosforečnan amonný, organické zdroje dusíku, jako hydrolyzát sojových bobů, plynný amoniak nebo vodný amoniak.

Živné prostředí by mělo obsahovat také další žádoucí složky, jako vitamin B|, L-izoleucin nebo extrakt z kvasnic, tyto složky se však obvykle vyskytují v příslušných množstvích jako stopové složky jiných organických materiálů. V případě potřeby je možno přidat malá množství fosforečnanu draselného, síranu hořečnatého a látek, obsahujících ionty železa, manganu a podobně.

Mikroorganismy se s výhodou pěstují za aerobních podmínek po dobu 16 až 72 hodin. Teplota při kultivaci se má pohybovat v rozmezí 25 až 45 °C, pH se v průběhu pěstování udržuje v rozmezí 5 až 8. K úpravě pH je možno použít anorganických nebo organických kyselých nebo alkalických sloučenin, je však možno také použít plynný amoniak a podobně.

L-lysin se po skončené fermentaci obvykle izoluje kombinací různých postupů, například při použití iontoměničové pryskyřice, srážení a jiných známých postupů.

Vynález bude dále popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněno schéma přípravy plazmidů s obsahem genů dapAl a dapA2, jde o plazmidy pdapAl a pdapA2.

Na obr. 2 je znázorněna inhibice L-lysinem v případě DDPS divokého typu a v případě mutovaných enzymů.

Na obr. 3 je znázorněn způsob přípravy plazmidů pdapAS824 s dvojitou mutací typu genu dapA*.

Na obr. 4 je znázorněna příprava plazmidů pLASCl a pLYSC2.

Na obr. 5 je znázorněn poměr vzhledu a mutace u transformantů po působení hydroxylaminem.

Na obr. 6 je znázorněna inhibice L-lysinem pro divoký typ a pro mutantu AKIII.

Na obr. 7 je znázorněna příprava plazmidů RSF24P z plazmidů RSF1010 s obsahem dapA*24.

- 15CZ 291730 B6

Na obr. 8 je znázorněna příprava plazmidu pLLC*80.

Na obr. 9 je znázorněna příprava plazmidu RSFD80 z plazmidu RSF1010 s obsahem dapA* 24 a lysC*80.

Na obr. 10 je znázorněna struktura plazmidů pdapA a pdapS* s obsahem dapA nebo dapA*.

Na obr. 11 je znázorněna struktura plazmidů plysC a plysC* s obsahem lysC nebo lysC^x80.

Na obr. 12 je znázorněna struktura plazmidu pppc s pbsahem ppc.

Na obr. 13 je znázorněna struktura plazmidu paspC s obsahem aspC.

Na obr. 14 je znázorněna struktura plazmidu pasD s obsahem asd.

Na obr. 15 je znázorněna struktura plazmidu pdapB s obsahem dapB.

Na obr. 16 je znázorněna struktura plazmidu pDDH s obsahem DDH.

Na obr. 17 je znázorněna struktura plazmidu plysA s obsahem lysA.

Na obr. 18 je znázorněn způsob výroby plazmidu pCABl zRSFIOIO s obsahem dapA*24 lysC*80 a dapB.

Na obr. 19 je znázorněn způsob výroby plazmidu pCABD2 zRSFIOIO sobsahem dapA*24, lysC*80, dapB a DDH.

Na obr. 20 je znázorněna struktura plazmidu pdapD s obsahem dapD.

Na obr. 21 je znázorněna struktura plazmidu pdapE s obsahem dapE.

Na obr. 22 je znázorněna struktura plazmidu pdapF s obsahem dapF.

Na obr. 23 je znázorněn způsob přípravy plazmidu pMWdapDEl s obsahem dapD a dapE.

Na obr. 24 je znázorněn způsob přípravy plazmidu pCABDEl, který obsahuje dapA*24, lysC*80, dapB, dapD a dapE.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

-16CZ 291730 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava mutovaného genu pro DDPS

I. Klonování genu dapA divokého typu

Nukleotidová sekvence genu dapA zE. coli již byla popsána v publikaci Richaud F. a další,

J. Bacteriol., 297, 1986 a je známo, že otevřený čtecí rámec ORF tohoto genu obsahuje 876 párů bází a kóduje bílkovinu, obsahující 292 zbytků aminokyselin. Vzhledem ktomu, že není známo, jak je gen dapA řízen, byla amplifikována pouze oblast, obsahující sekvenci SD a ORF s výjimkou promotorové oblasti při použití metody PCR a tato oblast byla klonována.

Celá DNA genomu kmene E. coli K-12 MC1061 byla extrahována způsobem podle publikace Saito a Miura, Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, 1963. Byly připraveny dva typy primerů s řetězci, které budou dále znázorněny jako řetězce č. 1 a 2 a tyto primery byly použity k provedení PCR-reakce podle publikace Erlich a další, PCR Technology, Stockton Press, 1989 a cílová DNA byla amplifikována. Získaná DNA pak byla uložena do běžně dodávaného vektoru pCRlOOO pro klonování PCR-fragmentů (Invitrogen, Ltd., Kalifornia, USA).

Plazmid pCRlOOO obsahuje promotor lacZ (Placz) a běžně se dodává, rozštěpeny v místě proti směru exprese od promotoru lacZ. V případě, že se do E. coli uloží rekombinantní DNA, získaná navázáním PCR-fragmentů mezi oběma rozštěpenými konci pCRlOOO, dojde k transkripci tohoto PCR-fragmentu pod řízením promotoru lacZ. Po vazbě PCR-fraginentu PCRlOOO se získají dva typy plazmidů, z nichž jeden je označen pdapAl, jde o plazmid, navázaný v normální orientaci a o plazmid pdapA2, navázaný v obrácené orientaci, vztaženo na směr transkripce dapA za řízení promotorem lacZ, jak je znázorněno na obr. 1.

V případě, že tyto plazmidy jsou uloženy do kmene E. coli JE7627, jemuž chybí DDPS, mají kmeny s uloženým plazmidem doplněnou auxotrofii pro kyselinu diaminopimelovou. Tímto způsobem bylo potvrzeno, že fragmenty DNA, uložené v obou plazmidech obsahují kódový gen dapA pro účinný enzym.

Trasformovaný kmen, získaný uložením plazmidů pdapAl do kmene divokého typu E. coli W3110 (National Institute of Genetics, Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonsko) byl označen W3110/pdapAl a transformaovaný kmen, získaný uložením pdapA2 do kmene E. coli W3110, byl označen W3110/pdapA2. Tyto dva transformované kmeny byly pěstovány v minimálním živném prostředí M9 se složením, které bude dále uvedeno, mimoto byl přidán AEC jako analog lysinu. Mimoto byl jako kontrola pěstován kmen W3110 bez jakéhokoliv uloženého plazmidů ve stejném živném prostředí. Oba transformované kmeny i kmen W3110 bez plazmidů zbrzdily svůj růst v přítomnosti ARC, avšak tato inhibice byla potlačena přidáním L-lysinu.

Minimální živné prostředí M9

A: (20xM9)

Na₂HPO₄. 12H₂O

KH₂PO₄

NaCl

NHjCl

303 g/l g/l g/l h/I

-17CZ 291730 B6

B: 1 M MgSO₄

C: 50% glukóza

D: thiamin 1/1

Roztoky A, B, C a D byly odděleně sterilizovány a pak byly smíseny v poměru A : B : C : D voda = 5 : 0,1 : 1 : 0,1 : 95.

2. Příprava mutovaného genu DDPS (dapA^x)

Bylo předpokládáno, že kmen s uloženým plazmidem, obsahujícím dapA^x pro DDPS s desenzibilovanou inhibici L-lysinem by měl růst na minimálním prostředí M9 se značeným množstvím AEC. Kmeny, obsahující plazmid s genem dapA^x byly proto podrobeny selekci na odolnost proti AEC.

Aby bylo možno účinně získat dapA*, byl podroben gen dapA v plazmidech pdapAl a pdapA2, připravených podle odstavce 1. tvorbě mutace.

1-2-1 Výzkum podmínek selekce pro kmen s plazmidem, obsahujícím dapA*

Kmeny W3U0/pdapAl a W3110/pdapA2, získané svrchu uvedeným způsobem, byly pěstovány na prostředí M9 na agarové plotně při různé koncentraci AEC. Byly sledovány koncentrace AEC, způsobující inhibici růstu a byly sledovány podmínky pro selekci kmenů s plazmidem, obsahujícím dapA^x.

Růst transformantů na prostředí M9 s obsahem ARC v různých koncentracích je uveden v následující tabulce 1. V této tabulce znamená + růst transfomovaného kmene, kdežto - znamená, že kmen neroste.

Tabulka 1

AEC koncentrace	W3110/pdapAl	W3110/pdapA2
(mM)
250	-	-
125	—	-
60	-	-
30	-	-
15	+	-
8	+	+
4	+	+
2	+	+

Směr transkripce genu dapA v plazmidu pdapAl je v souladu se směrem transkripce promotoru lacZ, jak je zřejmé z obr. 1. Bylo proto zjištěno, že gen dapA v tomto plazmidu je příčinou odolnosti proti působení AEC při vyšších koncentracích, i v tom případě, že jde o dapA divokého typu vzhledem ktomu, že exprese tohoto genu byla zvýšena promotorem lacZ. Naproti tomu v případě genu dapA v plazmidu pdapA2 dochází k nižší expresi a tím může dojít k inhibici růstu působením AEC již při nižších koncentracích vzhledem ktomu, že směr transkripce je opačný vzhledem k promotoru lacZ a vlastní promotor dapA chybí (růst byl potlačen přidáním 30 mM v případě kmene W3110/pdapAl a již při 15mM v případě kmene W3110/pdapA2). Bylo potvrzeno, že inhibici růstu bylo možno odstranit přidáním L-lysinu.

-18CZ 291730 B6

To znamená, že bylo možno použít plazmid pdapA2 pro zavedené mutace. K selekci kmene s obsahem plazmidu s genem dapA* bylo užito minimální prostředí M9, k němuž bylo přidáno 60 mM AEC. Toto prostředí bude dále označováno v průběhu příkladu 1 jako selekční prostředí.

1-2-2 Vyvolání mutace pdapA2 in vitro působením hydroxylaminu

Pro zavedení mutace do plazmidu pdapA2 in vitro byl použit postup, při němž se na plazmid přímo působí hydroxylaminem.

mikrogramy DNA byly zpracovány při teplotě 75 °C po dobu 1 až 4 hodiny v 0,4 M hydroxylaminu (0,1 Μ KH2PO4-I mM EDTA, ph 6,0 : 100 mikrolitrů, 1 M hydroxylamin-1 mM EDTA, pH 6,0 : 80 mikrolitrů, DNA: 2 mikrogramy, celkem 200 mikrolitrů po doplnění vodou). Takto zpracovaná DNA byla čištěna pomocí skelného prášku, uložená do E. coli W3110 a byly uskutečněny nátěry mikroorganismů na úplném živném prostředí (L-bujon: 1 % Bacto tiyptonu, 0,5 % extraktu z kvasnic, 0,5 % NaCl, 1,5 % agaru) a byla pozorována tvorba kolonií. Kolonie pak byly přeneseny na selekční prostředí, popsané v odstavci 1-2-1 a byly izolovány bakterie, vytvářející na tomto selekčním prostředí kolonie. Po dvojím opakování pokusu bylo získáno 36 kmenů s možným obsahem mutovaných plazmidů.

Uvedené kmeny byly znovu naneseny na selekční živné prostředí a byla sledována jejich odolnost proti působení AEC, pokud jde o inhibici růstu.

1-2-3 Izolace genu dapA* a sledování produktu exprese tohoto genu

Mutované plazmidy pdapA2 byly izolovány ze svrchu popsaných 36 kmenů, při použití těchto plazmidů byl pak transformován kmen JE7627, jemuž plazmid dapA chybí a také byl použit plazmid pdalA2 divokého typu. Z každého z transformovaných kmenů byly připraveny bezbuněčné extrakty a pak byla měřena účinnost DDPS.

Buněčný extrakt, to znamená roztok surového enzymu byl připraven následujícím způsobem. Transformovaný kmen byl pěstován na prostředí 2 xTY (1,6% Bacto tiyptonu, 1 % extraktu z kvasnic, 0,5 % NaCl) a byl izolován při optické hustotě přibližně 0,8 při 660 nm (OD₆₆o)· Usazenina buněk byla promyta 0,85% roztokem chloridu sodného při teplotě 0 °C a pak byl buněčný materiál uveden do suspenze ve 20 mM pufru s fosforečnanem draselným o pH 7,5 s obsahem 400 mM KC1. Buněčný materiál byl rozrušen působením ultrazvuku 10 minut při 0 °C při použití 200 W. Roztok rozrušených buněk byl odstředěn 1 hodinu při teplotě 0 °C a při 33 000 ot/min za získání supematantu, k němuž byl přidán síran amonný až do 80% nasycení. Pak byl materiál uložen přes noc při teplotě 0 °C, načež byl odstředěn, usazenina byla rozpuštěna ve 20 mM pufru fosforečnanu draselného o pH 7,5 se 400 mM chloridu draselného.

Enzymatická účinnost DDPS byla měřena podle publikace Yugari Y. a Gilvarg C., J. Biol. Chem., 240, 4 710, 1962.

Zkouška byla prováděna tak, že byla stanovena absorbance reakčního roztoku s dále uvedeným složením spektrofotometrem při teplotě 37 °C a vlnové délce 270 nm v závislosti na čase a tím bylo možno stanovit množství vytvořeného dihydrodipikolnátu. Z reakčního systému byl odstraněn pyrohroznan sodný a jeho roztok byl použit jako slepá zkouška.

-19CZ 291730 B6

Složení reakčního roztoku mM imidazolhydrochlorid, pH 7,4, mM semialdehyd kyseliny L-asparagové, mM pyrohroznan sodný, roztok enzymu voda (zbývající množství) celkový objem 1,0 ml.

K uvedenému roztoku byly v průběhu měření enzymatické účinnosti DDPS přidávány různé koncentrace L-lysinu a pak byl sledován stupeň inhibice L-lysinem. Jak je zřejmé z obr. 2, v případě DDPS divokého typu docházelo k inhibici L-lysinem. Plazmidy pro mutanty připravené z transformovaných kmenů s obsahem DDPS, odolné proti inhibici L-lysinem byly srovnávány s divokým typem, byly vybrány tři z 36 možných plazmidů. Tyto plazmidy byly označeny pdapAS8, pdapAS9 a pdapAS24. Podle následujícího stanovení nukleotidové sekvence bylo zjištěno, že plazmidy pdapAS8 a pdapAS9 obsahovaly tutéž mutaci.

Stupeň desenzibilace inhibice L-lysinem se poněkud měnil u všech tří mutant DDPS, pro něž jsou kódem svrchu uvedené plazmidy, avšak desenzitizace byla inhibována u všech tří mutant. I když specifická účinnost enzymu může být ovlivněna také růstovou fází buněk a způsobem přípravy vzorků, došlo přece jen ve všech případech pouze k nepatrnému snížení účinnosti ve srovnání s enzymem divokého typu. Plazmidy je proto možno použít k vytvoření organismů, produkujících enzym, odolný proti inhibici.

1-2-4 Stanovení nukleotidové sekvence mutovaného genu dapA

Nukleotidové sekvence mutovaných genů dapA byly stanoveny běžným způsobem při použití analyzátoru ABI Model 373A (Applied Biosystems lne.). Bylo prokázáno, že vpdapAS8 a psapAS9 je C v poloze 487 nahrazeno Tav pdapAS24 je C v poloze 597 nahrazeno T ve srovnání se sekvencí divokého typu genu dapA, tak je znázorněna v řetězci č. 3. V důsledku toho v řetězci aminokyselin dochází v DDPS, pro niž je kódem pdapAS8 a pdapAS9 k náhradě alaninového zbytku v poloze 81 za zbytek valinu a v DDPS, pro niž je kódem pdapAS24, dochází k náhradě histidinového zbytku v poloze 118 za tyrosinový zbytek v řetězci aminokyselin, který je znázorněn jako řetězec č. 4.

1-2-5 Příprava dapA s dvojitou mutací

Svrchu uvedeným způsobem byly získány dva typy mutovaných genů dapA. Aby bylo možno ověřit, zda ve výsledném enzymu dochází nebo nedochází k inhibici, byl připraven plazmid s obsahem dapA s obojí mutací. Způsob výroby tohoto plazmidů je znázorněn na obr. 3. Získaný plazmid s dvojitou mutací byl označen pdapAS824.

Příklad 2

Příprava mutanty genu AKIII

1. Klonování divokého typu genu lysC

Nukleotidová sekvence genu pro AKIII (lysC) z E. coli již byla popsána v publikacích Cassan M., Parsot C., Cohen G. N. a Patte J. C., J. Biol. Chem., 261, 1 052, 1986 a je známo, že ve svém otevřeném čtecím rámci (ORF) obsahuje 1 347 párů bází a je kódovým řetězcem pro bílkovinu, obsahující 449 zbytků aminokyselin. Tento gen obsahuje operátor a je potlačován L-lysinem.

-20CZ 291730 B6

K odstranění operátorové oblasti byla amplifikována pomocí PCR pouze oblast, obsahující sekvenci SD a ORF a tato oblast pak byla klonována.

Byla připravena DNA celého genomu kmene E. coli K-12 MC1061 způsobem podle publikace Saito a Muira, Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, 1963. Byly připraveny dva typy primerů s dále uvedeným řetězcem č. 5 a č. 6 a tyto primery byly použity k uskutečnění PCR-reakce podle publikace Erlich a další, PCR Technology, Stoskton Press, 1989 a gen lysC amplifikován. Získaná DNA byla rozštěpena pomocí enzymu BamHI a Asel, zakončení byla doplněna a materiál byl uložen do místa působení Smál vektoru PUC18. Toto místo působení enzymu Smál je uloženo proti směru exprese od promotoru lacZ v tomto vektoru a v případě, že se rekombinantní DNA, získaná uložením fragmentu DNA do místa působení Smál plazmidu pUC18 uloží do E. coli, dojde k transkripci uložené DNA pod řízením promotoru lacZ. Po uložení PCR-fragmentu do místa Smál v plazmidu pUC 18 byly získány dva plazmidy, které byly označeny pLYSCl v případě plazmidu s uloženým fragmentem v obrácené orientaci a pLASC2 v případě plazmidu s fragmentem, uloženým v normální orientaci pro směr transkripce lysC pod řízením transkripce promotorem lacZ, jak je zřejmé z obr. 4.

Tyto plazmidy byly použity k transformaci kmene E. coli GT3 (thrA1016b, metLM1005, lysC 1004) jako kmene, jemuž zcela chybí AKI, AKII, AKIII a byla doplněna auxotrofie GT3 pro homoserin a pro kyselinu diaminopimelovou. Bylo potvrzeno, že fragmenty DNA, uložené do obou plazmidů obsahují gen lysC s kódovým řetězcem pro účinný enzym AKIII.

Transformovaný kmen, získaný uložením pLYSCl do kmene E. coli GT3 byl označen GT3/pLAYSCl a transformovaný kmen, získaný uložením pLYSC2 do kmene E. coli GT3 byl označen GT3/pLYSC2. K minimálnímu živnému prostředí M9 bylo přidáno větší množství L-lysinu a oba uvedené kmeny byly v tomto živném prostředí pěstovány. Oba uvedené kmeny obsahují plazmidy s obsahem lysC divokého typu, v nichž enzym AKIII, pro nějž je kódem lysC, je jediným enzymem typu AK. Divoký typ AK3 je inhibován v přítomnosti většího množství L-lysinu. To znamená, že ani jeden z uvedených kmenů nebyl schopen syntetizovat L-threonin, L-izoleucin, L-methionin a kyselinu diaminopimelovou, DAP, a jejich růst byl potlačen.

2. Příprava mutanty genu pro AKIII, lysC*

Bylo předpokládáno, že kmen, do nějž byl uložen plazmid lysC* s kódovým řetězcem pro AK s desenzibilovanou inhibicí L-lysinem bude růst na minimálním živném prostředí M9 s přísadou většího množství L-lysinu. Kmen, obsahující plazmid s uloženým genem lysC*-byl získán selekcí kmenů, pěstovaných v přítomnosti L-lysinu a odolných proti L-lysinu nebo AEC jako analogu L-lysinu.

Aby bylo možno účinně získat mutovaný gen, byly plazmidy pLYSCl a pLYSC2, obsahující lysC a připravené v odstavci 1. podrobeny tvorbě mutace.

2-2-1 Zjištění podmínek pro selekci kmenů s plazmidem uloženým genem lysC*

Kmeny GT3/pLYSCl a GT3/pLYSC2 byly pěstovány na agarovém prostředí M9 s obsahem různých koncentrací L-lysinu nebo AEC. Byly sledovány inhibiční koncentrace L-lysinu nebo AEC a tím byly zjištěny podmínky pro selekci kmene, obsahujícího gen lysC*.

Růst transformovaných kmenů na prostředí M9 s obsahem L-lysinu nebo AEC v různých koncentracích je uveden v následující tabulce 2. V této tabulce znamená + růst transformantu, + znamená mírný růst a - znamená, že k růstu nedochází.

-21 CZ 291730 B6

Tabulka 2

Závislost růstu na koncentraci L-lysinu

	0	0,2 0,4 0,8	1,5	3	6 12 25 50	100	200 (mM)
GT3/pLYSCl	+
GT3/pLYSC2	+	+ + +	+	+	+ + + +	±	-
Závislost růstu na koncentraci AEC
	0	0,2 0,4	0,8	1,5	3 6 12	25	50 (mM)
GT3/pLYSCl	+	- -	-	-	_ _ _	-	-
GT3/pLYSC2	+	± ±	±	±	± - -	-	-

Směr transkripce genu lysC v plazmidu pLYSC2 odpovídá směru transkripce pod řízením promotoru lacZ, jak je zřejmé z obr. 4. Bylo tedy prokázáno, že gen lysC v tomto plazmidu může zajistit odolnost proti působení L-lysinu nebo AEC i ve vy sokých koncentracích, a to i když gen lysC zůstává ve formě, odpovídající divokému typu vzhledem ktomu, že byl amplifíkován promotorem lacZ, kdežto tentýž gen v plazmidu pLYSCl není uložen ve správném směru a dochází proto kjeho nižší expresi a tím i k inhibici růstu L-lysinem a AEC již v nižší koncentraci, protože gen je uložen v opačném směru vzhledem k promotoru lacZ a promotor sám je rovněž deficientní. Růst není potlačen až do 100 mM L-lysinu a až do 3 mM v případě kmene GT3/pLYSC2, kdežto k úplnému potlačení růstu dojde po přidání 0,2 mM L-lysinu nebo AEC v případě kmene GT3/pLYSCl. Bylo potvrzeno, že inhibici růstu je možno potlačit současným přidáním homoserinu a kyseliny diaminopimelové.

Plazmid pLYSCl byl proto použit k uskutečnění mutace. Prostředí, připravené přidáním 10 mM L-lysinu nebo 0,2 mM AEC k minimálními prostředí M9 bylo použito pro selekci kmenů s plazmidem, obsahujících lysC*. Toto prostředí je označováno jako „selekční prostředí“.

2-2-2 Vyvolání mutace v plazmidu pLYSCl in vitro působením hydroxylaminu

Pro zavedení mutace do plazmidu pLYSCl byly použity dvě metody, jedna z nich byla metoda in vitro, při níž byly plazmidy přímo zpracovány působením hydroxylaminu, druhá metoda byla prováděna in vivo a mutace při tomto postupu byla prováděna tak, že buněčný materiál s obsahem plazmidu byl zpracován působením nitrozoguanidinu, NTG, s následnou extrakcí plazmidu, aby bylo možno zjistit různé mutace, zvláště byly očekávány mutace, odlišné od mutace cytosinu na thymin po působení hydroxylaminu.

Vyvolání mutace in vitro působením hydroxylaminu mikrogramy DNA byly podrobeny při teplotě 75 °C po dobu 1 až 4 hodin působením 0,4 M hydroxylaminu (0,1 M KH₂PO₄-1 mM EDTA, pH 6,0 : 100 mikrolitrů, 1M hydroxylaminu1 mM EDTA, pH 6,0 : 80 mikrolitrů, DNA: 2 mikrogramy, celkem 200 mikrolitrů po doplnění vodou). DNA po tomto působení byla čištěna s použitím skelného prášku, uložena do kmene E. coli GT3, neprodukujícího žádný enzym typu AK a naočkována na úplné živné prostředí (L-bujon: 1% tryptonu Bacto, 0,5% extraktu z kvasnic, 0,5% NaCl, 1,5% agaru) a byla pozorována tvorba kolonií. Tyto kolonie pak byly přeneseny na selekční prostředí, popsané v odstavci 2-2-1 a byly vybrány kmeny, schopné růst na tomto prostředí. Poměr transformantů a mutací je znázorněn na obr. 5. Při působení po dobu 4 hodin byly získány mutované kmeny v podstatě vyšším poměru v rozmezí 0,5 až 0,8 %.

-22CZ 291730 B6

Vyvolání mutace in vivo působením NTG pLYSCl byl uložen do kmene E. coli MC1061 a buněčný materiál byl zpracován působením NTG. Buňky po zpracování byly pěstovány přes noc k fixaci mutace a pak byl plazmid z těchto buněk extrahován a uložen do buněk kmene E. coli GT3. Transformovaný kmen byl pěstován na živném prostředí 2 x TY (1,6 % tryptonu Bacto, 1 % extraktu z kvasnic a 0,5 % NaCl), materiál byl izolován při optické hustotě OD₆₆₀ přibližně 0,3, promyt pufřem TM, který bude dále popsán a pak uveden do suspenze v roztoku NTG (připraveném rozpuštěním NTG v koncentraci 0,2 mg/ml v pufru TM) a zpracováván při teplotě 37 °C po dobu 0 až 90 minut. Pak byl buněčný materiál promyt pufrem TM a prostředím 2 x TY a mutace byla fixována pěstováním buněk přes noc v prostředí 2 x TY. Pak byla z buněk extrahována DNA plazmidu a uložena do kmene E. coli GT3. Vyhledávaní kmenů s obsahem mutace bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladě mutace in vitro, čímž byly získány mutanty s odolností proti lvsinu (Lys^R) a mutanty s odolností proti AEC (AEC^r).

Složení pufru (tm)

tris kyselina maleinová síran amonný MgSO4.7H2O dusičnan vápenatý FeSO4.7H2O

50 mM 50 mM 1 g/i 0,1 g/1 5 mg/1 0,25 mg/ml

pH se upraví na 6,0 přidáním NaOH.

Celkem 180 kmenů, získaných svrchu uvedeným způsobem, a to 48 kmenů po působení hydroxylaminu a 132 kmenů po působení NTG bylo znovu naneseno na selekční prostředí, po ověření odolnosti proti AEC a L-lysinu se počet těchto kmenů snížil na 153. Vzhledem k odlišnosti nahromadění aminokyselin v živném prostředí bylo těchto 153 kmenů rozděleno do 14 skupin a účinnost AK byla měřena po selekci reprezentativních kmenů z každé skupiny. Nebylo možno pozorovat velký rozdíl v účinnosti AK mezi kmeny, které byly získány působením hydroxylaminu a kmeny, získanými působením NTG. Proto byly provedeny následující pokusy bez rozlišování těchto kmenů.

2-2-3 Izolace kmenu lysC* a sledování produktu exprese tohoto genu

Kmeny č. 24,43, 48,60, 80,117,126, 149,150,156,158,167,169 a 172 byly vybrány jako reprezentativní kmeny ze svrchu uvedených 14 skupin. Ze všech těchto kmenů byly izolovány plazmidy, odvozené od původního plazmidu pLYSCl a byly označovány pLYSCl*4, pLYSCl *43, pLYSCl *48, pLYSCl *60, pLYSCl *80, pLYSCl* 117, pLYSCl *126, pLYSCl*149, pLYSCl*150, pLYSCl*156, pLYSCl*158, pLYSCl*167, pLYSCl*169 a pLYSCl*172. Těmito plazmidy byl pak transformován kmen GT3, neprodukující žádný enzym typu AK, tento kmen byl rovněž transformován plazmidem divokého typu pLYSCl. Z každého transformovaného kmene byl připraven bezbuněčný extrakt a byla měřena účinnost AKIII.

Bezbuněčný extrakt (roztok surového enzymu) byl připraven následujícím způsobem. Transformované kmeny byly pěstovány na prostředí 2 x TY a buněčný materiál byl oddělen při optické hustotě OD^o přibližně 0,8. Pak byl tento materiál promyt směsí 0,02 M dihydrogenfosforečnanu draselného o pH 6,75 a 0,03 M beta-merkaptoethanolu při teplotě 0 °C a buňky byly rozrušeny ultrazvukem při teplotě 0 °C, 100 W, 4 x 30 minut. Roztok rozrušených buněk byl odstředěn při 33 000 ot/min po dobu 1 hodiny při teplotě 0 °C, k supematantu byl pak přidán síran amonný do 80% nasycení. Po odstředění byla usazenina rozpuštěna ve směsi 0,02 M dihydrogenfosforečnanu draselného o pH 6,75 a 0,03 M beta-merkaptoethanolu a roztok byl uložen přes noc při 0 °C.

-23CZ 291730 B6

Enzymatická účinnost enzymu AKIII byla měřena způsobem podle publikace Stadtman E. R., Cohen G. N., Lebras G. a Robichon-Szulmajster H., J. Biol. Chem., 236, 2 033, 1961. Reakční roztok s dále uvedeným složením byl inkubován při teplotě 27 °C po dobu 45 minut a pak byl k vyvolání zabarvení přidán roztok chloridu železitého (2,8 N HCI, 0,4 ml + 12% TCA, 0,4 ml + 5% FeCl₃.6H₂O/0,l NHC1, 0,7 ml) a roztok byl odstředěn, načež byla měřena absorbance supematantu při 540 nm. Účinnost byla vyjádřena v množství kyseliny hydroxamové, vytvořené za minutu (1 U = 1 mikromol/min). Molámí absorpční koeficient byl 600. Z reakčního roztoku byl oddělen aspartát draselný, který byl použit jako slepá zkouška.

Složení reakčního roztoku

Reakční směs^x 0,3ml roztok hydroxylaminu^xx 0,2ml

0,1 M aspartát draselný, pH 7,0 0,1ml roztok enzymu voda do 1,0ml ^x 1M tris-HCl, pH 8,1,9 ml + 0,3 M síran hořečnatý, 0,5 ml + 0,2 Μ ATP, pH 7,0, 5 ml, ^xx 8 M roztok hydroxylaminu byl neutralizován přidáním KOH těsně před použitím.

K reakčnímu roztoku s obsahem enzymu byly přidány různé koncentrace L-lysinu pro měření účinnosti enzymu AK a byl sledován stupeň inhibice L-lysinem, Výsledky jsou uvedeny na obr. 6 a v tabulce 3. Výsledky pro divoký typ a pro mutanty č. 24,43,48, 60, 80,117 a 126 jsou znázorněny na obr. 6A, výsledky pro mutanty č. 149, 150, 156, 158, 167, 169 a 172 jsou znázorněny na obr. 6B.

Jak je z uvedených výsledků zřejmé, dochází k silné inhibici AKIII divokého typu působením L-lysinu, a to k 50% inhibici při koncentraci přibližně 0,45 mM a ke 100% inhibici při koncentraci 5 mM L-lysinu. Na druhé straně získané mutanty AKIII byly ve všech případech desenzibilovány proti této inhibici, i když rozsah desenzitizace byl různý. Zejména v případě mutant č. 24,80, 117,169 a 172 bylo možno pozorovat inhibici pouze výjimečně i při koncentraci 100 mM L-lysinu a 50% inhibiční koncentrace pro tyto mutanty byly nejméně 200x vyšší ve srovnání s enzymem divokého typu. Specifická účinnost na celou bílkovinu, která by mohla být ovlivněna růstovou fází buněk a způsobem přípravy vzorků byla stejná nebo vyšší než v případě enzymu divokého typu téměř ve všech případech, takže v podstatě nevzniknul problém snížení účinnosti v důsledku zavedení mutace, jak je zřejmé z tabulky 3. Na základě těchto skutečností je možno předpokládat, že oblast při účinnost AKIII je nezávislá na řídicí oblasti, která může být nepříznivě ovlivněna L-lysinem. V tabulce 3 znamená stupeň desenzibilace inhibice v procentech účinnost enzymu AK v přítomnosti 100 mM L-lysinu ve srovnání s účinností téhož enzymu bez přítomnosti L-lysinu. Tepelná stálost v procentech je poměr zbývající účinnosti po působení teploty 55 °C po dobu 1,5 hodiny ve srovnání s původní účinností.

-24CZ 291730 B6

Tabulka 3

	specifická účinnost U/mg bílkoviny	stupeň desenzibilace v %x	tepelná stálost °/<řx
Divoký typ	0,0247	0	18
117	0,0069	120	0
24	0,0218	100	30
80	0,0244	99	36
172	0,0189	97	0
169	0,0128	96	2
150	0,0062	77	25
126	0,0250	61	39
149	0,0256	59	9
167	0,0083	43	45
48	0,0228	38	42
60	0,0144	35	9
158	0,0224	22	42
156	0,0101	18	2
43	0,0212	17	0

Účinnost AK v % v přítomnosti 100 mM L-lysinu ve srovnání s účinností téhož enzymu v nepřítomnosti L-lysinu, poměr zbývající účinnosti v % po působení teploty 55 °C po dobu 1,5 hodiny.

Bylo zapotřebí prokázat chování mutant enzymů při vyšších teplotách. V případě, že účinnost enzymu má být zvýšena, je důležité, aby vytvořený enzym, zůstával stálý i v buňkách. Při měření in vitro se vyskytují některé problémy vzhledem k odlišnosti účinnosti některých proteáz uvnitř buněk a mimo ně a v důsledku vlivu pufrů na skladování enzymů in vitro. Avšak vzhledem k tomu, že tato metoda je jednoduchá, byla tepelná stálost mutant AKIII sledována také in vitro.

Z výsledků sledování inaktivace uvedených mutant při různých teplotách za různých podmínek byl nakonec jako vhodný ukazatel zvolen poměr zbývající účinnosti po působení teplot} 55 °C po dobu 90 minut k původní účinnosti. Jak je zřejmé z tabulky 3, přibližně polovina mutovaných enzymů byla stálejší než enzym divokého typu. Tato skutečnost je zajímavá vzhledem k tomu, že mutované enzymy jsou často méně stálé než enzym, původní. Avšak v tomto případě byly některé mutanty AKIII velmi stálé a řada z nich bude pravděpodobně dobře prakticky použitelná pro výrobu L-lysinu.

2-2-4 Stanovení sekvence bází lysC divokého typu a mutovaného lysC

Nukleotidová sekvence genu lysC divokého typu byla stanovena běžnými postupy při použití analyzátoru ABI Model 373A (Applied Biosystems lne.). Analyzován byl řetězec č. 7. V důsledku této analýzy byly prokázány rozdíly na šesti místech (dvě místa na úrovni aminokyselin) ve srovnání sjiž zveřejněnou sekvencí pro lysC z kmene E. coli K-12 JC411 podle Cassan M., Rarsot C., Cohen G. N. a Patte J. C., J. Biol. Chem., 261,1 052,1986. Je pravděpodobné, že rozdíl v uvedených šesti místech je typický pro použitý odlišný bakteriální kmen.

Obdobným způsobem byla analyzována sekvence bází pro každou ze čtrnácti mutant pLYSCl, které jsou označeny lysC* a byla určena místa, v nichž došlo k mutaci. Výsledky této analýzy jsou uvedeny v následující tabulce 4. V této tabulce znamenají údaje, uvedené v závorkách mutace zbytků aminokyselin, k nimž došlo v důsledku mutací nukleotidů. Bylo prokázáno 12 typů mutací vzhledem ktomu, že dvě dvojice mutant, a to mutanta č. 4 a 167 a mutanta č. 24 a 80 obsahovaly tutéž mutaci. Pokud jde o způsob tvorby mutace, byly mutace č. 149, 150, 156, 158, 167, 169 a 172 získány po působení hydroxylaminu a mutace č. 24, 43, 48, 60, 80, 117 a 126 byly získány po působení NTG. Avšak pokud jde o typ mutace, šlo o mutace z cytosinu na thimin nebo o mutaci z guaninu na adenin na kódovém řetězci vzhledem k mutaci z cytosinu na thymin v nekódové části řetězce.

-25CZ 291730 B6

Tabulka 4

Určení míst mutace v genech lysC*

typ mutace lysC* mutace č.	mutagen	místo mutace (změna) aminokyseliny)
126	N	GGT-CA*T (323Gly-Asp)
43	N	GGT-GA*T (323Gly-Asp) GGC-GA’C (408Gly-Asp)
149	H	CGT-T*GT (34Arg-Cys) GGT-GA*T (323Gly-Asp)
48/167	N/H	CTC-T*TC (325Leu-Phe)
150	H	ATG-ATA’ (318Met-Ile)
172	H	775C-T (tichá) ATG-ATA’ (318Met-Ile) GTG-A*TG (349Val-Met)
117	N	TCA-TT‘A (345Ser-Leu)
158	H	GTG-A’TG (347Val-Met)
24/80	N/H	ACC-AT‘C (325Thr-Ile)
169	H	923C-T (tichá) ACC-AT‘C (352Thr-Ile) TCT-ΤΤ’Τ (369Ser-Phe)
60	N	859G-A (tichá) GAA-A’AA (164Glu-Lys)
156	H	ATG-ATA’ (417Met-Ile)

TGT-TA’T (⁴¹⁹Cys-Tyr) ²⁰¹⁴C-T (tichá)

H = působení hydroxylaminu, N = působení NTG

Příklad 3

Výroba L-lysinu fermentací kmene s obsahem dapA*

Aby bylo možno vyrábět L-lysin při využití bakterií E. coli podle zveřejněné japonské patentové 15 přihlášky č. 56-18 596 a také podle US č. 4 346 170 a Applied Microbiology and Biotechnology,

15, 227-231, 1982, bylo považováno za podstatné, aby hostitel, vybraný pro zlepšení účinnosti DDPS produkoval aspartokinázu, modifikovanou tak, aby u ní nedocházelo k inhibici L-lysinem. Příkladem takového kmene mohou být bakterie, produkující L-threonin. Z těchto kmenů má kmen E. coli B-3996 dosud nejvyšší známou produktivitu. Z tohoto důvodu byl kmen B-3996 20 použit jako hostitelský kmen pro vyhodnocení dapA*. Kmen B-3996 obsahuje plazmid pVIC40 extrachromozomálně jako samostatný plazmid. Podrobnosti jsou uvedeny ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 3-501 682 (PCT). Tento mikroorganismus je uložen ve veřejné sbírce kultur Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding pod registračním číslem RIA 1867.

Na druhé straně byl gen dapA*, obsažený v pdapAS24 (v němž je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu) zvolen jako dapA* pro uložení do E. coli na základě stupně desenzibilace inhibice a specifické účinnosti enzymu. Aby bylo možno zvýšit expresi genu dapA* a současně zvýšit stálost plazmidu, byl mutovaný gen, existující v pdapAS24, který bude 30 dále uváděn jako dapA*24, navázán proti směru exprese od promotoru genu pro odolnost proti tetracyklinu v pVIC40 a tím bylo možno získat RSF24P, jak je znázorněno na obr. 7.

-26CZ 291730 B6

Kmen, který byl získán uložením plazmidu RSF24P do kmene E. coli JMI09 byl označen AJ12395 a tento kmen byl uložen 28. října 1993 do veřejné sbírky kultur National Institute od Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology pod pořadovým číslem FERM P—13935 a pak byl z původního místa uložení přenesen v tomtéž místě do mezinárodní sbírky, odpovídající Budapešťské úmluvě, kde byl zařazen 1. listopadu 1994 pod pořadovým číslem FERm BP-4858. Kmeny s uloženými plazmidy pdapAS8 a pdapAS9 nebyly uloženy. Avšak všechna místa mutací v genech dapA* v každém z těchto plazmidů byla ověřena, jak již bylo svrchu popsáno. Je tedy pro odborníka snadné izolovat plazmid z uloženého mikroorganismu při použití způsobu podle publikace Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21, 1989, a požadovaný gen je možno připravit cílenou tvorbou mutace podle téže publikace, 15.63,1989.

Plazmid pVIC40 byl odstraněn z kmene B-3996 běžným způsobem a tak byl získán kmen B-399, neobsahující žádný plazmid. Do tohoto kmene byl pak uložen známým způsobem plazmid RSF24P, čímž byl získán kmen B-3999/RSF24P. Pak byla vyhodnocena produktivita získaného kmene pro L-lysin.

Mimoto byl zkonstruován plazmid RSFP jako kontrolní plazmid. Velký fragment byl izolován z plazmidu pVIC40 po dvojí štěpení enzymy BamHI a Dral, jak je znázorněno na obr. 7 a konce byly vyplněny Klenowovým fragmentem DNA-polymerázy. Velký fragment s vyplněnými konci byl pak svými konci navázán za vzniku plazmidu RSFP, který byl běžným způsobem uložen do kmene B-399 a tím byl získán kmen B-399/RSFP. I pro tento kmen byla vyhodnocena produktivita pro L-lysin.

Kmeny byly pěstovány v třepací kultuře při 114 až 116 ot/min celkem 48 hodin při teplotě 37 °C v prostředí s následujícím složením. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5.

Prostředí pro produkci L-lysin

A.

složkag/1 síran amonný16 dihydrogenfosforečnan draselný1

MgSO₄.7H₂O1

FeSO₄.7H₂O0,01

MnSO₄.5H₂O0,01 extrakt z kvasnic (Difco)2

L-methionin0,5

L-threonin0,1

L-izoleucin0,05 pH se upraví na 7,0 přidáním KOH, sterilizace 10 minut vautoklávu při 115 °C (objem 16/20).

B.

20% glukóza, sterilizace 10 minut v autoklávu při 115 °C (objem 4/20).

C.

Uhličitan vápenatý s čistotou podle lékopisu, sterilizace teplem v suchém stavu dva dny při teplotě 180 °C, 30 g/1.

-27CZ 291730 B6

Složky A a B se smísí v poměru 4 : 1, do 1 litru této směsi se přidá 30 g složky C, která se rozpustí a pak se přidají antibiotika, a to 100 mikrogramů/ml streptomycinu a 5 mikrogramů/ml kanamycinu.

Tabulka 5

Bakteriální kmen

B-399/RSF24P

B-399/RSFP produkované množství L-lysinhydrochloridu

4,1 g/1

0,0 g/1

Příklad 4

Produkce L-lysinu fermentací při použití kmene s uloženými geny dapA* a lysC* (I)

Účinek mutanty DDPS na produkci L-lysinu byl popsán v příkladu 3. Aby bylo možno dosáhnout dalšího zlepšení, byl mutovaný gen pro AKIII, získaný v příkladu 2 uveden do koexistence s mutovaným genem DDPS. Mutovaný gen AKIII k tomuto účelu byl vybrán z kmene č. 80 (lysC*) na základě účinnosti enzymu, jeho tepelné stálosti a dalších parametrů.

Gen lysC*80 byl použit po vyjmutí z plazmidu pLLC*80 (obr. 8), který byl připraven navázáním genu lysC* z plazmidu pLYSCl*80 (dále bude uváděn jako lysC*80) proti směru exprese od promotoru lacZ v plazmidu pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Uložení je v obráceném směru vzhledem k plazmidu pUC18, tak, aby bylo možno zvýšit expresi genu lysC*. Plazmid pLLC*80 je plazmid, který byl připraven k tomu účelu, aby bylo umožněno zajistit směr k tomu účelu, aby bylo umožněno zajistit směr transkripce genu lysC*80 v normální orientaci vzhledem k promotoru lacZ a tak bylo možno zlepšit produktivitu pro L-lysin vzhledem ktomu, že lycC*80 v plazmidu pLYSCl*80 má směr transkripce v obrácené orientaci vzhledem k promotoru lacZ.

Z plazmidů pLLC*80 a RSF24P, získaných v příkladu 3 byl připraven plazmid RSFD80, obsahující geny dapA* a lysC*, jak je znázorněno na obr. 9. Plazmid RSFD80 obsahuje geny dapA*24 a lysC*80 v uvedeném pořadí tak, aby směr transkripce byl v normální orientaci vzhledem k tetP proti směru exprese od promotoru tetP v genu pro odolnost tetracyklinu.

Plazmid RSFD80 byl pak uložen do kmene E. coli JMI09 a tento kmen byl označen AJ12396 a pak uložen do veřejné sbírky kultur National Institute of Bioscience and Human Technology ofAgency of Industrial Science and Technology dne 28. října 1993 pod pořadovým číslem FERMP-13936 a pak byl 1. listopadu 1994 přenesen z původního uložení do mezinárodní sbírky, odpovídající Budapešťské úmluvě, kde byl uložen pod pořadovým číslem FERM BP-4859. Kmeny, obsahující mutované plazmidy 1PYSC*24, pLYSCl*43, pLYSCl*48, pLYSCl*60, pLYSCl*117, pLYSCl*126, pLYSCl*149, pLYSCl*150, pLYSCl*156, pLYSCl*158, pLYSCl*167, pLYSCl*169 a pLYSCl*172 nebyly uloženy. Avšak všechna místa mutací v každém z uvedených plazmidů byla definována, jak již bylo svrchu uvedeno. Pro odborníka bude tedy snadné izolovat plazmid ze svrchu uloženého mikroorganismu při použití způsobu podle publikace Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21, 1989, a pak získat požadovaný hen při použití cílené tvorby mutace podle téže publikace, 15.63, 1989, Plazmid RSFD80 se uloží do kmene B-399 běžným způsobem, čímž vzniká kmen B-399/RSFD80. Produktivita tohoto kmene pro L-lysin byla vyhodnocena a podobným způsobem byla vyhodnocena také produktivita kontrolního kmene B-399/RSFP.

-28CZ 291730 B6

Kmeny byly pěstovány v třepací kultuře při 114 až 116 ot/min po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C při použití téhož živného prostředí, které bylo použito pro produkci L-lysinu v příkladu 3. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

Tabulka 6 bakteriální kmen

B-399/RSFD80

B-399/RSFP produkované množství L-lysinhydrochloridu

9,2 g/1

0,0 g/1

Příklad 5

Produkce L-lysinu fermentací při použití kmene s uloženými geny dapA* lysC* (II)

V příkladu 4 bylo potvrzeno, že produktivitu pro L-lysin je možno zlepšit tak, že se do bakterie z rodu Escherichia uloží mutovaný gen dapA a současně mutovaný gen lysC. byly proto prováděny pokusy za účelem zjistit, zda se tento účinek změní v případě, že se užije jiný hostitel.

V tomto případě byl jako hostitel použit kmen E. coli W3110 (tyrA). Tento kmen byl podrobně popsán ve zveřejněné evropské patentové přihlášce EP č. 488 424/92. Dále bude krátce popsán způsob získání kmene s uloženými mutovanými geny. Kmen E. coli W3110 byl získán z veřejné sbírky National Institute of Genetics (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonsko). Kmen byl naočkován na plotnu LB s obsahem streptomycinu a kmen, odolný proti streptomycinu byl získán vybíráním kmenů, které na tomto živném prostředí vytvářely kolonie. Zvolený kmen, odolný proti streptomycinu byl smísen s kmenem E. coli K--12 ME8424 a oba kmeny byly společně pěstovány na úplném živném prostředí (L-bujon: 1 % tryptonu Bacto, 0,5 % extraktu z kvasnic a 0,5 % NaCl) 15 minut při teplotě 37 °C, aby došlo ke konjugaci. Kmen E. coli K-12 ME8424 má genetickou charakteristiku (HfrPO45, thi, relAl, tyrA::Tnl0, ung-1, nadB) a je možno jej získat ze sbírky National Institute of Genetics.

Směs pak byla naočkována na svrchu uvedené úplné živné prostředí s obsahem streptomycinu, tetracyklinu a L-tyrosinu a byly izolovány kmeny, vytvářející za těchto podmínek kolonie. Izolovaný kmen byl označen E. coli W3110 (tyrA).

Ve zveřejněné evropské patentové přihlášce EP č. 488 424/92 se popisuje celá řada kmenů, získaných uložením různých plazmidů do kmene W3110 (tyrA). Například kmen, který byl získán uložením plazmidů pHATerm byl označen jako kmen E. coli W3110 (tyrA) / pHATerm a byl uložen do veřejné sbírky kultur National Institute of Bioscience and Human Technology od Agency of Industrial Science and Technology, pod pořadovým číslem FERM BP-3653. Kmen W3110 (tyrA) je možno připravit také úpravou kmene E. coli W3110 (tyrA)/pHATerm tak, že se z tohoto kmene vyjme plazmid pHATerm. Toto vyjmutí je možno uskutečnit některým z běžných postupů.

Plazmid RSFD80, který obsahuje mutované geny dapA* a lysC*, získaný podle příkladu 4, byl uložen do svrchu popsaného kmene W3110 (tyrA), čímž byl získán kmen W3110 (tyrA)/RSFD80. Pro tento kmen pak byla vyhodnocena produktivita při produkci L-lysinu. K vytvoření kontrolního kmene byl plazmid RSFP uložen rovněž do kmene W3110 (tyrA) běžným způsobem, čímž byl vytvořen kmen W3110 (tyrA)/RSFP. Také pro tento kontrolní kmen byla vyhodnocena jeho produktivita při produkci L-lysinu.

Oba kmeny byly pěstovány v třepací kultuře při 114 až 116 ot/min po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C a při použití svrchu uvedeného živného prostředí pro produkci L-lysinu. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 7.

-29CZ 291730 B6

Tabulka 7 bakteriální kmen

W3110 (tyrA)/RSFD80

W3110 (tyrA)/RSFP produkované množství L-lysinhydrochloridu

8,9 gA

0,0 g/1

Příklad 6

Analýza systému, produkujícího biosynteticky L-lysin a zlepšení produktivity pro L-lysin u bakterií z rodu Escherichia, produkující L-lysin

Při zlepšení produktivity L-lysinu je zapotřebí analyzovat systém pro biosyntézu L-lysinu z E. coli a geny pro enzymy, které katalyzují jednotlivé stupně produkce L-lysinu těmito kmeny fermentací.

1. Identifikace prvořadých určujících stupňů

6-1-1 Příprava genu pro systém biosyntézy L-lysinu

V tomto stupni byly izolovány různé geny v systému pro biosyntézu L-lysinu, tyto geny byly uloženy do E. coli a byly sledovány účinky těchto genů na produktivitu těchto kmenů pro L-lysin. Uložené geny pro enzymy z tohoto systému a enzymy, pro něž byly uložené geny kódovými řetězci, budou dále uvedeny.

PPc:	fosfoenolpyruvátkarboxyláza
aspC:	aspartaminotransferáza
lysC:	asparatokináza III
lysC*80:	sparatokináza III, desenzibilovaná proti inhibici
asd:	aspartátsemialdehyddehydrogenáza
dapA:	dihydrodipikolinátsyntetáza
dapA*24:	dihydrodipikolinátsyntetáza, desenzibilovaná proti inhibici
dapB:	dihydrodipikolinátreduktáza
DDH:	diaminopimelátdehydrogenáza, pocházející z Brevibacterium lactofermentum
lysA:	diaminopimelátdekarboxyláza.

Svrchu uvedenými geny je možno zcela pokrýt biosyntézu L-lysinu od kyseliny fosfoenolpyrohroznové až k L-lysinu. Geny dapC, dapD, dapE a dapF jsou geny ze systému pro biosyntézu L-lysinu, původně obsažené v E. coli. Tyto geny byly nahrazeny genem DDH s kódovým řetězcem pro enzym DDH, diaminopimelátdehydrogenázu z Brevibacterium lactofermentum, tento enzym může katalyzovat reakce, týkající se produktů tohoto genu. Jako hostitelský kmen pro uložení uvedených genů byl vybrán kmen W3110 (tyrA) ze skupiny E. coli K-12.

Geny dapA a dapA*24 byly získány izolací z plazmidů pdapA2 a pdapAS24 (příklad 1) při použití štěpení enzymy EcoRI a KpnI, jak je znázorněno na obr. 10. Uvedené geny byly uloženy do plazmidů pMWl 18, rozštěpeného enzymy EcoRI a KpnI, čímž byly získány plazmidy pdapA a pdapa* Geny LysC a lysC*80 byly získány rozštěpením plazmidů pLYSCl a pLLC*80 (příklad 2) enzymy EcoRI a SpHI. Pak byly tyto geny uloženy do plazmidů pMW119, rozštěpeného enzymy EcoRI a Sphl za vzniku plazmidů plysC a plysC*, jak je znázorněno na obr. 11.

Gen ppc byl získán z plazmidů pT2, který tento gen obsahuje. Plazmid pT2 byl rozštěpen enzymy Smál a Scal, zakončení byla vyplněna a pak byl gen uložen do místa štěpení enzymem

-30CZ 291730 B6

Smál v plazmidu pMWl 18 za vzniku plazmidu pppc, jak je zřejmé z obr. 12. Kmen E. coli F15 (AJ12873), obsahující plazmid pT2, byl uložen do veřejné sbírky National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology pod pořadovým číslem FERM BP-4732.

Gen aspC byl získán z plazmidu pLF4, popsaného v Inokuchi K. a další, Nucleic Acids Res., 10, 6 957, 1982, který tento gen obsahuje, jak je zřejmé z obr. 13. Plazmid pLF4 byl rozštěpen enzymy PvuII a Stul, zakončení byla vyplněna a gen byl uložen do místa štěpení enzymem Smál v plazmidu pMWl 19, čímž byl získán plazmid paspC.

Gen asd byl získán z plazmidu pAD20, který tento gen obsahuje a byl popsán v Haziza C. a další, EMBO, 1, 379, 1982. Plazmid pAD20 byl rozštěpen enzymy Asel a Clal, konce byly vyplněny a gen byl uložen do místa štěpení enzymem Smál v plazmidu pMWl 18 za vzniku plazmidu pasd, který je znázorněn na obr. 14.

Gen dapB byl získán amplifikací genu dapB z chromozomální DNA kmene E. coli W3110 metodou PCR při použití dvou typů oligonukleotidových primerů s řetězci č. 9 a 10, primery byly připraveny na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapB, popsaného v Bouvier J. a další, J. Biol. Chem., 259, 14 829, 1984 a znázorněného na obr. 15. Získaný amplifikovaný fragment DNA byl rozpuštěn působením enzymů Asel a Dral, zakončení byla vyplněna a gen byl uložen do místa působení enzymu Smál v plazmidu pMWl 19, čímž vznikl plazmid pdapB.

Gen DDH byl získán amplifikací genu DDH z chromozomální DNA mikroorganismu Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 pomocí PCR při použití dvou typů oligonukleotidových primerů s řetězci č. 11 a 12, připravených na bázi známé nukleotidové sekvence genu DDH z Corynebacterium glutamicum podle Ishimo S. a další, Nucleic Acides res., 15, 3 917, 1987. Získaný amplifikovaný fragment DNA byl rozštěpen enzymy Eco T221 a Aval, konce byly vyplněny a gen byl uložen do místa štěpení enzymem Smál v plazmidu pMW119, čímž byl získán plazmid pDDH, znázorněný na obr. 16.

Gen lysA byl získán amplifikací genu lysA z chromozomální DNA kmene E. coli W3110 pomocí PCR při použití dvou typů oligonukleotidových primerů s řetězci č. 13 a 14, připravených na bázi nukleotidové sekvence známého genu lysA podle Stragier P. a další, J. Mol. Biol., 168, 321,1983. Získaný amplifikovaný fragment DNA byl rozštěpen enzymy SplI a Bell, konce byly vyplněny a gen byl uložen do místa štěpení enzymem Smál v plazmidu pMWl 18, čímž byl získán plazmid plysA, znázorněný na obr. 17.

Potvrzení skutečnosti, že každý ze svrchu uvedených genů byl klonován, bylo provedeno rozštěpením těchto genů působením restrikčních enzymů, znázorněných na výkresech. Vektory pMW118 a pMW119 (Nippon Gene), použité pro klonování uvedených genů byly vybrány z toho důvodu, že tyto plazmidy mohou existovat současně v buňkách Escherichia coli spolu sRSF 1010 jako vektorem, užitým pro přípravu plazmidů pro výrobu lysinu, mimoto mají tyto vektory stabilní distribuční mechanismus.

6-1-2 Produktivita Escherichia coli s uloženými geny biosyntetického systému pro výrobu L-lysinu

Kmen E. coli W3110 (tyrA) byl transformován každým z plazmidů, obsahujících svrchu popsané geny biosyntetického systému L-lysinu a získané transformované kmeny byly pěstovány k dosažení produkce L-lysinu. Kmeny byly pěstovány 30 hodin při teplotě 37 °C v třepací kultuře při 114 až 116ot/min při použití následujícího prostředí. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 8.

-31 CZ 291730 B6 složka g/1

Složení živného prostředí

glukóza	40
MgSO4.7H2O	1
síran amonný	16
dihydrogenfosforečnan draselný	1
síran železnatý. 7H2O	0,01
síran manganatý. 5H2O	0,01
extrakt z kvasnic (difco)	2,0
L-tyrosin	0,1

Hodnota pH byla upravena na 7,0 přidáním KOH a pak bylo prostředí sterilizováno 10 minut v autoklávu při teplotě 115 °C. Glukóza a síran hořečnatý byly sterilizovány odděleně.

Uhličitan vápenatý s čistotou, odpovídající lékopisu v množství 25 g/1 byl v suchém stavu sterilizován teplem dva dny, použitá teplota byla 180 °C.

Mimoto byla přidávána antibiotika v závislosti na typu použitého plazmidu, a to 20 mg/1 streptomycinu nebo 50 mg/1 ampicilinu.

Tabulka 8

bakteriální kmen	produkované množství L-lysinhydrochloridu g/1	výtéžek v závislosti na cukru v %
W3110 (tyrA)	0,08	0.2
W3110 (tyrA)/pppc	0,08	0,2
W3110 (tyrA)/paspC	0,12	0,3
W3110 (tyrA)/plysC	0,08	0,2
W3110 (tyrAJ/plysC	2,27	5,57
W3110 (tyrA)/pasd	0,12	0,3
W3110 (tyrA)/pdapA	2,32	5,70
W3110 (tyrA)/pdapA*	3,63	8,90
W3110 (tyrA)/pdapB	0,08	0,2
W3110(tyrA)/pDDH	0,08	0,2
W3110 (tyrA)/plysA	0,12	0,3

Kmen E. coli W3110 (tyrA) produkuje L-lysin po uložení plazmidů plysC* pdapA nebo pdapA*. Vzhledem k tomu, že u produktů genů lysC a dapA je možno pozorovat inhibici L-lysinem vzhledem ke zpětné vazbě je možno předpokládat, že tyto enzymy jsou hlavními látkami, řídicími biosyntézu L-lysinu. Reakce, katalyzovaná produktem genu dapA je reakcí, v níž se biosyntetický systém větví na výrobu L-threoninu, L-methioninu a L-izoleucinu a biosyntetický systém pro výrobu L-lysinu a jde tedy o první stupeň biosyntetického systému, vlastního pro produkci L-lysinu. Bylo již uvedeno, že E. coli začíná produkovat L-lysin také po amplifikaci genu dapA divokého typu podle Eur. J. Appl. Microbiol. Biotecnolo., 15,227, 1982, což také potvrzují svrchu uvedené výsledky. Na druhé straně byl opět potvrzen výsledek příkladu 3, že totiž výtěžek L-lysinu je možno dále zvýšit v případě, že se do E. coli uloží mutovaný gen dapA*, jehož produkt je desenzibilován proti inhibici zpětnou vazbou.

Surové roztoky enzymu byly připraveny z kmenů W3110 (tyrA)/pdapA a W3110 (tyrA)/pdapa*stejným způsobem jako v příkladu 1 a pak byla měřena účinnost dihydrodipikolinátsyntetázy, DDPS a stupeň inhibice této účinnosti působením L-lysinu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9.

-32CZ 291730 B6

Tabulka 9

bakteriální kmen	y specifická účinnost	stupeň desenzibilace inhibice xx
W3110 (tyrA)	0,0423	50
W3110 (tyrA/pdapA)	0,2754	22,9
W3110 (tyrA)/pdapA*	0,1440	76,5

^x mikromoly/min/mg bílkoviny ^xx poměr účinnosti v %, zbývající v přítomnosti 5 mM L-lysinu.

Produkt genu dapA*, desenzibilovaný proti inhibicí má pravděpodobně velký účinek na produkci L-lysinu vzhledem k vysokému stupni desenzibilace inhibice, přestože má nižší specifickou účinnost než enzym divokého ty pu, přibližně o jednu polovinu. Nutnost desenzibilace inhibice io produktu dapA byla prokázána na produkci L-lysinu.

Mimoto je zřejmé, že lysC* má vliv na produkci L-lysinu také z následujících skutečností. Prvořadým určujícím stupněm je stupeň, v němž se HD (homoserindehydrogenáza, produkt trhA nebo metLM) dostává do kompetice s DDPS (produkt dapA) a ASA, aspartát-beta-semialdehyd 15 jako substrát v místě rozvětvení biosyntetického systému, takže v případě, že gen dapA je zvýhodněn svrchu uvedeným způsobem, probíhá reakce ve směru biosyntézy L-lysinu. Na druhé straně je pravděpodobné, že v případě, že se zvýší přiváděné množství ASA zvýhodněním genu lysC, který se účastní reakce dále od genu dapA, je kterákoliv z reakcí, jíž se účastní HD a DDPS rovněž usnadněna a produkce L-lysinu se rovněž zvyšuje. Avšak tohoto výsledku je jen zřídka 20 možno dosáhnout pouze zvýhodněním genu lysC divokého typu. Příčina spočívá pravděpodobně v tom, že inhibice divokého typu AKIII (produktu lysC) působením L-lysinu je pravděpodobně více vyjádřena než inhibice divokého typu DDPS (AKIII a DDPS jsou inhibovány přibližně na 100 % a 80 % v přítomnosti 5 mM L-lysinu).

Vzhledem ke svrchu uvedeným skutečnostem je velmi pravděpodobné, že reakce DDPS má vyšší účinek a je tedy prvořadým určujícím stupněm a reakce AKIII je dalším, druhořadým určujícím stupněm.

2. Identifikace druhořadého určujícího stupně

Tato reakce byla analyzována zvýhodněním různých genů systému pro biosyntézu L-lysinu při použití kmenů s uložením genu dapA*. Aby byly ostatní plazmidy stabilně uloženy po uložení do E. coli, byl plazmid, obsahující gen dapA* přenesen zpdapA do RSF1010, čímž byl získán RSF24P, jak je znázorněno na obr. 7. Plazmidem RSF24P s obsahem genu dapA* byl pak 35 transformován kmen E. coli W3110 (tyrA).

Plazmidy s obsahem genů pro biosyntézu L-lysinu byly uloženy do kmene E. coli W3110 (tyrA)/RSF24P. Byly použity dva typy plazmidů, a to RSF24P a plazmid, obsahující jiný gen pro biosyntézu L-lysinu, přičemž každý z transformovaných organismů obsahoval oba geny. Pak 40 byla zkoumána produktivita těchto kmenů pro L-lysin stejně jako v odstavci 6-1-2. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 10

-33CZ 291730 B6

Tabulka 10

bakteriální kmen	produkované množství L-lysinhvdrochloridu 2/1	výtížek v závislosti na cukru v %
W3110 (tyrA)/RSF24P	3,63	8,9
W3110 (tyrA)/RSF24P+pppc	3,67	9,0
W3110 (tyrA)/RSF24P+paspC	3,59	8,8
W3110 (tyrA)/RSF24+PplysC	3,42	8,4
W3110 (tyrA)/RSF24P+plysC*	9,17	22,5
W3110 (tyrA)/RSF24P+pasd	3.75	9,2
W3110 (tyrA)/RSF24P+pdapA	3,55	8,7
W3110 (tyrA)/RSF24P+pdapA’	3,46	8,5
W3110 (tyrA)/RSF24P+pdapB	4,08	10,0
W3110 (tyrA)/RSF24P+pDDH	3,67	9,0
W3110 (tyrA)/RSF24P+plysA	3,55	8,7

Jak je zřejmé, bylo dosaženo význačného zlepšení produktivity pro L-lysin pouze v případě uložení genu lysC*. Gen lysC divokého typu byl zcela bez účinku. Příčina spočívá pravděpodobně v příliš silné inhibici L-lysinem, jak již bylo svrchu popsáno. Tím bylo potvrzeno, že reakce, jíž se účastní produkt lysC* má druhořadý význam.

Gen lysC* byl integrován do plazmidů RSF24P za vzniku plazmidů RSFD80, znázorněno na obr. 9. Stejným způsobem byl také gen lysC integrován do plazmidů RSF24P a získaný plazmid byl označen RSFD1. Oba plazmidy pak byly uloženy do kmene E. coli W3I10 (tyrA), byly připraveny roztoky surového enzymu a byla měřena účinnost enzymu AK a stupeň inhibice této účinnosti působením L-lysinu stejným způsobem jako v odstavci 6-1-2. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 11.

Tabulka 11

bakteriální kmen	specifická účinnost*	stupeň desenzibilace inhibice
W3110(tyrA)/RSF24P	0,94	42,9
W3110 (typA/RSFDl	18,55	7,2
W3110 (typA)/RSFD80	33,36	98,8

^x nmol/min/mg bílkoviny ^xx poměr zbývající účinnost v % v přítomnosti 5 mM L-lysinu.

Specifická účinnost enzymu AK z kmenů, v nichž jsou uloženy plazmidy, byla zvýšena integrací genů LysC a LysC* do plazmidů RSF24P 20 až 30x. E. coli obsahuje tři typy enzymů AK, přičemž gen lysC je kódem pro AKIII. Ve svrchu uvedených pokusech však byla měřena celková účinnost všech tří enzymů AK. Je pravděpodobné, že inhibice L-lysinem je vysoká také u kmenů s plazmidem RSFD1 s obsahem lysC divokého typu vzhledem k tomu, že podíl AKIII je v tomto případě vyšší než AKI a AKII ve srovnání s kontrolním kmenem W3110 (tyrA/RSF24P, protože v tomto případě není možno pozorovat zvýšení produktivity pro L-lysin. Na druhé straně bylo prokázáno, že inhibice byla desenzibilována na přibližně 100 % pro AKIII u kmene s plazmidem RSFD80 a tato skutečnost byla příčinou zvýšení produkce L-lysinu.

3. Identifikace určujícího stupně třetího řádu

Do kmene E. coli W3110 (tyrA)/RSFD80 byly uloženy různé plazmidy ze systému pro biosyntézu L-lysinu a pak byly tyto kmeny pěstovány k dosažení produkce L-lysinu. Výsledky této kultivace jsou uvedeny v tabulce 12.

-34CZ 291730 B6

Tabulka 12

bakteriální kmen	produkované množství L-lysinhydrochloridu g/1	výtčžek v závislosti na cukru v %
W3110 (tyrA)/RSFD80	9,17	22,5
W3110 (tyrA)/RSFD80+pppc	8,97	22,0
W3110 (tyrA)/RSFD80+paspC	9,05	22,2
W3110 (tyrA)/RSFD80+plysC	8,56	21,0
W3110 (tyrA)/RSFD80+plysC*	8,15	20,0
W3110 (tyrA)/RSFD80+pasd	8,35	20,5
W3110 (tyrA)/RSFD80+pdapA	8,56	21,0
W3110 (tyrA)/RSFD80+pdapA*	8,15	20,0
W3110 (tyrA)/RSFD80+pdapB	10,80	26,5
W3110 (tyrA)/RSFD80+pDDH	8,56	21,0
W3110 (tyrA)/RSFD80+p!ysA	8,48	20,8

Zlepšující účinek na produktivitu L-lysinu bylo možno pozorovat pouze v případě dapB a bylo prokázáno, že reakce, jíž se účastní produkt genu dapB, je určujícím stupněm třetího řádu. Z tohoto důvodu byl gen dapB uložen do plazmidu RSFD80, čímž vznikl plazmid pCABl, znázorněný na obr. 18. Tento plazmid pak byl uložen do kmene E. coli W3110(TyrA) a byl připraven roztok surového enzymu, pak byla měřena enzymatická účinnost dihydrodipikolinátreduktázy, DDPR, způsobem podle publikace Tamir H. a Gilvarg C., J. Biol. Chem., 249,3 034,1974. Stejným způsobem byly připraveny roztoky surového enzymu z kmene, obsahujícího pouze plazmid RSFD80 a z kmene, obsahujícího oba plazmidy, RSFD80 i pdapB a byla měřena účinnost DDPR. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 13.

Tabulka 13 bakteriální kmen____specifická účinnost pmol/min/mg bílkoviny

W3110 (tyrA)/RSFD80 0,027

W3110 (tyrA)/RSFD80+pdapB 0,092

W3110 (tyrA)ZpCABl 0,178

Účinnost DDPR byla zvýšena přibližně třikrát u kmene, obsahujícího plazmidy RSFD80 a pdapB a přibližně 6,5x byla zvýšena u kmene obsahujícího plazmid pCABl, v němž je gen dapB uložen do plazmidu RSFD80, ve srovnání s kontrolním kmenem,obsahujícím pouze plazmid RSFD80. Vzhledem ktomu, že kmeny W3110 (tyrA)/RSFD80+pdapB a W3110 (tyrA)/pCABl měly ekvivalentní akumulaci L-lysinu 10,8 g/1 je zřejmé, že gen dapB byl přítomen v množství, dostatečném pro produkci L-lysinu, a určující stupeň byl přesunut do následujícího stupně.

4. Identifikace určujícího stupně čtvrtého řádu

Tato reakce byla identifikována při použití plazmidu pCABl sgeny lysC*, dapA*a dapB. Do kmene E. coli W3110 (tyrA)/pCABl byly uloženy různé plazmidy biosyntetického systému pro produkci L-lysinu a pak byly kmeny pěstovány k dosažení této produkce. Výsledky kultivace jsou shrnuty v následující tabulce 14.

-35CZ 291730 B6

Tabulka 14

bakteriální kmen	produkované množství L-lysinhydrochloridu g/l	výtěžek v závislosti na cukru, %
W3110(tyrA)/)CABl	10,80	26,5
W3110(tyrA)/pCABl+pppc	11,00	27,0
W3110 (tyrA)/pCABl+paspC	10,88	26,7
W3110 (tyrA)/pCAB 1+plysC	10,60	26,0
W3110 (tyrA)/pCAB 1+plysC'	10,39	25,5
W3110(tyrA)/pCABl+pasd	10,19	25,0
W3110 (tyrA)/pC AB 1 +pdapA	10,72	26,3
W3110 (tyrA)/pCABl+pdapA‘	10,80	26,5
W3110 (tyrA)/pCAB 1+pdapB	10,92	26,8
W3110 (tyrA)/pCABl+pDDH	12,23	30,0
W3110 (tyrA)/pCABl+plysA	10,60	26,0

Zlepšení produktivity pro L-lysin bylo možno pozorovat pouze v případě DDH a bylo prokázáno, že reakce, katalyzovaná DDH je určujícím stupněm čtvrtého řádu. Mimoto kyselina N-sukcinyl-L,L-alfa,eta-diaminopimelová, SDAP, kterou je možno prokázat v živném prostředí kmene bez produkce DDH, nebyla prokázána v živném prostředí kmene, produkujícího DDH. Detekce SDAP byla provedena pomocí TLC, jako systém rozpouštědel byla užita směs methanolu, vody, 10N HC1 a pyridinu v poměru 80 : 17,5 : 2,5 : 10, postup byl prováděn podle publikace Bouvier J., Richaud C., Higgins W., Bogler O. a Sragier P., J. Bacteriol., 174, 5 265,1992. Mimoto byla barva živného prostředí hnědá v případě kmene, neprodukujícího DDH a žlutá v případě kmene, produkujícího DDH, Gen DDH byl integrován do plazmidů pCABl za vzniku plazmidů pCABD2, znázorněného na obr. 19 a byla měřena účinnost DDH pro kmen E. coli W3110(tyrA), transformovaný tímto plazmidem. Účinnost enzymu DDH byla měřena podle publikace Azizono, Haruo, Fermentation and Industry, 45,964, 1987. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 15.

Tabulka 15 bakteriální kmen__specifická účinnost pmol/min/mg bílkoviny

W3110 (tyr A)/pCAB 1 0,000

W3110 (tyrA)/pCAB1 +pDDH 0,799

W3110 (tyrA)/pCABD2 2,214

Účinnost DDH nebylo možno prokázat u kontrolního kmene E3310 (tyrA)/pCABl vzhledem k tomu, že DDH se původně v E. coli nenachází. Specifická účinnost DDH u kmene s obsahem plazmidů pCABD2, E3110 (tyrA)/pCABD2 byla přibližně 2,5x vyšší než účinnost kmene s obsahem pDDH, W3110 (tyrA)/pCABl+pDDH, avšak uobou kmenů bylo prokázáno ekvivalentní hromadění L-lysinu, 12,23 g/l. Je proto zřejmé, že u pCABD2 dochází k dostatečné expresi DDH.

5. Analýza určujícího stupně v případě dapC, dapD, dapE a dapF

Aby bylo možno sledovat určující stupně v případě genů dapC, dapD, dapE a dapF, nahrazených při svrchu uvedené analýze DDH, byly tyto geny nejprve klonovány. Gen dapC nebyl klonován vzhledem ktomu, že neexistují žádné zprávy o jeho sekvenci bází, tři zbývající geny však byly klonovány obvyklým způsobem při použití PCR.

Gen dapD byl získán amplifikací genu dapD z chromozomální DNA kmene E. coli W3110 při použití PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů s řetězcem č. 15 a č. 16, připravených na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapD, který byl popsán v publikaci Richaud C. a další, J. Biol. Chem., 259, 15 824, 1984. Získaný amplifikovaný fragment DNA byl rozštěpen enzymy Eco0109I a Sací, zakončení byla doplněna a fragment za vzniku plazmidů pdapD, znázorněného na obr. 20.

-36CZ 291730 B6

Gen dapE byl získán amplifikací genu dapE z chromozomální DNA kmene E. coli W3110 pomocí PCR při použití dvou typů oligonukleotidových primerů s řetězcem č. 17 a ě. 18, které byly připraveny na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapE, popsaného v publikaci Bouvier J. a další, J. Bacteriol., 174, 5 265,1992. Získaný amplifikovaný fragment DNA byl rozštěpen enzymy MunI a BglII, vzniklá zakončení byla vyplněna a pak byl získán fragment uložen do místa působení enzym Smál v plazmidu pMW118 za získání plazmidu pdapE z obr. 21.

Gen dapF byl získán amplifikací genu dapF z chromozomální DNA kmene E. coli W3110 při použití metody PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů č. 19 a č. 20, připravených na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapF, popsaného v publikaci Richaud C. a další, Nucleic Acids Res., 16,10 367,1988. Takto získaný amplifikovaný fragment DNA byl rozštěpen působením enzymu Pstl, zakončení byla vyplněna a fragment byl uložen do místa působení enzymu Smál v plazmidu pMWl 18, čímž byl získán plazmid pdapF z obr. 22.

Každý z plazmidů, získaných svrchu uvedeným způsobem byl uložen do kmene W3110 (tyrA)/pCABl a kmen byl pěstován k dosažení produkce L-lysinu. V předchozím pokusu bylo možno pozorovat změny, pokud jde o barvu živného prostředí a také pokud jde o přítomnost nebo nepřítomnost meziproduktu SDAP kromě produkce L-lysinu před zavedením a po uložení DDH. Analýza určujícího stupně byla proto provedena také při použití těchto ukazatelů. Výsledky pokusů jsou shrnuty v následující tabulce 16.

Tabulka 16

bakteriální kmen	produkce L-lysin. HC1 g/1	výtéžek ve vztahu k cukru, %	barva živného prostředí	tvorba SDAP
W3110 (tyrA)/pCABl	10,80	26,5	hnédá	+
W3110 (tyrA)/pCAB 1+pdapD	11,08	27,2	žlutá	+
W3110 (tyrA)/pCABl+pdapE	11,12	27,3	hnédá	-
W3110 (tyrA)/pCAB 1+pdapF	10,96	26,9	hnédá	+
W3110 (tyrA)/pCABD2	12,23	30,0	žlutá	-

Množství produkovaného L-lysinu se poněkud zvýší při výhodném uložení dapD nebo dapE, avšak nepřevyšuje množství při použití DDH. Mimoto bylo prokázáno, že změna barvy živného prostředí a hromadění SADP jako meziproduktu, které byly pozorovány po uložení genu DDH, jsou navzájem nezávislé jevy. Změna barvy živného prostředí je důsledkem dapD a vymizení SDAP je důsledkem přítomnosti dapE. Vztah mezi přítomností dapE a přítomností SDAP je možno předpokládat na základě způsobu biosyntézy L-lysinu. Výhodné uložení dapF nemělo žádný vliv na zvýšení produkce L-lysinu.

Gen dapE byl štěpením vyjmut z plazmidu pdapE a byl uložen do plazmidu pdapD za vzniku plazmidu pMWdapDEl, který obsahuje oba geny, dapE i dapD, jak je zřejmé z obr. 23. Mimoto byl štěpením vyjmut z plazmidu pMWdapDEl fragment, obsahující oba uvedené geny a tento fragment byl uložen do plazmidu pCABl za vzniku plazmidu pCABDEl, který je znázorněn na obr. 24. Kmeny s uloženými plazmidy pCABl, pCABDEl nebo pCABD2 a kmen, v němž jsou uloženy plazmidy pCABDEl i pdapF pak byly použity po uložení do mikroorganismů pro produkci L-lysinu získanými kmeny. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 17.

Tabulka 17

bakteriální kmen	produkce L-lysin. HClg/l	výtéžek ve vztahu k cukru, %	barva živného prostředí	tvorba SDAP
W3110(tyrA)/pCABl	10,80	26,5	hnédá	+
W3110 (tyrA)/pCABDEl	12,23	30,0	žlutá	-
W3110 (tyrA)/pCABDE 1+pdapF	11,82	29,0	žlutá	-
W3110 (tyrA)/pCABD2	12,23	30,0	žlutá	-

-37CZ 291730 B6

Bylo zjištěno, že množství produkovaného L-lysinu, zbarvení živného prostředí a přítomnost nebo nepřítomnost SDAP jsou v podstatě ekvivalentní parametrům, které bylo možno pozorovat v případě produkce DDH při výhodném uložení kombinace genů dapD a dapE. Mimoto bylo prokázáno, že další zvýhodnění dapF již nezlepší množství produkovaného L-lysinu a reakce, jíž se účastní produkt genu dapF neomezuje produkované množství, tyto výsledky je možno vysvětlit následujícím způsobem.

Po uložení plazmidu pCABl se hromadí meziprodukty ve dvou stupních, a to kyselina N-sukcinyl-eta-keto-L-alfa-aminopimelová, SKAP a mimoto SDAP. Z těchto meziproduktů je možno prokázat SDAP mimo buňky v živném prostředí. Přestože nebylo možno prokázat přítomnost SKAP, je pravděpodobné, že se hromadí uvnitř bakteriálních buněk. Důvod pro tento předpoklad spočívá ve zbarvení živného prostředí. Barva tohoto prostředí je žlutá v případě divokého kmene W3110(tyrA) nebo kmene, který neprodukuje L-lysin. Avšak barva živného prostředí se mění na hnědou, pravděpodobně v důsledku bakteriolýzy v případě většího zatížení buněk. Je pravděpodobné, že SDAP znamená malé zatížení růstu buněk vzhledem k tomu, že se vylučuje ven z buněk do okolního prostředí a z tohoto důvodu má živné prostředí žlutou barvu, přestože se množství SDAP zvyšuje v případě, že se SKAP metabolizuje výhodným uložením genu dapD. Avšak i když je gen dapD uložen za výhodných podmínek, nedochází k nahromadění L-lysinu, pokud nedojde k desenzibilaci genu dapE a tím se neodstraní omezení produkce L-lysinu.

6. Závěry

Na základě svrchu uvedených výsledků bylo prokázáno, že produktivita pro L-lysin může být zvýšena postupně pomocí následujících opatření: 1) uložením genu dapA*, 2) uložením genu lysC*, 3) výhodné uložení genu dapB a 4) výhodné uložení genu DDH nebo dapD a dapE v bakteriích rodu Escherichia. Byly získány bakterie E. coli s postupně zlepšenou produktivitou pro L-lysin.

7. Analýza určujícího stupně biosyntetického systému pro L-lysin u kmene E. coli C

Aby bylo možno zjistit, zda bude proveditelné aplikovat svrchu uvedené závěry také na jiné kmeny než na kmeny ze skupiny E. coli K-12, byl stejným způsobem jako svrchu analyzován biosyntetický systém pro produkci L-lysinu u kmene E. coli C, IFO 13891 tak, aby bylo možno prokázat určující stupně biosyntézy. podmínky pěstování tohoto kmene byly stejné jako v případě kmene W3110 (tyrA), avšak k živnému prostředí nebyl přidáván L-tyrosin.

1) Identifikace prvního určujícího stupně

Kmen E. coli C, IFO 13891 byl transformován uložením plazmidů s obsahem genů z biosyntetického systému pro produkci L-lysinu a pak byl pěstován na živném prostředí, vhodném pro produkci L-lysinu a bylo sledováno produkované množství L-lysinhydrochloridu. Výsledky tohoto sledování jsou shrnuty v následující tabulce 18.

-38CZ 291730 B6

Tabulka 18

bakteriální kmen	produkované množství L-lysinhydrochloridu g/1	výtěžek závislosti na cukru. %
C	0,08	0,2
C/pppc	0,08	0,2
C/paspC	0,12	0,3
C/plysC	0,08	0,2
C/plysC*	0,12	0,3
C/pasd	0,08	0,2
C/pdapA	0,32	0,8
C/pdapA”	0,71	1,75
C/pdapB	0,12	0,3
C(pDDH	0,08	0,2
C/plysA	0,08	0,2

Stejně jako v případě kmene W3110 (tyrA), byl L-lysin produkován v živném prostředí kmenem C po uložení genu dapA divokého typu a genu dapA*, desenzitizovaného proti inhibici. Gen lysC* neměl žádný vliv na úroveň produkce L-lysinu.

2) Identifikace určujícího stupně druhého řádu

Plazmid RSF24P, obsahující gen dapA* byl uložen do kmene E. coli C a dále byly do tohoto kmene uloženy také plazmidy, obsahující další geny biosyntetického systému pro L-lysin. Získané transformované bakterie byly pěstovány v živném prostředí, vhodném pro produkci L-lysinu a bylo měřeno množství produkovaného L-lysinhydrochloridu. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 19.

Tabulka 19

bakteriální kmen	produkované množství L-lysinhydrochloridu g/1	výtěžek v závislosti na cukru, %
C/RSF24P	0,71	1,75
C/RSF24P+pppc	0,71	1,74
C/RSF24P+paspC	0,69	1,70
C/RSF24P+plysC	0,65	1,60
C/RSF24P+plysC‘	1,82	4,50
C/RSF24P+pasd	0,70	1,73
C/RSF24P+pdapA	0,71	1,75
C/RSF24P+pdapA*	0,69	1,70
C/RSF24P+pdapB	0,99	2,45
C/RSF24P+pDDH	0,73	1,80
C/RSF24P+plysA	0,69	1,70

Bylo prokázáno, že gen lysC* má vliv na zlepšení produktivity pro L-lysin i v případě kmene C, transformovaného genem dapA* a reakce, jíž se účastní produkt genu lysC* je tedy určujícím stupněm druhého řádu při produkci této aminokyseliny.

3) Identifikace určujícího stupně třetího řádu

Plazmid RSFD80, obsahující geny dapA* a lysC* byl uložen do kmene E. coli C a dále byly uloženy různé plazmidy s obsahem genů biosyntetického systému pro produkci L-lysinu. Získané transformanty byly pěstovány v živném prostředí, vhodném pro produkci L-lysinu a bylo měřeno získané množství L-lysinhydrochloridu. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 20.

-39CZ 291730 B6

Tabulka 20

bakteriální kmen	produkované množství L-lysinhydrochloridu g/1	výtčžek v závislosti na cukru, %
C/RSFD80	1,82	4,5
C/RSFD80+pppc	1,74	4,3
C/RSFD80+paspC	1,82	4,5
C/RSFD80+plysC	1,91	4,7
C/RSFD80+plysC*	1,74	4,3
C/RSFD80+pasd	1,82	4,5
C/RSFD80+pdapA	1,95	4,8
C/RSFD80+pdapA’	1,91	4,7
C/RSFD80+pdapB	2,31	5,7
C/RSFD80+pDDH	2,15	5,3
C/RSFD80+plysA	1,95	4,8

Stejně jako v případě kmene W3110 měl pote gen dapB účinek na zvýšení produktivity pro L-lysin a jde tedy o určující stupeň třetího řádu.

4) Identifikace určujícího stupně čtvrtého řádu

Plazmid pCABl, obsahující geny dapA*, lysC* a dapB byl uložen do kmene E. coli C a dále byly uloženy plazmidy, obsahující geny biosyntetického systému L-lysinu. Získané transformované bakterie byly pěstovány na produkčním živném prostředí pro L-lysin a bylo měřeno množství produkovaného L-lysinhydrochloridu. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 21.

Tabulka 21

bakteriální kmen	produkované množství L-lysinhydrochloridu g/1	výtčžek v závislosti na cukru, %
C/pCABl	2,31	5,7
C/pCAB 1+pppc	2,23	5,5
C/pCABl+paspC	2,35	5,8
C/pCABl+plysC	2,27	5,6
C/pCAB 1+plysC’	2,19	5,4
C/pCAB 1+pasd	2,23	5,5
C/pCABl+pdapA	2,31	5,7
C/pCAB 1+pdapA*	2,27	5,6
C/pCABl+pdapB	2,23	5,5
C/pCAB 1+pDDH	2,59	6,4
C/pCAB 1+plysA	2,19	5,4

Stejně jako v případě kmene W3110 měl pouze gen DDH vliv na zlepšení produktivity pro lysin a jde tedy o určující stupeň čtvrtého řádu.

5) Analýza určujících stupňů při použití genů dapC, dapD, dapE a dapF

Místo genu DDH byly do kmene Escherichia coli C uloženy geny dapD, dapE nebo dapF, pro uložení byl použit kmen, který již obsahoval plazmid pCABl a pak byl kmen pěstován a byla měřena produkce L-lysinu. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 22.

Tabulka 22

bakteriální kmen	produkce Llysin. HCI, g/1	výtčžek ve vztahu k cukru, %	barva živného prostředí	tvorba SDAP
C/pCAB 1	2,31	5,7	hnčdá	+
C/pCAB 1+pdapD	2,43	6,0	žlutá	+
C/pCAB 1+pdapE	2,35	5,8	hnčdá	-
C/pCAB 1+pdapF	2,23	5,5	hnčdá	+
C/pCABDEl	2,59	6,4	žlutá	-
C/pCABDE 1+pdapF	2,43	6,0	žlutá	-
C/pCABD2	2,59	6,4	žlutá	-

-40CZ 291730 B6

Bylo prokázáno, že dva stupně, jichž se účastní produkty genů dapD a dapE jsou v případě kmene C rovněž určující stejně jako v případě kmene W3110.

Jak již bylo svrchu uvedeno, bylo možno pro kmeny K.-12 a C, které patří k rozdílným skupinám E. coli prokázat totéž pořadí určujících stupňů. Je proto možno se domnívat, že celou čeleď E. coli možno použít pro zlepšení produkce L-lysinu postupně při ukládání genů dapA^x a lysC^x při výhodném uložení a zesíleném působení genů dapB a DDH (nebo dapD a dapE) v uvedeném pořadí.

Průmyslová využitelnost

Vynález popisuje získání mutovaného genu DDPS, pocházejícího z bakterií, náležejících do rodu Escherichia, dosahuje se dostatečné desenzibilace inhibice L-lysinem. Tímto způsobem byla získána baterie s větším zlepšením, než jakého bylo možno dosáhnout v případě známých bakterií. Toho bylo dosaženo uložením genu s kódovým řetězcem pro aspartokinázu s desenzitizovanou inhibici L-lysinem v důsledku zpětné vazby.

Dále je možno produktivitu pro L-lysin postupně ještě zlepšit výhodným uložením a zesílením genů dapB a DDH (nebo dapD a dapE) do svrchu uvedeného bakteriálního kmene, produkujícího L-lysin v uvedeném pořadí.

Informace o řetězcích

1) Obecné informace:

i) přihlašovatel: Ajinomoto CO., Inc.

ii) název vynálezu: Kódová DNA pro enzym, bakterie zrodu E. coli a způsob výroby L-lysinu iii) počet řetězců: 20

2) Informace o řetězci č. 1:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce Č. 1:

CCGCAACTAC TGACATGACG 20

-41 CZ 291730 B6

2) Informace o řetězci č. 2:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 2:

AGTAAGCCAT CAAATCTCCC 20

2) Informace o řetězci č. 3:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 1197

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: dvojitý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: DNA genomu vi) původní zdroj:

A) organismus: Escherichia coli

B) kmen: MC1061 ix) vlastnost:

název/klíč: prim transcript uložení: 248 identifikační metoda: E ix) vlastnost:

název/klíč: CDS uložení: 272 až 1150 identifikační metoda: E ix) vlastnost:

název/klíč: primer bind uložení: 27 až 46 identifikační metoda: E ix) vlastnost:

název/klíč: primer bind uložení: 1156 až 1175 identifikační metoda: E

-42CZ 291730 B6 ix) vlastnost:

název/klíč: RBS uložení: 261 až 265 identifikační metoda: S xi) popis řetězce č. 3:

CCAGGCGACT GTCTTCAATA TTACAGCCGC AACTACTGAC ATGACGGGTG ATGGTGTTCA60

CAATTCCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG TGATCACCAG ATAATGTGTT GCGATGACAG120

TGTCAAACTG GTTATTCCTT TAAGGGGTGA GTTGTTCTTA AGGAAAGCAT AAAAAAAACA180

TGCATACAAC AATCAGAACG GTTCTGTCTG CTTGCTTTTA ATGCCATACC AAACGTACCA240

TTGAGACACT TGTTTGCACA GAGGATGGCC C ATG TTC ACG GGA AGT ATT GTC292

Met Phe Thr Gly Ser Ile Val

GCG

ATT

GTT

ACT

CCG

ATG

GAT

GAA

AAA

1 GGT

AAT

GTC

TGT

5 CGG

GCT

AGC

340

Ala

Ile

Val

Thr

Pro

Met

Asp

Glu

Lys

Gly

Asn

Val

Cys

Arg

Ala

Ser

10

15

20

TTG

AAA

AAA

CTG

ATT

GAT

TAT

CAT

GTC

GCC

AGC

GGT

ACT

TCG

GCG

ATC

388

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

Asp

Tyr

His

Val

Ala

Ser

Gly

Thr

Ser

Ala

Ile

25

30

35

GTT

TCT

GTT

GGC

ACC

ACT

GGC

GAG

TCC

GCT

ACC

TTA

AAT

CAT

GAC

GAA

436

Val

Ser

Val

Gly

Thr

Thr

Gly

Glu

Ser

Ala

Thr

Leu

Asn

His

Asp

Glu

40

45

50

55

CAT

GCT

GAT

GTG

GTG

ATG

ATG

ACG

CTG

GAT

CTG

GCT

GAT

GGG

CGC

ATT

484

His

Ala

Asd

Val

Val

Met

Met

Thr

Leu

Asp

Leu

Ala

Asp

Gly

Arg

Ile

60

65

70

532

CCG

GTA

ATT

GCC

GGG

ACC

GGC

GCT

AAC

GCT

ACT

GCG

GAA

GCC

ATT

AGC

Pro

Val

Ile

Ala

Gly

Thr

Gly

Ala

Asn

Ala

Thr

Ala

Glu

Ala

Ile

Ser

75

80

85

-43CZ 291730 B6

CTG

ACG

CAG

CGC

TTC

AAT

GAC

AGT

GGT

ATC

GTC

GGC

TGC

CTG

ACG

GTA

Leu

Thr

Gin

Arg

?he

Asn

Asp

Ser

Gly

Ile

Val

Gly

Cys

Leu

Thr

Val

90

95

100

ACC

CCT

TAC

TAC

AAT

CGT

CCG

TCG

CAA

GAA

GGT

TTG

TAT

CAG

CAT

TTC

Thr

Pro

Tyr

Tyr

Asn

Arg

Pro

Ser

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Gin

His

Phe

105

HO

115

AAA

GCC

ATC

GCT

GAG

CAT

ACT

GAC

CTG

CCG

CAA

ATT

CTG

TAT

AAT

GTG

Lys

Ala

Ile

Ala

Glu

His

Thr

Asp

Leu

Pro

Gin

ile

Leu

Tyr

Asn

Val

120

125

130

135

CCG

TCC

CGT

ACT

GGC

TGC

GAT

CTG

CTC

CCG

GAA

ACG

GTG

GGC

CGT

CTG

Pro

Ser

Arg

Thr

Gly

Cys

Asp

Leu

Leu

Pro

Glu

Thr

Val

Gly

Arg

Leu

140

145

150

C-CG

AAA

GTA

AAA

AAT

ATT

ATC

GGA

ATC

AAA

GAG

GCA

ACA

GGG

AAC

TTA

Ala

Lys

Val

Lys

Asn

Ile

Ile

Gly

Ile

Lys

Glu

Ala

Thr

Gly

Asn

Leu

155

160

165

ACG

CGT

GTA

AAC

CAG

ATC

AAA

GAG

CTG

GTT

TCA

GAT

GAT

τπ

GTT

CTG

Thr

Arg

Val

Asn

Gin

Ile

Lys

Glu

Leu

Val

Ser

Asp

Asp

Phe

Val

Leu

170

175

180

CTG

AGC

GGC

GAi

GAT

GCG

AGC

GCG

CTG

GAC

TTC

ATG

CAA

TTG

GGC

GGT

Leu

Ser

Gly

Asp

Asp

Ala

Ser

Ala

Leu

Asp

Phe

Met

Gin

Leu

Gly

Gly

185

>90

195

CAT

GGG

GTT

ATT

TCC

GTT

ACG

ACT

.AAC

GTC

GCA

GCG

CGT

GAT

ATG

GCC

His

Gly

Val

Ile

Ser

Val

Thr

Thr

Asn

Val

Ala

Ala

Arg

Asp

Met

Ala

200

205

210

215

CAG

ATG

TGC

AAA

CTG

GCA

GCA

GAA

GAA

CAT

TTT

GCC

GAG

GCA

CGC

Gi i

Gin

Met

Cys

Lys

Leu

Ala

Ala

Glu

Glu

His

Phe

Ala

Glu

Ala

Arg

Val

220

225

230

ATT

AAT

CAG

CGT

CTG

ATG

CCA

TTA

CAC

AAC

AAA

CTA

TTT

GTC

GAA

CCC

Ile

Asn

Gin

Arg

Leu

Met

Pro

Leu

His

Asn

Lys

Leu

Phe

Val

Glu

Pro

235

240

245

AAT

CCA

ATC

CCG

GTG

AAA

TGG

GCA

TGT

AAG

GAA

CTG

GGT

CTT

GTG

r*'**»-* uuU

Asn

Pro

Ile

Pro

Val

Lys

Trp

Ala

Cys

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

Val

Ala

250

255

260

ACC

GAT

ACG

CTG

CGC

CTG

CCA

ATG

ACA

CCA

ATC

ACC

GAC

AGT

GGT

CGT

Thr

Asp

Thr

Leu

Arg

Leu

Pro

Met

Thr

Pro

Ile

Thr

Asp

Ser

Gly

Arg

265

270

275

GAG

ACG

GTC

AGA

GCG

GCG

CTT

AAG

CAT

GCC

GGT

TTG

CTG

T AAAGT

i íAGG

GLu

Thr

Val

Arg

Ala

Ala

Leu

Lys

His

Ala

Gly

Leu

Leu

280

285

290

GAGATTTGAT GGCTTACTCT GTTCAAAAGT CGCGCCTGG

580

628

676

724

772

820

868

916

964

1012

1060

1108

1158

1197

-44CZ 291730 B6

2) Informace o řetězci č. 4:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 292

B) typ: aminokyselina

C) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid

xi) pc

ipis ře

:tězce

č. 4:

Met

Phe

Thr

Gly

Ser

Ile

Val

Ala

Ile

Val

Thr

Pro

Met

Asp

Glu

Lys

1

5

10

15

Gly

Asn

Val

Cys

Arg

Ala

Ser

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

Asp

Tyr

His

Val

20

25

30

Ala

Ser

Gly

Thr

Ser

Ala

Ile

Val

Ser

Val

Gly

Thr

Thr

Gly

Glu

Ser

35

40

45

Ala

Thr

Leu

Asn

His

Asp

Glu

His

Ala

Asp

Val

Val

Met

Met

Thr

Leu

50

55

60

Asp

Leu

Ala

Asp

Gly

Arg

Ile

Pro

Val

Ile

Ala

Gly

Thr

Gly

Ala

Asn

65

70

75

80

Ala

Thr

Ala

Glu

Ala

Ile

Ser

Leu

Thr

Gin

Arg

Phe

Asn

Asp

Ser

Gly

85

90

95

Ile

Val

Gly

Cvs

Leu

Thr

Val

Thr

Pro

Tyr

Tyr

Asn

Arg

Pro

Ser

Gin

1Ó0

105

110

Glu

Gly

Leu

Tyr

Gin

His

Phe

Lys

Ala

Ile

Ala

Glu

His

Thr

Asp

Leu

115

120

125

Pro

Gin

Ile

Leu

Tyr

Asn

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Glv

Cys

Asp

Leu

Leu

130

135

140

Pro

Glu

Thr

Val

Gly

Arg

Leu

Ala

Lys

Val

Lys

Asn

Ile

Ile

Gly

Ile

145

150

155

160

Lys

Glu

Ala

Thr

Gly

Asn

Leu

Thr

Arg

Val

Asn

Gin

Ile

Lys

Glu

Leu

165

170

175

Va-1

Ser

Asp

Asd

Phe

Val

Leu

Leu

Ser

Gly

Asp

Asp

Ala

Ser

Ala

Leu

180

185

190

Asp

Phe

Met

Gin

Leu

Gly

Gly

His

Gly

Val

Ile

Ser

Val

Thr

Thr

Asn

195

200

205

Val

Ala

Ala

Arg

Asp

Met

Ala

Gin

Met

Cys

Lys

Leu

Ala

Ala

Glu

Glu

210

215

220

His

Phe

Ala

Glu

Ala

Arg

Val

Ile

Asn

Gin

Arg

Leu

Met

Pro

Leu

His

225

230

235

240

Asn

Lys

Leu

Phe

Val

Glu

Pro

Asn

Pro

Ile

Pro

Val

Lys

Trp

Ala

Cys

245

250

255

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

Val

Ala

Thr

Asd

Thr

Leu

Arg

Leu

Pro

Met

Thr

260

265

270

Pro

Ile

Thr

Asp

Ser

Gly

Arg

Glu

Thr

Val

Arg

Ala

Ala

Leu

Lys

His

275

280

285

Ala

Gly

Leu

Leu

290

-45CZ 291730 B6

2) Informace o řetězci č. 5:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 5:

CTTCCCTTGT GCCAAGGCTC

2) Informace o řetězci č. 6:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 18

B) typ: molekulová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 6

GAATTCCTTT GCGAGCAG

2) Informace o řetězci č. 7:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 2147

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: dvojitý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: DNA genomu vi) původní zdroj:

A) organismus: Escherichia coli

B) kmen: MC1061 ix) vlastnost:

název/klíč: -35 signál uložení: 242 až 249 identifikační metoda: S

-46CZ 291730 B6 ix) vlastnost:

název/klíč: -10 signál uložení: 265 až 273 identifikační metoda: S ix) vlastnost:

název/klíč: primer bind uložení: 536 až 555 identifikační metoda: E ix) vlastnost:

název/klíč: primer bind uložení: 2128 až 2147 identifikační metoda: E xi) vlastnost:

název/klíč: RBS uložení: 575 až 578 identifikační metoda: S ix) vlastnost:

název/klíč: CDS uložení: 584 až 1933 identifikační metoda: S ix) vlastnost:

název/klíč: terminátor uložení: 1941 až 1968 identifikační metoda: S

-47CZ 291730 B6 xi) popis řetězce č. 7:

TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT 60

AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA 120

AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA 180 AGCATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT 240 CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC 300 CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG 360 AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC 420 TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC 480 ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC 540 CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595 Met Ser Glu Ile

GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643

Val Val Ser Lys Phe Gly Glv Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met

0

10

15

20

AAC

CGC

AGC

GCT

GAT

ATT

GTG CTT

TCT

GAT

GCC

AAC

GTG

CGT

TTA

GCT

691

Asn

Arg

Ser

Ala

Asp

Ile

Val Leu

Ser

Asp

Ala

Asn

Val

Arg

Leu

Val

25

30

35

GTC

CTC

TCG

GCT

TCT

GCT

GGT ATC

ACT

AAT

CTG

CTG

GTC

GCT

TTA

GCT

739

Val

Leu

Ser

Ala

Ser

Ala

Gly Ile

Thr

Asn

Leu

Leu

Val

Ala

Leu

Ala

40

45

50

GAA

GGA

CTG

GAA

CCT

GGC

GAG CGA

TTC

GAA

AAA

CTC

GAC

GCT

ATC

CGC

787

Glu

Gly

Leu

Glu

Pro

Gly

Glu Arg

Phe

Glu

Lys

Leu

Asp

Ala

Ile

Arg

OO

60

65

AAC

ATC

CAG

TTT

GCC

ATT

CTG GAA

CGT

CTG

CGT

TAC

CCG

AAC

GTT

ATC

835

Asn

lle

Gin

Phe

Ala

Ile

Leu Glu

Arg

Leu

Arg

Tyr

Pro

Asn

Val

Ile

70

75

80

CGT

GAA

GAG

ATT

GAA

CGT

CTG CTG

GAG

AAC

ATT

ACT

GTT

CTG

GCA

GAA.

883

Arg

Glu

Glu

Ile

Glu

Arg

Leu Leu

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Leu

Ala

Glu

85

90

95

100

nm Ιχυσ

GCG

GCG

CTG

GCA

ACG

TCT CCG

GCG

CTG

ACA

GAT

GAG

CTG

GTC

AGC

931

Ala

Ala

Ala

Leu

Ala

Thr

Ser Pro

Ala

Leu

Thr

Asp

Glu

Leu

Val

Ser

105

110

115

CAC

GGC

GAG

CTG

ATG

TCG

ACC CTG

CTG

TTT

GCT

GAG

ATC

CTG

CGC

GAA

979

His

Gly

Glu

Leu

Met

Ser

Thr Leu

Leu

Phe

Val

Glu

Ile

Leu

Arg

Glu

120

125

130

CGC

GAT

GTT

CAG

GCA

CAG

TGG τπ

GAT

GTA

CGT

AAA

GTG

ATG

CGT

ACC

1027

Arg

Asp

Val

Gin

Ala

Gin

Trp Phe

Asp

Val

Arg

Lys

Val

Met

Arg

Thr

135

140

145

AAC

GAC

CGA

τπ

GGT

CGT

GCA GAG

CCA

GAT

ATA

GCC

GCG

CTG

GCG

GAA

1075

Asn

Asp

Arg

Phe

Gly

Arg

Ala Glu

Pro

Asp

Ile

Ala

Ala

Leu

Ala

Glu

150

155

160

CTG

GCC

GCG

CTG

CAG

CTG

CTC CCA

CGT

CTC

AAT

GAA

GGC

TTA

GTG

ATC

1123

Leu

Ala

Ala

Leu

Gin

Leu

Leu Pro

Arg

Leu

Asn

Glu

Gly

Leu

Val

Ile

165

170

175

180

ACC

CAG

GGA

τπ

ATC

GGT

AGC GAA

AAT

AAA

GGT

CGT

ACA

ACG

ACG

CCT

1171

Thr

Gin

Gly

Phe

Ile

Gly

Ser Glu

Asn

Lys

Gly

Arg

Thr

Thr

Thr

Leu

185

190

195

GGC

CGT

GGA

GGC

AGC

GAT

TAT ACG

GCA

GCC

TTG

CTG

GCG

GAG

GCT

TTA

1219

Gly

Arg

Gly

Gly

Ser

Asp

Tyr Thr

Ala

Ala

Leu

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

200

205

210

CAC

GCA

TCT

CGT

GTT

GAT

ATC TGG

ACC

GAC

GTC

CCG

GGC

ATC

TAC

ACC

1267

His

Ala

Ser

Arg

Val

Asp

Ile Trp

Thr

Asp

Val

Pro

Gly

Ile

Tyr

Thr

-48CZ 291730 B6

215

220

225

ACC

GAT

CCA

CGC

GTA

GTT

TCC

GCA

GCA

AAA

CGC

ATT

GAT

GAA

ATC

GCG

1315

Thr

Asp

Pro

Arg

Val

Val

Ser

Ala

Ala

Lys

Arg

Ile

Asp

Glu

Ile

Ala

230

235

240

τπ

GCC

GAA

GCG

GCA

GAG

A1G

GCA

ACT

TTT

GGT

GCA

AAA

GiA

CTG

CAT

1363

Phe

Ala

Glu

Ala

Ala

Glu

Met

Ala

Thr

Phe

Glv

Ala

Lys

Val

Leu

His

245

250

255

260

CCG

GCA

ACG

TTG

CTA

CCC

GCA

GTA

CGC

AGC

GAT

ATC

CCG

GTC

i l l

GTC

1411

Pro

Ala

Thr

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Arg

Ser

Asp

Ile

Pro

Val

Phe

Val

265

270

275

GGC

TCC

AGC

AAA

GAC

CCA

CGC

GCA

GGT

GGT

ACG

CTG

GTG

TGC

AAT

AAA

1459

Gly

Ser

Ser

Lys

Asp

Pro

Arg

Ala

Gly

Gly

Thr

Leu

Val

Cys

Asn

Lys

280

285

290

ACT

GAA

AAT

CCG

CCG

CTG

TTC

CGC

GCT

CTG

GCG

CTT

CGT

CGC

AAT

CAG

1507

Thr

Glu

Asn

Pro

Pro

Leu

Phe

Arg

Ala

Leu

Ala

Leu

Arg

Arg

Asn

Gin

295

300

305

ACT

CTG

CTC

ACT

TTG

CAC

AGC

CTG

AAT

ATG

CTG

CAT

TCT

CGC

GGT

TTC

1555

Thr

Leu

Leu

Thr

Leu

His

Ser

Leu

Asn

Met

Leu

His

Ser

Arg

Gly

Phe

310

315

320

v

CTC

GCG

GAA

GTT

TTC

GGC

ATC

CTC

GCG

CGG

CAT

AAT

ATT

TCG

GiA

GAC

1603

Leu

Ala

Glu

Val

Phe

Gly

Ile

Leu

Ala

Arg

His

Asn

tle

Ser

Val

Aso

325

330

τις

340

TTA

ATC

ACC

ACG

TCA

G.AA

GTG

AGC

GTG

GCA

TTA

ACC

CTT

GAi

ACC

ACC

1651

Leu

Ile

Thr

Thr

Ser

Glu

Val

Ser

Val

Ala

Leu

Thr

Leu

Asp

Thr

Thr

345

350

355

GGT

TCA

ACC

TCC

ACT

GGC

GAT

ACG

TTG

CTG

ACG

C.AA

TCT

CTG

CTG

ATG

1699

Gly

Ser

Thr

Ser

Thr

Gly

Asp

Thr

Leu

Leu

Thr

Gin

Ser

Leu

Leu

Met

360

365

370

GAG

CTT

TCC

GCA

CTG

TGT

CGG

GTG

GAG

GTG

GAA

GAA

GGT

CTG

GCG

CTG

1747

Glu

Leu

Ser

Ala

Leu

Cys

Arg

Val

Glu

Val

Glu

Glu

Gly

Leu

Ala

Leu

375

380

385

GTC

GCG

TTG

ATT

GGC

AAT

GAC

CTG

TCA

AAA

GCC

TGC

GGC

GTT

GGC

AAA

1795

Val

Ala

Leu

Ile

Gly

Asn

Asp

Leu

Ser

Lys

Ala

Cys

Gly

Val

Gly

Lys

390

395

400

GAG

GTA

TTC

GGC

GTA

CTG

GAA

CCG

TTC

AAC

ATT

CGC

ATG

ATT

TGT

TAT

1843

Glu

Val

Phe

Gly

Val

Leu

Glu

Pro

Phe

Asn

Ile

Arg

Met

Ile

Cys

Tyr

405

410

415

420

GGC

GCA

TCC

AGC

CAT

AAC

CTG

TGC

TTC

CTG

GTG

CCC

GGC

GAA

GAT

GCC

1891

Gly

Ala

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Cys

Phe

Leu

Val

Pro

Gly

Glu

Aso

Ala

425

430

435

GAG

CAG

GTG

GTG

CAA

AAA

CTG

CAT

AGT

AAT

TTG

TTT

GAG

TAA

ATACTGT

1940

Glu

Gin

Val

Val

Gin

Lys

Leu

His

Ser

Asn

Leu

Phe

Glu

440

445

ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA 2000 ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT ΤΑΑΊΤΠΊΤΤ 2060 ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA 2120 TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC 2147

-49CZ 291730 B6

2) Informace o řetězci č. 8:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 449

B) typ: aminokyselina D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 8:

Met

Ser

Glu

Ue

Val

Val

Ser

Lys

Phe

Gly

Gly

Thr

Ser

Val

Ala

Asp

l

5

10

15

Phe

Asp

Ala

Met

Asn

Arg

Ser

Ala

Asp

Ue

Val

Leu

Ser

Asp

Ala

Asn

20

25

30

Val

Arg

Leu

Val

Val

Leu

Ser

Ala

Ser

Ala

Gly

Ue

Thr

Asn

Leu

Leu

35

40

45

Val

Ala

Leu

Ala

Glu

Gly

Leu

Glu

Pro

Gly

Glu

Arg

Phe

Glu

Lys

Leu

50

55

60

Asp

Ala

Ue

Arg

Asn

Ue

Gin

Phe

Ala

Ue

Leu

Glu

Arg

Leu

Arg

Tyr

65

70

to

30

Pro

Asn

Val

Ue

Arg

Glu

Glu

Ue

Glu

Arg

Leu

Leu

Glu

Asn

Ue

Thr

85

90

95

Val

Leu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Leu

Ala

Thr

Ser

Pro

Ala

Leu

Thr

Asp

100

105

110

Glu

Leu

Val

Ser

His

Gly

Glu

Leu

Met

Ser

Thr

Leu

Leu

Phe

Val

Glu

115

120

125

Ue

Leu

Arg

Glu

Arg

Asp

Val

Gin

Ala

Gin

Trp

Phe

Asp

Val

Arg

Lys

130

135

140

Val

Met

Arg

Thr

Asn

Asp

Arg

Phe

Gly

Arg

Ala

Glu

Pro

Asp

Ue

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Ala

Glu

Leu

Ala

Ala

Leu

Gin

Leu

Leu

Pro

Arg

Leu

Asn

Glu

165

170

175

Gly

Leu

Val

Ue

Thr

Gin

Gly

Phe

Ue

Gly

Ser

Glu

Asn

Lys

Gly

Arg

180

185

190

Thr

Thr

Thr

Leu

Gly

Arg

Gly

Gly

Ser

Asp

Tyr

Thr

Ala

Ala

Leu

Leu

195

200

205

Ala

Glu

Ala

Leu

His

Ala

Ser

Arg

Val

Asp

Ue

Trp

Thr

Asp

Val

Pro

210

215

220

Gly

Ue

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Arg

Val

Val

Ser

Ala

Ala

Lys

Arg

Ue

225

230

235

240

Asp

Glu

Ue

Ala

Phe

Ala

Glu

Ala

Ala

Glu

Met

Ala

Thr

Phe

Gly

Ala

245

250

255

Lys

Val

Leu

His

Pro

Ala

Thr

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Arg

Ser

Asp

Ue

260

265

270

Pro

Val

Phe

Val

Gly

Ser

Ser

Lys

Asp

Pro

Arg

Ala

Gly

Gly

Thr

Leu

275 280 285

Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu 290 295 300

-50CZ 291730 B6

Arg

Arg

Asn

Gin

Thr

Leu

Leu

Thr

Leu

His

Ser

Leu

Asn

Met

Leu

His

305

310

315

320

Ser

Arg

Gly

Phe

Leu

Ala

Glu

Val

Phe

Gly

Ile

Leu

Ala

Arg

His

Asn

325

330

335

Ile

Ser

Val

Asp

Leu

Ile

Thr

Thr

Ser

Glu

Val

Ser

Val

Ala

Leu

Thr

340

345

350

Leu

Asp

Thr

Thr

Gly

Ser

Thr

Ser

Thr

Gly

Asp

Thr

Leu

Leu

Thr

Gin

355

360

365

Ser

Leu

Leu

Met

Glu

Leu

Ser

Ala

Leu

Cys

Arg

Val

Glu

Val

Glu

Glu

370

375

380

Gly

Leu

Ala

Leu

Val

Ala

Leu

Ile

Gly

Asn

Asp

Leu

Ser

Lys

Ala

Cvs

385

390

395

400

Gly

Val

Gly

Lys

Glu

Val

Phe

Gly

Val

Leu

Glu

Pro

Phe

Asn

Ile

Arg

405

410

415

Met

Ile

Cys

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Cys

Phe

Leu

Val

Pro

420

425

430

Gly

Glu

Asp

Ala

Glu

Gin

Val

Val

Gin

Lys

Leu

His

Ser

Asn

Leu

Phe

435

440

445

Glu

2) Informace o řetězci č. 9:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 9:

CTTTCACTGA TATCCCTCCC 20

2) Informace o řetězci č. 10:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 10:

AAAAAGTGGA CCAAATGGTC

-51 CZ 291730 B6

2) Informace o řetězci č. 11:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 11:

CATCTAAGTA TGCATCTCGG

2) Informace o řetězci č. 12:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 12:

TGCCCCTCGA GCTAAATTAG

2) Informace o řetězci č. 13:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 13:

TGCACGGTAG GATGTAATCG 20

-52CZ 291730 B6

2) Informace o řetězci č. 14:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 14:

TTAATGAAAC AAATGCCCGG

2) Informace o řetězci č. 15:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineami ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 15:

TTTATTCATA ATTGCCACCG

2) Informace o řetězci č. 16:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce: č. 16:

CACGGTAATA CATATAACCG 20

-53CZ 291730 B6

2) Informace o řetězci č. 17:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 17:

CCTGCAATTG TCAAACGTCC 20

2) Informace o řetězci č. 18:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 18:

GTCGACGCGC TTGAGATCTT

2) Informace o řetězci č. 19:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce: ě. 19:

TCATAAAGAG TCGCTAAACG 20

-54CZ 291730 B6

2) Informace o řetězci č. 20

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 20:

CAACCGCCCG GTCATCAAGC

Claims (12)

1. Kódová DNA pro enzym dihydrodipikolinátsyntetázu z bakterie z rodu Escherichia s mutací pro desenzibilaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby, v níž se mutace pro desenzibilaci inhibice L-lysinem volí z mutace, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu, mutace, při níž je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu a mutace, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu a současně je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu, počínaje vždy od N-zakončení řetězce aminokyselin dihydrodipikolinátsyntetázy, definovaného řetězcem č. 4.

2. Bakterie z rodu Escherichia coli, která je transformována uložením kódové DNA podle nároku 1, pro dihydrodipikolinátsyntetázu z bakterie z rodu Escherichia s mutací pro desenzibilaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby do buněk.

3. Bakterie z rodu Escherichia podle nároku 2, která dále produkuje aspratokinázu s desenzibilaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby.

4. Bakterie z rodu Escherichia podle nároku 3, která produkuje aspartokinázu s desenzibilaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby, přičemž obsahuje kódovou DNA pro aspartokinázu III z bakterie rodu Escherichia s mutací pro desenzibilizaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby.

5. Bakterie z rodu Escherichia podle nároku 4, v níž se mutace pro desenzibilaci inhibice aspartokinázy III L-lysinem v důsledku zpětné vazby volí ze skupiny mutace, při níž je zbytek glycinu v poloze 323 nahrazen zbytkem kyseliny asparagové, mutace, při níž je zbytek lysinu v poloze 323 nahrazen zbytkem kyseliny asparagové a současně je zbytek glycinu v poloze 408 rovněž nahrazen zbytkem kyseliny asparagové, mutace, při níž je zbytek argininu v poloze 34 nahrazen zbytkem cysteinu a současně je zbytek glycinu v poloze 323 nahrazen zbytkem kyseliny asparagové, mutace, při níž je zbytek leucinu v poloze 325 nahrazen zbytkem fenylalaninu, mutace, při níž je zbytek methioninu v poloze 318 nahrazen zbytkem izoleucinu, mutace, při níž je zbytek methioninu v poloze 318 nahrazen zbytkem izoleucinu a současně je zbytek valinu v poloze 349 nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při níž je zbytek šeřinu v poloze 345 nahrazen zbytkem leucinu, mutace, při níž je zbytek valinu v poloze 347 nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při níž je zbytek threoninu v poloze 352 nahrazen zbytkem izoleucinu, mutace, při níž je zbytek threoninu v poloze 352 nahrazen zbytkem izoleucinu a současně je zbytek šeřinu v poloze 369 nahrazen zbytkem fenylalaninu, mutace, při níž je

-55CZ 291730 B6 zbytek kyseliny glutamové v poloze 164 nahrazen zbytkem lysinu a mutace, při níž je zbytek methioninu v poloze 417 nahrazen zbytkem izoleucinu a současně je zbytek cysteinu v poloze 419 nahrazen zbytkem tyrosinu, počítáno od N-zakončení řetězce aminokyselin aspartokinázy III, definovaného řetězcem č. 8.

6. Bakterie z rodu Escherichia podle nároku 3, v nichž je účinnost dihydrodipikolinátreduktázy v bakteriálních buňkách zvýšena.

7. Bakterie z rodu Escherichia podle nároku 6, která je transformována rekombinantní DNA, zkonstruovanou vazbou genu pro dihydrodipikolinátreduktázu na vektor, autonomně replikovatelný v buňkách bakterií z rodu Escherichia.

8. Bakterie z rodu Escherichia podle nároku 6, která je transformována genem pro diaminopimelátdehydrogenázu z coryneformních bakterií.

9. Bakterie z rodu Escherichia podle nároku 8, která je transformována rekombinantní DNA, zkonstruovanou vazbou genu pro diaminopimelátdehydrogenázu z coryneformní bakterie na vektor, autonomně replikovatelný v buňkách bakterií z rodu Escherichia.

10. Bakterie z rodu Escherichia podle nároku 6, v nichž je účinnost tetrahydrodipikolinátsukcinylázy a sukcinyldiaminopimelátdeacylázy v bakteriálních buňkách zvýšena.

11. Bakterie zrodu Escherichia podle nároku 10, která je transformována jednou z rekombinantní DNA nebo dvěma rekombinantními DNA, zkonstruovanými vazbou genu pro tetrahydrodipikolinátsukcinylázu a genu pro sukcinyldiaminopimelátdeacylázu na stejný vektor nebo na odlišné vektory, autonomně replikovatelné v bakteriích rodu Escherichia.

12. Způsob výroby L-lysinu, vyznačující se tím, že se pěstuje bakterie z rodu Escherichia podle některého z nároků 2 až 11 v příslušném živném prostředí a nahromaděný L-lysin se izoluje.