WO1995016042A1 - Procede de production de l-lysine par fermentation - Google Patents

Procede de production de l-lysine par fermentation Download PDF

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WO1995016042A1
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Hiroyuki Kojima
Yuri Ogawa
Kazue Kawamura
Konosuke Sano
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    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01016—Diaminopimelate dehydrogenase (1.4.1.16)

Definitions

  • the present invention relates to the microbial industry, and more particularly to a method for producing L-lysine by a fermentation method, and a DNA and a microorganism used in the production method.
  • BACKGROUND ART Conventionally, when producing L-lysine by a fermentation method, a strain isolated from the natural world or an artificial mutant of the strain has been used in order to improve productivity. Many artificial mutants that produce L-lysine are known, many of which are S-2-aminoethylcystin (AEC) -resistant mutants, and belong to the genus Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, or Escherichia. belong to. Also, various techniques for increasing amino acid production, such as using a transformant using recombinant DNA (US Pat. No. 4,278,765), have been disclosed.
  • AEC S-2-aminoethylcystin
  • DDPS dihydrodipicolinate synthase
  • the number of g of L-lysine produced per gram of sugar or the percentage thereof is calculated as 0.04 or 4%.
  • a method for producing L-lysine using a Escherichia bacterium into which DDPS derived from a corynebacterium genus known to be unaffected by feedback inhibition by L-lysine has been introduced. No. 8382 (consumption factor 17 %).
  • the maximum growth temperature of Corynebacterium bacteria is about 10 degrees lower than the maximum growth temperature of Escherichia bacteria, DNA encoding DDPS derived from Corynebacterium bacteria is introduced into Escherichia bacteria.
  • dihydrodipicolinic acid synthase is an enzyme that synthesizes dihydrodipicolinic acid by dehydrating and condensing asparto semialdehyde and pyruvic acid, and this reaction is involved in the biosynthesis of L-lysine in aspartic acid-based amino acids. It is a branch of the system. It is known that in Aspergillus X-Richeria bacteria, it plays an important role in L-lysine biosynthesis together with aspartokinase.
  • DDPS is encoded by the dapA gene in E. coli (Escherichia coli). This dapA has been cloned and its nucleotide sequence has been determined (Richaud, F. et al. J. Bacteriol., 297 (1986)).
  • aspartokinase is an enzyme that catalyzes the reaction of converting aspartic acid to ⁇ -phosphoaspartic acid, and is used in the biosynthesis of aspartic acid-based amino acids. It is the main regulatory enzyme.
  • E. coli AK AK I, ⁇ , ⁇
  • HD homoserine dehydrogenase
  • One of the complex enzymes is AK I—HDI, encoded by the thrAit gene, and the other is AKII—HDII, encoded by the metLM gene.
  • AK I undergoes concerted inhibition by threonine and isoleucine and inhibition by threonine, and AKII is inhibited by methionine Receive.
  • AKIII alone is a monofunctional enzyme, a product of a gene named lysC, which is known to be inhibited by L-lysine and inhibited by feed knock.
  • DDPS derived from Corynebacterium bacteria is not subject to feedback inhibition by L-lysine.
  • the culture temperature must be maintained. There is a problem in the point. If a mutant enzyme of DPSS or A Kill derived from Escherichia bacterium that is not subject to feedback inhibition by L-lysine can be obtained, efficient fermentative production of L-lysine can be performed using Escherichia bacterium.
  • a mutant enzyme of DPSS or A Kill derived from Escherichia bacterium that is not subject to feedback inhibition by L-lysine can be obtained, efficient fermentative production of L-lysine can be performed using Escherichia bacterium.
  • There is no prior literature showing the power, the 'expected power,' and the mutant enzyme of DDPS.Also, although there is a report on the mutant enzyme of AK III (Boy, E.
  • the present invention has been made from the above viewpoint, and obtained DDPS and ⁇ derived from a genus Escherichia bacterium in which the feedback inhibition by L-lysine was sufficiently released, which was further improved compared to the conventional art.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing L-lysine by a fermentation method.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, succeeded in obtaining a DNA encoding DD DDS derived from Escherichia bacterium in which feedback inhibition by L-lysine was sufficiently released. did.
  • the DNA encoding DDPS derived from E. coli from which feedback inhibition by L-lysine has been sufficiently released may be referred to as a mutant dapA or dapA * in this specification.
  • the present inventors have also created a bacterium belonging to the genus Escherichia that retains aspartokinase and mutant dapA in which feedback inhibition by L-lysine has been released.
  • Escherichia coli-derived athno in which feedback inhibition by L-lysine was sufficiently released.
  • the DNA encoding soletokinase is herein referred to as mutant 1 ysC or Sometimes called 1 ys C *.
  • the present inventors have created a bacterium belonging to the genus Escherichia, which retains the mutant dapA and the mutant 1ySC. By culturing the bacteria belonging to the genus X-Richia in an appropriate medium, it was found that a significant amount of L-lysine could be produced and accumulated in the culture. In addition, the present inventors have further enhanced L-lysine producing ability by enhancing other genes of the L-lysine biosynthesis system of the bacterium belonging to the genus Escherichia carrying the mutant dap A and the mutant 1 ysC. It has been found that it can be improved.
  • the present invention relates to a DNA encoding a dihydrodipicolinate synthase derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia having a mutation in which feedback inhibition by L-lysine is released.
  • the mutation that releases the feedback inhibition by L-lysine includes the alanine residue at position 81 from the N-terminal to the valine residue in the amino acid sequence of dihydrodipicolinate synthase described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the present invention is also a bacterium belonging to the genus Escherichia, which is transformed by introducing DNA encoding a dihydrodipicolinate synthase derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia having a mutation that eliminates the feedback inhibition by L-lysine into cells.
  • the mutation that releases the feedback inhibition by L-lysine is the amino acid sequence of dihydrodipicolinate synthase described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, in which the alanine residue at position 81 from the N-terminus has a valine residue.
  • the present invention further provides the bacterium belonging to the genus Escherichia, further comprising an aspartokinase from which feedback inhibition by L-lysine has been released.
  • an aspartokinase from which feedback inhibition by L-lysine has been released As a method for retaining the esbartkinase from which feedback inhibition by L-lysine has been released in Escherichia bacteria, there is a method for asbestos kinase from Escherichia bacterium having a mutation in which feedback inhibition by L-lysine is released.
  • II I A method of introducing DNA to be introduced into cells.
  • Mutations in aspartokinase II I that release the feedback inhibition by L-lysine include the amino acid sequence of aspartokinase I II described in SEQ.
  • a mutation in which the glycine residue of the above is replaced with an aspartic acid residue a mutation in which the glycine residue of the 233 is replaced with an aspartic acid residue and the glycine residue of the 408 is replaced with an aspartic acid residue, 3 Mutation in which the 4th arginine residue is replaced with a cysteine residue and 3 2 3 a glycine residue is replaced with an aspartic acid residue, 3 2 5
  • substitution of a leucine residue with a phenylalanine residue Mutation, substitution of the methionine residue at position 318 with an isoleucine residue, substitution of the methionine residue at position 318 with an isoleucine residue, and substitution of the valine residue at position 349 with methionine Mutation, substitution of serine residue 345 with leucine residue
  • the DNA encoding 11I may be retained on the chromosome of the bacterium belonging to the genus Escherichia, or may be retained on the same or different plasmids in the cell. Furthermore, one of the DNAs may be retained on the chromosome and the other DNA may be retained on the plasmid.
  • the present invention also provides the bacterium belonging to the genus Escherichia, wherein the dihydrodipicolinate reductase gene is further enhanced. Enhancement of the dihydrodipicolinate reductase gene is achieved by transforming the dihydrodipicolinate reductase gene with a recombinant DNA linked to an autonomously replicable vector in Escherichia bacteria cells. Can be performed.
  • the present invention further relates to the bacterium belonging to the genus Escherichia, wherein a diaminopimelate dehydrogenase gene derived from a coryneform bacterium such as Brevibacterium lactofermentum is introduced.
  • a diaminopimelate dehydrogenase gene derived from a coryneform bacterium such as Brevibacterium lactofermentum is introduced.
  • Introduction of the enhanced diaminopimelate dehydrogenase gene derived from a coryneform bacterium into a genus Escherichia bacterium is performed by transforming the gene with a recombinant DNA ligated to a vector capable of autonomously replicating in a bacterium belonging to the genus Escherichia. It can be done by doing.
  • coryneform bacterium examples include a bacterium belonging to the genus Corynebacterium or Brevibacterium, which is a wild-type strain having a glutamic acid-producing ability and other mutant strains having the ability to produce an amino acid. More specifically, in addition to Brevipacterium and Lactofamentum, there may be mentioned Brevibacterium. Furanokum, Brevinokterium 'Divalikatam', Corynebacterium glutamicum, Corynenocterium relium and the like.
  • the present invention is also a bacterium belonging to the genus Escherichia, in which the succinildiaminopimelate transaminase gene and the succinildiaminopimelate deacylase gene are enhanced in place of the diaminopimelate dehydrogenase gene. Enhancement of these genes is achieved by transforming them with a single recombinant DNA or two recombinant DNAs linked to the same or different vectors capable of autonomous replication in Escherichia bacteria cells. It can be carried out.
  • the present invention also provides a method for culturing any of the above-mentioned bacteria belonging to the genus Escherichia in a suitable medium, producing and accumulating L-lysine in the culture, and collecting L-lysine from the culture.
  • DNA encoding DDPS or AKIII, or DNA containing a promoter in these DNAs may be referred to as “DDPS gene” or ⁇ gene.
  • DDPS gene DNA encoding DDPS or AKIII, or DNA containing a promoter in these DNAs
  • DDPS gene DNA encoding DDPS or AKIII, or DNA containing a promoter in these DNAs
  • a mutant enzyme from which feedback inhibition by L-lysine has been released is sometimes simply referred to as “mutant enzyme”, and DNA encoding the same or DNA containing a promoter is sometimes referred to as “mutant gene”.
  • the feedback inhibition by L-lysine is released means that the inhibition only needs to be substantially released, and it is not necessary that the feedback be completely released.
  • the DNA encoding the mutant DDPS of the present invention is a DNA encoding a wild-type DDPS that has a mutation in which feedback inhibition of L-lysine of the encoded DDPS is released.
  • DDPS include those derived from bacteria belonging to the genus Escherichia, particularly DDPS derived from E. coli.
  • the mutation that releases the feedback inhibition by DDPS0L-U gin includes, from the N-terminal of DDP S in the amino acid sequence of DDP S described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the DNA encoding wild-type DDP S is not particularly limited as long as it encodes a DDPS derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia, but specifically encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • DNA and more specifically, among the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a sequence represented by nucleotide numbers 272 to 1147 is exemplified. In these sequences, those having a mutation in the base sequence that causes the substitution of the amino acid residue are DNAs encoding the mutant DDPS of the present invention.
  • the type of the codon corresponding to the substituted amino acid residue is not particularly limited as long as it encodes the amino acid residue.
  • the sequence of the retained DDPS may differ slightly depending on the type of strain ⁇ , but substitution of an amino acid residue at position I or position that is not involved in the activity of such an enzyme.
  • the deletion L which has an insertion, is also included in the mutant DDPS gene of the present invention.
  • the method for obtaining such a mutant gene is as follows. First, DNA containing the wild-type DDPS gene or the DDPS gene having another mutation is subjected to in vitro mutation treatment, and the mutated DNA is ligated to a vector DNA compatible with the host to recombine. Obtain DNA. A transformant is obtained by introducing the recombinant DNA into a host microorganism, If one of the transformants that led to the expression of mutant DDPS is selected, the transformant will retain the mutant gene.
  • a DNA containing a wild-type DDPS gene or a DDPS gene having another mutation is ligated to a vector suitable for the host to obtain a recombinant DNA, and then the recombinant DNA is subjected to in vitro mutation treatment.
  • the transformant even if a transformant is obtained by introducing the recombinant DNA after the mutagenesis treatment into a host microorganism, and a transformant that has become capable of expressing the mutant DDPS is selected from the transformants, the transformant will It has a mutant gene.
  • a mutant gene may be obtained from the mutant.
  • a transformant into which a recombinant DNA linked to a wild-type gene has been introduced is subjected to mutation treatment to create a mutant that produces a mutant enzyme, and then the recombinant DNA is recovered from the mutant.
  • a mutant gene is created on the DNA.
  • Examples of the drug for in vitro mutagenizing DNA include hydroxylamine. Hydroxyl ⁇ Min, cytosine N 4 - is a chemical mutation treatment agent which causes mutation from cytosine to thymine by may strange hydroxy cytosine.
  • a UV-irradiation or a mutation agent commonly used for artificial mutation such as N-methyl- ⁇ '-nitro- ⁇ -nitrosogazine (NTG) or nitrite is used. Is performed.
  • any kind of microorganism that belongs to the genus Escherichia may be used as a donor of the DNA containing the DDPS gene having another mutation in the wild-type DDPS gene.
  • those described in the books of Neidhardt et al. Neidhardt, F. G et. Al., Escherichia coii and Salmonella Typhimurium, American Society of Microbiology, Washington DC, 1208, table 1 can be used.
  • E. coli JM109 strain and MC1061 strain can be mentioned.
  • a wild strain is used as a donor strain of DM containing the DDPS gene, a DNA containing a wild-type DDPS gene can be obtained.
  • wild type A culture is obtained by culturing E. coli having dapA of, for example, MC1061 strain.
  • the above microorganisms may be cultured by a usual solid culture method, but it is preferable to employ a liquid culture method in consideration of the efficiency at the time of collection.
  • the culture medium may include, for example, one or more nitrogen sources such as yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor or soybean or wheat leachate, and the like, monobasic potassium phosphate, dibasic potassium phosphate, magnesium sulfate, One or more inorganic salts such as sodium chloride, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate are added, and if necessary, saccharide raw materials, vitamins and the like are appropriately added. It is appropriate to adjust the initial pH of the medium to 6 to 8.
  • the culture is carried out for 30 to 42, preferably 37 to 4 to 24 hours by submerged aeration and stirring, shaking culture, or stationary culture.
  • the culture thus obtained is centrifuged at, for example, 3,000 rpm for 5 minutes to obtain cells of E. coli MC1061 strain. From these cells, methods such as the method of Saito and Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)) and the method of KS Kirby (Biochem. J., 64, 405, (1956)) Can obtain chromosome DM.
  • chromosomal DNA library is prepared.
  • chromosomal DNA is partially digested with an appropriate restriction enzyme to obtain a mixture of various fragments.
  • restriction enzymes can be used by adjusting the degree of cleavage by adjusting the cleavage reaction time and the like.
  • Sau3AI acts on chromosomal DNA at a temperature of 30 or more, preferably 37, at an enzyme concentration of 1 to 10 units / ml for various times (1 minute to 2 hours) to digest it.
  • the cut chromosomal DNA fragment is ligated to a vector DNA that can be autonomously replicated in a bacterial cell belonging to the genus Escherichia, thereby producing a recombinant DNA.
  • a restriction enzyme that generates a terminal base sequence complementary to the restriction enzyme Sau3AI used to cut chromosomal DNA for example, BamHI, is used under the conditions of a temperature of 30 or more and an enzyme concentration of 1 to 100 units / ml. It is allowed to act on the vector DNA for at least an hour, preferably for 1 to 3 hours, to completely digest the vector DNA and to cleave it.
  • the chromosomal DNA fragment mixture obtained as described above is mixed with the cleaved and cleaved vector DNA, and DNA ligase, preferably T4 DNA ligase, is mixed with the mixture at a temperature of 4 to I6 and an enzyme concentration of 1 to 4. : Reacting DNA for 1 hour or more, preferably 6 to 24 hours under the condition of I00 unit Zml to obtain recombinant DNA. Using the obtained recombinant DNA, a microorganism of the genus Escherichia, such as E.
  • chromosomal DNA library is prepared by transforming DDPS-deficient mutant strains such as proA3, lac-3, tsx-76). This transformation can be carried out by the method of DMMorrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) or by increasing the permeability of DNA by treating recipient cells with chlorosyl chloride (Mandel. M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
  • the JE7627 strain is available from the National Institute of Genetics (Mishima, Shizuoka, Japan).
  • a strain having a recombinant DNA of the DDPS gene from a strain having an increased DDPS activity or a strain having complemented auxotrophy due to the deletion of the DDPS gene.
  • a DDPS-deficient mutant is auxotrophic for diaminopimelic acid
  • a strain capable of growing on a medium that does not contain diaminopimelic acid is isolated, and the strain is isolated.
  • a candidate strain with a recombinant DNA containing the DDPS gene actually retains the recombinant DNA from which the DDPS gene was cloned
  • prepare a cell extract from the candidate strain This can be achieved by preparing a crude enzyme solution and confirming that the DDPS activity has increased.
  • the enzyme activity of DDPS can be measured by the method of Yu gari et al. (Yugari, Y. and Gilvarg, C., J. Biol. Chem., 240, 4710 (1962)).
  • the recombinant DNA in which the DNA containing the DDPS gene was inserted into the vector DNA was used, for example, by the method of P. Guerry et al. (J. Bacteriol., 116, 1064, (1973)), DB Clewell It can be isolated by a method (J. Bacteriol., 110, 667, (1972)).
  • a chromosome DNA was prepared from a strain having the DDPS gene on the chromosome by the method of Saito, Miura, etc., and the polymerase chain reaction was used.
  • CR polymerase chain reaction; White, TJ et al According to Trends Genet., 5,185 (1989)), it is also performed by amplifying the DDPS gene. I can.
  • the DNA primer used for the amplification reaction a primer complementary to both 3 ′ ends of the DNA double-stranded chain containing the entire region or a partial region of the DDPS gene is used.
  • the DNA fragment containing the entire region from a chromosomal DNA library When only a partial region of the DDPS gene is amplified, it is necessary to use the DNA fragment as a primer to screen a DNA fragment containing the entire region from a chromosomal DNA library.
  • the PCR reaction solution containing the DNA fragment containing the amplified DDPS gene is subjected to agarose gel electrophoresis, and then the target DNA fragment is extracted. The DNA fragment containing the gene can be recovered.
  • the DNA primer may be appropriately prepared based on, for example, a sequence known in E. coli (Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)).
  • a primer capable of amplifying a region consisting of 1150 bases encoding the DDPS gene is preferable, and two types of primers shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 are suitable.
  • the primer DNA is synthesized by a conventional method such as the phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)) using a commercially available DNA synthesizer (eg, a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems).
  • PCR was performed using a commercially available PCR reactor (Takara Shuzo Co., Ltd. DNA Thermal Cycler PJ2000, etc.) and TaqDM Polymerase (supplied by Takara Shuzo Co., Ltd.). Can be performed according to the method specified by the supplier.
  • the DDPS gene amplified by the PCR method is connected to an autonomously replicable vector DNA in Escherichia bacterium cells, and is introduced into Escherichia bacterium cells to introduce mutations into the DDPS gene.
  • the operation such as becomes difficult.
  • the vector DNA used, the transformation method, and the method for confirming the presence of the DDPS gene are the same as those described above.
  • Methods for performing mutations such as amino acid residue substitution, insertion and deletion in the DDPS gene obtained as described above include recombinant PCR (Higuchi, R., 61, in PCR Technology (Erlich , HA Eds., Stockton press (1989))), Site-directed mutagenesis (Kramer, W. and Frits, HJ, Meth. In Enzvmol., 154, 350 (1987)); Kunk el, TA et. al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)). Using these methods, the desired mutation can be made at the target site.
  • a mutation at a target site or a random mutation can be introduced.
  • a recombinant DNA consisting of a DNA fragment containing the DDPS gene and a vector DNA is directly mutated with hydroxylamine or the like, and thus, for example, the E. coli W3110 strain is used. Is transformed. Next, the transformant is cultured in a minimal medium, such as M9, containing S-2-aminoethylcysteine (AEC), an analog of L-lysine. Strains harboring recombinant DNA containing the wild-type DDPS gene cannot synthesize L-lysine and diaminopimelic acid (DAP) because DDEC expressed by the recombinant DNA is inhibited by AEC.
  • a minimal medium such as M9
  • AEC S-2-aminoethylcysteine
  • DAP diaminopimelic acid
  • strains containing a recombinant DNA containing the DDPS gene de-inhibited by L-lysine are not affected by AEC because the mutant enzyme encoded by the DDPS gene in the recombinant DNA is not affected by AEC. It should be possible to grow on minimal medium supplemented with AEC. Utilizing this phenomenon, select strains whose growth is resistant to AEC, an analog of L-lysine, that is, strains that retain recombinant DNA containing a mutant DDPS gene whose inhibition has been released. be able to.
  • the host is preferably a microorganism belonging to the genus Escherichia, and examples include Escherichia coli (E. coli).
  • the mutant DDP S gene fragment is extracted from the recombinant DNA and transferred to another vector.
  • the one inserted in DNA may be used.
  • the vector DNA that can be used in the present invention is preferably a plasmid vector DNA, for example, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218. And the like. Other phage DNA vectors can also be used.
  • mutant DDPS gene in order to efficiently carry out the expression of the mutant DDPS gene, other promoters such as lac, trp, and PL that work in microorganisms are linked upstream of the DNA sequence encoding the mutant DDPS.
  • the promoter contained in the DDPS gene may be used as it is or after amplification.
  • a mutant gene inserted into a vector DNA capable of autonomous replication may be introduced into a host, and the host may be retained as an extrachromosomal DNA, such as plasmid, Type gene, transduction, transposon (Berg, DE and Berg, CM, Bio / Technol., 1, 417 (1983)), Mu phage (JP-A-2-109985) or homologous recombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)) may be incorporated into the chromosome of the host microorganism.
  • the DNA encoding mutant type ⁇ used in the present invention has a mutation in DNA encoding wild-type AKIII in which the feedback inhibition of L-lysine of encoded AKIII is released.
  • the mutation that releases the feedback inhibition by L-lysine in ⁇ is the amino acid sequence of AKIII shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, from the N-terminal of AKIII.
  • the DNA encoding wild-type AKIII is not particularly limited, and includes a DNA encoding a bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, E. coli, and specifically, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8. And the sequence represented by base numbers 584 to 193 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the E. coli ⁇ ⁇ ⁇ is encoded by the lysC gene.
  • those having a change in the base sequence that causes the substitution of the amino acid residue are DNAs encoding the mutant form of the present invention.
  • the type of the codon corresponding to the substituted amino acid residue is not particularly limited as long as it encodes the amino acid residue.
  • the amino acid sequence of wild-type AK II I retained may differ slightly depending on the type of strain and strain.
  • the mutant AKI II gene of the present invention also has a substitution, deletion or insertion of an amino acid residue at a position not involved in the activity of such an enzyme.
  • the nucleotide sequence of the wild-type lysC gene (SEQ ID NO: 7) obtained in Example 2 described later is the sequence of lysC of E.
  • coli K-12 JC411 strain (Cassan, M., Parsot , C., Cohen, GN, and Patte, JC, J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)), and two of them differ in the encoded amino acid residues.
  • LysC of the JC411 strain is represented by the amino acid sequence of lysC shown in SEQ ID NO: 8, The N-terminal 58th glycine residue is replaced by a cysteine residue, and the 401st glycine residue is replaced by an alanine residue.
  • Even if lysC has the same sequence as lysC of this E. coli K-12 JC411 strain the feedback inhibition by L-lysine is released by introducing any of the mutations (a) to (ii) above. It is expected that lysC having the mutated mutation will be obtained.
  • the method for obtaining DNA encoding the mutant ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in which feedback inhibition by lysine has been released is as follows. First, the DNA containing the wild-type AKIII gene or the AKIII gene having another mutation is subjected to in vitro mutagenesis, and the mutated DNA is ligated with a vector DNA compatible with the host to recombine. Obtain DNA. The recombinant DNA is introduced into a host microorganism to obtain a transformant. If the transformant that has expressed the mutant AKIII is selected, the transformant is transformed into the mutant gene. Holding.
  • a DNA containing the wild-type A Kill gene or the AKIII gene having another mutation is ligated to a vector DNA compatible with the host to obtain a recombinant DNA, and then the recombinant DNA is subjected to in vitro mutation treatment. Then, the transformant obtained after the mutation treatment is introduced into a host microorganism to obtain a transformant, and a transformant which has become capable of expressing the mutant AK11I is selected from the transformants. The transformant retains the mutant gene.
  • a microorganism that produces a wild-type enzyme may be subjected to mutation treatment to create a mutant strain that produces the mutant enzyme, and then a mutant gene may be obtained from the mutant strain.
  • the drug for directly mutagenizing DNA include hydroxylamine.
  • Hydrate Rokishinoreamin is cytosine N 4 - is a chemical mutation treatment agent which causes mutation from cytosine to thymine by changing the hydroxy cytosine.
  • ultraviolet irradiation or treatment with a mutagen that is commonly used for artificial mutation such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) is performed.
  • Any kind of microorganisms belonging to the genus Escherichia may be used as a donor of the DNA containing the AK111 gene having another mutation in L of the wild-type AK111 gene.
  • those described in the book by Neidhardt et al. (Neidhardt, FC et. Al., Escherichia coli and Salmonella Typhimuriura, American Society for Microbiology, Washington DC, 1208, table 1) can be used.
  • Examples include E. coli JM109 strain and MC1061 strain.
  • the preparation of the chromosomal DNA, the preparation of the chromosomal DNA library, and the like may be performed in the same manner as the above-mentioned acquisition of the DDPS gene. It is preferable to use AKI, II, and III all-deficient strains, such as E. coli GT3 strain (available from E. coli Genetic Stock Center (Connecticut, USA), etc.) as a host used for library preparation.
  • E. coli GT3 strain available from E. coli Genetic Stock Center (Connecticut, USA), etc.
  • a strain having a recombinant DNA of the AKIII gene is obtained as a strain with increased AKIII activity or a strain with complemented auxotrophy.
  • Prepare a cell extract from the candidate strain prepare a crude enzyme solution from it, and confirm AK111 activity. ⁇ can be performed by the method of Stattman et al. (Stadtman, ER, Cohen, GN, LeBras, G., and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033 (1961)).
  • a completely AK-deficient mutant when used as a host, it can grow on a medium without L-lysine, L-threonine, L-methinion and diaminopimelic acid, or on a medium without homoserine and diaminopimelic acid
  • a DNA fragment containing the AKIII gene can be obtained.
  • AKIII gene is amplified from chromosomal DNA by the PCR method, for example, a sequence known in E. coli (Cassan, M., Parsot, C., Cohen GN, and Patte, JC, J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)), but a primer that can amplify a region consisting of 1347 bases encoding the lysC gene is appropriate.
  • a primer that can amplify a region consisting of 1347 bases encoding the lysC gene is appropriate.
  • two types of primers having the sequences shown in SEQ ID NOS: 5 and 6 are suitable.
  • the AKIII gene obtained as described above may be mutated such as amino acid residue substitution, insertion and deletion by the same method as the above-mentioned mutation treatment of the DDPS gene, such as recombinant PCR, site-specific mutation. There are laws.
  • a mutation at a target site or a random mutation can be introduced.
  • AK111 gene DNA on chromosomal or extrachromosomal recombinant DNA is directly there is a method of treating with hydroxylamine (Hashimoto, T. and Sekiguchi, M., J. Bacteriol., 159, 1039 (1984)). Also, a method of irradiating a bacterium belonging to the genus Escherichia carrying the gene on the chromosome or extrachromosomal recombinant DNA with ultraviolet light, or a method of treating with a chemical agent such as ⁇ -methyl-N'-nitrosguanidine or nitrous acid is used. You may.
  • a recombinant DNA containing the mutated AK111 gene is transformed into a completely AK-deficient strain, for example, an E. coli GT3 strain.
  • the transformed strain is cultured in a minimal medium containing a significant amount of L-lysine, for example, M9.
  • Strains harboring recombinant DNA containing the wild-type AK111 gene are identified as L-threonine, L-isoleucine, L-methionine, and diaminopimelic acid (since only AK is inhibited by L-lysine). DAP) cannot be synthesized and growth is suppressed.
  • a recombinant DNA-bearing strain containing a mutant AK111 gene whose L-lysine inhibition has been released should be able to grow on a minimal medium supplemented with a significant amount of L-lysine. is there.
  • strains whose growth has become resistant to L-lysine or AEC which is an analog of L-lysine that is, a strain having a recombinant DNA containing a mutant AK111 gene whose inhibition has been released, can be used. You can choose.
  • the thus obtained mutant gene is introduced as a recombinant DNA into a suitable microorganism (host) and expressed to obtain a microorganism having A Kill from which feedback inhibition has been released.
  • a suitable microorganism host
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia are preferable, and examples include E. coli.
  • a mutant AKIII gene fragment extracted from the recombinant DNA and inserted into another vector may be used.
  • the vector DNA that can be used in the present invention is preferably a plasmid vector DNA, for example, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMWl18, pMW219, pMW218 and the like. No. Alternatively, a phage DNA vector can be used.
  • another promoter such as lac, trp, or PL that works in microorganisms may be linked upstream of the DNA encoding the mutant AKIII.
  • the promoter contained in the AKIII gene Alternatively, it may be amplified and used.
  • a mutant gene inserted into autonomously replicable vector DNA may be introduced into a host, and may be retained in the host as extrachromosomal DNA such as plasmid.
  • extrachromosomal DNA such as plasmid.
  • a bacterium belonging to the genus Escherichia which is transformed by introducing the mutant DDPS gene obtained as described above and retains AK in which feedback inhibition by L-lysine has been released, is cultured in a suitable medium.
  • L-lysine By producing and accumulating L-lysine in a product and collecting L-lysine from the culture, L-lysine can be efficiently produced. That is, L-lysine can be efficiently produced by retaining mutant DDPS and mutant ⁇ ⁇ ⁇ together in a bacterium belonging to the genus Escherichia.
  • DNA encoding AKI II having a mutation in which feedback inhibition by L-lysine is released is integrated into chromosomal DNA and transformed.
  • the AK from which feedback inhibition by L-lysine has been released may be I or wild-type AK which is not subjected to feedback inhibition by L-lysine. It may be an introduced one.
  • a mutant strain of Escherichia bacterium which is capable of producing a mutant ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ by mutagenizing a bacterial cell of the genus Escherichia may be used.
  • Transformation may be performed by incorporating the mutant DDPS gene into chromosomal DNA and transforming the recombinant DDPS gene with a vector DNA capable of autonomously replicating in Escherichia bacteria cells. Transformation may be achieved by introducing DNA into cells.
  • both the mutant DDPS gene and the mutant AKill gene are introduced into a bacterium belonging to the genus Escherichia, even if both the mutated genes are integrated and retained on the chromosomal DNA of the bacterium belonging to the genus Escherichia, And may be retained as extrachromosomal DNA on single or separate plasmids.
  • different plasmids it is preferable to use brassamides each having a stable distribution mechanism such that each of them is stably retained inside the cell.
  • one of the mutant genes may be integrated and retained on chromosome DNA, and the other mutant gene may be retained as extrachromosomal DNA on plasmid in the cell.
  • L-lysine productivity can be further improved. Furthermore, by introducing a diaminopimelic acid dehydrogenase gene derived from a coryneform bacterium into a bacterium belonging to the genus Escherichia carrying the mutant AKil gene and the mutant DDPS gene and having an enhanced dihydrodipicolinate reductase gene, L-lysine productivity can be further improved. This diaminopimelate dehydrogenase gene needs to be enhanced.
  • the succinildialaminopimelate transaminase gene and the succinoinoresaminopimelate deacylase gene may be enhanced to the same extent as L- Lysine productivity can be improved.
  • the enhancement of a gene means enhancing the activity per cell of an enzyme which is an expression product of the gene. Specifically, for example, increasing the intracellular copy number of the gene, using a promoter with high expression efficiency to increase the expression level per gene, introducing a mutation that enhances enzyme activity into the gene, etc. Is mentioned. Fine
  • the gene may be inserted into a vector capable of autonomous replication in a cell belonging to the genus Escherichia, and the vector may be used to transform a bacterium belonging to the genus Escherichia.
  • This vector is preferably a multicopy plasmid.
  • the copy number may be increased by amplifying the DNA integrated into the chromosomal DNA using Mu phage or the like.
  • a plasmid is used to introduce the mutant DDPS gene and the mutant AK III gene, a stable partitioning mechanism is used so that both of these plasmids are stably retained in the cell. It is preferable to use a plasmid having The order of introduction of each gene does not matter.
  • the mechanism by which L-lysine productivity can be gradually increased by sequentially enhancing L-lysine biosynthesis genes as described above will be described below.
  • a biosynthesis system consisting of multiple reactions can be compared to a liquid flowing through multiple tips of different thicknesses connected in series.
  • each pipe corresponds to an individual enzyme
  • the thickness of the pipe corresponds to the enzyme reaction rate.
  • it is effective to make the thinnest pipe thicker. The effect cannot be expected even if the thick pipe is made thicker.
  • make the second thinnest pipe thicker From such a viewpoint, the present inventors have attempted to enhance the L-lysine biosynthesis system.
  • the rate-limiting step of the L-lysine biosynthesis system is introduced into E. coli by introducing the L-lysine biosynthesis gene from E. coli in stages. Clarified.
  • dapC tetrahydrodipicolinate succinylase gene
  • dapD succinyldiaminonopimelate transaminase gene
  • dapE succinyldiaminopimerate deacylase gene
  • dapF due to the downstream of the biosynthesis system
  • Diaminopimelate epimerase gene DDH (diaminopimelate dehydrogenase) of Brevibacterium lactofermentum, which can catalyze the reactions involving these gene products independently.
  • DDH diaminopimelate dehydrogenase
  • DDH diaminopimelic acid dehydrogenase (derived from Brevipa's tertiary lactofermentum)
  • the ppc gene can be obtained from plasmid pS2 (Sabe, H. et al., Gene, 31, 279 (1984)) containing this gene, or pT2.
  • pS2 By cutting pS2 with Aatll and Aflll, a DNA fragment having the ppc gene can be obtained.
  • a DNA fragment having the ppc gene can be obtained by cutting pT2 with Smal and Seal.
  • E. coli F15 strain (AJ12873) carrying PT2 was commissioned to FERM BP-4732 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-3-3, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan) Deposited under a number under the Budapest Treaty.
  • the aspC gene is a plasmid containing this gene, pLF4 (Inokuchi, K. et al., ucleic Acids Res., 10, 6957 (1982)).
  • pLF4 is digested with PvuII and Stul, a DNA fragment containing the aspC gene is obtained.
  • the asd gene is obtained from the plasmid pAD20 (Haziza, C. et al., ⁇ ⁇ 0, 1, 379 (1982)) carrying this gene.
  • pAD20 is cut with Asel and Clal, a DNA fragment having asd is obtained.
  • the dapB gene is composed of two types of oligonucleotide primers (for example, based on the nucleotide sequence of a known dapB gene (Bouvier, J. et al., J. Biol. Chem., 259, 14829 (1984))). It can be obtained by amplifying E. coli chromosomal DNA by PCR using SEQ ID NOS: 9, 10).
  • the DDH gene was created based on the known nucleotide sequence of the DDHil gene of Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)). It is obtained by amplifying the chromosomal DNA of Brevipacterium lactofermentum by PCR using the two oligonucleotide primers (for example, SEQ ID NOS: 11 and 12).
  • the lysA3 ⁇ 4 gene is composed of two oligonucleotide primers (for example, based on the nucleotide sequence of a known lysAil gene (Stragier, P. et al., J. Mol. Biol., 168, 321 (1983))). It can be obtained by amplifying E. coli chromosomal DNA by the PCR method using SEQ ID NOs: 13, 14).
  • the dapDit gene is composed of two oligonucleotide primers (Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)) based on the known nucleotide sequence of the dapDap gene. For example, it can be obtained by amplifying chromosomal DNA of E. coli 13110 strain by a PCR method using SEQ ID NOs: 15, 16).
  • the dapE gene is composed of two oligonucleotide primers (SEQ ID NOs: 17 and 18) prepared based on the nucleotide sequence of a known dapE gene (Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174, 5265 (1992)). ) By amplifying E. coli DNA by PCR.
  • the dapF gene is composed of two types of oligonucleotide primers (for example, SEQ ID NO: 19) prepared based on the nucleotide sequence of a known dapF gene (Richaud, C. et al., Nucleic Acids Res., 16, 10367 (1988)). , 20) by PCR. Obtained by amplifying i-chromosomal DNA.
  • the bacterium belonging to the genus Escherichia used as a host in the present invention includes a promoter of a mutant DDPS gene and a mutant AK111 gene, or a promoter of another L-lysine biosynthesis gene or another gene for expressing these genes in the cell. If the promoter functions, and the mutant DDPS gene, mutant AKI II gene, or other L-lysine biosynthesis gene is to be introduced as extrachromosomal DNA into the plasmid, the vector DNA used for the introduction Any replication origin can be used as long as it functions in the cell and can replicate.
  • L-lysine-producing E. coli specifically, mutants having resistance to L-lysine analogs can be exemplified.
  • This L-lysine analog is such that it inhibits the growth of a bacterium belonging to the genus Escherichia, but its inhibition is such that it is totally or partially released when L-lysine coexists in the medium. Examples include oxalidine, lysine hydroxamate, AEC, 7-methyllysine, ⁇ -chlorocaprolactam, and the like.
  • Mutants having resistance to these lysine analogs can be obtained by subjecting a microorganism belonging to the genus Escherichia to ordinary artificial mutation procedures.
  • the strain used for the production of L-lysine has been deposited as Escherichia coli AJ1142 (FERM BP-1543 and NRRLB-12185). No. 185856 and U.S. Pat. No. 4,346,170).
  • the feedback inhibition of L-lysine in the above-mentioned microbial asbestos kinase has been released.
  • L-threonine-producing bacteria examples include L-threonine-producing bacteria. This is because L-threonine-producing bacteria also generally have their L-lysine inhibition of aspartokinase released.
  • E. coli L-threonine-producing bacterium the B-3996 strain has the highest productivity among the currently known strains. B-3996 strain has been deposited with Reserch Institute ior Genetics and Industrial Microorganism Breeding under accession number RIA18667.
  • the medium used for culturing the transformant having the mutant gene according to the present invention is a usual medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions and other organic components as required.
  • a carbon source use sugars such as glucose, lactose, galactose, hydrolyzate of fructose or starch, alcohols such as glycerol or sorbitol, or organic acids such as fumaric acid, citric acid or succinic acid. Can be.
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride or ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolyzate, ammonia gas, and ammonia water can be used.
  • organic trace nutrients it is desirable to contain required substances such as vitamin L-isoleucine or an appropriate amount of yeast extract.
  • required substances such as vitamin L-isoleucine or an appropriate amount of yeast extract.
  • small amounts of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions, etc. are added as necessary.
  • the culture is preferably performed under aerobic conditions for 16 to 72 hours, and the culture temperature is controlled to 25 to 45, and the pH is controlled to 5 to 8 during the culture.
  • inorganic or organic acidic or alkaline substances, ammonia gas, and the like can be used for pH adjustment.
  • FIG. 1 is a diagram showing a manufacturing process of pdapAl and pda P A2.
  • FIG. 2 is a diagram showing inhibition of wild-type and mutant DDPS by L-lysine.
  • FIG. 3 is a diagram showing a production process of a plasmid pdapAS824 having a double mutant dapA ′ gene.
  • FIG. 4 is a diagram showing a process for producing pLYSCl and pLYSC2.
  • FIG. 5 is a diagram showing the appearance rate and mutation rate of transformants after treatment with hydroxylamine.
  • FIG. 6 is a diagram showing the inhibition of wild-type and mutant AKIII by L-lysine.
  • FIG. 7 is a diagram showing a process for producing RSF10P-derived plasmid RSF24P having dapA * 24.
  • FIG. 8 is a diagram showing a manufacturing process of plasmid p LLC * 80.
  • FIG. 9 is a diagram showing a production process of a plasmid RSFD80 derived from RSF1010 having dapA * 24 and lysC * 80.
  • FIG. 10 shows the structures of plasmids pdapA and pdapA * having dapA or dapA *.
  • FIG. 11 is a diagram showing the structure of plasmids plysC and plysC * having lysC or lysC * 80.
  • FIG. 12 is a diagram showing the structure of plasmid pppc having ppc.
  • FIG. 13 is a diagram showing the structure of plasmid paspC having aspC.
  • FIG. 14 is a diagram showing the structure of a plasmid pasd having asd.
  • FIG. 15 shows the structure of plasmid pdapB having dapB.
  • FIG. 16 shows the structure of plasmid pDDH having DM.
  • FIG. 17 is a diagram showing the structure of a plasmid plysA having lysA.
  • FIG. 18 is a diagram showing a process for producing RSF1010-derived plasmid pCABl having dapA * 24, lysC * 80 and dapB.
  • Figure 19 shows plasmid pC from RSF1010 with dapA * 24, lysC * 80, dapB and DDH.
  • FIG. 4 is a diagram showing a manufacturing process of ABD2.
  • FIG. 20 is a diagram showing the structure of plasmid pdapD having dapD.
  • FIG. 21 shows the structure of plasmid pdapE having dapE.
  • FIG. 22 is a diagram showing the structure of plasmid pdapF having dapF.
  • FIG. 23 is a diagram showing a production process of a plasmid pMWdapDEl having dapD and dapE.
  • FIG. 24 is a diagram showing a production process of a plasmid pCABDEl having dapA * 24, lysC * 80, dapB, dapD and dapE.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples.
  • Example 1 Obtaining Mutant DDPS Gene
  • the nucleotide sequence of the dapA gene of E. coli has already been reported (Richaud, F. et al., J. BacterioL, 297 (1986)), and the open reading frame (ORF) has 876 base pairs and 292 amino acids remaining. It is known to encode a basic protein. Since it is unclear how this dapA gene is regulated, a region containing only the SD sequence and 0RF, except for the promoter region, was amplified by PCR and cloned.
  • Total genome DNA of E. coli K-12 MC1061 strain was recovered by the method of Saito and Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)), and two types having the sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 were collected.
  • a primer was prepared, and a PCR reaction was carried out using these primers according to the method of Erlitsch et al. (PCR Technology, Stockton press (1989)) to amplify the target DNA.
  • the obtained DNA was directly inserted into a commercially available cloning vector for PCR fragment pCR100 (purchased from Invitrogen, Calif., USA).
  • pCR100 contains the lacZ promoter (Placz) and is commercially available cut at the downstream site of the lacZ promoter.
  • pdapAl When connecting to a 100-meter scale, pdapAl is connected as a plasmid so that the transfer direction of dapA is in the forward direction with respect to the transfer direction by this lacZ motor, so that it is in the opposite direction. Two plasmids, pdapA2, were obtained as the linked plasmid (Fig. 1).
  • the transformant obtained by the introduction was named W3110 / pdapA2.
  • AEC a lysine analog
  • W3110 strain into which no plasmid was introduced was also cultured in the same medium. Both the two transformants and the W3110 strain without plasmid were inhibited by AEC, but their growth inhibition was restored by the addition of L-lysine.
  • a strain containing a plasmid containing dapA *, which encodes DDPS de-inhibited by L-lysine, is expected to be able to grow on minimal medium M9 supplemented with a significant amount of AEC. Decided to select a plasmid-bearing strain containing dapA 'by selecting a strain resistant to AEC.
  • dapA on pdapAl and pdapA2 prepared in 1) was mutated.
  • the W3110 / pdapAl strain and the W3110 / pdapA2 strain obtained above were used for M9 agar plates containing various concentrations of AEC. Cultured on medium. Then, the growth inhibitory concentration by AEC was examined, and selection conditions for a plasmid-containing strain containing dapA 'were examined.
  • Table 1 shows the growth of the transformants on M9 medium containing AEC at various concentrations. In the table, + indicates that the transformed strain grew, and 1 indicates that it did not grow. table 1
  • the direction of transcription of the dapA gene on pdapAl coincides with the direction of transcription by the lacZ promoter ( Figure 1). Therefore, since the expression level of the dapA gene on pdapAl was amplified by the lacZ promoter, the dapA gene on pdapA2 was resistant to fairly high concentrations of AEC even when the wild-type dapA remained, but the transcription direction of the dapAit gene on pdapA2 was lacZ promoter. The expression was low because the promoter of dapA itself was also deleted, indicating that growth was inhibited at lower concentrations of AEC (W3110 / pda P Al strain). growth in addition group of 15mM was suppressed in 30mM, W3 110 / pda P A2 shares). It was confirmed that this growth inhibition was eliminated by simultaneous addition of L-lysine.
  • dapA2 was used for mutagenesis, and a minimal medium M9 supplemented with 60 mM AEC was used to select a dapA * -containing plasmid-containing strain.
  • this medium is referred to as a selective medium.
  • (1-2-2) In vitro mutation treatment of pdapA2 with hydroxylamine Mutation was introduced into pdapA2 plasmid using an in vitro mutation treatment method in which plasmid was directly treated with hydroxylamine.
  • Mutant pdapA2 was recovered from the above 36 strains, and dapA-deficient strain JE7627 was transformed with each of them and wild-type pdapA2.A cell-free extract was prepared from each transformant, and the enzyme activity of DDPS was determined. It was measured.
  • a cell-free extract (crude enzyme solution) was prepared as follows. Transformants 2 XTY culture areas (1.6% Bacto trypton, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl) were cultured in turbidity at 660 nm (OD 66 Q) was harvested upon reaching about 0.8. The cells under the conditions of 0, and washed with 0.85% NaCl, and suspended in 20mM potassium phosphate buffer P H7.5- 400mM KC1, was disrupted by sonication (0, 200 W, 10 minutes) .
  • the lysate was centrifuged at 33 krpm for 1 hour under the condition of 0, the supernatant was added to the solution, ammonium sulfate was added to 80% saturation, stored at 0 overnight, centrifuged, and the pellet was concentrated to 20 mM phosphate. It was dissolved in potassium phosphate buffer pH 7.5-400 mM KC1.
  • the DDPS enzyme activity was measured by the method of Yugari et al. (Yugari, Y. and Gilvarg, CJ Biol. Chem. 240, 4710 (1962)). That is, the absorbance of the reaction solution having the following composition was measured with a spectrophotometer at 270 nm over time at 37, and the resulting dihydrodipicolinic acid was measured. Specified. As a blank, sodium pyruvate was removed from the reaction system.
  • L-lysine inhibited the inhibition of the three mutant DDPSs encoded by dapA * on pdapAS8, pdapAS9, and pdapAS24 at varying degrees, but all three inhibited L-lysine.
  • the specific activity of the enzyme was slightly lower than that of the wild type, both in terms of the growth of the cells and the effect of the preparation of the sample. However, it was judged that the breeding material was not practically problematic.
  • the nucleotide sequence of the mutant dapA gene was determined according to a conventional method.
  • pda P AS8 and pdapAS9 is a 4 8 7 th C is T
  • P DapAS24 5 9 7 th C is changed to T
  • the amino acid sequence of the DDPS shown in SEQ ID NO: 4 the DDPS encoded by pdapAS8 and pdapAS9 has the 8
  • the DDPS revealed that the histidine residue at position 118 was changed to a tyrosine residue.
  • the nucleotide sequence of the E. coli AKI II gene (lysC) has already been reported (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, GN, and Patte, JC, J. Biol. Chem., 261, 1052). (1986)), it has been known that the open reading frame (0RF) is composed of 1347 base pairs and encodes a protein consisting of 449 amino acid residues. Since this gene has an operator and is suppressed by L-lysine, in order to remove this operator region, a region containing only the SD sequence and 0RF was amplified using the PCR method and cloned.
  • the PCR reaction was performed according to Stockton press (1989)), and the lysC gene was amplified.
  • the obtained DNA was digested with BamHI and Asel, blunt-ended, and inserted into a multicopy vector—Smal site of PUC18.
  • This Smal site is located downstream of the lacZ promoter present in the vector, and when a recombinant DNA obtained by inserting a DNA fragment into the Smal site of pUC18 is introduced into E. coli, the lacZ promoter is regulated.
  • E. coli GT3 (thrAlOl 6b, metLM1005, lysC1004), a completely AKI, II, and III deficient strain, with these plasmids complemented the requirements for homoserine and diaminopimelic acid of GT3.
  • the DNA fragment inserted into the plasmid was confirmed to contain the active lysC gene encoding AKI II.
  • a transformant obtained by introducing pLYSCl into an AK completely deficient strain E. coli GT3 was named GT3 / pLYSC1
  • a transformant obtained by introducing pLYSC2 into E. coli GT3 was named GT3 / pLYSC2.
  • a remarkable amount of L-lysine was added to the minimal medium M9, and the GT3 / PLYSC1 strain and the GT3 / PLYSC2 strain were cultured respectively.
  • Both the GT3 / pLYSCl strain and the GT3 / PLYSC2 strain retain a plasmid containing wild-type lysC, and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ encoded by lysC on the same plasmid is the only AK.
  • Plasmid-bearing strains containing lysC * which encodes AK that has been desensitized by L-lysine, are expected to be able to grow on minimal medium M9 supplemented with significant amounts of L-lysine. Decided to select a plasmid-bearing strain containing lysC * by selecting a strain resistant to L-lysine or AEC, an analog of L-lysine.
  • the GT3 / pLYSCl strain and the GT3 / pLYSC2 strain were cultured on M9 agar plates containing various concentrations of L-lysine or AEC, respectively. Then, the growth inhibitory concentration of L-lysine or AEC was examined, and selection conditions for a plasmid-containing strain containing lysC 'were examined.
  • Table 2 shows the growth of transformants on M9 medium containing L-lysine or AEC at various concentrations. In the table, + indicates that the transformed strain grew, ⁇ indicates that it grew slightly, and-indicates that it did not grow.
  • Example 2 this medium is referred to as selection medium.
  • DNA ⁇ was also measured by adding water 200 / U) for 1 to 4 hours under the conditions of 75. Purify the treated DNA with glass powder and introduce it into a completely defective E. coli GT3 strain, complete medium (L-broth: 1% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar) To form colonies. This was replied to the selection medium set in (2-2-1), and a strain capable of growing on the selection medium was selected as a candidate strain. The appearance rate and mutation rate of the transformants showed changes as shown in Figure 5. Mutants were obtained at a considerably high rate of 0.5 to 0.8% after 4 hours of treatment.
  • E. coli MC1061 E. coli MC1061, and the whole cells were subjected to NTG treatment. After treatment, the cells were cultured overnight to fix the mutation, and then plasmid was extracted and introduced into E. coli GT3. That is, the transformed strain 2 XTY medium (1.6% Bacto trypton, 1% Yeast e xtract, 0.5% NaCl) and cultured in, OD 66. The cells were collected at a pH of about 0.3, washed with TM buffer (TM buffer) shown below, and then NTG solution (prepared by dissolving NTG in TM buffer at a concentration of 0.2 mg / ml) And treated with 37 for 0-90 minutes.
  • TM buffer TM buffer
  • NTG solution prepared by dissolving NTG in TM buffer at a concentration of 0.2 mg / ml
  • plasmid DNA is extracted from the cells, introduced into E. coli GT3 strain, and the candidate strain is screened. Leaning was performed in the same manner as in vitro mutation to obtain lysine-resistant (Lys R ) and AEC-resistant (AEC R ) mutants.
  • a cell-free extract (crude enzyme solution) was prepared as follows.
  • the transformed strain was cultured in 2 X TY culture areas, OD 6 6. Was collected at about 0.8. Conditions of the cells 0, 0. 02M KH 2 P0 4 (pH6. 75) -0. Washed with 03M S- mercaptoethanol, sonicated The cells were disrupted at (0, 100W, 30 seconds x4). The cell lysate was centrifuged at 33 krpm for 1 hour under the condition of 0.The supernatant was taken and ammonium sulfate was added to 80% saturation.After centrifugation, the pellet was added to 0.02M KH 2 PO 4 (pH 6. 75) -0. 03M; Dissolved in 9-mercaptoethanol and stored at 0 overnight.
  • wild-type AK111 was very strongly inhibited by L-lysine, 50% inhibited at about 0.45 mM L-lysine, and almost 100% inhibited at 5 mM.
  • the degree of release was variable, but the inhibition by L-lysine was released in all 14 species.
  • No. 24, 80, 117, 169, 172 Showed almost no inhibition with L-lysine lOOmM, and the 50% inhibitory concentration was more than 200 times higher than that of wild type.
  • the specific activity per total protein is almost equal to or higher than that of the wild type, both of which are affected by the growth condition of the cells and the preparation of the sample. None (Table 3).
  • the degree of inhibition release refers to the AK activity in the presence of 100 mM L-lysine relative to the AK activity in the absence of L-lysine in the reaction solution.
  • Thermal stability is the retention of activity after 1.5 hours at 55.
  • thermostability of a type enzyme to improve a certain enzyme and increase its activity. In this case, it is important that the enzyme to be created is stably retained in the cell. Due to differences in protease activity inside and outside the cell and the effect of a storage buffer for in vitro storage of the enzyme, there are problems with in vitro measurement.However, for convenience, mutation is used as a parameter. The thermal stability of type A A was studied in vitro.
  • nucleotide sequence was determined for each of the 14 lys (Ts) mutated pLYSCls, and the mutation points were determined.
  • the results are shown in Table 4.
  • the amino acid residues based on nucleotide mutations are shown in parentheses. There were 12 identical mutations among 14 species (No. 48 and No. 167, and No. 24 and No. 80). Nos. 149, 150, 156, 158, 167, 169, 172 are mutants obtained by hydroxylamine treatment, and Nos. 24, 43, 48, 60, 80, 117, 126 are mutants obtained by NTG treatment.
  • the mutation patterns were all mutations from cytosine to thymine, or mutations from guanine to adenine in the front chain due to the mutation from cytosine to thymine in the back chain.
  • Table 4 Identification of lysC * mutation points
  • B-3996 strain retains pVIC40 as the only plasmid extrachromosomally. The details are described in Japanese Patent Application Publication No. 3-5010162. The microorganism has been deposited with the Research Institute for Genetics and Industrial Microorganisms Breeding under accession number RIA 1867.
  • dapA * (118th histidine residue contained in pdapAS24, which was mutated to a tyrosine residue. Is selected).
  • the mutant dapA * (hereinafter referred to as “dapA * 24”) on pdapAS24 was transformed into pVIC40 tetracycline-resistant It was ligated downstream of the gene promoter to obtain RSF24P as shown in FIG.
  • RSF24P plasmid was introduced into the E. coli JM109 strain was named AJ12395 and was contacted by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology on October 28, 1990.
  • No strains harboring pdapAS8 and pdapAS9 were deposited, but all mutations in dapA * on each plasmid were clarified as described above.
  • PVIC40 was dropped from the B-3996 strain in accordance with a conventional method, and a B-399 strain was obtained as a strain having no plasmid.
  • RSF24P plasmid was introduced into the B-399 strain according to a conventional method to obtain B-399 / RSF24P.
  • the L-lysine productivity of B-399 / RSF24P was evaluated.
  • RSFP was constructed as a control plus. That is, a large fragment was selected from the double digest of BamHI and Dral of pVIC40 shown in FIG. It was blunt-ended with DNA polymerase Klenow fragment. The blunt-ended large fragment was self-ligated to obtain plasmid RSFP.
  • RSFP was introduced into the B-399 strain according to a conventional method to obtain B-399 / RSFP. B-399 / RSFP was also evaluated for L-lysine productivity.
  • the cultivation was carried out using the following medium, with a culturing time of 48 hours and a temperature of 37, with stirring at 114 to 116 rpm. Table 5 shows the results.
  • Example 4 Fermentative production of L-lysine by a strain into which dapA * and lysC * were introduced (I)
  • the effect of mutant DDPS on L-lysine production was shown in Example 3, but in order to further improve this,
  • the mutant AK111 gene obtained in step 2 was allowed to coexist with the mutant DDPS gene.
  • the mutant A Kill gene coexisting with the mutant DDPS gene was selected from the No. 80 strain (lys C * 80) in terms of enzyme activity, heat stability and the like.
  • lys80 is a vector PHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) having an inverted insertion site with respect to pUC18 by replacing lysC * (hereinafter referred to as “lysC * 80”) on pLYSCl * 80 to increase the expression level of lysC *.
  • the plasmid pLLC * 80 (Fig. 8), which was created by reconnection to the downstream of the lacZ promoter, was used. Since lysC * 80 on pLYSCl * 80 is located in the transcription direction opposite to that of lacZ promoter, pLLC * 80 is required for lacZ promoter to improve the productivity of L-lysine. Use plush to create lysC * 80 so that the transfer direction is positive.
  • a plasmid RSFD80 having dapA 'and lysC * was prepared as shown in FIG.
  • dapA'24 and lysC'80 are arranged in this order downstream of the promoter of the tetracycline resistance gene (tetP) so that the transcription direction is forward with respect to tetP.
  • tetP tetracycline resistance gene
  • AJ12396 The product obtained by introducing RSFD80 plasmid into E. coli JM109 strain was named AJ12396.
  • AJ 12396 was deposited on October 28, 1993 with the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology and Industrial Technology under the accession number F ERM P-13936, and was transferred to the International Deposit under the Budapest Treaty on November 1, 1994. Deposit under the accession number of FERM BP-4859.
  • RSFD80 was introduced into the B-399 strain according to a conventional method to obtain B-399 / RSFD80.
  • the L-lysine productivity of B-399 / R SFD80 was evaluated.
  • L-lysine productivity was also evaluated for B-399 / RSFP.
  • Example 5 Fermentative production of L-lysine by a strain into which daoA 'and lvsC' were introduced (II)
  • the productivity of L-lysine was increased by allowing a bacterium belonging to the genus Escherichia to carry a mutant dapA gene and a mutant lysC gene.
  • the improvement was confirmed in Example 4.
  • An experiment was conducted to determine whether this effect was maintained even when the host was changed.
  • E. coli W3110 (tyrA) strain was used as a host.
  • the W3110 (tyrA) strain is described in detail in European Patent Publication No. 48,884,244, and the following briefly describes its preparation method.
  • E. coli W3110 strain was obtained from National Institute of Genetics (Mishima City, Shizuoka Prefecture). The strain was spread on an LB plate containing streptomycin, and a strain that formed a colony was selected to obtain a streptomycin-resistant strain. Mix the selected streptomycin-resistant strain with the E. coli K-12 ME8424 strain, and mix in a complete medium (L-Broth: ⁇ % Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl).
  • E. coli K-12 ME8424 strain HfrP045, thi. relAl, tvrA:: TnlO, ung-1, nadB
  • the culture is then spread on complete medium (L-Broth: 1% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar) containing streptomycin, tetracycline and L-tyrosine. A strain forming a colony was selected. This strain was named E. coli W3110 (tyrA) strain.
  • the strain obtained by introducing the plasmid pHAT erm is named E. coli W3110 (tyrA) / pHATerm strain, which has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and registered under the registration number FE RM BP- 3 6 5 3 is given.
  • the W3110 (tyrA) strain can also be obtained by dropping the plasmid pHA Term from the E. coli W3110 (tyrA) / pHATerm strain. Plasmid can be dropped off by a conventional method. '
  • the plasmid RSFD80 containing both dapA * and lysC * obtained in Example 4 was introduced into the W3110 (tyrA) strain obtained as described above to obtain W3110 (tyrA) / RSFD80.
  • the L-lysine productivity of W3110 (tyrA) / RSFD80 was evaluated.
  • RSFP was introduced into the W3110 (tyrA) strain according to a conventional method to obtain W3110 (tyrA) / RSFP.
  • the cultivation was carried out using the L-lysine production medium described above, with a culturing time of 48 hours and a temperature of 37 under stirring at 114 to U6 rpm. Table 7 shows the results.
  • the rate-limiting step was identified by isolating various lysine biosynthesis genes, introducing those genes into E. coli, and examining the effect of each gene on L-lysine production.
  • the introduced L-lysine biosynthetic enzyme genes and the enzymes they encode are as follows.
  • DDH diaminopimelic acid dehydrogenase from Brevipa, Cterium lactate fermentum
  • lysA diaminopimelic acid decarboxylase
  • the above genes cover the L-lysine biosynthesis system from phosphoenolpyruvate to L-lysine.
  • the dapC ;, dapD, dapE and dapF genes are brevibacterium lactams that can independently catalyze reactions involving these gene products.
  • Copies DDH (Diaminopimelate Dehydrogenase) from tovimentum (Brevibacterium lactofermentum) We decided to replace the gene DDH.
  • E. coli K-12 strain W3110 (tyrA) was used as a host for introducing these genes.
  • the dapA and dapA * 24 genes were obtained by excision from pdapA2 and pdapAS24 (see Example 1) with EcoRI and Kpnl, respectively (FIG. 10). These genes were ligated with pMW118 digested with EcoRI and Kpnl to obtain pdapA and pdapA *.
  • the lysC and lys80 genes were obtained by excision with pLYSCl and pLLC'80 (see Example 2), EcoRI and Sphl, respectively. These genes were ligated with pMWll9 digested with EcoRI and Sphl to obtain plysC and plysC * (FIG. 11).
  • the ppc gene was obtained from plasmid pT2 carrying this gene. [Rho .tau.2 was cut with Smal and Seal, after the termini were blunt-ended, and inserted into the Smal site of pMW118, to obtain a plasmid pppc (Fig. 12).
  • the E. coli F15 strain (AJ12873) carrying pT2 has been deposited under the accession number FERM BP-4732 at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the Ministry of International Trade and Industry.
  • the aspC gene was obtained from plasmid pLF4 (Inokuchi, K. et al., Nucleic Acids Res., 10, 6957 (1982)) carrying this gene (FIG. 13).
  • pLF4 was digested with PvuII and Stul, the ends were blunted, and inserted into the Smal site of pMW119 to obtain plasmid paspC.
  • the asd gene was obtained from the plasmid pAD20 (Haziza, C. et al., EMB 0, 1, 379 (1982)) carrying this gene. After cutting pAD20 with Asel and Clal and blunting the end, it was inserted into the Smal site of PMW118 to obtain plasmid pasd (FIG. 14).
  • the dapB gene is composed of two types of oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 1) created based on the nucleotide sequence of a known dapB gene (Bouvier, J. et al., J. Biol. Chem., 259, 14829 (1984)). It was obtained by amplifying the dapB gene from the chromosomal DNA of the E. coli W3110 strain by PCR using 9, 10) (Fig. 15). The resulting amplified DNA fragment was cut with Asel and Dral, the ends were blunt-ended, and inserted into the Smal site of pMW119 to obtain plasmid pdapB.
  • SEQ ID NO: 1 oligonucleotide primers
  • the DDH gene was created based on the known nucleotide sequence of the DDH gene of Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)). Brevipacterium lactos by PCR using two oligonucleotide primers (SEQ ID NOS: 11 and 12) It was obtained by amplifying the DDH gene from the chromosomal DNA of the famentum ATCC13869. The obtained amplified DNA fragment was cut with EcoT22I and Aval, the ends were blunt-ended, and then inserted into the Sraal site of PMW119 to obtain plasmid pDDH (FIG. 16).
  • the lysAit gene is the nucleotide sequence of a known lysAil gene (Stragier, P. et al.,
  • lysAil transfer from E. coli W3110 strain chromosomal DNA was performed by PCR using two types of oligonucleotide primers (SEQ ID NOS: 13 and 14). Obtained by amplifying the offspring. The amplified DNA fragment obtained was cut with Spll and Bell, the ends were blunted, and inserted into the Smal site of pMW118 to obtain plasmid plysA (Fig. 17).
  • E. coli W3110 (tyrA) was transformed with each plasmid containing the L-lysine biosynthesis gene, and the resulting transformant was cultured to produce L-lysine.
  • the cultivation was carried out using the following medium at a culturing temperature of 37 and stirring of 114 to 116i: pm for 30 hours. Table 8 shows the results.
  • E. coli W3110 began to produce L-lysine by introduction of lysC ⁇ pdapA or pdapA *.
  • L-lysine feedback for both lysC and dapA products As a result of this inhibition, it is anticipated that these enzymes are major regulators of L-lysine biosynthesis.
  • the reaction catalyzed by the dapA product is present at the branching point between the synthesis systems of L-threonine, L-methionine and L-isoleucine and the L-lysine synthesis system, and is the first step in the synthesis system unique to L-lysine. It has already been reported that E.
  • a crude enzyme solution was prepared from W3110 (tyrA), W3110 (tyrA) / pdapA and W3110 (tyrA) / pdapA * in the same manner as in Example 1, and the DDPS (dihydrodipicolinate synthase) activity was measured. The degree of inhibition of activity by L-lysine was examined. Table 9 shows the results. Table 9
  • the effect of lysC * on L-lysine production can be considered as follows.
  • the first rate-limiting step involves the conversion of ASA (aspartic acid- ⁇ -semialdehyde), a substrate at the branching point of the biosynthetic system, to HD (homoserine dehydrogenase: t). This is the stage where the product of hrA or metLM) and DDPS (dapA product) compete.
  • ASA aspartic acid- ⁇ -semialdehyde
  • HD homoserine dehydrogenase: t
  • dapA * was transferred from pdapA to RSF1010 so that these plasmids would be stably retained when other plasmids were introduced into E. coli that harbors a plasmid containing dapA * to obtain RSF24P.
  • Figure 7 E. coli W3110 (tyrA) was transformed with the plasmid RSF24P having this dapA *.
  • Plasmid having an L-lysine biosynthesis gene was introduced into E. coli W3110 (tyrA) / RSF24P.
  • two kinds of plasmids including RSF24P and a plasmid containing other L-lysine biosynthetic genes are coexistent. These strains were examined for L-lysine productivity in the same manner as in (6-1-2). Table 10 shows the results.
  • LysC * was incorporated into RSF24P to obtain RSFD80 (Fig. 9).
  • lysC was incorporated into RSF24P, and the resulting plasmid was named RSFD1.
  • These plasmids were introduced into E. coli W3110 (tyrA), and a crude enzyme solution was prepared in the same manner as in (6-T2), and the AK activity and the degree of L-lysine inhibition of AK activity, t, were examined. . Table 11 shows the results. Table 11
  • dapB was incorporated into RSFD80 to obtain pCABl (Fig. 18).
  • This plasmid was introduced into E. coli W3110 (tyrA), and a crude enzyme solution was prepared.
  • the enzymatic activity of DDPR dihydrodipicolinate reductase was measured according to the method described in Tamir, H. and Gilvarg, C., J. Biol. Chem., 249, 3034 (1974).
  • DDPR activity was increased about 3-fold in the strain holding RSFD80 and pdapB and 6.5-fold in the strain holding pCABl in which dapB was incorporated into RSFD80, compared to the control (strain holding only RSFD80). .
  • the accumulation of L-lysine was the same as f3110 (tyrA) / RSFD80 + pdapB and ⁇ 3110 (t yrA) / pCABl. It was determined that the rate-limiting step had shifted to the next step.
  • the fourth rate-limiting step was identified using the plasmid pCABl having lysC *, dapA *, and dapB.
  • E. coli W3110 (tyrA) / P CABl various lysine biosynthesis plasmid was introduced into and subjected to L one lysine production culture. Table 14 shows the culture results.
  • the dapD gene is composed of two types of oligonucleotide primers (Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)) based on the nucleotide sequence of a known dapD gene. It was obtained by amplifying the dapD gene from the chromosomal DNA of the E. coli W3110 strain by the PCR method using SEQ ID NOs: 15 and 16). The obtained amplified DNA fragment was digested with Eco0109I and Sacl, the ends were blunted, and inserted into the Smal site of pMW118 to obtain plasmid pdapD (FIG. 20).
  • the dapE gene is composed of two oligonucleotide primers (SEQ ID NOs: 17 and 18) prepared based on the nucleotide sequence of a known dapE gene (Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174, 5265 (1992)). ) was amplified by amplifying the dapE gene from chromosomal DNA of E. coli strain W3110. The resulting amplified DNA fragment was cut with Muni and Bglll, the ends were blunted, and inserted into the Smal site of pMW118. Mid pdapE was obtained ( Figure 21).
  • the dapF gene is composed of two types of oligonucleotide primers (SEQ ID NOs: 19 and 20) prepared based on the nucleotide sequence of a known dapF gene (Richaud, C. et al., Nucleic Acids Res., 16, 10367 (1988)). ) was amplified by amplifying the dapF gene from chromosomal DNA of E. coli strain W3110. The resulting amplified DNA fragment was cut with Pstl, the ends were blunted, and inserted into the Smal site of PMW118 to obtain plasmid pdapF (FIG. 22).
  • L-Lysine production increased slightly with the enhancement of dapD or dapE, but did not reach that of DDH.
  • the change in broth color and the accumulation of intermediate SMP, which are observed by the introduction of DDH, are independent phenomena, and the change in broth color is due to dapD, and the disappearance of SDAP is due to dapE. I understood.
  • the relationship between dapE and SDAP is also predictable from the viewpoint of the L-lysine synthesis pathway. Increasing dapF had no effect on improving L-lysine productivity.
  • dapE was excised from pdapE and inserted into pdapD to produce a plasmid pMWdapDEl having both dapE and dapD (FIG. 23).
  • contains dapE and dapD from pMWdapDEl The fragment was cut out and inserted into pCABl to produce pCABDEl (FIG. 24).
  • Strains retaining pCABl, pCABDEl or pCABD2, and strains retaining both pCABDEl and pdapF were prepared, and L-lysine production culture was performed using these strains.
  • Table 17 shows the results. Table 17 ⁇ L-Rishi strains, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , ⁇ ⁇ SDAP
  • Plasmid RSF24P containing dapA * was introduced into E. coli C strain, and plasmid containing L-lysine biosynthesis gene was further introduced. The resulting transformant was cultured in L-lysine production medium, and -The production of lysine hydrochloride was measured. Table 19 shows the results. Table 19 Production of L-lysine hydrochloride (g / 1) vs. sugar yield (%)
  • the plasmid RSFD80 containing dapA * and lys was introduced into E. coli, the plasmid containing the L-lysine biosynthesis gene was further introduced, and the resulting transformant was cultured in an L-lysine production medium.
  • the production of L-lysine hydrochloride was measured. The results are shown in Table 20.
  • Plasmid pCABl containing dapA *, lysC * and dapB was introduced into E. coli C strain, and plasmid containing L-lysine biosynthesis gene was further introduced, and the resulting transformant was used to produce L-lysine.
  • the cells were cultured in a medium, and the production of L-lysine hydrochloride was measured. The results are shown in Table 21.
  • Plasmid having a dapD, dapE or dapF gene instead of DDH was introduced into an E. coli C strain carrying pCABl, and L-lysine production culture was performed. The results are shown in Table 22. Table 22 Poor forest L-Rishi ', II salt cattle if landscape vs. sugar yield
  • L-lysine productivity can be improved stepwise.
  • Lys Ala lie Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gin lie Leu Tyr Asn Val
  • Organism name Escherichia coli
  • strain name C1061 Sequence characteristics:
  • primer bind Location 536.. 555
  • primer bind Location 2128.. 2147
  • Asp Ala lie Arg Asn lie Gin Phe Ala lie Leu Glu Arg Leu Arg Tyr 65 70 75 80
  • Gly Leu Val lie Thr Gin Gly Phe lie Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg
  • Asp Glu lie Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala
  • Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu lie Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys 385 390 395 400

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Description

明細書 発酵法による L一リジンの製造法 技術分野 本発明は微生物工業に関連したものであり、 詳しくは、 発酵法による Lーリジ ンの製造法、 この製造法に用いる D N A及び微生物に関するものである。 背景技術 従来、 発酵法により L一リジンを製造する場合、 生産性を向上させるために、 自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。 Lーリジ ンを生産する人工変異株は数多く知られており、 その多くは S— 2—アミノエチ ルシスティン （A E C ) 耐性変異株であり、 ブレビバクテリウム属、 コリネバク テリゥム属、 バチルス属、 またはェシヱリヒア属に属している。 また、 組換え D N Aを使用した形質転換体を用いる （米国特許第 4278765号） 等、 アミノ酸の生産 を増加させる種々の技術が開示されている。
例えば、 ェシエリヒア属においては、 特開昭 56- 18596号公報、 米国特許第 4346, 170号および Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227-231(1982)にぉ いてジヒドロジピコリン酸合成酵素（以下、 「D D P S」 と略すことがある） を 増強した株を用いた L一リジンの製造法が示されている。 しかし、 ここで用いら れた D D P Sは野生型であり、 L—リジンによるフィードバック阻害を受けるた め、 十分満足できる L—リジンの生産性が得られていなかった。 尚、 上記 Applie d Microbiology and Biotechnology, 15, p227-231(1982)に記載されている L一 リジン生産量は、 グルコース 7 5 g / 1から Lーリジン塩酸塩 3 g / 1であり、 消費係数 （糖 1 gに対し生産される L—リジンの g数、 又はその百分率） は 0 . 0 4もしくは 4 %と計算される。 - 一方、 L一リジンによるフィードバック阻害を受けな 、事が知られているコリ ネバクテリウム属細菌由来の D D P Sを導入したェシヱリヒァ属細菌を用 t、た L 一リジンの製造法が、 大韓民国特許公告 92- 8382号に示されている （消費係数 1 7 %) 。 しかし、 コリネバクテリゥム属細菌の生育上限温度はェシエリヒア属細菌 の生育上限温度よりも 10度程度低いために、 コリネバクテリゥム属細菌由来の DDPSをコ一ドする DNAをェシヱリヒア属細菌に導入して Lーリジン生産に 利用するためには、 培養温度を下げて培養する必要があると考えられる。 従って、 ェシヱリヒア属細菌が有する、 生育温度が高く生育速度及び L -リジン生産速度 も速いという利点を発揮させる事が困難であると予想される。 また、 一般に異種 生物由来の遺伝子を発現させる場合には、 発現産物がプロテアーゼに分解された り、 不溶性の封入体を形成する事もあり、 同種の遺伝子を発現させる場合よりも 困難が予想される。 さらに、 コリネバクテリゥム属細菌由来の DDPSをコード する D N Aをェシヱリヒァ属細菌等に導入し、 工業的に Lーリジンを生産させる 場合には、 組換え DN Aガイドラインに従って、 同種遺伝子を導入した組換え体 を使用するよりも厳しい規制が課せられる。
ところで、 ジヒドロジピコリン酸合成酵素 （DDPS) は、 ァスパルトセミア ルデヒドとピルビン酸を脱水縮合させ、 ジヒドロジピコリン酸を合成する酵素で あり、 この反応はァスパラギン酸系アミノ酸の生合成において、 L一リジン生合 成系への分岐の 口となっている。 ェシ Xリヒア属細菌においてはァスパルトキ ナーゼとともに Lーリジン生合成の重要な調節部位を担つている事が知られてい る
DDPSは E. coli (ェシエリヒア 'コリ ：大腸菌） では dapAとレ、う遺伝子にコ ードされている。 この dapAはすでにクローニングされており、 塩基配列も決定さ れている (Richaud, F. et al. J. Bacteriol. , 297 (1986))。
一方、 ァスバルトキナーゼ （以下、 「AK」 と略すことがある） は、 ァスパラ ギン酸を^—ホスホアスパラギン酸に変える反応を触媒する酵素であり、 ァスパ ラギン酸系のアミノ酸の生合成系の主な調節酵素となっている。 E. coliの AKは 3種あり （AK I, ΑΚΠ，ΑΚΙΙΙ) 、 うち 2つはホモセリンデヒドロゲナーゼ (以下、 「HD」 と略すことがある） との複合酵素である。 複合酵素の内のひと つは thrAit伝子にコードされる AK I— HD Iであり、 もう一方は metLM遺伝子 にコードされる AKII— HDIIである。 AK Iはスレオニンとイソロイシンによ る協奏的抑制及びスレオニンによる阻害を受け、 AKIIはメチォニンによる抑制 を受ける。
これらに対し、 A K IIIのみは単機能酵素であり、 lysCと名付けられた遺伝子の 産物であつて、 L一リジンによる抑制及びフィ一ドノ ック阻害を受けること力、'知 られている。 菌体内でのこれらの活性の割合は、 AK I： ΑΚΠ:ΑΚΙΠ=約 5： 1 :4となっている。
上述したように、 コリネバクテリゥム属細菌由来の DDPSは、 L—リジンに よるフィードバック阻害を受けないが、 これをェシエリヒア属細菌に導入して L 一リジン生産に利用するためには、 培養温度の点で問題がある。 L—リジンによ るフィードバック阻害を受けないェシェリヒア属細菌由来の DDP Sあるいは A Killの変異酵素を取得することができれば、 ェシェリヒア属細菌を用いて効率の 良い Lーリジンの発酵生産を行うことができること力、'期待される力、'、 D D P Sの 変異酵素を示した先行文献はなく、 また、 A K IIIの変異酵素についても報告はあ るものの (Boy, E. et al. , J. Bacteriol. , 112. 84, (1972)) 、 同変異酵素が L—リジンの生産性を改善できることを示唆した例は知られていない。 発明の開示 本発明は、 上記観点からなされたものであり、 L—リジンによるフィードバッ ク阻害が十分に解除されたェシヱリヒア属細菌由来の DD P Sと ΑΚΙΙΙを取得し、 従来よりもさらに改良された発酵法による L—リジンの製造法を提供することを 課題とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、 L一リジン によるフィードバック阻害が十分に解除されたェシヱリヒァ属細菌由来の D D Ρ Sをコードする DNAを取得することに成功した。 尚、 L一リジンによるフィ一 ドバック阻害が十分に解除された E. coli由来の DDP Sをコードする DN Aを本 明細書において変異型 d a p Aあるいは d a p A*とよぶことがある。
本願発明者らはまた、 Lーリジンによるフィードバック阻害が解除されたァス パルトキナーゼおよび変異型 d a p Aを保持するェシェリヒア属細菌を創製した。 尚、 L一リジンによるフィードバック阻害が十分に解除された E. coli由来のァス ノ、。ソレトキナ一ゼをコ一ドする DN Aを本明細書において変異型 1 y s Cあるいは 1 y s C *とよぶことがある。
さらに本願発明者らは、 変異型 d a p A及び変異型 1 y s Cを保持するェシェ リヒア属細菌を創製した。 そして同ェシ Xリヒア属細菌を好適な培地で培養する ことにより、 該培養物中に Lーリジンを著量生産蓄積させ得ることを見出した。 また、 本願発明者らは、 変異型 d a p A及び変異型 1 y s Cを保持するェシェ リヒア属細菌の L一リジン生合成系の他の遺伝子を増強することにより、 Lーリ ジン生産能をさらに向上させることができることを見出した。
すなわち本願発明は、 Lーリジンによるフィードバック阻害が解除される変異 を有するェシェリヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする D N Aである。 この Lーリジンによるフィードバック阻害が解除される変異とし ては、 配列表の配列番号 4に記載されるジヒドロジピコリン酸合成酵素のァミノ 酸配列中、 N—末端から 8 1番目のァラニン残基をバリン残基に置換させる変異、 1 1 8番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる変異、 8 1番目のァラ ニン残基をバリン残基に置換させかつ 1 1 8番目のヒスチジン残基をチロシン残 基に置換させる変異よりなる群から選ばれる変異が挙げられる。
本願発明はまた、 Lーリジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有 するェシヱリヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする D N Aが細胞内に導入されて形質転換されたェシヱリヒア属細菌である。 L—リジン によるフィードバック阻害が解除される変異としては、 配列表の配列番号 4に記 載されるジヒドロジピコリン酸合成酵素のアミノ酸配列中、 N—末端から 8 1番 目のァラニン残基をバリン残基に置換させる変異、 1 1 8番目のヒスチジン残基 をチロシン残基に置換させる変異、 8 1番目のァラニン残基をパリン残基に置換 させかつ 1 1 8番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる変異力、'挙げら れる。
本願発明はさらに、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスパ ルトキナーゼをさらに保持することを特徴とする前記ェシ リヒァ属細菌である。 L—リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスバルトキナーゼをェシェ リヒア属細菌に保持させる方法としては、 L—リジンによるフィ一ドバック阻害 が解除される変異を有するェシェリヒア属細菌由来のァスバルトキナーゼ II Iをコ 一ドする D N Aを細胞内に導入する方法が挙げられる。
Lーリジンによるフィードバック阻害が解除されるァスパルトキナ一ゼ II Iの変 異としては、 配列表の配列番号 8に記載されるァスバルトキナーゼ I IIのァミノ酸 配列中、 N—末端から 3 2 3番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換さ せる変異、 3 2 3番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換させかつ 4 0 8番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換させる変異、 3 4番目のアル ギニン残基をシスティン残基に置換させかつ 3 2 3番目のグリシン残基をァスパ ラギン酸残基に置換させる変異、 3 2 5番目のロイシン残基をフヱニルァラニン 残基に置換させる変異、 3 1 8番目のメチォニン残基をイソロイシン残基に置換 させる変異、 3 1 8番目のメチォニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ 3 4 9番目のバリン残基をメチォニン残基に置換させる変異、 3 4 5番目のセリン 残基をロイシン残基に置換させる変異、 3 4 7番目のバリン残基をメチォニン残 基に置換させる変異、 3 5 2番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換さ せる変異、 3 5 2番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ 3 6 9番目のセリン残基をフヱニルァラニン残基に置換させる変異、 1 6 4番目のグ ルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、 4 1 7番目のメチォニン残基を イソロイシン残基に置換させかつ 4 1 9番目のシスティン残基をチロシン残基に 置換させる変異が挙げられる。
尚、 L一リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するェシエリ ヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコ一ドする D N A及び L—リ ジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するァスパルトキナ一ゼ 11 Iをコ一ドする D N Aは、 各々エシュリヒア属細菌の染色体に保持されていても、 細胞内で同一または別々のプラスミ ド上に保持されていてもよい。 さらに、 各々 の D N Aの一方が染色体に保持され、 もう一方の D N Aがプラスミ ド上に保持さ れていてもよい。
本発明はまた、 さらにジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子が増強された 前記ェシヱリヒア属細菌である。 ジヒドロジピコリン酸レダクタ一ゼ遺伝子の増 強は、 ジヒドロジピコリン酸レダクタ一ゼ遺伝子がェシヱリヒア属細菌細胞内で 自律複製可能なベクターに連結されてなる組換え D N Aで形質転換することによ り行うことができる。
本発明はさらに、 増強されたブレビバクテリゥム ラクトファーメンタム等の コリネ型細菌由来のジァミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された前 記ェシヱリヒア属細菌である。 増強されたコリネ型細菌由来のジァミノピメリン 酸デヒドロゲナ一ゼ遺伝子のェシヱリヒア属細菌への導入は、 該遺伝子がェシヱ リヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターに連結されてなる組換え D N Aで 形質転換することにより行うことができる。 コリネ型細菌としては、 コリネパク テリゥム属細菌またはブレビパクテリゥム属細菌であって、 グルタミン酸生産能 を有する野生株及び他のァミノ酸生産能を有するこれらの変異株が挙げられる。 より具体的には、 ブレビパクテリゥム，ラクトフアーメンタムの他に、 ブレビバ クテリゥム . フラノくム、 ブレビノくクテリゥム 'ディバリカタム、 コリネバクテリ ゥム ·グルタミカム、 コリネノ クテリゥム · リリゥム等が挙げられる。
本発明はまた、 前記ジァミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の代わりにス クシ二ルジァミノピメリン酸トランスアミナーゼ遺伝子及びスクシ二ルジァミノ ピメリン酸デアシラーゼ遺伝子が増強されたェシヱリヒア属細菌である。 これら の遺伝子の増強は、 これらの遺伝子がエシ リヒア属細菌細胞内で自律複製可能 な同一又は異なるベクターに連結されてなる単一の組換え D N A又は 2つの組換 え D N Aで形質転換することにより行うことができる。
本発明はまた、 上記のェシエリヒア属細菌のいずれかを好適な培地で培養し、 該培養物中に L一リジンを生産蓄積せしめ、 該培養物から L—リジンを採取する ことを特徴とする Lーリジンの製造法を提供する。
尚、 本明細書において、 D D P S又は A K II Iをコードする D N A、 あるいはこ れらにプロモータ一を含む D N Aを、 「D D P S遺伝子」又は ΓΑ Κ ΙΙΙ遺伝子」 ということがある。 また、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除された変 異酵素を単に 「変異型酵素」 、 これをコードする D N Aあるいはこれにプロモー ターを含む D N Aを 「変異型遺伝子」 ということがある。 さらに、 「L一リジン によるフィードバック阻害が解除される」 とは、 実質的に阻害が解除されていれ ばよいことを意味し、 完全に解除されている必要はない。
以下、 本発明について詳細に説明する。 < 1〉本発明の変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDP S) をコードする DNA
本発明の変異型 DDP Sをコードする DNAは、 野生型 D DP Sをコードする DNAにおいて、 コードされる DDP Sの L—リジンによるフィードバック阻害 が解除される変異を有するものである。 DDPSとしては、 ェシヱリヒア属細菌 由来のもの、 特に E. coli由来の DDP Sが挙げられる。 また、 DDPS0L— U ジンによるフィ一ドバック阻害を解除する変異としては、 配列表の配列番号 4に 記載される DDP Sのアミノ酸配列中、 DDP Sの N—末端から
① 81番目のァラニン残基をバリン残基に置換させる変異、
② 118番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる変異、
③ 81番目のァラニン残基をバリン残基に置換させかつ 118番目のヒスチジン残基を チロシン残基に置換させる変異、
が挙げられる。
野生型 D DP Sをコードする DN Aとしては、 ェシヱリヒア属細菌由来の DD P Sをコードするものであれば特に制限されないが、 具体的には配列番号 4に示 すァミノ酸配列をコ一ドする DN Aが挙げられ、 さらに具体的には配列番号 3に 示す塩基配列のうち、 塩基番号 272〜1147で表される配列が挙げられる。 これらの配列において、 上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変異 を有するものが、 本発明の変異型 DDPSをコードする DNAである。 尚、 置換 されたアミノ酸残基に対応するコドンは、 そのアミノ酸残基をコードするもので あれば種類は特に問わない。 また、 菌種ゃ菌株の違いにより保持する D DP Sの 配列がわずかに相異することが予想されるが、 このような酵素の活性に関与しな I、位置でのァミノ酸残基の置換、 欠失ある L、は挿入を有するものも本発明の変異 型 DDP S遺伝子に含まれる。
このような変異型遺伝子を取得する方法は以下の通りである。 まず、 野生型 D DP S遺伝子又は他の変異を有する DDP S遺伝子を含有する DN Aをインビト 口変異処理し、 変異処理後の D N Aと宿主に適合するべクタ一 DNAとを連結し て組換え D N Aを得る。 組換え D N Aを宿主微生物に導入して形質転換体を得、 同形質転換体のうちで変異型 D D P Sを発現するように至つたものを選択すれば、 同形質転換体が変異型遺伝子を保持している。 また、 野生型 D D P S遺伝子又は 他の変異を有する D D P S遺伝子を含有する D N Aを、 宿主に適合するべクタ一 D N Aと連結して組換え D N Aを得て、 その後組換え D N Aをインビト口変異処 理し、 変異処理後の組換え D N Aを宿主微生物に導入して形質転換体を得、 同形 質転換体のうちで変異型 D D P Sを発現するように至ったものを選択しても、 同 形質転換体は変異型遺伝子を保持している。
野生型酵素を生産する微生物を変異処理し、 変異型酵素を生産する変異株を創 成した後、 該変異株から変異型遺伝子を取得してもよい。 もしくは、 野生型遺伝 子が連結されている組換え D N Aが導入されている形質転換体を変異処理し、 変 異型酵素を生産する変異株を創成した後、 該変異株から組換え D N Aを回収すれ ば、 同 D N A上に変異型遺伝子が創成される。
D N Aをインビトロ変異処理するための薬剤としては、 ヒドロキシルアミン等 が挙げられる。 ヒドロキシルァミンは、 シトシンを N4—ヒドロキシシトシンに変 えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。 ま た、 微生物自体を変異処理する場合は、 紫外線照射または N—メチル—Ν'—ニトロ —Ν—二トロソグァ二ジン （NTG) もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いら れている変異剤による処理を行う。
上記野生型 D D P S遺伝子ある t、は他の変異を有する D D P S遺伝子を含有す る DNAの供与菌としては、 ェシエリヒア属に属する微生物であればいかなるものを 用いてもかまわない。 具体的にはナイトハルトらの著書 （Neidhardt, F. G et. al. , Escherichia coii and Salmonella Typhimurium, American Society ior Microbi ology, Washington D. C. , 1208, table 1) にあげられるものが利用できる。 たとえ ば、 E. coli JM109株や、 MC1061 株などがあげられる。 D D P S遺伝子を含有す る DMの供与菌として野生株を用いた場合、 野生型の D D P S遺伝子を含む DNAが 取得できる。
( 1 ) 野生型 D D P S遺伝子の取得
以下に、 D D P S遺伝子を含有する DNAの調製例について述べる。 まず、 野生型 の dapAをもつ E. coli例えば MC1061株を培養して培養物を得る。 上記微生物を培養 するには、 通常の固体培養法で培養しても良いが、 集菌の際の効率を考慮すると 液体培養法を採用して培養するのが好ましい。 また、 培地としては、 例えば酵母 エキス、 ペプトン、 肉エキス、 コーンスティープリカ一または大豆もしくは小麦 の浸出液等の 1種類以上の窒素源に、 リン酸第 1カリウム、 リン酸第 2カリウム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 塩化マグネシウム、 塩化第 2鉄、 硫酸第 2 鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の 1種以上を添加し、 更に必要に応じて糖質 原料、 ビタミン等を適宜添加した物が用いられる。 なお、 培地の初発 pHは、 6 〜 8に調製するのが適当である。 また培養は 30〜42 、 好ましくは 37 前 後で 4〜24時間、 通気攪拌深部培養、 振盪培養または静置培養等により行う。 このようにして得られた培養物を、 例えば 3, 000 r.p.m.で 5分間遠心分離して E. coli MC1061株の菌体を得る。 この菌体より、 例えば斎藤、 三浦の方法 （Bioc hem. Biophys. Acta. , 72, 619， (1963))、 K. S. Kirbyの方法 (Biochem. J. , 64， 405, (1956)) 等の方法により染色体 DMを得ることができる。
こうして得られた染色体 DNAから DDPS遺伝子を単離するために、 染色体 DNAライブラ.リーを作製する。 まず、 染色体 DN Aを適当な制限酵素で部分分 解して種々の断片混合物を得る。 切断反応時間等を調節して切断の程度を調節す れば、 幅広い種類の制限酵素が使用できる。 例えば、 Sau3AIを、 温度 30 以上、 好ましくは 37 、 酵素濃度 1〜10ュニット /mlで様々な時間 （1分〜 2時間） 染色体 D N Aに作用させてこれを消化する。
ついで、 切断された染色体 DNA断片を、 ェシエリヒア属細菌細胞内で自律複 製可能なベクター DNAに連結し、 組換え DNAを作製する。 具体的には、 染色体 D N Aの切断に用いた制限酵素 Sau3AIと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限 酵素、 例えば BamHIを、 温度 30 以上、 酵素濃度 1〜100ュニッ ト /mlの条件下 で 1時間以上、 好ましくは 1〜3時間、 ベクター DNAに作用させてこれを完全 消化し、 切断開裂する。 次いで、 上記のようにして得た染色体 DN A断片混合物 と切断開裂されたべクタ一 DNAを混合し、 これに DNAリガーゼ、 好ましくは T 4 D N Aリガーゼを、 温度 4〜： I 6 、 酵素濃度 1〜： I 00ユニット Zmlの条 件下で 1時間以上、 好ましくは 6~24時間作用させて組換え D N Aを得る。 得られた組換え DNAを用いて、 ェシヱリヒア属の微生物、 例えば大腸菌 K-1 2株、 好ましくは JE7627株 （ponB704, dacB12, pfv+, tonA2, dapA, lysA, str, malA38, metBl, ilvH611, leuA371, proA3, lac- 3, tsx-76) のような DDPS欠損変異株を形 質転換して染色体 DN Aライブラリーを作製する。 この形質転換は D.M.Morriso nの方法 （Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) あるいは受容菌細胞を塩化力 ルシゥムで処理して DNAの透過性を増す方法 （Mandel.M. and Higa, A. , J. Mol. Biol., 53, 159(1970))等により行うことができる。 なお、 JE7627株は国立遺伝学 研究所 （日本国静岡県三島市） より入手可能である。
得られた染色体 DN Aライブラリーの中から、 DDP S活性が増大した株ある いは D DP S遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株より DDPS 遺 伝子の組換え DNAをもつ菌株を得る。 例えば、 DDPS欠損変異株はジァミノ ピメリン酸要求性であるので、 DDPS欠損変異株を宿主に用いた場合は、 ジァ ミノピメリン酸を含有しない培地上で生育可能となった菌株を単離し、 該菌株か ら組換え D N Aを回収することにより、 DDPS遺伝子を含有する D N A断片を 得ることができる。
DDP S遺伝子を含有する組換え DN Aをもつ候補株が、 実際に DDPS遺伝 子がクローニングされた組換え D N Aを保持するかどうかを確認するには、 候補 株から細胞抽出液を調製し、 それより粗酵素液を調製して D D P S活性が増大し ていることを確認することにより達成できる。 DDPSの酵素活性測定法は、 Yu gariらの方法により行うことができる （Yugari, Y. and Gilvarg, C. , J. Biol. Che m., 240, 4710(1962))。
そして、 上記菌株より、 DDPS遺伝子を含有する DNAがベクター DNAに 挿入された組換え DNAを、 例えば P. Guerry らの方法 （J. Bacteriol. , 116, 1 064,(1973)) 、 D. B. Clewellの方法 (J. Bacteriol. , 110, 667,(1972)) などによ り単離することができる。
野生型 D D P S遺伝子の取得は、 染色体上に D D P S遺伝子を有する株から、 斎藤、 三浦の方法等により染色体 DN Aを調製し、 ポリメラ一ゼチェインリアク シ aン法 C R： polymerase chain reaction； White, T. J. et al ； Trends G enet. , 5,185 (1989)参照） により、 DD P S遺伝子を増幅することによつても行 える。 増幅反応に用いる DNAプライマーは、 DDPS 遺伝子の全領域あるいは 一部領域を含有する DN A二重鎖の両 3' 末端に相補するものを用いる。 DDP S遺伝子の一部領域だけを増幅した場合には、 該 D N A断片をブライマ一として 全領域を含む D N A断片を染色体 D N Aライブラリーよりスクリーニングする必 要がある。 DDPS遺伝子の全領域を増幅した場合には、 増幅された DDPS遺 伝子を含有する DN A断片を含む PC R反応液をァガロースゲル電気泳動に供し た後、 目的の DNA断片を抽出することによって DDPS 遺伝子を含有する D NA断片を回収できる。
DN Aプライマーとしては、 例えば E. coliにおいて既知となっている配列 (R ichaud, F. et al. , J. Bacteriol. , 297(1986)) を基にして適宜作成すればよいが、 具体的には、 DDPS遺伝子をコードする 1150塩基からなる領域を増幅できるプ ラィマーが好ましく、 配列番号 1及び 2に示した 2種のブライマ一が適当である。 プライマー DN Aの合成は、 ホスホアミダイト法 （Tetrahedron Letters, 22, 185 9(1981)参照） 等の常法により、 市販の DNA合成装置 （例えば、 Applied Biosy stems社製 DNA合成機 model 380B等） を用いて行うことができる。 また、 PCR反 応は、 市販の PC R反応装置 （宝酒造 （株） 製 DN Aサーマルサイクラ一 PJ200 0型等） を使用し、 TaqDMポリメラ一ゼ （宝酒造 （株） より供給されている） を用 い、 供給者により指定された方法に従って行うことができる。
P CR法により増幅された DDPS遺伝子は、 ェシ リヒア属細菌細胞内にお いて自律複製可能なベクター DN Aに接続し、 ェシエリヒア属細菌細胞に導入す ることによって、 DDPS遺伝子への変異の導入などの操作がしゃすくなる。 用 いられるベクター DNAと形質転換法、 さらに DDPS遺伝子の存在の確認方法 は上述した方法と同じである。
(2) DDPS遺伝子への変異の導入
上記のようにして得られた DDPS遺伝子に、 アミノ酸残基の置換、 挿入およ び欠失等の変異を実施する方法としては、 リコンビナント P C R法 （Higuchi, R. , 61, in PCR Technology (Erlich, H. A. Eds. , Stockton press(1989))) 、 部位特異的 変異法 (Kramer, W. and Frits, H. J. , Meth. in Enzvmol. , 154, 350 (1987)); Kunk el, T. A. et. al. , Meth. in Enzymol.， 154, 367(1987)) などがある。 これらの方法 を用いると、 目的部位に目的の変異を起こすことができる。
また、 目的遺伝子を化学合成する方法によれば、 目的部位への変異、 あるいは ランダムな変異を導入することができる。
さらに、 染色体もしくはプラスミ ド上の DDPS遺伝子を直接ヒドロキシルァ ミンで処理する方法 (Hashimoto, T. and Sekiguchi, . , J. Bacteriol. ' 159， 1039 (1984)) がある。 また、 DDPS遺伝子を保有するェシ リヒア属細菌を紫外線 照射する方法または N—メチル— N'—ニトロソグァニジンもしくは亜硝酸などの化 学薬剤処理による方法を用いてもよい。 これらの方法によれば、 ランダムに変異 を導入できる。
変異型遺伝子の選択方法としては、 まず DD P S遺伝子を含有する DN A断片 とべクタ一 DN Aからなる組換え DN Aを、 直接ヒドロキシルアミン等で変異処 理し、 これで例えば E. coli W3110株を形質転換する。 次に L—リジンのアナ口 グである、 S— 2—アミノエチルシスティン （AEC) を含む最少培地、 例えば M9に形質転換株を培養する。 野生型の D D P S遺伝子を含有する組換え D N Aを 保持する株は、 その組換え DN Aにより発現される DDPSが A ECにより阻害 されるために、 Lーリジン及びジァミノピメリン酸 (DAP)の合成が出来なくなり生 育が抑えられる。 これに対し、 L一リジンによる阻害の解除された DDPS遺伝 子を含有する組換え D N Aを保持する株は、 同組換え DNA中の DDPS遺伝子 にコードされる変異酵素が AECによる阻害を受けないので、 AECが添加され た最少培地上での生育が可能になるはずである。 この現象を利用し、 生育が、 L 一リジンのアナログである AECに耐性となっている株、 すなわち阻害の解除さ れた変異型 DDP S遺伝子を含有する組換え D N Aを保持する株を選択すること ができる。
こうして得られた該変異型遺伝子を、 組換え DN Aとして適当な宿主微生物に 導入し、 発現させることによりフィードバック阻害が解除された DDPSを保有 する微生物を取得できる。 宿主としては、 ェシエリヒア属に属する微生物が好ま しく、 例えば大腸菌 （E. coli) が挙げられる。
また、 組換え DNAから変異型 DDP S遺伝子断片を取り出し、 他のベクター DN Aに挿入したものを使用してもよい。 本発明において用いることのできるこ とのできるベクター DNAとしては、 プラスミ ドベクター DNAか'好ましく、 例 えば pUC19、 pUC18、 pBR322、 pHSG299、 pHSG298、 pHSG399、 pHSG398、 RSF1010、 p MW119、 pMW118、 pMW219、 pMW218等が挙げられる。 他にもファージ D N Aのべクタ 一も利用できる。
さらに、 変異型 DDPS遺伝子の発現を効率的に実施するために、 変異型 DD P Sをコードする DN A配列の上流に、 l a c、 t rp、 PL等の微生物内で働 く他のプロモーターを連結してもよく、 DDP S遺伝子に含まれるプロモーター をそのまま、 あるいは増幅して用いてもよい。
また、 上記のように、 変異型遺伝子を自律複製可能なベクター DN Aに挿入し たものを宿主に導入し、 プラスミ ドのように染色体外 DN Aとして宿主に保持さ せてもよいが、 変異型遺伝子を、 トランスダクシヨン、 トランスポゾン （Berg,D. E. and Berg, C. M. , Bio/Technol. , 1, 417(1983))、 Muファージ (特開平 2 - 10 9985) または相同性組換え （Experiments in Molecular Genetics, Cold Sp ring Harbor Lab. (1972)) を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよ い。 く 2〉本発明に用いる変異型ァスバルトキナーゼ III (AKIII) をコードする D NA
本発明に用いる変異型 ΑΚΙΠをコードする DNAは、 野生型 AKIIIをコード する DN Aにおいて、 コ一ドされる AKIIIの L—リジンによるフィードバック阻 害が解除される変異を有するものである。 また、 ΑΚΙΠの L—リジンによるフィ 一ドバック阻害を解除する変異としては、 配列表の配列番号 8に示す AKIIIのァ ミノ酸配列中、 AKIIIの N—末端から
(ィ） 323番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換させる変異、
(口) 323番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換させかつ 408番目のグリシ ン残基をァスパラギン酸残基に置換させる変異、
(八) 34番目のアルギニン残基をシスティン残基に置換させかつ 323番目のグリシン 残基をァスパラギン酸残基に置換させる変異、 (ニ)325番目の口イシン残基をフヱニルァラ二ン残基に置換させる変異、
(ホ) 318番目のメチォニン残基をィソロイシン残基に置換させる変異、
(へ) 318番目のメチォニン残基をィソロイシン残基に置換させかつ 349番目のバリン 残基をメチォニン残基に置換させる変異、
(ト )345番目のセリン残基を口イシン残基に置換させる変異、
(チ) 347番目のバリン残基をメチォニン残基に置換させる変異、
(リ） 352番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、
(ヌ) 352番目のスレオニン残基をィソロイシン残基に置換させかつ 369番目のセリン 残基をフェニルァラ二ン残基に置換させる変異、
(ル) 164番目のグル夕ミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、
(ヲ） 417番目のメチォニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ 419番目のシステ ィン残基をチロシン残基に置換させる変異、
が挙げられる。
野生型 A K II Iをコードする D N Aとしては、 特に制限されないが、 ェシヱリヒ ァ属細菌、 例えば E. coli由来の Α Κ ΠΙをコードする D N Aが挙げられ、 具体的 には配列番号 8に示すアミノ酸配列をコードする D N A、 さらには配列番号 7に 示す塩基配列のうち、 塩基番号 5 8 4〜1 9 3 0で表される配列が挙げられる。 尚、 E. coliの Α Κ ΠΙは、 lysC遺伝子にコードされている。
これらの配列において、 上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変 異を有するものが、 本発明の変異型 Α Κ ΠΙをコードする D N Aである。 尚、 置換 されたアミノ酸残基に対応するコドンは、 そのアミノ酸残基をコードするもので あれば種類は特に問わない。 また、 菌種ゃ菌株の違いにより保持する野生型 A K II Iのァミノ酸配列がわずかに相異するものがある。 このような酵素の活性に関与 しない位置でのアミノ酸残基の置換、 欠失あるいは挿入を有するものも本発明の 変異型 A K I II遺伝子に含まれる。 例えば、 後記実施例 2で得られた野生型 lysC遺 伝子の塩基配列 （配列番号 7 ) は、 既に発表されている E. coli K-12 JC411株の lysCの配列 （Cassan, M. , Parsot, C. , Cohen, G. N. , and Patte, J. C. , J. Biol. Chem.， 2 61, 1052(1986)) と 6ケ所相違しており、 そのうち 2ケ所でコードされるアミノ酸 残基が異なっている （JC411株の lysCは、 配列番号 8に示す lysCのアミノ酸配列中、 N—末端から 5 8番目のグリシン残基がシスティン残基に、 4 0 1番目のグリシ ン残基がァラニン残基に置き換わっている） 。 この E. coli K-12 JC411株の lysC と同一の配列を有する lysCであつても、 上記 (ィ）〜（ヲ)のいずれかの変異を導入す れば、 L一リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有する lysCが得 られることが予想される。
リジンによるフィードバック阻害が解除された変異型 Α Κ Π Ιをコードする D N Aを取得する方法は以下の通りである。 まず、 野生型 A K II I遺伝子又は他の変異 を有する A K II I遺伝子を含有する D N Aをインビト口変異処理し、 変異処理後の D N Aと宿主に適合するべクタ一 D N Aとを連結して組換え D N Aを得る。 組換 え D N Aを宿主微生物に導入して形質転換体を得、 同形質転換体のうちで変異型 A K II Iを発現するように至ったものを選択すれば、 同形質転換体が変異型遺伝子 を保持している。 また、 野生型 A Kill遺伝子又は他の変異を有する A K II I遺伝 子を含有する D N Aを、 宿主に適合するべクター D N Aと連結して組換え D N A を得て、 その後組換え D N Aをインビトロ変異処理し、 変異処理後の組換え D N Aを宿主微生物に導入して形質転換体を得、 同形質転換体のうちで変異型 A K 11 Iを発現するように至ったものを選択しても、 同形質転換体は変異型遺伝子を保持 している。
あるいは、 野生型酵素を生産する微生物を変異処理し、 変異型酵素を生産する 変異株を創成した後、 該変異株から変異型遺伝子を取得してもよい。 D N Aを直 接変異処理するための薬剤としては、 ヒドロキシルァミン等が挙げられる。 ヒド ロキシノレアミンは、 シトシンを N4—ヒドロキシシトシンに変えることによりシト シンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。 また、 微生物自体を変 異処理する場合は、 紫外線照射または N—メチルー N'—二トロ— N—ニトロソグァ 二ジン （NTG) 等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。 上記野生型 A K 111遺伝子ある L、は他の変異を有する A K 111遺伝子を含有する DNAの供与菌としては、 ェシェリヒア属に属する微生物であればいかなるものを用 いてもかまわない。 具体的にはナイトハルトらの著書 (Neidhardt, F. C. et. al. , Escherichia coli and Salmonella Typhimuriura, American Society for Microbi ology, Washington D. C. , 1208, table 1) にあげられるものが利用できる。 たとえ ば、 E.coli JM109株や、 MC1061株などがあげられる。 これらの株から AKIII遺伝 子を取得するに際し、 染色体 DN Aの調製、 染色体 DN Aライブラリーの作製等 は、 上記の D DPS遺伝子の取得と同様に行えばよい。 ライブラリー作製に用い る宿主としては、 AKI、 II、 III全欠損株、 例えば E. coli GT3株 （E. coli Ge netic Stock Center (米国コネチカット州） 等から入手できる） 等を用いること が好ましい。
得られた染色体 DN Aライブラリーの内、 AKIII活性が増大した株あるいは栄 養要求性が相補された株として AKIII遺伝子の組換え DNAをもつ菌株を得る。 候補株から細胞抽出液を調製し、 それより粗酵素液を調製して A K 111活性を確認 する。 ΑΚΙΠの酵素活性測定法は、 スタツトマンらの方法により行うことができ る (Stadtman, E. R. , Cohen, G. N.， LeBras, G. , and Robichon-Szulmajster, H. , J. Bio l.Chem.,236, 2033(1961))。
例えば、 A K完全欠損変異株を宿主に用いた場合は、 L一リジン、 L—スレオ ニン、 L—メチニオンおよびジアミノピメリン酸を含有しない培地上で、 または ホモセリンおよびジァミノピメリン酸を含有しない培地上で生育可能となった形 質転換株を単離し、 該菌株から組換え DNAを回収することにより、 AKIII遺伝 子を含有する D N A断片を得ることができる。
尚、 PCR法により染色体 DNAから AKIII遺伝子を増幅する場合には、 PC R反応に用いる DNAプライマーとしては、 例えば E. coliにおいて既知となって いる配列 （Cassan, M. , Parsot, C. , Cohen, G. N. , and Patte, J. C. , J. Biol. Chem. ,261, 1052(1986)) を基にして適宜作成できるが、 lysC遺伝子をコードする 1347塩基か らなる領域を増幅できるブライマ一が適当であり、 例えば配列番号 5及び 6に示 す配列を有する 2種のプライマーが適当である。
上記のようにして得られた AKIII遺伝子に、 アミノ酸残基の置換、 挿入および 欠失等の変異を実施する方法としては、 前記 D D P S遺伝子の変異処理と同様に、 リコンビナント P C R法、 部位特異的変異法などがある。
また、 目的遺伝子を化学合成する方法によれば、 目的部位への変異、 あるいは ランダムな変異を導入することができる。
さらに、 染色体もしくは染色体外の組換え D N A上の A K 111遺伝子 D N Aを直 接ヒドロキシルァミンで処理する方法 （Hashimoto, T. and Sekiguchi, M. , J. Bact eriol., 159, 1039(1984))がある。 また、 染色体もしくは染色体外の組換え D N A 上に ΑΚΙΠ遺伝子を保持するエシュリヒア属細菌を紫外線照射する方法、 または Ν—メチル— N'—二トロソグァニジンもしくは亜硝酸などの化学薬剤で処理する方 法を用いてもよい。
変異型 A Κ II I遺伝子の選択方法としては、 まず変異処理した A K 111遺伝子を 含有する組換え DN Aを A K完全欠損株、 例えば E. coli GT3株に形質転換する。 次に著量の L一リジンを含む最少培地、 例えば M9で形質転換株を培養する。 野生 型の A K 111遺伝子を含有する組換え D N Aを保持する株は、 唯一の A Kが L—リ ジンにより阻害されるために、 L—スレオニン、 L—イソロイシン、 L—メチォ ニン、 及びジァミノピメリン酸 (DAP)の合成が出来なくなり生育が抑えられる。 こ れに対し L—リジンによる阻害の解除された変異型 A K 111遺伝子を含有する組換 え DNA保持株は、 著量の Lーリジンが添加された最少培地上での生育が可能に なるはずである。 この現象を利用し、 生育が、 L一リジンあるいは L一リジンの アナログである A ECに耐性となっている株、 すなわち阻害の解除された変異型 A K 111遺伝子を含有する組換え D N A保持株を選択することができる。
こうして得られた該変異型遺伝子を、 組換え DN Aとして適当な微生物 （宿主） に導入し、 発現させることによりフィードバック阻害が解除された A Killを保有 する微生物を取得できる。 宿主としては、 ェシエリヒア属に属する微生物が好ま しく、 例えば大腸菌 (E. coli)が挙げられる。
また、 組換え DNAから変異 AKIII遺伝子断片を取り出し、 他のベクターに挿 入したものを使用してもよい。 本発明において用いることのできることのできる ベクタ一 DN Aとしては、 プラスミ ドベクター DNAが好ましく、 例えば pUC19、 pUC18、 pBR322、 pHSG299、 pHSG298、 pHSG399、 pHSG398、 RSF1010、 pMW119、 pMWl 18、 pMW219、 pMW218等が挙げられる。 他にもファージ DNAのベクターも利用で きる。
さらに、 変異型 AKIII遺伝子の発現を効率的に実施するために、 変異型 AKI IIをコードする DNAの上流に、 l a c、 t rp、 P L等の微生物内で働く他の プロモーターを連結してもよく、 AKIII遺伝子に含まれるプロモータ一をそのま ま、 あるいは増幅して用いてもよい。
また、 上記のように、 変異型遺伝子を自律複製可能なベクタ一 D N Aに挿入し たものを宿主に導入し、 プラスミ ドのように染色体外 D N Aとして宿主に保持さ せてもよいが、 変異型遺伝子を、 トランスダクシヨン、 トランスポゾン （Berg, D. E. and Berg, C. M. , Bio/Technol. , 1, 417(1983))、 M uファージ (特開平 2— 1 0 9 9 8 5 ) または相同性組換え (Experiments in Molecular Genetics, Cold Sp ring Harbor Lab. (1972)) を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよ い。
< 3 >本発明による Lーリジンの製造
上記のようにして得られる変異型 D D P S遺伝子を導入することによって形質 転換され、 さらに L一リジンによるフィードバック阻害が解除された A Kを保持 するェシエリヒア属細菌を、 好適な培地中で培養し、 該培養物中に L—リジンを 生産蓄積させ、 該培養物から L—リジンを採取することにより、 L一リジンを効 率よく製造することができる。 すなわち、 変異型 D D P Sと変異型 Α Κ ΠΙをとも にェシェリヒア属細菌に保持させることによって、 Lーリジンを効率よく製造さ せることができる。
Lーリジンによるフィードバック阻害が解除された A Kを保持するェシエリヒ ァ属細菌としては、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有 する A K I IIをコードする D N Aが染色体 D N Aに組み込まれて形質転換されたェ シエリヒア属細菌、 または該 D N Aとェシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能 なベクター D N Aとを連結してなる組換え D N Aが細胞内に導入されることによ つて形質転換されたェシヱリヒア属細菌が挙げられる。 また、 L—リジンによる フィードバック阻害が解除された A Kは、 L—リジンによるフィードバック阻害 を受けな I、野生型 A Kであってもよく、 このような野生型 A K遺伝子を同様にし てエシュリヒア属細菌に導入したものでもよい。 さらに、 ェシヱリヒア属細菌細 胞を変異処理することにより、 変異型 Α Κ Ι Πを産生するようになったエシ リヒ ァ属細菌変異株であつてもよい。
一方、 変異型 D D P S遺伝子をェシェリヒア属細菌に導入することによって形 質転換するには、 変異型 D D P S遺伝子を染色体 D N Aに組み込んで形質転換し てもよく、 変異型 D D P S遺伝子とェシ リヒア属細菌細胞内で自律複製可能な ベクター D N Aとを連結してなる組換え D N Aを細胞内に導入することによって 形質転換してもよい。
変異型 D D P S遺伝子及び変異型 A K ill遺伝子の両方をェシェリヒア属細菌に 導入する場合には、 両方の変異型遺伝子がェシ リヒア属細菌の染色体 D N A上 に組み込まれて保持されていても、 細胞内で単一または別々のプラスミ ド上に染 色体外 D N Aとして保持されていてもよい。 別々のプラスミ ドを用いる場合には、 各々力、'安定して細胞内に保持されるような安定分配機構を有するブラスミ ドを用 いることが好ましい。 さらに、 各々の変異型遺伝子の一方が染色体 D N A上に組 み込まれて保持され、 もう一方の変異型遺伝子が細胞内でプラスミ ド上に染色体 外 D N Aとして保持されていてもよい。 変異型 D D P S遺伝子及び変異型 A K II I遺伝子をェシェリヒア属細菌に導入するに際しては、 両遺伝子の導入の順序は問 わない。
変異型 D D P S遺伝子及び変異型 A K I II遺伝子を導入されたェシエリヒア属細 菌のジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子を増強することにより、 L—リジ ン生産性を一層向上させることができる。 さらに、 変異型 A K il l遺伝子及び変異 型 D D P S遺伝子を保持し、 ジヒドロジピコリン酸レダクタ一ゼ遺伝子が増強さ れたェシヱリヒア属細菌に、 コリネ型細菌由来のジァミノピメリン酸デヒドロゲ ナーゼ遺伝子を導入することによって、 より一層 Lーリジン生産性を向上させる ことができる。 このジァミノピメリン酸デヒドロゲナ一ゼ遺伝子は増強されてい る必要がある。 また、 ジァミノピメリン酸デヒドロゲナ一ゼ遺伝子を導入する代 わりに、 スクシ二ルジァミノピメリン酸トランスアミナーゼ遺伝子及びスクシ二 ノレジァミノピメリン酸デアシラーゼ遺伝子を増強することによつても、 同程度に L—リジン生産性を向上することができる。
ここで、 遺伝子の増強とは、 その遺伝子の発現産物である酵素の細胞当たりの 活性を増強することをいう。 具体的には、 例えば、 該遺伝子の細胞内コピー数を 高めること、 発現効率のよいプロモーターを用 、て遺伝子当たりの発現量を高め ること、 酵素活性を高める変異を該遺伝子に導入することなどが挙げられる。 細 胞内の遺伝子のコピー数を高めるには、 ェシエリヒア属細菌細胞内で自律複製可 能なベクターに該遺伝子を挿入し、 このベクターでェシエリヒア属細菌を形質転 換すればよい。 このベクターはマルチコピー型のプラスミ ドであることが好まし い。 また、 M uファージ等を用いて染色体 D N Aに組み込んだ D N Aを増幅する ことによりコピー数を増加させてもよい。 プラスミ ドを用いる際に、 変異型 D D P S遺伝子及び変異型 A K III遺伝子の導入にプラスミ ドを用いた場合には、 これ らのプラスミ ドが共に安定して細胞内に保持されるような安定分配機構を有する プラスミ ドを用いることが好ましい。 尚、 各遺伝子の導入の順序は問わない。 上記のようにして Lーリジン生合成系遺伝子を順次増強することにより L—リ ジン生産性を段階的に向上させることができるメ力二ズムを以下に説明する。 複 数反応からなる生合成系は、 直列に連結された太さの異なる複数のノ ィプを流れ る液体にたとえることができる。 ここで、 各々のパイプは個々の酵素に相当し、 そのパイプの太さは酵素反応速度に相当する。 パイプを流れる液体の量を増やす には、 最も細いパイプを太くするのが効果的である。 太いパイプをさらに太くし ても、 効果は期待できない。 さらに流量を増やすには、 2番目に細いパイプを太 くすればよい。 本発明者らはこのような観点から、 L—リジン生合成系を強化す ることを試みた。 そのために、 後記実施例 6に示すように、 E. coliに、 E. coli 由来の L—リジン生合成系遺伝子を段階的に導入することによって、 L—リジン 生合成系の律速段階の順位を解明した。 その際、 生合成系の下流に位置する dapC (テトラヒドロジピコリン酸スクシ二ラーゼ遺伝子） 、 dapD (スクシ二ルジァミ ノピメリン酸トランスァミナーゼ遺伝子） 、 dapE (スクシニルジァミノピメリン 酸デアシラーゼ遺伝子） 及び dapF (ジァミノピメリン酸ェピメラーゼ遺伝子） の 4遺伝子につ L、ては、 これらの遺伝子産物が関与する反応を単独で触媒し得るブ レヒノヽクテリゥム ラク卜ファーメンタム (Brevibacterium lactofermentum) の DDH (ジァミノピメリン酸デヒドロゲナ一ゼ） をコードする遺伝子 DDHで代替した。 すなわち、 導入した L—リジン生合成系酵素遺伝子とそれらがコ一ドする酵素は 次のとおりである。
ppc ：ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ
aspC ：ァスパラギン酸アミノ トランスフヱラーゼ lysC ァスバルトキナーゼ III
lysC* 阻害解除型ァスハ。ノレトキナーゼ III
asd ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ
dapA ジヒドロジピコリン酸シンターゼ
dapA* 阻害解除型ジヒドロジピコリン酸シンターゼ
dapB ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
DDH ジァミノピメリン酸デヒドロゲナ一ゼ （ブレビパ'クテリゥム ラクトフ ァーメンタム由来）
lysA ジァミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
E. coliに各遺伝子を個別に導入した結果、 lysC*、 dapAあるいは dapA*を導入し た株に L一リジン生産が認められ、 dapA*導入株が最も高い L—リジン生産性を示 した。 この結果から、 dapAが触媒する反応が第一の律速段階であることがわかつ た。 次に、 dapA*導入株に各 L一リジン生合成系遺伝子を導入したところ、 lysC* が最も L -リジン生産性向上に効果があり、 lysCが触媒する反応が第 2の律速段 階であることがわかった。 同様にして、 dapBが触媒する反応が第 3の律速段階、 DDHが触媒する反応が第 4の律速段階であることがわかった。 さらに、 DDHで代替 された dapC：、 dapD、 dapE及び dapFによる反応の間の律速段階を調べた結果、 dapD 及び dapEが律速となっていることがわかつた。
以下に、 E. coliの L一リジン生合成系遺伝子、 及びブレビバ'クテリゥム ラク トファーメンタムの DDH遺伝子の取得法を例示する。
ppc遺伝子は、 この遺伝子を有するプラスミ ド pS2 (Sabe, H. et al. , Gene, 3 1, 279 (1984)) 、 あるいは pT2から得ることができる。 pS2を Aatllと Aflllで切断 することにより、 ppc遺伝子を有する D N A断片が得られる。 また、 pT2を Smalと Sealで切断することによつても ppc遺伝子を有する D N A断片を得ることができる。 PT2を保持する E. coli F15株 （AJ12873) は、 工業技術院生命工学工業技術研究所 (郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に、 FERM BP- 4732の 受託番号のもとでブダぺスト条約に基づいて国際寄託されている。
aspC遺伝子は、 この遺伝子を有するプラスミ ド pLF4 (Inokuchi, K. et al. , ucleic Acids Res. , 10, 6957 (1982)) から得られる。 pLF4を PvuI Iと Stulで切断 すると、 aspC遺伝子を有する D N A断片が得られる。
asd遺伝子は、 この遺伝子を有するプラスミ ド pAD20 (Haziza, C. et al. , Ε Β 0, 1, 379 (1982)) から得られる。 pAD20を Aselと Clalで切断すると、 asdを有す る D N A断片が得られる。
dapB遺伝子は、 既知の dapB遺伝子のヌクレオチド配列 （Bouvier, J. et al. , J. Biol. Chem. , 259, 14829 (1984)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチ ドプライマ一 （例えば、 配列番号 9、 10) を用いた P C R法により、 E. coli染色 体 D N Aを増幅することによって得られる。
DDH遺伝子は、 コリネバクテリゥム グルタミカム （Corynebacterium glutami cum) の DDHil伝子の既知のヌクレオチド配列 （Ishino, S. et al. , Nucleic Aci ds Res. , 15， 3917 (1987)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライ マー （例えば、 配列番号 11、 12) を用いた P C R法により、 ブレビパクテリゥム ラクトファーメンタムの染色体 D N Aを増幅することによって得られる。
lysA¾伝子は、 既知の lysAil伝子のヌクレオチド配列 （Stragier, P. et al. , J. Mol. Biol. , 168, 321 (1983)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチド プライマー （例えば、 配列番号 13、 14) を用いた P C R法により、 E. coli染色体 D N Aを増幅することによって得られる。
dapDit伝子は、 既知の dapD¾伝子のヌクレオチド配列 （Richaud, C. et al. , J. Biol. Chem. , 259, 14824 (1984)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチ ドプライマ一 （例えば、 配列番号 15、 16) を用いた P C R法により、 E. coli 13 110株染色体 D N Aを増幅することによって得られる。
dapE遺伝子は、 既知の dapE遺伝子のヌクレオチド配列 （Bouvier, J. et al. , J. Bacteriol. , 174, 5265 (1992)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチド プライマー （配列番号 17、 18) を用いた P C R法により、 E. coli D N Aを増幅 することによって得られる。
dapF遺伝子は、 既知の dapF遺伝子のヌクレオチド配列 （Richaud, C. et al. , Nucleic Acids Res. , 16, 10367 (1988)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレ ォチドプライマ一 （例えば、 配列番号 19、 20) を用いた P C R法により、 E. col i染色体 D N Aを増幅することによって得られる。
本発明において宿主として用いるェシヱリヒア属細菌としては、 その細胞内で 変異型 D D P S遺伝子及び変異型 A K 111遺伝子、 もしくは他の Lーリジン生合成 系遺伝子のプロモータ一又はこれらの遺伝子を発現させるための他のプロモータ 一が機能し、 さらに変異型 D D P S遺伝子、 変異型 A K I II遺伝子、 あるいは他の Lーリジン生合成系遺伝子をブラスミ ド上に染色体外 D N Aとして導入する場合 には、 導入するのに用いるベクタ一 D N Aの複製起点が細胞内で機能して複製可 能なものであれば利用できる。
例えば、 L一リジン生産性の E. coli、 具体的には L一リジンアナログに耐性を 有する変異株が例示できる。 この L—リジンアナログは、 ェシエリヒア属細菌の 増殖を阻害するようなものであるが、 その抑制は Lーリジンが培地中に共存すれ ば、 全体的または部分的に解除されるようなものである。 例えば、 ォキサリジン、 リジンハイドロキサメート、 A E C、 7—メチルリジン、 α—クロロカプロラク タム等がある。 これらのリジンアナログに耐性を有する変異株は、 通常の人工変 異操作をェシヱリヒア属の微生物に施すことにより得られる。 Lーリジン製造に 用いる菌株として、 具体的には、 ェシエリヒア .コリ A J 1 1 4 4 2 ( F E RM B P - 1 5 4 3及び N R R L B - 1 2 1 8 5として寄託されている。 特開昭 5 6 - 1 8 5 9 6号及び米国特許第 4 3 4 6 1 7 0号参照） が挙げられる。 以上の 微生物のァスバルトキナーゼは、 L一リジンによるフィードバック阻害が解除さ れている。
その他にも、 たとえば Lースレオニン生産菌が挙げられる。 L—スレオニン生 産菌も、 一般的にはそのァスバルトキナーゼの Lーリジンによる阻害が解除され ているからである。 E. coliの Lースレオニン生産菌としては、 B-3996株が現在知 られている内で最も高い生産能を持っている。 B - 3996株は、 Reserch Institute ior Genetics and Industrial Microorganism Breedingに、 登録番号 R I A 1 8 6 7のもとに寄託されている。
本発明による変異型遺伝子を保持する形質転換体の培養に使用する培地は、 炭 素源、 窒素源、 無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培 地である。 炭素源としては、 グルコース、 ラクトース、 ガラクトース、 フラクト一スもし くはでんぷんの加水分解物などの糖類、 グリセロールもしくはソルビトールなど のアルコール類、 またはフマール酸、 クェン酸もしくはコハク酸等の有機酸類を 用いることができる。
窒素源としては、 硫酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥムもしくはリン酸アンモ ニゥム等の無機アンモニゥム塩、 大豆加水分解物などの有機窒素、 アンモニアガ ス、 またはアンモニア水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、 ビタミン L—イソロイシンなどの要求物質また は酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。 これらの他に、 必要に応じて、 リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄イオン、 マンガンイオン等が少量添加さ れる。
培養は、 好気的条件下で 1 6〜 7 2時間実施するのがよく、 培養温度は 2 5 〜4 5 に、 培養中 p Hは 5〜8に制御する。 尚、 p H調整には無機あるいは有 機の酸性あるいはアルカリ性物質、 更にアンモニアガス等を使用することができ る。
発酵液からの Lーリジンの採取は通常ィォン交換樹脂法、 沈澱法その他の公知 の方法を組み合わせることにより実施できる。 図面の簡単な説明 図 1は、 pdapAlと pdaPA2の製造工程を示す図である。
図 2は、 野生型及び変異型 D D P Sの L一リジンによる阻害を示す図である。 図 3は、 二重変異型 dapA'遺伝子を有するプラスミ ド pdapAS824の製造工程を示 す図である。
図 4は、 pLYSClと pLYSC2の製造工程を示す図である。
図 5は、 ヒドロキシルアミン処理後の形質転換体の出現率と変異率を示す図で ある。
図 6は、 野生型及び変異型 A K I I Iの L一リジンによる阻害を示す図である。 図 7は、 dapA*24を有する RSF1010由来のプラスミ ド RSF24Pの製造工程を示す図 である。 図 8は、 プラスミ ド p L L C * 8 0の製造工程を示す図である。
図 9は、 dapA*24及び lysC*80を有する RSF1010由来のプラスミ ド RSFD80の製造ェ 程を示す図である。
図 10は、 dapA又は dapA*を有するプラスミ ド pdapA及び pdapA*の構造を示す図で あ 。
図 11は、 lysC又は lysC*80を有するプラスミ ド plysC及び plysC*の構造を示す図 である。
図 12は、 ppcを有するプラスミ ド pppcの構造を示す図である。
図 13は、 aspCを有するプラスミ ド paspCの構造を示す図である。
図 14は、 asdを有するプラスミ ド pasdの構造を示す図である。
図 15は、 dapBを有するプラスミ ド pdapBの構造を示す図である。
図 16は、 DMを有するプラスミ ド pDDHの構造を示す図である。
図 17は、 lysAを有するプラスミ ド plysAの構造を示す図である。
図 18は、 dapA*24、 lysC*80及び dapBを有する RSF1010由来のプラスミ ド pCABlの 製造工程を示す図である。
図 19は、 dapA*24、 lysC*80、 dapB及び DDHを有する RSF1010由来のプラスミ ド pC
ABD2の製造工程を示す図である。
図 20は、 dapDを有するプラスミ ド pdapDの構造を示す図である。
図 21は、 dapEを有するプラスミ ド pdapEの構造を示す図である。
図 22は、 dapFを有するプラスミ ド pdapFの構造を示す図である。
図 23は、 dapD及び dapEを有するプラスミ ド pMWdapDElの製造工程を示す図である。 図 24は、 dapA*24、 lysC*80、 dapB、 dapD及び dapEを有するプラスミ ド pCABDElの 製造工程を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 以下に、 実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する 実施例 1 変異型 D D P S遺伝子の取得
< 1 >野生型 dapA遺伝子のクローニング
E. coliの dapA遺伝子の塩基配列は既に報告されており （Richaud, F. et al. , J. BacterioL , 297(1986)) 、 オープンリーディングフレーム（ORF)は 876塩基対で あり、 292アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることがわかっている。 こ の dapA遺伝子がどのように調節されているか不明であるため、 プロモーター領域 を除き、 S D配列と 0RFのみを含む領域を PCR法を用いて増幅し、 クローニングす ることにした。
E. coli K-12 MC1061株の全ゲノム D N Aを斎藤、 三浦の方法 （Biochem. Bioph ys. Acta. , 72, 619(1963)) により回収し、 配列番号 1及び 2に示す配列を有する 2 種のプライマ一を作製し、 これらを用いて、 エルリツチらの方法 （PCR Technolo gy, Stockton press (1989)) に従って P C R反応を行い、 目的 D N Aの増幅を行 つた。 得られた D N Aをそのまま市販の P C R断片用クローニングベクター p C R 1 0 0 0 (Invitrogen社 （米国カルホルニァ州） より購入） に挿入した。 p C R 1 0 0 0は lacZプロモータ一 （Placz) を含有しており、 lacZプロモーターの下 流の部位で切断した状態で市販されている。 この p C R l 0 0 0の両切断末端の 間に P C R断片を連結して得られる組換え D N Aを E. coliに導入すると、 lacZプ 口モーター制御下で P C R断片が転写される。 ？〇尺断片を？0尺1 0 0 0に連 結する際、 この lacZプ口モータ一による転写方向に対して dapAの転写の向きが正 方向となるように連結されたプラスミ ドとして pdapAl、 逆方向となるように連結 されたプラスミ ドとして pdapA2の 2種のプラスミ ドを得た （図 1 ) 。
これらのプラスミ ドを D D P S欠損株である E. coli JE7627に導入したところ、 プラスミ ドを導入された株は宿主である JE7627のジァミノピメリン酸の要求性が 相補されたので、 両プラスミ ドに挿入された D N A断片は、 活性のある D D P S をコードする遺伝子 dapAを含有すると確認した。 pdapAlを野生型 E. coli W3110株 （国立遺伝学研究所 （日本国静岡県三島市） か ら入手） に導入して得られる形質転換株を W3110/pdapAl、 pdapA2を E. coli W311 0株に導入して得られる形質転換株を W3110/pdapA2とそれぞれ命名した。 そして以 下の組成を有する最少培地 M9にリジンのアナログである AE Cを加え、 これら 2 種の形質転換株をそれぞれ培養した。 コントロールとしてプラスミ ドを導入して いない W3110株も同培地で培養した。 2種の形質転換株もプラスミ ドを持たない W 3110株も、 AECにより生育が抑えられたが、 その生育阻害は L—リジンの添加 によって回復した。
(最小培地 M9)
A： (20XM9)
Figure imgf000029_0001
NaCl 10 g/L
Figure imgf000029_0002
B ： 1M MgS04
C ： 50% Gulcose
D ： lg/L Thiamine
上記 A、 B、 C、 Dを別々に滅菌し、 A B ： C ： D ：水 = 5:0.1:1:0.1:95 の 割合で混合する。
< 2 >変異型 DD P S遺伝子 （dapA*) の取得
L—リジンによる阻害が解除された DDPSをコードする dapA*を含有するブラ スミ ド保持株は、 著量の A ECが添加された最少培地 M9上での生育が可能になる と予想し、 生育が AECに耐性となっている株を選択することによって、 dapA'を 含有するプラスミ ド保持株を選択することにした。
dapA*を効率よく取得するために、 く 1〉で作製した pdapAlおよび pdapA2上の d apAに変異処理を行なうことにした。 (1-2-1) dapA*を含有するプラスミ ド保持株の選択条件の検討 上記で得られた W3110/pdapAl株および W3110/pdapA2株を、 それぞれ種々の濃度 の A E Cを含有する M 9寒天平板培地上で培養した。 そして A E Cによる生育阻 止濃度を調べ、 dapA'を含有するプラスミ ド保持株の選択条件の検討を行なった。 各種濃度で A E Cを含む M 9培地での形質転換体の生育を表 1に示す。 尚、 表 中の +は形質転換株が生育することを示し、 一は生育しなかったことを示す。 表 1
Figure imgf000030_0001
pdapAl上の dapA遺伝子の転写方向は lacZプロモ一ターによる転写の方向と一致 している （図 1 ) 。 よって pdapAl上の dapA遺伝子は lacZプロモーターにより発現 量が増幅されているため、 dapAが野生型のままでもかなり高濃度の A E Cに耐性 であつたが、 pdapA2上の dapAit伝子は転写方向が lacZプロモータ一に対して逆方 向であり、 dapA自身のプロモータ一も欠失しているため発現量が少なく、 より低 濃度の A E Cで生育が阻害されることがわかった （W3110/pdaPAl株では 30mM、 W3 110/pdaPA2株では 15mMの添加区で生育が抑えられた） 。 なお、 この生育阻害は L 一リジンの同時添加により消去されることを確認した。
したがって、 変異導入対象には dapA2を用い、 最少培地 M 9に A E Cを 60mM添 加したものを、 dapA*を含有するプラスミ ド保持株の選択に用いた。 以下、 実施例 1においてこの培地を選択培地という。 (1-2-2) ヒドロキシルアミンによる pdapA2のインビトロ変異処理 pdapA2プラスミ ドへの変異の導入には、 プラスミ ドを直接ヒドロキシルアミン で処理するインビトロ変異処理法を用いた。
2 zgの DNAを 0.4Mヒドロキシルアミン中 （0.1M KH2PC - ImM EDTA (pH6.0) 100 1、 1M ヒドロキシルアミン -ImM EDTA (pH6.0) 80〃1、 DNA 、 水を加え て計 200^1とする） で、 75 で 1〜4時間処理した。 処理後の DNAをガラスパ ウダ一で精製後、 E. coli W3110に導入し、 完全培地 （L-broth : \% Bacto tryp ton, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar) に撒き、 コロニーを形成 させた。 これらを （1-2-1) で述べた選択培地にレプリカし、 選択培地上でコロニ 一を形成するものを選択した。 2度の実験で合計 36株の変異プラスミ ドの候補 が得られた。
こうして得られた候補株合計 36株を、 再度選択培地にスポッ トし、 AEC耐性を確 忍し/
(1-2-3) dapA*遺伝子の単離及び dapA*産物の検討
上記 36株か.ら変異型 pdapA2を回収し、 これらと野生型 pdapA2のそれぞれで da pA欠損株 JE7627を形質転換し、 各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、 DDP Sの酵素活性を測定した。
無細胞抽出液 （粗酵素液） は次のようにして調製した。 形質転換株を 2 XTY培 地 （1.6% Bacto trypton, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl) で培養し、 660 nmにおける濁度 （OD66Q) が約 0.8になったところで集菌した。 菌体を 0 の 条件下で、 0.85%NaClで洗浄し、 20mMリン酸カリウム緩衝液 PH7.5— 400mM KC1に 懸濁し、 超音波処理 （0 ， 200W, 10分） で菌体を破砕した。 菌体破砕液を 0 の条 件下で、 33krpmで 1時間遠心し、 上清をとつてこれに 80%飽和になるよう硫安を 添加し、 0 で一夜保存した後遠心し、 ペレツトを 20mMリン酸カリウム緩衝液 p H7.5-400mM KC1に溶解した。
DDP S酵素活性の測定は、 Yugariらの方法 （Yugari, Y. and Gilvarg, C. J.B iol. Chem.240, 4710(1962)) で行った。 即ち下記組成の反応液の吸光度を、 37 で 分光光度計中で経時的に 270nmの波長で測定し、 生じるジヒドロジピコリン酸を測 定した。 ブランクとしては反応系からピルビン酸ナトリゥムを除いたものとした。
(反応液組成）
50mM ィミダゾールー HC1 pH7. 4
20mM Lーァスパラギン酸セミアルデヒド
20mM ピルビン酸ナトリウム
酵素液
水 （バランス）
計 1. Oml
D D P Sの酵素活性を測定する際、 酵素反応液中に種々の濃度の Lーリジンを 加え、 L—リジンによる阻害の度合を調べた。 図 2に示す様に、 野生型 D D P S は L—リジンによる阻害を受けた。 野生型に比べて L一リジンによる阻害を受け にくくなつた D D P Sを有する形質転換株由来の変異プラスミ ドは、 候補プラス ミ ド 3 6種中 3種類であつた。 これらをそれぞれ、 pdapAS8、 pdapAS9および pdap AS24と命名した。 後の塩基配列の決定で pdapAS8と pdapAS9は同一変異を有するこ とが判明した。 .
pdapAS8、 pdapAS9および pdapAS24上の dapA*にコードされる 3種の変異型 D D P Sの Lーリジンによる阻害の解除の度合は様々ではあつたが、 3種とも L—リジ ンによる阻害が解除されていた。 酵素の比活性は、 菌体の生育状況や試料の調製 に影響される力、'、 いずれも野生型より若干の低下が見られた。 しかし、 育種素材 としては実質的に問題となる程ではないと判断した。
(1-2-4) 変異型 dapA¾伝子の塩基配列の決定
DNAシークェンサ一 ABI Model 373A (Applied Biosystems社製） を使用して、 常法に従い、 変異型 dapA遺伝子の塩基配列の決定を行った。 その結果、 配列番号 3に示す野生型 dapA遺伝子の配列上で、 pdaPAS8及び pdapAS9は、 4 8 7番目の C が Tに、 PdapAS24は 5 9 7番目の Cが Tに変化していることが明かとなった。 従 つて配列番号 4に示す D D P Sのァミノ酸配列において、 pdapAS8及び pdapAS9の コードする D D P Sは、 8 1番目のァラニン残基力くパ、リン残基に、 pdapAS24のコ 一ドする D D P Sは、 1 1 8番目のヒスチジン残基がチロシン残基に変化してい ることが明かとなった。
(1-2-5) 二重変異型 dapAの作製
上述のように 2種類の変異型 dapA¾伝子が得られた。 これらの変異は阻害の解 除が相加的に働くかどうかを検証するために、 2つの変異を同時に持つ変異型 da pAを含有するプラスミ ドを作成した。 作成の手順は図 3に示す通りである。 得ら れた二重変異プラスミ ドを pdaPAS824と命名した。 実施例 2 変異型 A K i ll遺伝子の取得
< 1 >野生型 lysC遺伝子のクローニング
E. coliの A KI II遺伝子 (lysC) の塩基配列は既に報告されており (Cassan, M. , Parsot, C. , Cohen, G. N. , and Patte, J. C. , J. Biol. Chem. , 261, 1052(1986)) 、 オーブ ンリーディングフレーム（0RF)は 1347塩基対よりなり、 449アミノ酸残基からなる 蛋白質をコードしていることがわかっている。 この遺伝子にはオペレーターが存 在し Lーリジンによる抑制を受けるため、 このオペレーター領域を除くために、 SD配列と 0RFのみを含む領域を、 P C R法を用いて増幅し、 クローニングすること にした。
E. coli K-12 MC1061 株の全ゲノム D N Aを斎藤、 三浦の方法 （Biochem. Bioph ys. Acta. , 72, 619(1963)) により調製し、 配列番号 5及び 6に示す配列を有する 2 種のプライマーを作製し、 これらを用いてエルリツチらの方法 （PCR Technology,
Stockton press (1989)) に従って P C R反応を行い、 lysC遺伝子の増幅を行つ た。 得られた D N Aを BamHIと Aselで消化した後、 平滑末端にし、 多コピーべクタ — PUC18の Smal部位に挿入した。 この Smal部位はベクター内に存在する lacZプロモ 一ターの下流側に位置しており、 pUC18の Smal部位に D N A断片を挿入して得られ る組換え D N Aを E. coliに導入すると、 lacZプロモーター制御による読み越し
(リードスルー） 転写により、 挿入された D N A断片が転写される。 PUC18の Sma I部位に P C R断片を挿入する際、 pUC18に含まれている lacZプロモーターによる 転写方向に対して lysCの転写の向きが逆方向となるように挿入されたプラスミ ド として pLYSClと、 正方向となるように挿入されたプラスミ ドとして pLYSC2の 2種 のプラスミ ドを得た （図 4 )。
これらのプラスミ ドで A K I、 II、 III完全欠損株である E. coli GT3 (thrAlOl 6b, metLM1005, lysC1004) を形質転換したところ、 GT3のホモセリンおよびジアミ ノピメリン酸の要求性が相補されたので、 両プラスミ ドに挿入された D N A断片 は、 活性のある A K I IIをコードする遺伝子 lysCを含有すると確認した。
pLYSClを A K完全欠損株 E. coli GT3に導入して得られる形質転換株を GT3/pLY SC1、 pLYSC2を E. coli GT3に導入して得られる形質転換株を GT3/pLYSC2と命名し た。 最少培地 M 9に著量の L—リジンを加え、 GT3/PLYSC1株および GT3/PLYSC2株 をそれぞれ培養した。 GT3/pLYSCl株および GT3/PLYSC2株ともに野生型の lysCを含 有するプラスミ ドを保持し、 同プラスミ ド上の lysCにコードされる Α Κ Ι Πが唯一 の A Kである。 著量の L—リジン存在下では唯一の A Kである野生型 A K II Iが L 一リジンにより阻害されるために、 両株とも Lースレオニン、 L—イソロイシン、 L一メチォニン、 及びジァミノピメリン酸 (MP)の合成ができなくなり生育が抑え られた。 く 2〉変異型 Α Κ ΙΠ遺伝子（lysC*) の取得
L一リジンによる阻害の解除された A Kをコードする lysC*を含有するプラスミ ド保持株は、 著量の L—リジンが添加された最少培地 M9上での生育が可能になる と予想し、 生育が Lーリジンあるいは L—リジンのアナログである A E Cに耐性 となっている株を選択することによって、 lysC*を含有するプラスミ ド保持株を選 択することにした。
lysC*を効率よく取得するために、 く 1〉で作製した pLYSClおよび pLYSC2上の 1 ysCに変異処理を行なうことにした。
(2-2-1) lysC*を含有するプラスミ ド保持株の選択条件の検討
GT3/pLYSCl株および GT3/pLYSC2株をそれぞれ種々の濃度の Lーリジンあるいは AECを含有する M 9寒天平板培地上で培養を行なった。 そして L—リジンあるいは AECによる生育阻止濃度を調べ、 lysC'を含有するプラスミ ド保持株の選択条件の 検討を行なった。 各種濃度で Lーリジンあるいは AECを含む M 9培地での形質転換体の生育を表 2 に示す。 尚、 表中の +は形質転換株が生育したことを示し、 ±はやや生育したこ とを示し、 —は生育しなかったことを示す 表 2
L一リジン濃度と生育
0 0. 2 0. 4 0. 8 1. 5 3 6 12 25 50 100 200 (mM)
GT3/pLYSCl +
GT3/DLYSC2 + + + + + + + + + + 土 一
A E C濃度と生育
Figure imgf000035_0001
PLYSC2上の lysC遺伝子の転写は lacZプロモーターによる転写の方向と一致して いる （図 4 ) 。 よって pLYSC2上の lysC遺伝子は lacZプロモーターで発現量が増幅 されているため lysCが野生型のままでもかなり高濃度の Lーリジン、 AECに耐性で あつたが、 pLYSCl上の lysC遺伝子は転写方向が lacZプロモータ一に対して逆方向 であり、 自身のプロモーターも欠失しているため発現量が少なく、 より低濃度の L一リジン、 AECで生育が阻害されることがわかった （GT3/PLYSC2株では Lーリジ ンにつ t、ては lOOmMの添加区まで、 AECにつ L、ては 3mMの添加区まで生育が抑えられ なかったのに対し、 GT3/PLYSC1株では L—リジン、 AECとも 0. 2mMの添加区で生育 が完全に抑えられた） 。 なお、 この生育阻害はホモセリン及びジァミノピメリン 酸の同時添加により消去されることを確認した。
したがって、 変異導入実験には pLYSClを用い、 最少培地 M 9に L一リジン 10πιΜ、 もしくは AEC 0.2mMを添加したものを、 lysC*を含有するプラスミ ド保持株の選 択に用いた。 以下、 実施例 2においてこの培地を選択培地という。
(2-2-2) ヒドロキシルァミンによる pLYSClのインビトロ変異処理
pLYSClプラスミ ドへの変異の導入には、 プラスミ ドを直接ヒドロキシルアミン で処理するインビトロ変異処理法に加え、 変異に多様性を与えるため、 即ちヒド 口キシルアミンによるシトシンからチミンへの変異以外の変異を期待して、 ブラ スミ ドを保持した菌体をニトロソグァ二ジン （NTG) で処理した後プラスミ ドを抽 出するインビボ変異処理法の 2種の方法を用し、た。
(ヒドロキシルアミンによるインビトロ変異処理）
2；^^の0 を 0.4M ヒドロキシルアミン中 （0.1M KH2P04-lmM EDTA (pH6.0) 100 1M ヒドロキシルアミン -ImM EDTA (pH6.0) 80 1、 DNA βも、 水を加え て計 200/Uとする） で 、 75 の条件下で、 1〜4時間処理した。 処理後の DNA をガラスパウダーで精製後、 ΑΚ完全欠損株 E. coli GT3株に導入し、 完全培地 ( L- broth: 1% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% ag ar) に撒きコロニーを形成させた。 これを （2-2-1) で設定した選択培地にレプリ 力し、 選択培地上に生育可能な株を選択し候補株とした。 形質転換体の出現率と 変異率は図 5のような推移がみられた。 4時間処理では 0.5〜0.8%とかなり高率 で変異株が得られた。
(NTGによるインビボ変異処理）
pLYSClを E. coli MC1061に導入し、 菌体ごと NTG処理をおこなった。 処理後 の菌体を一夜培養して変異を固定した後プラスミ ドを抽出し、 E. coli GT3に導入 した。 すなわち、 形質転換株を 2 XTY培地 （1.6% Bacto trypton, 1% Yeast e xtract, 0.5% NaCl) で培養し、 OD66。が約 0. 3になったところで集菌し、 下 記に示す TM緩衝液 （TM buffer) で洗浄した後、 NTG液 （0.2mg/mlの濃度で N TGを TM bufferに溶解させて調製） に懸濁し、 37 で 0〜90分処理した。 菌体 を TM buffer及び 2 XTY培地で洗浄後、 2 xTY培地で一夜培養して変異を固定した 後、 菌体よりプラスミ ド DNAを抽出し、 E. coli GT3株に導入し、 候補株のスク リーニングをインビトロ変異と同様に行い、 リジン耐性 (LysR) 、 A E C耐性 (AECR) の変異体を得た。
(TM buffer)
Tris 50οιΜ
マレイン酸 50m
Figure imgf000037_0001
Ca(N0s) 2 5mg/L
FeS( H20 0. 25mg/L
NaOHを用いて pH6. 0に調整 上記で得られた候補株合計 180株（ヒドロキシルアミン処理 48株、 NTG処理 132株） を再度選択培地にスポッ卜し、 AEC及び L一リジン耐性を確認し 153株を得た。 培 地中のァミノ酸蓄積パターンの違いに注目して、 この 153株を 14群に分け各群の代 表株を選んで A K活性を測定することにした。 なお、 ヒドロキシルァミン処理に よる変異株と、 NTG処理による変異株との間では A Kの活性に大きな差はなかった ので、 それぞれを区別することなく以降の実験を行なつた。
(2-2-3) lysC*遺伝子の単離及び lys 産物の検討
上記 14群の代表株として、 No. 24, No. 43, No. 48， No. 60, No. 80, No. 117, No. 126, No. 149， No. 150， No. 156, No. 158, No. 167, No. 169, No. 172を選び、 おのお のから pLYSClに由来する変異型プラスミ ドを回収し、 それぞれ pLYSCl*24， pLYSC 1*43, pLYSCl*48, pLYSCl *60, pLYSCl*80, pLYSCl* 117, pLYSCl* 126, pLYSCl* 14 9, pLYSCri50, pLYSCri56, pLYSCl*158, pLYSCl* 167, pLYSCl * 169, pLYSCl*17 2と命名した。 これらと野生型 pLYSClで A K完全欠損株 GT3を形質転換し、 各形質 転換株から無細胞抽出液を調製し、 A K 111の酵素活性を測定した。
無細胞抽出液 （粗酵素液） は次のようにして調製した。 形質転換株を 2 X TY培 地で培養し、 O D 6 6。が約 0. 8になったところで集菌した。 菌体を 0 の条件下、 0. 02M KH2P04 (pH6. 75)-0. 03M S—メルカプトエタノールで洗浄し、 超音波処理 (0 ， 100W，30秒 x4) で菌体を破砕した。 菌体破砕液を 0 の条件下、 33krpmで 1時間遠心し、 上清をとりこれに 80%飽和になるよう硫安を添加し、 遠心後ペレ ットを 0. 02M KH2PO4(pH6. 75)-0. 03M ;9—メルカプトエタノールに溶解し、 0 で 一夜保存した。
Α Κ ΙΠ酵素活性の測定は、 スタツトマンらの方法にしたがった (Stadtman, E. R.， Cohen, G. N. , LeBras, G. , and Robichon-Szulmajster, H. , J. Biol. Chem. , 236, 2033(1 961))。 すなわち、 下記組成の反応液を 27 で 45分インキュベートし、 FeCl3溶液 (2. 8N HC1 0. 4ml + 12%TCA 0. 4ml + 5%FeCl3'6H2O/0. IN HCl 0. 7ml) を加え発 色させ、 これを遠心後、 上清の 540nmでの吸光度を測定した。 活性は 1分間に生成 するヒドロキサム酸の量で表示 （HJ=l z mol/min) した。 モル吸光係数は 600とし た。 尚、 反応液からァスパラギン酸カリウムを除いたものをブランクとした。
(反応液組成）
reaction mixture *1 0. 3ml
ヒドロキシルァミン溶液 *2 0. 2ml
0. 1M ァスパラギン酸力リ（pH7. 0) 0. lml
酵素液
水 （パ'ランス）
計 1. 0ml
*1 ; 1M Tris-HCl(pH8. l)9ml + 0. 3M MgS04 0. 5ml f 0. 2M ATP(pH7. 0) 5ml *2 ; 8M ヒドロキシルアミン溶液を直前に K0Hで中和したもの
A Kの酵素活性を測定する際、 酵素反応液中に種々の濃度の L—リジンを加え、 L一リジンによる阻害の度合を調べた。 結果を、 図 6及び表 3に示した。 尚、 野 生型及び No. 24, 43, 48, 60, 80， 117, 126については図 6 Aに、 No. 149, 150, 156, 158, 167, 169, 172については図 6 Bに示した。
この結果が示すように、 野生型 A K 111は L一リジンによる阻害を非常に強く受 け、 L—リジン約 0. 45mMで 50%阻害され、 5mMになるとほぼ 100%阻害された。 そ れに対し、 今回得られた変異型 A K I IIは、 解除の度合は様々ではあつたが、 14種 とも L—リジンによる阻害が解除されていた。 特に No. 24、 80、 117、 169、 172で は、 L—リジン lOOmMでも阻害はほとんどみられず、 50%阻害濃度は野生型のそれ と比較して 200倍以上であった。 また総蛋白当りの比活性は、 菌体の生育状況や試 料の調製に影響される力、 いずれもほとんどが野生型と同等もしくはそれ以上の ものであり、 変異導入による活性低下の問題はほとんどなかった （表 3 ) 。 この ことより、 A K 111の活性中心と L—リジンによる調節部位がそれぞれ独立してい ることが予想された。 尚、 表 3中、 阻害解除度 （％) とは、 反応液中 L—リジン 非存在下での A K活性に対する L一リジン 100 mM存在下での A K活性である。 熱 安定性 （％) とは 55 で 1. 5時間処理後の活性保持率である。 表 3
Figure imgf000039_0001
Ί：レリシ"ン非存在下での AK活性に対する L-リシ、'ン 100 mM存在下での AK活性 (！ ¾) '2： 55 で 1. 5時間処理後の活性保持率 ） 続いて変異型酵素の熱安定性を調べた。 ある酵素を改良し活性を上げようとす る場合、 創成される酵素が細胞内で安定に保持されることが重要である。 細胞内 外でのプロテアーゼの活動の違いや、 酵素をインビトロ保存するための保存用バ ッファーの影響などもあるため、 インビトロの測定には問題もあるが、 簡便のた め 1つのパラメータ一として変異型 A Κ ΠΙの熱安定性についてインビトロで検討 した。
A K illの失活温度を種々の条件で検討した結果から、 55 、 90分処理後の活性 保持率を測定することにした。 表 3に示すように、 半数がむしろ野生型よりも優 れていた。 通常変異型酵素は野生型に比べ不安定なものが多いが、 今回得られた 変異型 A K 111には安定性が野生型を上回るものもあり、 Lーリジン生産の実用面 でかなり有力と思われるものが多かつた。
(2-2-4) 野生型 lysCおよび変異型 lysCの塩基配列の決定
DNA シークェンサ一 ABI Model 373A ( Applied Biosystems社製） を使用して、 常法に従い、 今回取得した野生型 lysC遺伝子の塩基配列の決定を行なった （配列 番号 7 ) 。 その結果、 既に発表されている E. coli K-12 JC411株の lysCの配列
(Cassan, M.， Parsot, C. , Cohen, G. N. , and Patte, J. C. , J. Biol. Chem. , 261, 1052(19 86)) と 6ケ所 . (アミノ酸レベルでは 2ケ所） の相違があった。 この 6ケ所の相違 は使用菌株の違いによるものであると考えられる。
同様に、 14種の変異型 pLYSCl上にある lys(Tそれぞれについて塩基配列を決定し、 変異点を明らかにした。 結果を表 4に示す。 表中、 〇 内はヌクレオチドの変異 に基づくアミノ酸残基の変異を示す。 14種のうち全く同一の変異型が 2組 （No. 4 8と No. 167、 及び No. 24と No. 80) あつたので、 変異の種類は 12種類であった。 尚、 No. 149, 150, 156, 158, 167, 169, 172 はヒドロキシルァミン処理、 No. 24、 43、 48、 60、 80、 117、 126は N T G処理によって得た変異型であるが、 変異のパターンは いずれもシトシンからチミンへの変異、 あるいは裏鎖のシトシンからチミンへの 変異による表鎖のグァニンからアデ二ンへの変異であつた。 表 4 lysC*の変異点の特定
Figure imgf000041_0001
* H； ヒドロキシルァミン処理 N ; N T G処理
実施 J[3 dapA'を導入した株による L一リジンの発酵生産
E. coliで L—リジンを生産させるためには、 特開昭 56- 18596号公報、 及び米国 特許第 4, 346, 170公報及び Applied Microbiology and Biotechnology, 15, p227-23 1(1982)に示されるように、 D D P Sを増強する宿主としては、 ァスパルトキナ一 ゼが L一リジンによる阻害を受けなくなっているように変化している事が必須で あるとされている。 そのような株として、 たとえば L—スレオニン生産菌があげ られる。 E. coliスレオニン生産菌としては、 B- 3996株が現在知られている内で最 も高い生産能を持っている。 そこで、 dapA*を評価するに当たり、 B-3996株を宿主 に用いることとした。 B- 3996株は、 染色体外に唯一のプラスミ ドとして p V I C 4 0を保持する。 詳細は特表平 3— 5 0 1 6 8 2号公報に記載されている。 当該 微生物は、 Reserch Institute for Genetics and Industrial Microorganism Br eedingに、 登録番号 R I A 1 8 6 7のもとに寄託されている。
また、 E. coliに導入する dapA'としては、 酵素の阻害解除度、 比活性より判断 して、 pdapAS24に含まれている dapA* ( 1 1 8番目のヒスチジン残基がチロシン残 基に変異しているもの） を選択した。 まず、 dapA*の発現量を増すためと、 プラス ミ ドの安定性を増すために、 pdapAS24上にあった変異型 dapA* (以下、 「dapA*24」 という） を p V I C 4 0のテトラサイクリン耐性遺伝子プロモーターの下流に連 結し、 図 7に示す様にして R S F 2 4 Pを得た。
R S F 2 4 Pプラスミ ドを E. coli JM109株に導入したものは、 A J 1 2 3 9 5と命名され、 1 9 9 3年 1 0月 2 8日に工業技術院生命工学工業技術研究所に 受託番号 F E RM P— 1 3 9 3 5として寄託され、 1 9 9 4年 1 1月 1日にブ ダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP-4858の受託番号のもとで寄 託されている。 pdapAS8および pdapAS9を保持する株は寄託しなかったが、 各ブラ スミ ド上の dapA*の変異点は前述の通りすべて明らかになっているので、 上記寄託 菌ょりプラスミ ドをマニアティスらの方法 （Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , Maniati s, T. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1. 21(1989)) により回収し、 サイト ·ダイレクテツド · ミユータジヱネシス法 （Sambrook, J. , fritsch, E. F. , Maniatis, T. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborato ry Press, 15. 63(1989)) により目的遺伝子を得ることは当業者にとり容易である。
B-3996株から p V I C 4 0を常法に従い脱落させて、 プラスミ ドを有しない株 として B- 399株を取得した。 R S F 2 4 Pプラスミ ドを常法にしたがい B- 399株に 導入し、 B- 399/RSF24Pを得た。 B- 399/RSF24Pの L一リジン生産性について評価を 行なった。
一方、 コントロールのプラスミ ドとして R S F Pを構築した。 すなわち、 図 7 に示す p V I C 4 0の BamHIおよび Dralによる二重消化物より大断片を選択し、 こ れを D N Aポリメラーゼ クレノー ·フラグメントによつて平滑末端化処理した。 平滑末端化処理した大断片を自己連結させてプラスミ ド RSFPを得た。 B- 399株 に RSFPを常法に従い導入し、 B - 399/RSFPを得た。 B- 399/RSFPについても L一 リジン生産性の評価を行った。
培養は、 以下の培地を用い、 培養時間 48時間、 温度 37 の条件下、 攪拌 114〜1 16rpmで行った。 結果を表 5に示す。
(Lーリジン生産培地)
A (皿 4)2S04 16 g/L
Figure imgf000043_0001
MnS04»5H20 0.01 /L
Yeast Ext. (Difco) 2 g/L
L一メチォ二ン 0.5 g/L
Lースレオニン 0.1 g/L
L—イソロイシン 0.05 g/L
KOHで pH7.0に調整し、 115 で 10分ォ一トクレーブ （16/20容）
B 20% Glucose (115 で 10分ォートクレーブ） （4/20容） C 局方 CaC03 (180^で 2日間乾熱滅菌） （30g/L) A： Bを 4 ： 1で混合し、 1 Lに対して Cを 30 g加えて溶解し、 抗生物質 (ストレフ。トマイシン 100jug/ml, カナマイシン 5/z /ml) を加える。 表 5 fel 株 L一リジン塩酸塩の生産量
B-399/RSF24P 4. 1 g/L
B - 399/RSFP 0 g/L 実施例 4 dapA*及び lysC*を導入した株による Lーリジンの発酵生産（I) 実施例 3で変異型 D D P Sの Lーリジン生産に対する効果が示されたが、 これ をさらに改良するために、 実施例 2で得られた変異型 A K 111遺伝子を変異型 D D P S遺伝子と共存させる事とした。 変異型 DD P S遺伝子と共存させる変異型 A Kill遺伝子としては、 酵素活性、 熱安定性等から No. 80株由来のもの （lys C*80)を選択した。
lys 80は、 lysC*の発現量を増すために pLYSCl*80上にあった lysC* (以下、 「lysC*80」 という） を pUC18に対して逆位の挿入部位を有するベクター PHSG399 (宝酒造社製） の lacZプロモーターの下流につなぎかえることにより作成された プラスミ ド pLLC*80 (図 8)から切り出したものを使用した。 pLLC*80は、 pLYSCl *80上の lysC*80が、 転写方向が lacZプロモータ一に対して逆方向に配置されてい るので、 L—リジンの生産性を向上させるために、 lacZプロモーターに対して転 写方向が正方向となるように lysC*80を配置させるために作成されたプラスミ ドで める。
pLLC'80と、 実施例 3で得られた RSF 24 Pから、 dapA'及び lysC*を有するプ ラスミ ド RSFD80を図 9の様にして作製した。 RSFD80は、 テトラサイ クリン耐性遺伝子のプロモータ一 （tetP) の下流に、 tetPに対して転写方向が正 方向となるように dapA'24及び lysC'80がこの順序で配置されている。
RSFD80プラスミ ドを E. coli JM109株に導入したものを、 A J 12396 と命名した。 AJ 12396は、 1993年 10月 28日に工業技術院生命工学 工業技術研究所に受託番号 F ERM P— 13936として寄託され、 1994 年 11月 1日にブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP- 4859の受 託番号のもとで寄託されている。 pLYSCl*24, LYSC1*43, pLYSCl*48, pLYSCl*60, pLYSCl*117, pLYSCri26, pLYSCl*149, pLYSCl*150, pLYSCl*156, pLYSCl*158, pLYSCri67, pLYSCl*169, pLYSCl'172を保持する株は寄託しなかったが、 各ブラ スミ ド上の lys の変異点は前記の通りすベて明らかになっているので、 上記寄託 菌ょりプラスミ ドをマニアテイスらの方法 （Sambrook, J.， Fritsch, E. F. , Maniati s, T. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21(1989)) により回収し、 サイト ·ダイレクテツド · ミユータジヱネシス法 （Sambrook, J. , Fritsch, E, F. , Maniatis, T. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborato ry Press, 15. 63(1989)) により目的遺伝子を得ることは当業者にとり容易である。
R S F D 8 0を常法にしたがい B-399株に導入し、 B-399/RSFD80を得た。 B-399/R SFD80の L—リジン生産性について評価を行なった。 コントロールとして、 B-399 /RSFPについても Lーリジン生産性の評価を行った。
培養は、 実施例 3と同様の L一リジン生産培地を用い、 培養時間 48時間、 温度 37 の条件下、 攪拌 114〜116i:pmで行った。 結果を表 6に示す。 表 6
Figure imgf000045_0001
実施例 5 daoA'及び lvsC'を導入した株による L-リシ'ンの発酵生産 （I I) ェシェリヒア属細菌に変異型 dapA遺伝子と、 変異型 lysC遺伝子を保持させて、 L一リジンの生産性が改善できることが実施例 4で確認された。 この効果が、 宿 主を変更した場合にも維持されるかどうかを実験した。
宿主には、 E. coli W3110(tyrA)株を用いた。 W3110(tyrA)株は欧州特許公開 9 2年 4 8 8 4 2 4号公報に詳しい記載がある力、'、 その調製方法について簡単にふ れると以下の通りである。 国立遺伝学研究所 （静岡県三島市） より E. coli W311 0株を入手した。 同株をストレプトマイシン含有の L Bプレートにまき、 コロニー を形成する株を選択してストレプトマイシン耐性株を取得した。 選択したストレ プトマイシン耐性株と、 E. coli K-12 ME8424株を混合して、 完全培地 （L- Broth ： \ % Bacto trypton, 0. 5% Yeast extract, 0. 5% NaCl) で 3 7 の条件下、 1 5分間静置培養して接合を誘導した。 E. coli K-12 ME8424株は、 （HfrP045, thi. relAl, tvrA: :TnlO, ung-1, nadB) の遺伝形質を有し、 国立遺伝学研究所よ り入手できる。
その後で培養物を、 ストレプトマイシン、 テトラサイクリンおよび L一チロシ ンを含有する完全培地 (L-Broth： 1% Bacto trypton, 0. 5% Yeast extract, 0. 5% NaCl, 1. 5% agar) にまき、 コロニーを形成する株を選択した。 この株を、 E. coli W3110(tyrA)株と命名した。
ところで、 欧州特許公開 9 2年 4 8 8 4 2 4号公報には、 W3110(tyrA)株にブラ スミ ドを導入して形成される株が多く記載されている。 例えば、 プラスミ ド pHAT ermを導入して得られる株は、 E. coli W3110(tyrA)/pHATerm株と命名され、 工業 技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、 登録番号 F E RM B P - 3 6 5 3が付与されている。 この E. coli W3110(tyrA)/pHATerm株からプラスミ ド pHA Termを脱落させることによっても W3110(tyrA)株を取得することができる。 プラス ミ ドの脱落は常法によって行うことができる。 '
前記のようにして得られた W3110(tyrA)株に、 実施例 4で得られた dapA*と lysC *をともに含有するプラスミ ド R S F D 8 0を導入し、 W3110(tyrA)/RSFD80を得た。
W3110(tyrA)/RSFD80の L—リジン生産性について評価を行なつた。 コント口一ル として、 W3110(tyrA)株に R S F Pを常法に従い導入し、 W3110(tyrA)/RSFPを得た。
W3110(tyrA)/RSFPについても Lーリジン生産性の評価を行った。
培養は、 前記 L -リジン生産培地を用い、 培養時間 48時間、 温度 37 の条件下、 攪拌 114〜： U6rpmで行った。 結果を表 7に示す。
困 株 Lーリジン塩酸塩の生産量
W3110(tyrA)/RSFD80 8. 9 g / L
W3110(tyrA)/RSFP 0 g / L 実施例 6 L -リジン生合成系の律速段階の解析及び
L—リジン産生ェシヱリヒア属細菌の Lーリジン生産性の向上
E. coliの L—リジン生合成系の律速段階を解析し、 その段階を触媒する酵素の 遺伝子を増強することによって、 Lーリジン生産性の向上を試みた。
< 1 >第一律速段階の特定
(6-1- 1) L—リジン生合成系遺伝子の取得
律速段階の特定は、 各種リジン生合成系遺伝子を単離し、 それらの遺伝子を E. coliに導入し、 それぞれの遺伝子の L—リジン生産能に対する効果を調べること によって行った。 導入した L—リジン生合成系酵素遺伝子とそれらがコ一ドする 酵素は次のとおりである。
ppc ホスホエノ一ルピルビン酸力ルボキシラーゼ
aspC ァスパラギン酸ァミノ トランスフェラ一ゼ
lysC ァスバルトキナーゼ I I I
lysC*80 阻害解除型ァスパル卜キナーゼ I I I
asd ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼ
dapA ジヒドロジピコリン酸シンタ一ゼ
dapA*24 阻害解除型ジヒドロジピコリン酸シンターゼ
dapB ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
DDH ジァミノピメリン酸デヒドロゲナ一ゼ （ブレビパ、クテリウム ラク ト ファーメンタム由来）
lysA ： ジァミノピメリン酸デカルボキシラーゼ 以上の遺伝子でホスホエノ一ルビルビン酸から Lーリジンに至る Lーリジン生 合成系が網羅できる。 尚、 本来 E. coliが保持する L一リジン生合成系遺伝子のう ち、 dapC；、 dapD、 dapE及び dapF遺伝子は、 これらの遺伝子産物が関与する反応を 単独で触媒し得るブレビパクテリゥム ラク トフアーメンタム （Brevibacterium lactofermentum) の DDH (ジァミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ） コ一ドする 遺伝子 DDHで代替することにした。 また、 これらの遺伝子を導入する宿主としては、 E. coli K-12系の W3110(tyrA)株を用いた。
dapA及び dapA*24遺伝子は、 それぞれ pdapA2及び pdapAS24 (実施例 1参照） から EcoRI及び Kpnlで切り出すことによって得た （図 10) 。 これらの遺伝子を EcoRI及 び Kpnlで消化した pMW118と連結して pdapA及び pdapA*を得た。 また、 lysC及び lys 80遺伝子は、 それぞれ pLYSCl及び pLLC'80 (実施例 2参照） 力、ら EcoRI及び Sphl で切り出すことによつて得た。 これらの遺伝子を EcoRI及び Sphlで消化した pMWll 9と連結して plysC及び plysC*を得た （図 11) 。
ppc遺伝子は、 この遺伝子を有するプラスミ ド pT2から得た。 ΡΤ2を Smalと Sealで 切断し、 末端を平滑化した後、 PMW118の Smal部位に挿入し、 プラスミ ド pppcを得 た （図 12) 。 pT2を保持する E. coli F15株 （AJ12873) は、 通商産業省工業技術院 生命工学工業技術研究所に FERM BP- 4732の受託番号のもとに寄託されている。
aspC遺伝子は、 この遺伝子を有するプラスミ ド pLF4 (Inokuchi, K. et al. , N ucleic Acids Res. , 10, 6957 (1982)) から得た (図 13) 。 pLF4を PvuIIと Stulで 切断し、 末端を平滑化した後、 pMW119の Smal部位に挿入し、 プラスミ ド paspCを得 た。
asd遺伝子は、 この遺伝子を有するプラスミ ド pAD20 (Haziza, C. et al.， EMB 0, 1， 379 (1982)) から得た。 pAD20を Aselと Clalで切断し、 末端を平滑化した後、 PMW118の Smal部位に挿入し、 プラスミ ド pasdを得た （図 14) 。
dapB遺伝子は、 既知の dapB遺伝子のヌクレオチド配列 (Bouvier, J. et al. , J. Biol. Chem. , 259, 14829 (1984)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチ ドプライマ一 （配列番号 9、 10) を用いた P C R法により、 E. coli W3110株染色 体 D N Aから dapB遺伝子を増幅することによって得た （図 15) 。 得られた増幅 D N A断片を Aselと Dralで切断し、 末端を平滑化した後、 pMWl 19の Smal部位に挿入 し、 プラスミ ド pdapBを得た。
DDH遺伝子は、 コリネバクテリゥム グルタミカム （Corynebacterium glutami cum) の DDH遺伝子の既知のヌクレオチド配列 （Ishino, S. et al. , Nucleic Aci ds Res. , 15, 3917 (1987)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライ マー （配列番号 11、 12) を用いた P C R法により、 ブレビパクテリゥム ラクト フアーメンタム ATCC13869 の染色体 D N Aから DDH遺伝子を増幅することによつ て得た。 得られた増幅 D N A断片を EcoT22Iと Avalで切断し、 末端を平滑化した後、 PMW119の Sraal部位に挿入し、 プラスミ ド pDDHを得た （図 16) 。
lysAit伝子は、 既知の lysAil伝子のヌクレオチド配列 （Stragier, P. et al. ,
J. Mol. Biol. , 168, 321 (1983)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチド プライマー （配列番号 13、 14) を用いた P C R法により、 E. coli W3110株染色体 D N Aから lysAil伝子を増幅することによつて得た。 得られた増幅 D N A断片を Spllと Bellで切断し、 末端を平滑化した後、 pMW118の Smal部位に挿入し、 プラス ミ ド plysAを得た （図 17) o
上記各遺伝子がクローニングされたことの確認は、 図中に示された制限酵素で 切断することにより行った。 また、 これらの遺伝子のクローニングに用いたべク タ一 PMW118及び PMW119 (二ツボンジーン製） は、 後述するリジン生産用プラスミ ドの作製に使用したベクタ一である RSF1010と E. coli細胞中で共存でき、 安定分 配機構も持っため、 選択した。
(6-1- 2) L—リジン生合成系遺伝子を導入した E. coliの L—リジン生産性
E. coli W3110(tyrA)を上記の L—リジン生合成系遺伝子を含む各プラスミ ドで 形質転換し、 得られた形質転換体を培養して L一リジン生産を行った。 培養は以 下の培地を用い、 培養温度 37 、 撹拌 114〜116i:pmの条件下で 30時間行った。 結果 を表 8に示す。
(培地組成）
Glucose 40g/l
Figure imgf000050_0001
FeS( H20 0.01g/l
Figure imgf000050_0002
Yeast Extract (Dif co ) 2g/l
L-チロシン 0. lg/1
KOHで pH7.0 に調整し、 115 で 10分オートクレーブ （Glucose、 MgS04*7H20は別殺）
局方 CaC03 25g/l (180 で 2日間乾熱滅菌）
抗生物質
(導入するプラスミ ドの種類に応じストレプトマイシン 20mg/l、 また はアンピシリン 50mg/l)
表 8 菌 株 L-リシ"ン塩酸塩の生産量 (g/1) 対糖収率 ( )
W3110(tyrA) 0.08 0.2
W3110(tyrA)/pppc 0.08 0.2
W3110(tyrA)/paspC 0.12 0.3
W3110(tyrA)/plysC 0.08 0.2
W3110(tyrA)/plysC* 2.27 5.57
W3110(tyrA)/pasd 0.12 0.3
W3110(tyrA)/pdapA 2.32 5.70
W3110(tyrA)/pdapA* 3.63 8.90
W3110(tyrA)/pdapB 0.08 0.2
W3110(tyrA)/pDDH 0.08 0.2
W3110(tyrA)/plysA 0.12 0.3
E. coli W3110(tyrA)は、 lysC\ pdapAあるいは pdapA*の導入で L一リジンを 生産するようになった。 lysC産物、 dapA産物ともに L—リジンによるフィードバ ック阻害を受けることから、 これらの酵素が L—リジン生合成における主要な調 節点であることは予想できることである。 dapA産物が触媒する反応は、 Lースレ ォニン、 L—メチォニン及び L一イソロイシンの合成系と Lーリジン合成系との 枝分かれの位置に存在し、 L一リジン固有の合成系の最初の段階である。 野生型 dapAの増幅によっても E. coliが Lーリジンを生産するようになることは既に報告 されており （Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. , 15, 227 (1982)) 、 それ は上記の結果からも確認された。 一方、 E. coliに阻害解除型遺伝子である dapA* を導入すると、 さらに Lーリジン収率が増すという実施例 3の結果が再確認され た。
W3110(tyrA), W3110(tyrA)/pdapA及び W3110(tyrA)/pdapA*から実施例 1と同様 にして粗酵素液を調製し、 DDPS (ジヒドロジピコリン酸シンタ一ゼ） 活性を測定 し、 さらに DDPS活性の L—リジンによる阻害の度合いを調べた。 結果を表 9に示 す。 表 9
¾ 株 比活性' 1 阻害解除度' 2
W3110(tyrA) 0. 0423 50
W3110(tyrA)/pdapA 0. 2754 22. 9
W3110(tyrA)/pdapA* 0. 1440 76. 5
*1： mols/min/mg protein
*2： L—リジン 5mM存在時の活性保持率 (！ ¾) 阻害解除型の dapA*産物は、 野生型酵素に比べて比活性は低いが （約 1/2)、 阻害 解除度が高いために、 L—リジン生産に与える効果が大きいものと思われ、 L— リジン生産にとつて dapA産物が阻害解除されることの必要性が示された。
また lysC*が L—リジン生産に効果があることについては以下のように考えるこ とができる。 第 1の律速段階は、 生合成系の枝分かれの点となる基質である ASA (ァスパラギン酸- ^ -セミアルデヒド） を HD (ホモセリンデヒドロゲナーゼ： t hrA又は metLMの産物） と DDPS (dapA産物） が取り合う段階であり、 上記のように dapAを増強すると反応は L一リジン生合成の方向に流れる。 一方、 dapAよりさら に上流の反応に関与する lysCを増強することによって ASAの供給量を増した場合 も、 HD と DDPSが関与するいずれの反応も増進するため、 L—リジンの生産量も 増加したものと考えられる。 ただし、 野生型の lysCのみの増強ではこの効果はほ とんど得られない。 その理由は、 野生型 AKI IKlysC産物）の L—リジンによる阻害 が、 野生型 DDPSのそれに比べて厳格であるためであろう （L一リジン 5mMの存在に より、 AKI I Iはほぼ 100¾、 DDPSは 80!¾阻害される) 。
以上のことから、 Lーリジン生産効果がより高い DDPSによる反応 第 1律速段 階であると判断し、 さらに ΑΚΙ Πによる反応が第 2律速段階であると推定した。 く 2〉第 2律速段階の特定
dapA*が導入された株において、 L—リジン生合成系の各種遺伝子を増強し、 第 2律速段階の特定を行った。 dapA*を含むプラスミ ドを保持する E. coliに、 他の プラスミ ドを導入したときに、 これらのプラスミ ドが安定に保持されるように、 dapA*を pdapAから RSF1010に移し、 RSF24Pを得た （図 7 ) 。 この dapA*を有するプ ラスミ ド RSF24Pで E. coli W3110(tyrA)を形質転換した。
E. coli W3110(tyrA)/RSF24Pに、 L一リジン生合成系遺伝子を有するプラスミ ドを導入した。 得られた各形質転換体は、 RSF24P及び他の L一リジン生合成系遺 伝子を含むプラスミ ドの 2種類のプラスミ ドが共存している。 これらの株を、 （6 - 1-2)と同様にして Lーリジン生産性を調べた。 結果を表 10に示す。
表 10 菌 株 L-リシ'ン塩酸塩の生産量 (g/1) 対糖収率 (!
W3110(tyrA)/RSF24P 3. 63 8. 9
W3110(tyrA)/RSF24Plpppc 3. 67 9. 0
W3110(tyrA)/RSF24P+paspC 3. 59 8. 8
W3110(tyrA)/RSF24P+plysC 3. 42 8. 4
W3110(tyrA)/RSF24P+plysC' 9. 17 22. 5
W3110(tyrA)/RSF24P+pasd 3. 75 9. 2
W3110(tyrA)/RSF24P+pdapA 3. 55 8. 7
W3110(tyrA)/RSF24P+pdapA!' 3. 46 8. 5
W3110(tyrA)/RSF24P+pdapB 4. 08 10. 0
W3110(tyrA)/RSF24PlpDDH 3. 67 9. 0
W3110(tyrA)/RSF24P+plysA 3. 55 8. 7
その結果、 lysC*のみに顕著な L一リジン生産性増強効果がみられた。 野生型の lysCでは全く効果がなく、 その理由は先に述べたように L一リジンによる阻害が 強いためと思われる。 これにより lys が関与する反応が第 2律速段階となること が確認された。
lysC*を RSF24Pに組み込み、 RSFD80を得た （図 9 ) 。 同様に、 lysCを RSF24Pに組 み込み、 得られたプラスミ ドを RSFD1と命名した。 これらのプラスミ ドを E. coli W3110(tyrA)に導入し、 （6-卜 2)と同様に粗酵素液を調製して AK活性及び AK活性の L—リジンによる阻害の度合 t、を調べた。 結果を表 11に示す。 表 11
AK活性菌株 比活性 # 1 阻害解除度' 2
W3110(tyrA)/RSF24P 0. 94 42. 9
W3110(tyrA)/RSFDl 18. 55 7. 2
W3110(tyrA)/RSFD80 33. 36 98. 8
*1： nmols/min/mg protein
*2： L—リジン 5mM存在時の活性保持率 (！ ¾) RSF24Pに lysC、 lysC*を組み込むことにより、 このプラスミ ドを保持する株の A Kの比活性は 20〜30倍に増加した。 E. coli には AK は 3種類あり、 lysCはそのう ち AKI I Iをコードしているが、 上記の実験では 3種の AKの合計の活性を測定してい る。 野生型 lysCを組み込んだ RSFD1を保持する株では、 コントロール （W3110(tyr A)/RSF24P) に比べて、 AKK AKIIに対して ΑΚΙ Πが占める割合が高いために L—リ ジンによる阻害も高くなり、 結果として L—リジン生産能増強には効果を示さな かったと考えられる。 一方、 RSFD80を保持する株では、 ΑΚΠΙのほぼ 100%が阻害 が解除されており、 これが L—リジン生産の向上に寄与していることがわかった。
< 3 >第 3律速段階の特定
次に、 E. coli W3110(tyrA)/RSFD80に各種 L一リジン生合成系プラスミ ドを導 入し、 L—リジン生産培養を行った。 培養結果を表 12に示す。 表 12 菌 株 レリシ 塩酸塩の生産量 (g/1) 対糖収率 (¾)
W3110(tyrA)/RSFD80 9. 17 22. 5
W3110(tyrA)/RSFD80+pppc 8. 97 22. 0
W3110(tyrA)/RSFD80+paspC 9. 05 22. 2
W3110(tyrA)/RSFD80+plysC 8. 56 21. 0
W3110(tyrA)/RSFD80+plysC* 8. 15 20. 0
W3110(tyrA)/RSFD80+pasd 8. 35 20. 5
W3110(tyrA)/RSFD80+pdapA 8. 56 21. 0
W3110(tyrA)/RSFD80+pdapA* 8. 15 20. 0
W3110(tyrA)/RSFD80+pdapB 10. 80 26. 5
W3110(tyrA)/RSFD80+pDDH 8. 56 21. 0
W3110(tyrA)/RSFD80+plysA 8. 48 20. 8
dapBのみに Lーリジン生産性増強効果がみられ、 dapBが関与する反応が第 3律 速段階であることがわかった。 そこで、 dapBを RSFD80に組み込み、 pCABlを得た (図 18) 。 このプラスミ ドを E. coli W3110(tyrA)に導入し、 粗酵素液を調製して、 Tamir, H. and Gilvarg, C. , J. Biol. Chem. , 249, 3034 (1974)に記載の方法に従つ て、 DDPR (ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ） の酵素活性を測定した。 同様に して、 RSFD80のみを保持する株と RSFD80と pdapBを共に保持する株から粗酵素液を 調製し、 DDPR活性を測定した。 結果を表 13に示す。 表 13 菌 株 i ?¾¾(, β mols/min/mg protein)
W3110(tyrA)/ SFD80 0. 027
W3110(tyrA)/RSFD80+pdapB 0. 092
W3110(tyrA)/pCABl 0. 178
DDPR活性は、 コントロール （RSFD80のみ保持する株） に比べて、 RSFD80及び pd apBを保持する株で約 3倍、 RSFD80に dapBを組み込みこんだ pCABlを保持する株で は 6. 5倍に増加した。 L—リジンの蓄積は、 f3110(tyrA)/RSFD80+pdapB, ¥3110(t yrA)/pCABlとも同等の 10. 8g八であったことから、 dapBは L—リジン生産には十分 量であり、 律速段階は次の段階に移ったと判断した。
< 4 >第 4律速段階の特定
次に、 lysC*、 dapA*及び dapBを有するプラスミ ド pCABlを用いて、 第 4の律速段 階の特定を行った。 E. coli W3110(tyrA)/PCABlに各種リジン生合成系プラスミ ド を導入し、 L一リジン生産培養を行った。 培養結果を表 14に示す。
表 14 菌 株 レリ ン塩酸塩の生産量 (g/1) 対糖収率 (％)
W3110(tyrA)/pCABl 10.80 26.5
W3110(tyrA)/pCABHpppc 11.00 27.0
W3110C tyrA)/pCABl ipaspC 10.88 26.7
W3110(tyrA)/pCABHplysC 10.60 26.0
W3110(tyrA)/pCABHplysC* 10.39 25.5
W3110(tyrA)/pCABl+pasd 10.19 25.0
W3110(tyrA)/pCABHpdapA 10.72 26.3
W3110 (tyrA)/pCABl IpdapA* 10.80 26.5
W3110(tyrA)/pCABl+pdapB 10.92 26.8
W3110(tyrA)/pCABHpDDH 12.23 30.0
W3110(tyrA)/pCABHplysA 10.60 26.0
DDHのみに L—リジン生産性増強効果がみられ、 DDHが触媒する反応が第 4の律 速段階となることがわかった。 また、 DDH非導入株の培養ブロス中に検出された S DAP (N-スクシ^ル- L，レ α, £-ジァミノピメリン酸） が、 DDH導入株の培養ブロス には検出されなかった。 尚、 SMPの検出は TLC展開によって行った （展開溶媒組成 メタノール：水： ION HC1： ピリジン =80: 17.5:2.5:10) (Bouvier, J., Richau d, C. , Higgins, W.， Bogler, 0. and Stragier, P. J., Bacteriol. , 174, 526 5 (1992))。 さらに、 ブロスの色も DDH非導入株では茶色であったのが、 DDH導入株 では黄色に変化した。 そこで、 DDHを pCABlに組み込んだプラスミ ド pCABD2を作製 し （図 19) 、 このプラスミ ドで形質転換した E. coli W3110(tyrA)の DDH活性を測 定した。 DDH酵素活性の測定は、 文献 （味園春雄 発酵と工業 45,964(1987)) に 従って行った。 結果を表 15に示す。 表 15 菌 株 比活性 ( zmols/min/mg protein)
W3110(tyrA)/pCABl 0. 000
W3110(tyrA)/pCABl+pDDH 0. 799
W3110(tyrA)/pCABD2 2. 214
E. coli には本来 DMが存在しないため、 コントロール （W3110(tyrA)/pCABl) では DDH活性は検出されなかった。 pCABD2保持株 （W3110(tyrA)/PCABD2) の DDHの 比活性は pDDH保持株 （W3110(tyrA)/pCABl+pDDH) の約 2. 5倍であるが、 両株とも L —リジンの蓄積量は同等 （12. 23g/l) であったので、 pCABD2の DDH発現量は十分量 であると判断した。
< 5〉dap dapD、 dapE及び dapF間の律速段階の解析
次に、 上記解析において DDHで代替された dapC、 dapD、 dapE及び dapFの律速順位 を調べるため、 まずこれらの遺伝子のクローニングを行った。 dapCについては塩 基配列についての報告がないためクローン化は行わなかったが、 残り 3種の遺伝 子については PCR法にてクローニングを行った。
dapD¾伝子は、 既知の dapD¾伝子のヌクレオチド配列 （Richaud, C. et al. , J. Biol. Chem. , 259， 14824 (1984)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチ ドプライマ一 （配列番号 15、 16) を用いた P C R法により、 E. coli W3110株染色 体 D N Aから dapD遺伝子を増幅することによつて得た。 得られた増幅 D N A断片 を Eco0109Iと Saclで切断し、 末端を平滑化した後、 pMW118の Smal部位に挿入し、 プラスミ ド pdapDを得た （図 20) 。
dapE遺伝子は、 既知の dapE遺伝子のヌクレオチド配列 （Bouvier, J. et al. , J. Bacteriol. , 174, 5265 (1992)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチド プライマー （配列番号 17、 18) を用いた P C R法により、 E. coli W3110株染色体 D N Aから dapE遺伝子を増幅することによつて得た。 得られた増幅 D N A断片を Muniと Bglllで切断し、 末端を平滑化した後、 pMW118の Smal部位に挿入し、 プラス ミ ド pdapEを得た (図 21) 。
dapF遺伝子は、 既知の dapF遺伝子のヌクレオチド配列 （Richaud, C. et al. , Nucleic Acids Res. , 16， 10367 (1988)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレ ォチドプライマ一 （配列番号 19、 20) を用いた P C R法により、 E. coli W3110株 染色体 D N Aから dapF遺伝子を増幅することによつて得た。 得られた増幅 D N A 断片を Pstlで切断し、 末端を平滑化した後、 PMW118の Smal部位に挿入し、 プラス ミ ド pdapFを得た (図 22) 。
上記のようにして得られた各プラスミ ドを、 W3110(tyrA)/pCABlに導入し、 L— リジン生産培養を行った。 先の実験で、 DDHの導入前と後では L—リジン生産量の 他、 ブロスの色、 中間体 （SDAP) の蓄積の有無についても変化がみられたため、 これらも指標として、 律速段階の解析を行った。 結果を表 16に示す。 表 16 菌 株 L -リシ、、ン難■ 対糖収率 フ、、ロス SDAP
(g/1) (¾) の色 の蓄積
W3110(tyrA)/pCABl 10. 80 26. 5 茶 +
W3110(tyrA)/pCABHpdapD 11. 08 27. 2 黄 +
W3110(tyrA)/pCABl+pdapE 11. 12 27. 3 茶 -
W3110(tyrA)/pCABHpdapF 10. 96 26. 9 茶 +
W3110(tyrA)/pCABD2 12. 23 30. 0 黄 -
L—リジンの生産量は、 dapDあるいは dapEの増強によって若干増加したが、 DD Hには及ばなかった。 また、 DDHの導入により観察されたブロスの色の変化と中間 体である SMPの蓄積は各々独立の現象であり、 ブロスの色の変化は dapD、 SDAPの 消失は dapEに起因するものであることがわかった。 dapEと SDAPの関係については Lーリジン合成経路からみても予想のつくものである。 dapFの増強は、 L—リジ ン生産性向上には効果がみられなかった。
pdapEから dapEを切り出し、 pdapDに挿入して dapE及び dapDを共に有するプラス ミ ド pMWdapDElを作製した (図 23) 。 さらに、 pMWdapDElから dapE及び dapDを含む 断片を切り出し、 これを pCABlに挿入して pCABDElを作製した （図 24)。 pCABl、 pC ABDElあるいは pCABD2を保持する株、 及び pCABDElと pdapFを共に保持する株を作製 し、 これらの株により L—リジン生産培養を行った。 結果を表 17に示す。 表 17 ή 株 L-リシ、、ン騰撮 対糖収率 フ、、ロス SDAP
(g/1) (¾) の色 の蓄積
W3110(tyrA)/pCABl 10. 80 26. 5 茶 +
W3110(tyrA)/pCABDEl 12. 23 30. 0 黄 -
W3110(tyrA)/pCABDEl IpdapF 11. 82 29. 0 黄 -
W3110(tyrA)/pCABD2 12. 23 30. 0 黄 -
dapD、 dapEを組み合わせて増強することにより、 Lーリジン生産量、 ブロスの 色、 SDAPの蓄積の有無とも DDHの導入と同等になることがわかった。 また、 さらに dapFを増強しても L一リジン生産性向上には効果はなく、 dapFが関与する反応は 律速にはなって.いないことがわかった。 以上の結果は、 以下のように解釈できる。
pCABlを導入した段階で中間体は SKAP (N-スクシニル - ε -ケト- L- α -ァミノピメ リン酸） と SDAPの 2段階で蓄積している。 これらの中間体のうち S Pについては 菌体外のブロス中に検出された。 SKAPは検出されなかったが、 おそらく菌体内に 蓄積していたものと考えられる。 そう考えられる理由はブロスの色である。 L一 リジンを生産しない野生株 （W3110(tyrA)) などではブロスの色は黄色であるが、 生育に負担がかかると、 溶菌などによりブロスが茶色になると考えられる。 SDAP は菌体外に排出されているため生育に対する負担は小さく、 したがって、 dapDの みの増強により SKAPが代謝されると SDAPの蓄積量が増加するがブロスは黄色に改 善したものと思われる。 但し、 dapDを増強しても、 より下流の dapEによる律速が 解除されないと、 L—リジンの蓄積量は増加しない。
< 6〉まとめ
以上の結果から、 ェシヱリヒア属細菌において、 ① dapA*の導入、 ② lys の導 入、 ③ dapBの増強、 ④ DM、 あるいは dapD及び dapEの増強、 を行うことによって、 段階的に L—リジン生産性が向上することがわかった。 また、 段階的に L—リジ ン生産性が向上した E. coliが得られた。
< 7 >E. coli における Lーリジン生合成系の律速段階の解析
上記で得られた結論が、 coli K-12系列以外の株においても適用できるかを調 ベるために、 E. coli C株（IF013891)の L—リジン生合成系の律速段階の解析を上 記と同様にして行った。 尚、 培養条件は W3110(tyrA)と同様にして行ったが、 培地 には L-チロシンを添加しなかった。
( 1 ) 第一律速段階の特定
L—リジン生合成系遺伝子を含むプラスミ ドで形質転換した E. coli C株（IF01 3891)を L一リジン生産培地で培養し、 L—リジン塩酸塩の生産量を測定した。 結 果を表 18に示す。 表 18 ―
菌 株 レリシ'ン塩酸塩の生産量 (g/1) 対糖収率 (％)
C 0. 08 0. 2
C/pppc 0. 08 0. 2
C/paspC 0. 12 0. 3
C/plysC 0. 08 0. 2
C/plysC" 0. 12 0. 3
C/pasd 0. 08 0. 2
C/pdapA 0. 32 0. 8
C/pdapA* 0. 71 1. 75
C/pdapB 0. 12 0. 3
C/pDDH 0. 08 0. 2
C/plysA 0. 08 0. 2
W3110(tyrA)の場合と同様に、 C株においても野生型 dapA、 さらに阻害解除型 da pA*の導入により、 L一リジンを培地中に蓄積するようになった。 lysC ま、 L— リジン生産性に効果がなかった。 ( 2 ) 第 2律速段階の特定
E. coli C株に dapA*を含むプラスミ ド RSF24Pを導入し、 さらに L一リジン生 合成系遺伝子を含むプラスミ ドを導入し、 得られた形質転換体を L—リジン生産 培地で培養し、 L—リジン塩酸塩の生産量を測定した。 結果を表 19に示す。 表 19 菌 株 L-リシ"ン塩酸塩の生産量 (g/1) 対糖収率 (％)
C/RSF24P 0.71 1.75
C/RSF24P+pppc 0.71 1.74
C/RSF24P+paspC 0.69 1.70
C/RSF24P+plysC 0.65 1.60
C/RSF24P+plysC* 1.82 4.50
C/RSF24P+pasd 0.70 1.73
C/RSF24P+pdapA 0.71 1.75
C/RSF24P+pdapA* 0.69 1.70
C/RSF24P+pdapB 0.99 2.45
C/RSF24P+pDDH 0.73 1.80
C/RSF24P+plysA 0.69 1.70 dapA*を導入した C株でも、 Lーリジン生産性向上に効果があるのは lysC*であり lys が関与する反応が第 2律速段階であることがわかった。
( 3 ) 第 3律速段階の特定
E. coli に dapA*及び lys を含むプラスミ ド RSFD80を導入し、 さらに L一 リジン生合成系遺伝子を含むプラスミ ドを導入し、 得られた形質転換体を Lーリ ジン生産培地で培養し、 L一リジン塩酸塩の生産量を測定した。 結果を表 20に示 す。 表 20 菌 株 レリ'/'ン塩酸塩の生産量 (g/1) 対糖収率 (％)
C/RSFD80 1.82 4.5
C/RSFD80lpppc 1.74 4.3
C/RSFD80+paspC 1.82 4.5
C/RSFD80+plysC 1.91 4.7
C/RSFD80+plysC* 1.74 4.3
C/RSF賺 pasd 1.82 4.5
C/RSFD80+pdapA 1.95 4.8
C/RSFD80+pdapA* 1.91 4.7
C/RSFD80+pdapB 2.31 5.7
C/RSFD80lpDDH 2.15 5.3
C/RSFD80+plysA 1.95 4.8
W3110株同様に、 dapBのみに L一リジン生産性向上に効果があり、 第 3律速段階 であることがわかった。
( 4 ) 第 4律速段階の特定
E. coli C株に dapA*、 lysC*及び dapBを含むプラスミ ド pCABlを導入し、 さら に L一リジン生合成系遺伝子を含むプラスミ ドを導入し、 得られた形質転換体を L—リジン生産培地で培養し、 L一リジン塩酸塩の生産量を測定した。 結果を表 21に示す。
表 21 菌 株 L-リシ'ン塩酸塩の生産量 (g/l) 対糖収率 (!¾)
C/pCABl 2.31 5.7
C/pCABl+pppc 2.23 5.5
C/pCABl+paspC 2.35 5.8
C/pCABl+plysC 2.27 5.6
C/pCABl+plysC* 2.19 5.4
C/pCABllpasd 2.23 5.5
C/pCABl+pdapA 2.31 5.7
C/pCABl+pdapA* 2.27 5.6
C/pCABl+pdapB 2.23 5.5
C/pCABHpDDH 2.59 6.4
C/pCABHplysA 2.19 5.4
W3110株同様に、 DDHのみに L—リジン生産性向上に効果があり、 第 4律速段階 であることがわかった。
( 5 ) dap dapD、 dapE及び dapF間の律速段階の解析
pCABlを保持する E. coli C株に、 DDHの代わりに dapD、 dapEあるいは dapF遺伝子 を有するプラスミ ドを導入し、 L—リジン生産培養を行った。 結果を表 22に示す。 表 22 困 林 L-リシ'、ン II塩の牛 if景 対糖収率 フ、、ロス SDAP
(g/1) (¾) の色 の蓄積
C/pCABl 2.31 5.7 茶 +
C/pCABl+pdapD 2.43 6.0 黄 +
C/pCABHpdapE 2.35 5.8 茶 -
C/pCABHpdapF 2.23 5.5 茶 +
C/pCABDEl 2.59 6.4 黄 -
C/pCABDEl+pdapF 2.43 6.0 黄 -
C/pCABD2 2.59 6.4 黄 - C¾においても、 W3110株同様に dapD及び dapEの 2段階が律速となっていること がわかった。 以上のように K- 12、 Cと系列の異なる株でも同様の律速順位であったことから、 dapA\ lysC*の導入、 dapB、 DDH (又は dapD及び dapE) の増強をこの順に行うこと によって、 Lーリジン生産性を段階的に向上させることができるという概念は、 E. coli全般に適用できるものと思われる。 産業上の利用性 本発明により、 L—リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたェシ リヒア属細菌由来の D D P S変異遺伝子が得られた。 この遺伝子を、 Lーリジ ンによるフィードバック阻害が解除されたァスバルトキナーゼを保持するェシェ リヒア属細菌に導入することにより、 従来よりもさらに改良された Lーリジン生 産菌を得ることができた。
さらに、 上記 L—リジン生産菌の dapB、 DDH (又は dapD及び dapE) をこの順に増 強することにより、 L—リジン生産性を段階的に向上させることができる。
配列表
(1)一般情報
(i) 出願人： 味の素株式会社
(ii)発明の名称： 発酵法による L一リジンの製造法 (iii)配列数： 20
(iv)連絡先：
(A)宛名
(B)番地
(C)市
(D)州
(E)国
(F) ZIP：
(V) コンピュータ読取り可能形式
(A)媒体：フロッピ一ディスク
(B)コンピュータ： IBM PC互換
(C)操作システム： P DOS/MS-DOS
(D)ソフトゥヱァ： Patentln
(vi)現行出願データ
(A)出願番号
(B)出願日
(。分類
(viii)代理人 Z事務所情報
(A)名前：
(B)登録番号：
(C)整理番号：
(ix)通信情報
(A)電話番号：
(B)ファクシミ リ番号：
(2) 配列番号 1に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A
(xi)配列の説明：配列番号 1 CCGCAACTAC TGACATGACG 20
(2) 配列番号 2に関する情報
(i) 配列の特徴
(A)長さ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A
(xi)配列の説明：配列番号 2
AGTAAGCCAT CAAATCTCCC 20
(2) 配列番号 3に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 1197
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：二本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ： genomic DNA
(vi)起源
(A) 生物名： ェシヱリヒア · コリ（Escherichia coli)
(B) 株名： MC1061 配列の特徴：
特徴を表わす記号： prim transcript
存在位置： 248
特徴を決定した方法： E 配列の特徴：
特徴を表わす記号： CDS
存在位置： 272. . 1150
特徴を決定した方法： E 配列の特徴：
特徴を表わす記号： primer bind
存在位置： 27. . 46
特徴を決定した方法： E 配列の特徴：
特徴を表わす記号： primer bind
存在位置： 1156. . 1175
特徴を決定した方法： E 配列の特徴：
特徴を表わす記号： RBS
存在位置： 261. . 265
特徴を決定した方法： S
(xi) 配列の説明：配列番号 3
CCAGGCGACT GTCTTCAATA TTACAGCCGC AACTACTGAC ATGACGGGTG ATGGTGTTCA 60 CAATTCCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG TGATCACCAG ATAATGTGTT GCGATGACAG 120 TGTCAAACTG GTTATTCCTT TAAGGGGTGA GTTGTTCTTA AGGAAAGCAT AAAAAAAACA 180 TGCATACAAC AATCAGAACG GTTCTGTCTG CTTGCTTTTA ATGCCATACC AAACGTACCA 240 TTGAGACACT TGTTTGCACA GAGGATGGCC C ATG TTC ACG GGA AGT ATT GTC 292
Met Phe Thr Gly Ser lie Val
1 5
GCG ATT GTT ACT CCG ATG GAT GAA AAA GGT AAT GTC TGT CGG GCT AGC 340 Ala lie Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser
10 15 20
TTG AAA AAA CTG ATT GAT TAT CAT GTC GCC AGC GGT ACT TCG GCG ATC 388 Leu Lys Lys Leu lie Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala lie
25 30 35
GTT TCT GTT GGC ACC ACT GGC GAG TCC GCT ACC TTA AAT CAT GAC GAA 436 Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu
40 45 50 55
CAT GCT GAT GTG GTG ATG ATG ACG CTG GAT CTG GCT GAT GGG CGC ATT 484 His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg He
60 65 70
CCG GTA ATT GCC GGG ACC GGC GCT AAC GCT ACT GCG GAA GCC ATT AGC 532 Pro Val lie Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala lie Ser
75 80 85
CTG ACG CAG CGC TTC AAT GAC AGT GGT ATC GTC GGC TGC CTG ACG GTA 580 Leu Thr Gin Arg Phe Asn Asp Ser Gly lie Val Gly Cys Leu Thr Val
90 95 100
ACC CCT TAC TAC AAT CGT CCG TCG CAA GAA GGT TTG TAT CAG CAT TTC 628 Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gin Glu Gly Leu Tyr Gin His Phe
105 110 115 AAA GCC ATC GCT GAG CAT ACT GAC CTG CCG CAA ATT CTG TAT AAT GTC 676
Lys Ala lie Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gin lie Leu Tyr Asn Val
120 125 130 135
CCG TCC CGT ACT GGC TGC GAT CTG CTC CCG GAA ACG GTG GGC CGT CTG 724
Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu
140 145 150
GCG AAA GTA AAA AAT ATT ATC GGA ATC AAA GAG GCA ACA GGG AAC TTA 772 Ala Lys Val Lys Asn lie lie Gly lie Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu
155 160 165
ACG CGT GTA AAC CAG ATC AAA GAG CTG GTT TCA GAT GAT TTT GTT CTG 820 Thr Arg Val Asn Gin lie Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu
170 175 180
CTG AGC GGC GAT GAT GCG AGC GCG CTG GAC TTC ATG CAA TTG GGC GGT 868 Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gin Leu Gly Gly
185 190 195
CAT GGG GTT ATT TCC GTT ACG ACT AAC GTC GCA GCG CGT GAT ATG GCC 916 His Gly Val lie Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala
200 205 210 215
CAG ATG TGC AAA CTG GCA GCA GAA GAA CAT TTT GCC GAG GCA CGC GTT 964 Gin Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val
. 220 225 230
ATT AAT CAG CGT CTG ATG CCA TTA CAC AAC AAA CTA TTT GTC GAA CCC 1012 lie Asn Gin Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro
235 240 245
AAT CCA ATC CCG GTG AAA TGG GCA TFT AAG GAA CTG GGT CTT GTG GCG 1060 Asn Pro lie Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala
250 255 260
ACC GAT ACG CTG CGC CTG CCA ATG ACA CCA ATC ACC GAC AGT GGT CGT 1108 Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro lie Thr Asp Ser Gly Arg
265 270 275
GAG ACG GTC AGA GCG GCG CTT AAG CAT GCC GGT TTG CTG T AAAGTTTAGG 1158 Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu
280 285 290
GAGATTTGAT GGCTTACTCT GTTCAAAAGT CGCGCCTGG 1197 (2) 配列番号 4に関する情報
(i) 配列の特徴
(A)長さ ： 292
(B) 種類：アミノ酸
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：ペプチド
(xi) 配列の説明：配列番号 4
Met Phe Thr Gly Ser He Val Ala lie Val Thr Pro Met Asp Glu Lys
1 5 10 15
Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu lie Asp Tyr His Val
20 25 30
Ala Ser Gly Thr Ser Ala lie Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser
35 40 45
Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Gly Arg He Pro Val lie Ala Gly Thr Gly Ala Asn 65 70 75 80
Ala Thr Ala Glu Ala lie Ser Leu Thr Gin Arg Phe Asn Asp Ser Gly
85 90 95 lie Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gin
100 105 110
Glu Gly Leu Tyr Gin His Phe Lys Ala lie Ala Glu His Thr Asp Leu
115 120 125
Pro Gin lie Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu
130 135 140
Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn lie lie Gly lie 145 150 155 160
Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gin lie Lys Glu Leu
165 170 175
Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu
180 185 190
Asp Phe Met Gin Leu Gly Gly His Gly Val lie Ser Val Thr Thr Asn
195 200 205
Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gin Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu
210 215 220
His Phe Ala Glu Ala Arg Val lie Asn Gin Arg Leu Met Pro Leu His 225 230 235 240 Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro lie Pro Val Lys Trp Ala Cys
245 250 255
Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr
260 265 270
Pro lie Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His
275 280 285
Ala Gly Leu Leu
290
(2) 配列番号 5に関する情報
(i)配列の特徴
(A)長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A
(xi)配列の説明：配列番号 5
CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20
(2) 配列番号 6に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 18
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A
(xi)配列の説明：配列番号 6
GAATTCCTTT GCGAGCAG 18
(2) 配列番号 7に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 2147
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：二本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ： enomic DNA
(vi)起源
(A) 生物名： ェシエリ ヒア ' コリ (Escherichia coli) (B) 株名： C1061 配列の特徴：
特徴を表わす記号： -35 signal 存在位置： 242. · 249
特徴を決定した方法： S 配列の特徴：
特徴を表わす記号： -10 signal 存在位置： 265. . 273
特徴を決定した方法： S 配列の特徴：
特徴を表わす記号： primer bind 存在位置： 536. . 555
特徴を決定した方法： E 配列の特徴：
特徴を表わす記号： primer bind 存在位置： 2128. . 2147
特徴を決定した方法： E 配列の特徴：
特徴を表わす記号： RBS
存在位置： 575. . 578
特徴を決定した方法： S 配列の特徴：
特徴を表わす記号： CDS
存在位置： 584. . 1933
特徴を決定した方法： S 配列の特徴：
特徴を表わす記号： terminator 存在位置： 1941. · 1968
特徴を決定した方法： S
(xi) 配列の説明：配列番号 Ί 配列
TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT 60 AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGMG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA 120 AAAATGTGAT GGHTTAGTG CCGHAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA 180 AGCATTTAH AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT 240 CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC 300 CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG 360 AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC 420 TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC 480 ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC 540 CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595
Met Ser Glu lie
1
GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643 Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met
5 10 15 20
AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT TTA GTT 691 Asn Arg Ser Ala Asp lie Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val
25 30 35
GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CTG CTG GTC GCT TTA GCT 739 Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly lie Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala
40 45 50
GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787 Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala l ie Arg
55 60 65
AAC ATC CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT CTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835 Asn lie Gin Phe Ala lie Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val lie
70 75 80
CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GTT CTG GCA GAA 883 Arg Glu Glu lie Glu Arg Leu Leu Glu Asn lie Thr Val Leu Ala iriu
85 90 95 100
GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG ACA GAT GAG CTG GTC AGC 931 Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser
105 110 115 CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979 His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu lie Leu Arg Glu
120 125 130
CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027 Arg Asp Val Gin Ala Gin Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr
135 140 145
AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1075 Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp l ie Ala Ala Leu Ala Glu
150 155 160
CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTC AAT GAA GGC TTA GTG ATC 1123 Leu Ala Ala Leu Gin Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val lie
165 170 175 180
ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171 Thr Gin Gly Phe lie Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu
185 190 195
GGC CGT GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA CCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219 Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu
200 205 210
CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CCG GGC ATC TAC ACC 1267 His Ala Ser Arg Val Asp l ie Trp Thr Asp Val Pro Gly l ie Tyr Thr
215 . 220 225
ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315 Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg lie Asp Glu lie Ala
230 235 240
TTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363 Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His
245 250 255 260
CCG GCA ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411 Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp lie Pro Val Phe Val
265 270 275
GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459 Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys
280 285 290
ACT GAA AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG 1507 Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gin
295 300 305 ACT CTG CTC ACT TTG CAC AGC CTG AAT ATG CTG CAT TCT CGC GGT TTC 1555 Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe
310 315 320
CTC GCG GAA GTT TTC GGC ATC CTC GCG CGG CAT AAT ATT TCG GTA GAC 1603 Leu Ala Glu Val Phe Gly lie Leu Ala Arg His Asn lie Ser Val Asp
325 330 335 340
TTA ATC ACC ACG TCA GAA GTG AGC GTG GCA TTA ACC CTT GAT ACC ACC 1651 Leu lie Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr
345 350 355
GGT TCA ACC TCC ACT GGC GAT ACG HG CTG ACG CAA TCT CTG CTG ATG 1699 Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gin Ser Leu Leu Met
360 365 370
GAG CTT TCC GCA CTG TGT CGG GTG GAG GTG GAA GAA GGT CTG GCG CTG 1747 Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu
375 380 385
GTC GCG TTG ATT GGC AAT GAC CTG TCA AAA GCC TGC GGC GTT GGC AAA 1795 Val Ala Leu He Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys Gly Val Gly Lys
390 395 400
GAG GTA TTC GGC GTA CTG GAA CCG TTC AAC ATT CGC ATG ATT TGT TAT 1843 Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn lie Arg Met lie Cys Tyr
405 410 415 420
GGC GCA TCC AGC CAT AAC CTG TGC TTC CTG GTG CCC GGC GAA GAT GCC 1891 Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Ala
425 430 435
GAG CAG GTG GTG CAA AAA CTG CAT AGT AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT 1940 Glu Gin Val Val Gin Lys Leu His Ser Asn Leu Phe Glu
440 445
ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA 2000 ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT 2060 ATCTGCATCT CTAAHAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA 2120 TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC 2147
(2) 配列番号 8に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 449
(B) 種類：アミノ酸
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：ペプチド (xi) 配列の説明：配列番号 8
Met Ser Glu lie Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp
1 5 10 15
Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp lie Val Leu Ser Asp Ala Asn
20 25 30
Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly lie Thr Asn Leu Leu
35 40 45
Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu
50 55 60
Asp Ala lie Arg Asn lie Gin Phe Ala lie Leu Glu Arg Leu Arg Tyr 65 70 75 80
Pro Asn Val lie Arg Glu Glu lie Glu Arg Leu Leu Glu Asn lie Thr
85 90 95
Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp
100 105 110
Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu
115 120 125
lie Leu Arg Glu Arg Asp Val Gin Ala Gin Trp Phe Asp Val Arg Lys
130 135 140
Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp lie Ala 145 150 155 160
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gin Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu
165 170 175
Gly Leu Val lie Thr Gin Gly Phe lie Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg
180 185 190
Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu
195 200 205
Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp He Trp Thr Asp Val Pro
210 215 220
Gly lie Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg lie 225 230 235 240
Asp Glu lie Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala
245 250 255
Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp lie
260 265 270
Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu
275 280 285 Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu
290 295 300
Arg Arg Asn Gin Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His 305 310 315 320
Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly lie Leu Ala Arg His Asn
325 330 335 lie Ser Val Asp Leu lie Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr
340 345 350
Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gin
355 360 365
Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu
370 375 380
Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu lie Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys 385 390 395 400
Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn lie Arg
405 410 415
Met lie Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro
420 425 430
Gly Glu Asp Ala Glu Gin Val Val Gin Lys Leu His Ser Asn Leu Phe
435 440 445
Glu
(2) 配列番号 9に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A
(xi)配列の説明：配列番号 9
CTTTCACTGA TATCCCTCCC 20
(2) 配列番号 10に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 10
AAAAAGTGGA CCAAATGGTC 20
(2) 配列番号 11に関する情報
(i) 配列の特徴
(A)長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 11
CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20
(2)配列番号 12に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 12
TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20
(2) 配列番号 13に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 13
TGCACGGTAG GATGTAATCG 20
(2) 配列番号 14に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 14
TTAATGAAAC AAATGCCCGG 20
(2) 配列番号 15に関する情報
(i)配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 15
TTTATTCATA ATTGCCACCG 20
(2) 配列番号 16に関する情報
(i)配列の特徴
(A)長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 16
CACGGTAATA CATATAACCG 20
(2) 配列番号 17に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 17
CCTGCAATTG TCAAACGTCC 20
(2) 配列番号 18に関する情報
(i) 配列の特徴 (A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 18
GTCGACGCGC HGAGATCn 20
(2) 配列番号 19に関する情報
(i)配列の特徴
(A)長さ： 20
(B)種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 19
TCATAAAGAG TCGCTAAACG 20
(2) 配列番号 20に関する情報
(i) 配列の特徴
(A) 長さ ： 20
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii)分子タイプ：他の核酸 合成 D N A (xi)配列の説明：配列番号 20
CAACCGCCCG GTCATCAAGC 20

Claims

請求の範囲
1 . L一リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するェシェ リヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコ一ドする D N A。
2 . L—リジンによるフィードバック阻害が解除される変異が、 配列表の配 列番号 3に記載されるジヒドロジピコリン酸合成酵素のアミノ酸配列中、 N—末 端から 8 1番目のァラニン残基をバリン残基に置換させる変異、 1 1 8番目のヒ スチジン残基をチロシン残基に置換させる変異、 8 1番目のァラニン残基をバリ ン残基に置換させかつ 1 1 8番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる 変異よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項 1記載の D N A。
3 . L一リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するェシェ リヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする D N Aが細胞内 に導入されて形質転換されたェシエリヒア属細菌。
4 . L一リジンによるフィードバック阻害が解除される変異が、 配列表の配 列番号 4に記載'されるジヒドロジピコリン酸合成酵素のァミノ酸配列中、 N—末 端から 8 1番目のァラニン残基をバリン残基に置換させる変異、 1 1 8番目のヒ スチジン残基をチロシン残基に置換させる変異、 8 1番目のァラニン残基をバリ ン残基に置換させかつ 1 1 8番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる 変異よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項 3記載のェシエリヒア属細
5 . さらに、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスバルト キナーゼを保持することを特徴とする請求項 3記載のェシエリヒア属細菌。
6 . L—リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するェシェ リヒア属細菌由来のァスパルトキナ一ゼ I IIをコードする D N Aが細胞内に導入さ れたことにより、 L一リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスパル卜 キナーゼを保持することを特徴とする請求項 5記載のェシヱリヒア属細菌。
7 . ァスパル卜キナーゼ IIIの Lーリジンによるフィードバック阻害が解除さ れる変異が、 配列表の配列番号 8に記載されるァスパノレ卜キナーゼ I IIのアミノ酸 配列中、 N—末端から 3 2 3番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換さ せる変異、 3 2 3番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換させかつ 4 0 8番目のグリシン残基をァスパラギン酸残基に置換させる変異、 3 4番目のアル ギニン残基をシスティン残基に置換させかつ 3 2 3番目のグリシン残基をァスパ ラギン酸残基に置換させる変異、 3 2 5番目のロイシン残基をフヱニルァラニン 残基に置換させる変異、 3 1 8番目のメチォニン残基をイソロイシン残基に置換 させる変異、 3 1 8番目のメチォニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ 3 4 9番目のパ'リン残基をメチォニン残基に置換させる変異、 3 4 5番目のセリン 残基をロイシン残基に置換させる変異、 3 4 7番目のバリン残基をメチォニン残 基に置換させる変異、 3 5 2番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換さ せる変異、 3 5 2番目のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ 3 6
9番目のセリン残基をフ 二ルァラニン残基に置換させる変異、 1 6 4番目のグ ルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、 4 1 7番目のメチォニン残基を イソロイシン残基に置換させかつ 4 1 9番目のシスティン残基をチロシン残基に 置換させる変異、 よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項 6記載のェシ リヒア属細菌。
8 . ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子が増強された請求項 5記載の ェシエリヒア属細菌。
9. ジヒドロジピコリン酸レダクタ一ゼ遺伝子がェシエリヒア属細菌細胞内 で自律複製可能なベクターに連結されてなる組換え D N Aで形質転換された請求 項 8記載のェシヱリヒァ属細菌。
1 0 . 増強されたコリネ型細菌由来のジァミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺 伝子が導入された請求項 8記載のェシェリヒア属細菌。
1 1 . コリネ型細菌由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がェシ リヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクタ一に連結されてなる組換え D N A で形質転換された請求項 1 0記載のェシェリヒア属細菌
1 2 . スクシ二ルジァミノピメリン酸トランスァミナーゼ遺伝子及びスクシ二 ルジァミノピメリン酸デアシラーゼ遺伝子が増強された請求項 8記載のェシェリ ヒア属細菌。
1 3 . スクシ二ルジァミノピメリン酸トランスァミナーゼ遺伝子及びスクシニ ルジァミノピメリン酸デアシラーゼ遺伝子がェシ Xリヒア属細菌細胞内で自律複 製可能な同一又は異なるべクタ一に連結されてなる単一の組換え D N A、 又は 2 つの組換え D N Aで形質転換された請求項 1 2記載のェシェリヒア属細菌。
1 4 . 請求項 3〜1 3のいずれか一項に記載のェシヱリヒア属細菌を好適な培 地で培養し、 該培養物中に L—リジンを生産蓄積せしめ、 該培養物から L—リジ ンを採取することを特徴とする Lーリジンの製造法。
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SK713-96A SK280629B6 (sk) 1993-12-08 1994-11-28 Dna kódujúca dihydrodipikolinát syntázu, baktéria
EP95901600A EP0733710B1 (en) 1993-12-08 1994-11-28 Process for producing l-lysine by fermentation
HU9601535A HU219608B (hu) 1993-12-08 1994-11-28 Eljárás L-lizin fermentációval történő előállítására
BR9408288A BR9408288A (pt) 1993-12-08 1994-11-28 DNA codificante para uma di-hidro-di-picolinato sintase bactéria e processo para produzir L-lisina
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Cited By (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0770676A2 (en) 1995-10-23 1997-05-02 Ajinomoto Co., Ltd. Method for treating fermentation broth
EP0834559A1 (en) * 1995-06-13 1998-04-08 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-lysine by fermentation
EP0811682A3 (en) * 1996-06-05 1998-06-10 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine
US5932453A (en) * 1996-10-15 1999-08-03 Ajinomoto Co., Ltd. Process for producing L-amino acid through fermentation
WO2000056858A1 (fr) * 1999-03-19 2000-09-28 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine
WO2001053459A1 (fr) * 2000-01-21 2001-07-26 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine
EP1188822A1 (en) * 1999-04-09 2002-03-20 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing bacteria and process for producing l-amino acid
EP1266966A2 (en) 2001-06-12 2002-12-18 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-lysine or L-arginine by using methanol assimilating bacterium
WO2003044192A1 (fr) 2001-11-23 2003-05-30 Ajinomoto Co.,Inc. Procede de production de l-aminoacides a l'aide d'escherichia
WO2005007848A1 (ja) 2003-07-16 2005-01-27 Ajinomoto Co., Inc. 腸内細菌科の細菌を用いたｌ−ヒスチジンの製造法
US7192747B2 (en) 1999-08-17 2007-03-20 Ajinomoto, Co. Inc. Methods for producing L-amino acids
WO2007086546A1 (en) 2006-01-26 2007-08-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of enterobacteriaceae family with attenuated expression of the aldh gene
WO2007088970A1 (ja) 2006-02-02 2007-08-09 Ajinomoto Co., Inc. メタノール資化性細菌を用いたｌ－リジンの製造法
WO2007114465A1 (ja) 2006-03-30 2007-10-11 Ajinomoto Co., Inc. メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法
WO2007119890A1 (en) 2006-04-18 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE
EP2055771A2 (en) 2006-03-23 2009-05-06 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA
DE102008049533A1 (de) 2007-09-27 2009-06-18 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zum Herstellen von Aminosäuren unter Verwendung eines Bakteriums der Familie Enterobacteriaceae
WO2009088049A1 (ja) 2008-01-10 2009-07-16 Ajinomoto Co., Inc. 発酵法による目的物質の製造法
WO2009093703A1 (ja) 2008-01-23 2009-07-30 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ-アミノ酸の製造法
JP2009261286A (ja) * 2008-04-23 2009-11-12 Toyota Motor Corp 変異体酵母及びこれを用いた物質生産方法
EP2196535A1 (en) 2008-12-09 2010-06-16 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-arginine using a bacterium of enterobacteriaceae family, having attenuated expression of a gene encoding an l-arginine transporter
US7794988B2 (en) 2006-07-04 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of the rspAB operon
WO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 味の素株式会社 Ｌ-アミノ酸の製造法
WO2011016301A1 (ja) 2009-08-03 2011-02-10 味の素株式会社 ビブリオ属細菌を用いたｌ－リジンの製造法
WO2011024555A1 (ja) 2009-08-28 2011-03-03 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2011043485A1 (en) 2009-10-05 2011-04-14 Ajinomoto Co.,Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-CYSTEINE, L-CYSTINE, A DERIVATIVE OR PRECURSOR THEREOF OR A MIXTURE THEREOF USING A BACTERIUM OF Enterobacteriaceae FAMILY
WO2011055710A1 (ja) 2009-11-06 2011-05-12 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
EP0841395B1 (en) * 1995-06-07 2011-11-02 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing l-lysine
WO2011152568A1 (en) 2010-06-03 2011-12-08 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family, having attenuated expression of genes encoding a lysine/arginine/ornithine transporter
WO2011152565A1 (en) 2010-06-03 2011-12-08 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family, having attenuated expression of gene(s) encoding peptidase
WO2012011595A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Ajinomoto Co.,Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY HAVING ATTENUATED EXPRESSION OF THE astCADBE OPERON
EP2460873A1 (en) 2006-12-12 2012-06-06 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using a bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of any of the cynT, cynS, cynX or cynR genes or a combination thereof
WO2012147989A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid belonging to the glutamate family, using a coryneform bacterium
EP2559754A2 (en) 2011-08-18 2013-02-20 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having enhanced expression of the flagella formation and motility cascade genes
US8535915B2 (en) 2008-01-31 2013-09-17 Cj Cheiljedang Corporation Promoter, and a production method for L-lysine using the same
WO2013151174A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Ajinomoto Co.,Inc. Auto-inducible expression system, and the use thereof for producing useful metabolites using a bacterium of the family enterobacteriaceae
JP2013543727A (ja) * 2010-10-28 2013-12-09 アディッソ・フランス・エス．エー．エス． ２，４−ジヒドロキシ酪酸の生成の方法
WO2014027702A1 (en) 2012-08-17 2014-02-20 Ajinomoto Co.,Inc. Method for producing l-arginine using bacterium of the family enterobacteriaceae having n-acetylornithine deacetylase with downregulated activity
EP2796560A1 (en) 2013-04-23 2014-10-29 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family Enterobacteriaceae having attenuated expression of the yjjK gene
EP2818556A2 (en) 2004-10-07 2014-12-31 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing a basic substance
WO2015030019A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Ajinomoto Co.,Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE FAMILY ENTEROBACTERIACEAE HAVING ATTENUATED EXPRESSION OF THE znuACB GENE CLUSTER
WO2015050276A1 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having attenuated expression of a phosphate transporter-encoding gene
WO2015122544A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Ajinomoto Co.,Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE FAMILY ENTEROBACTERIACEAE HAVING OVEREXPRESSED THE yajL GENE
EP3085705A1 (en) 2015-04-22 2016-10-26 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-isoleucine using a bacterium of the family enterobacteriaceae having overexpressed the cyca gene
EP3098319A1 (en) 2015-05-28 2016-11-30 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having an attenuated expression of a gsha gene
WO2017146195A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
US9840725B2 (en) 2013-10-28 2017-12-12 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family Enterobacteriaceae having a disrupted putrescine degradation pathway
DE102004001674B4 (de) 2003-01-29 2019-01-24 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Einsatz von Methanol verwertenden Bakterien
WO2019130723A1 (en) 2017-12-26 2019-07-04 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing glycine by fermentation
WO2019212052A1 (en) 2018-05-04 2019-11-07 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING L-METHIONINE USING A BACTERIUM OF THE GENUS Pantoea
WO2020067487A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-methionine using a bacterium
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
WO2020138178A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing basic l-amino acids or salts thereof by fermentation of an enterobacteriaceae bacterium
WO2020171227A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE
WO2020204179A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing l-amino acids
WO2021060438A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation
US11999983B2 (en) 2018-12-27 2024-06-04 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing basic L-amino acids or salts thereof by fermentation of an Enterobacteriaceae bacterium

Families Citing this family (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK285201B6 (sk) * 1996-12-05 2006-08-03 Ajinomoto Co., Inc. Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7
JP4075087B2 (ja) * 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
RU2175351C2 (ru) * 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
DE19943587A1 (de) * 1999-09-11 2001-03-15 Degussa Neue für das dapF-Gen codierende Nukleotidsequenzen
JP2001120269A (ja) * 1999-10-22 2001-05-08 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
US6927046B1 (en) 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
CN101824392B (zh) * 2000-01-21 2014-09-24 味之素株式会社 生产l-赖氨酸的方法
DE10014546A1 (de) * 2000-03-23 2001-09-27 Degussa Für das dapC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
EP1174520A3 (en) * 2000-07-18 2004-02-18 Degussa AG Method for monitoring a fermentation process using an expression array
EP1368367B1 (en) * 2001-02-08 2017-05-03 Archer-Daniels-Midland Company Polynucleotide constructs for increased lysine production
DE60219968T2 (de) * 2001-02-13 2008-01-17 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren mittels Bakterien der Gattung Escherichia
JP3932945B2 (ja) 2002-03-27 2007-06-20 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2216405A1 (en) 2002-05-03 2010-08-11 Monsanto Technology LLC Speed specific USP promoters for expressing genes in plants
AU2003205041A1 (en) 2002-07-12 2004-01-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by fermentation
BR0304860A (pt) * 2002-11-11 2004-08-31 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
BRPI0408896A (pt) 2003-03-28 2006-04-25 Monsanto Technology Llc promotores de planta para uso no desenvolvimento precoce de sementes
JP2005021154A (ja) * 2003-06-11 2005-01-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP1656454A4 (en) * 2003-07-08 2011-06-22 Novus Int Inc PROCESS FOR METHIONINAL RECOVERY
EP1650296B1 (en) * 2003-07-16 2012-04-18 Ajinomoto Co., Inc. Mutant serine acetyltransferase and process for producing l-cysteine
RU2276688C2 (ru) * 2003-08-29 2006-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia,- ПРОДУЦЕНТ L-ГИСТИДИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГИСТИДИНА
RU2275425C2 (ru) * 2003-11-03 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина
US20050176033A1 (en) * 2003-11-10 2005-08-11 Klyachko Elena V. Mutant phosphoribosylpyrophosphate synthetase and method for producing L-histidine
RU2275424C2 (ru) * 2003-12-05 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia
US20050181488A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 Akhverdian Valery Z. Method for producing L-threonine using bacteria belonging to the genus Escherichia
US7915018B2 (en) * 2004-10-22 2011-03-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family
KR100768748B1 (ko) 2004-12-30 2007-10-19 씨제이 주식회사 외래의 ｎａｄｐ 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나제 유전자를 포함하는 에세리키아 종 또는코리네박리움 종 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을생산하는 방법
US20070212764A1 (en) * 2005-01-19 2007-09-13 Ptitsyn Leonid R Method for producing l-amino acids using bacterium of the enterobacteriaceae family
WO2006089950A2 (en) 2005-02-26 2006-08-31 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
JP5583311B2 (ja) * 2005-03-10 2014-09-03 味の素株式会社 プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法
US7326546B2 (en) * 2005-03-10 2008-02-05 Ajinomoto Co., Inc. Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance
DE102005017508A1 (de) * 2005-04-15 2006-10-19 Basf Ag Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus einer Fermentationsbrühe II
US8034994B2 (en) * 2005-04-19 2011-10-11 Basf Plant Science Gmbh Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants
CA2605393A1 (en) 2005-04-20 2006-10-26 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
US7790873B2 (en) 2005-05-10 2010-09-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
JP2007185184A (ja) * 2005-12-16 2007-07-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
WO2007086618A1 (en) 2006-01-30 2007-08-02 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009095237A (ja) 2006-02-02 2009-05-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2009060791A (ja) * 2006-03-30 2009-03-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
US7309602B2 (en) * 2006-04-13 2007-12-18 Ambrozea, Inc. Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
US20090291469A1 (en) * 2006-04-13 2009-11-26 David Peter R Compositions and Methods for Producing Fermentation Products and Residuals
US20070244719A1 (en) * 2006-04-13 2007-10-18 David Peter R Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
US20070243235A1 (en) * 2006-04-13 2007-10-18 David Peter R Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2021458A1 (en) 2006-05-23 2009-02-11 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
EP2046949B1 (en) * 2006-07-19 2014-01-15 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
JP5315600B2 (ja) * 2006-09-05 2013-10-16 味の素株式会社 γ−グルタミルシステイン生産酵母とその利用
RU2355763C2 (ru) 2006-09-13 2009-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная ацетолактатсинтаза и способ продукции разветвленных l-аминокислот
BRPI0716980A2 (pt) * 2006-09-15 2013-10-22 Cj Cheiljedang Corp Corynebacteria com produtividade de l-lisina aumentada e método de produção da l-lisina usando a mesma
JP2010017081A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2008072761A2 (en) * 2006-12-11 2008-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an l-amino acid
RU2006145712A (ru) * 2006-12-22 2008-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина
WO2008090770A1 (ja) 2007-01-22 2008-07-31 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法
KR100830826B1 (ko) 2007-01-24 2008-05-19 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법
JP2010088301A (ja) * 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CA2675926A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
JP2010110217A (ja) * 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010226956A (ja) * 2007-07-23 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
JP2010263790A (ja) * 2007-09-04 2010-11-25 Ajinomoto Co Inc アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
EP2192170B1 (en) 2007-09-04 2017-02-15 Ajinomoto Co., Inc. Amino acid-producing microorganism and method of producing amino acid
RU2395579C2 (ru) * 2007-12-21 2010-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
KR101368922B1 (ko) * 2008-03-03 2014-02-27 글로벌 바이오-켐 테크놀로지 그룹 컴퍼니 리미티드 재조합 미생물 및 ｌ－리신을 생산하는 방법
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
KR101126041B1 (ko) 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
ES2624913T3 (es) 2008-09-08 2017-07-18 Ajinomoto Co., Inc. Microorganismo que produce un L-aminoácido y procedimiento para producir un L-aminoácido
JP5504608B2 (ja) * 2008-10-23 2014-05-28 東レ株式会社 １，５−ペンタンジアミンの製造方法
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
KR101886012B1 (ko) 2008-12-12 2018-08-06 씨제이제일제당 (주) 폴리（5ｈｖ）및 5 탄소 화학물질의 생산을 위한 녹색 공정 및 조성물
JP2010142200A (ja) 2008-12-22 2010-07-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
BRPI1007069A2 (pt) 2009-01-23 2015-08-25 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido.
JP5521347B2 (ja) 2009-02-16 2014-06-11 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
BRPI1006614A2 (pt) 2009-04-17 2015-08-25 Basf Plant Science Co Gmbh Promotor isolado ou fragmento ativo ou um derivado deste, construção de expressão, vetor de expressão, método para a produção de uma construção de expressão, processo para a produção de um vetor de expressão, uso do promotor isolado ou fragmento ativo ou derivado deste, planta ou parte da planta transgênica, método de produção de uma célula vegetal transgênica, método para produção de uma planta transgênica ou plântula transgênica, método para produzir uma semente transgênica a partir de uma planta, processo para a reprodução de uma planta transgênica, método para expressão de um ácido nucleico e método para a modulação ou atribuição de um fenótipo ou característica em uma parte de planta ou planta
AU2010270309A1 (en) 2009-07-10 2012-02-02 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants
CN102782141A (zh) 2009-12-03 2012-11-14 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中胚-特异性表达的表达盒
RU2010101135A (ru) 2010-01-15 2011-07-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Бактерия семейства enterobacteriaceae - продуцент l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
EP2363489A1 (en) 2010-03-03 2011-09-07 Technische Universität Hamburg-Harburg Enzyme Aspartokinase III having a reduced L-lysine feedback inhibition
CN102191227B (zh) * 2010-03-04 2013-10-09 中国科学院上海生命科学研究院 一种二氢吡啶二羧酸合成酶
US8839078B2 (en) * 2010-03-05 2014-09-16 Samsung Electronics Co., Ltd. Application layer FEC framework for WiGig
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CN102191289B (zh) * 2011-03-18 2012-08-15 宁夏伊品生物科技股份有限公司 赖氨酸的发酵制备
CN102286505B (zh) * 2011-05-26 2013-04-03 江南大学 用于发酵生产l-缬氨酸的重组dna、菌株及方法
CN102234667B (zh) * 2011-06-08 2012-08-15 宁夏伊品生物科技股份有限公司 赖氨酸的三级发酵制备
JP2015013812A (ja) 2011-11-01 2015-01-22 味の素株式会社 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法
EP2912050A4 (en) 2012-10-29 2016-09-28 Cocrystal Pharma Inc NUCLEOTIDES PYRIMIDINES AND THEIR MONOPHOSPHATE PRODRUGS FOR THE TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS AND CANCER
CN102911976B (zh) * 2012-11-07 2013-10-16 宁夏伊品生物科技股份有限公司 发酵制备中纯度赖氨酸硫酸盐的方法
CN103805626B (zh) * 2012-11-07 2017-07-18 宁夏伊品生物科技股份有限公司 发酵制备赖氨酸盐的方法及其产品
CN103215286B (zh) * 2012-11-12 2015-11-25 江南大学 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用
MY185322A (en) 2013-05-13 2021-05-04 Ajinomoto Kk Method for producing l-amino acid
EP3004362A4 (en) * 2013-06-05 2017-01-11 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms exhibiting increased flux through a fermentation pathway
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
CN106459857B (zh) 2013-10-02 2019-04-19 味之素株式会社 氨控制装置及氨控制方法
CN104736707B (zh) 2013-10-21 2017-08-25 味之素株式会社 生产l‑氨基酸的方法
WO2015060391A1 (ja) 2013-10-23 2015-04-30 味の素株式会社 目的物質の製造法
CA3038351A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 The Procter & Gamble Company Multi-phase oral composition for tooth whitening
KR101863456B1 (ko) * 2016-11-15 2018-06-01 씨제이제일제당 (주) L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 생산방법
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
KR102011994B1 (ko) * 2017-06-30 2019-08-20 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법
JP2020162549A (ja) 2019-03-29 2020-10-08 味の素株式会社 制御装置、制御方法およびプログラムならびに有機化合物の製造方法
JP2022529190A (ja) 2019-04-25 2022-06-17 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 活性剤送達のための口腔ケア組成物
MX2021011294A (es) 2019-04-25 2022-07-19 Procter & Gamble Composiciones multifase que pueden enjuagarse.
CN114134095B (zh) * 2022-01-28 2022-06-17 清华大学 一种利用嗜盐细菌生产l-赖氨酸和/或1,5-戊二胺的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0435132A1 (de) * 1989-12-27 1991-07-03 Forschungszentrum Jülich Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, dafür geeignete Mikroorganismen und rekombinante DNA
EP0485970A2 (en) * 1990-11-13 1992-05-20 Yeda Research And Development Company Limited Transgenic plants overproducing threonine and lysine
WO1993019190A1 (en) * 1992-03-19 1993-09-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragments and methods for increasing the lysine and threonine content of the seeds of plants
WO1994011517A1 (en) * 1992-11-10 1994-05-26 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-threonine by fermentation

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU875663A1 (ru) 1978-06-30 1982-09-15 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени
JPS5618596A (en) 1979-07-23 1981-02-21 Ajinomoto Co Inc Production of l-lysine through fermentation process
JPH0746994B2 (ja) * 1984-10-04 1995-05-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
FR2627508B1 (fr) 1988-02-22 1990-10-05 Eurolysine Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede
US5258300A (en) * 1988-06-09 1993-11-02 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Method of inducing lysine overproduction in plants
WO1990004636A1 (en) 1988-10-25 1990-05-03 Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky Institut Genetiki I Selektsii Promyshlennykh Mikroorganizmov (Vniigenetika) Strain of bacteria escherichia coli, producer of l-threonine
EP0488424B1 (en) 1990-11-30 1997-03-05 Ajinomoto Co., Inc. Recombinant DNA sequences encoding feedback inhibition released enzymes, plasmids comprising the recombinant DNA sequences, transformed microorganisms useful in the production of aromatic amino acids, and a process for preparing aromatic amino acids by fermentation
KR920008382B1 (ko) 1990-12-31 1992-09-26 제일제당 주식회사 재조합 대장균에 의한 라이신 제조방법
US5545545A (en) * 1993-04-27 1996-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Lysine-insensitive maize dihydrodipicolinic acid synthase

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0435132A1 (de) * 1989-12-27 1991-07-03 Forschungszentrum Jülich Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, dafür geeignete Mikroorganismen und rekombinante DNA
EP0485970A2 (en) * 1990-11-13 1992-05-20 Yeda Research And Development Company Limited Transgenic plants overproducing threonine and lysine
WO1993019190A1 (en) * 1992-03-19 1993-09-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragments and methods for increasing the lysine and threonine content of the seeds of plants
WO1994011517A1 (en) * 1992-11-10 1994-05-26 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-threonine by fermentation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. BACTERIOL, Vol. 166, No. 1, (1986), RICHARD FRANCOIS et al., "Chromosomal Location and Nucleotide Sequence of the Escherichia Coli dapA Gene", p. 297-300. *

Cited By (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0841395B1 (en) * 1995-06-07 2011-11-02 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing l-lysine
EP0834559A1 (en) * 1995-06-13 1998-04-08 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-lysine by fermentation
EP0834559A4 (en) * 1995-06-13 1999-09-08 Ajinomoto Kk PROCESS FOR PRODUCING L-LYSINE BY FERMENTATION
US5989875A (en) * 1995-06-13 1999-11-23 Ajinomoto Co., Inc. Method of process for producing L-lysine by fermentation
EP0770676A2 (en) 1995-10-23 1997-05-02 Ajinomoto Co., Ltd. Method for treating fermentation broth
EP0811682A3 (en) * 1996-06-05 1998-06-10 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine
US6090597A (en) * 1996-06-05 2000-07-18 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine
US5932453A (en) * 1996-10-15 1999-08-03 Ajinomoto Co., Ltd. Process for producing L-amino acid through fermentation
KR100430168B1 (ko) * 1996-10-15 2004-07-19 아지노모토 가부시키가이샤 L-라이신에의한피이드백억제가해제된에스케리키아속세균의아스파르토키나제iii를암호화하는dna,당해dna를지닌미생물및당해미생물을이용한l-아미노산의생산방법
WO2000056858A1 (fr) * 1999-03-19 2000-09-28 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine
EP1188822A1 (en) * 1999-04-09 2002-03-20 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing bacteria and process for producing l-amino acid
US7223572B1 (en) 1999-04-09 2007-05-29 Ajinomoto Co., Inc. Methylophilus methylotrophus having enhanced dihydrodipicolinate synthase and/or aspartokinase activity for L-amino acid production
EP1188822A4 (en) * 1999-04-09 2003-09-03 Ajinomoto Kk L-AMINO ACID-PRODUCING BACTERIUM AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACID
US7192747B2 (en) 1999-08-17 2007-03-20 Ajinomoto, Co. Inc. Methods for producing L-amino acids
WO2001053459A1 (fr) * 2000-01-21 2001-07-26 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine
US7723081B1 (en) 2000-01-21 2010-05-25 Ajinomoto Co., Inc. Bacteria containing aspartate-semialdehyde dehydrogenase, phosphoenolpyruvate carboxylase, and transhydrogenase to produce L-lysine in escherichia, and methods of using same
US8062869B2 (en) 2000-01-21 2011-11-22 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-lysine
EP1266966A2 (en) 2001-06-12 2002-12-18 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-lysine or L-arginine by using methanol assimilating bacterium
WO2003044192A1 (fr) 2001-11-23 2003-05-30 Ajinomoto Co.,Inc. Procede de production de l-aminoacides a l'aide d'escherichia
DE102004001674B4 (de) 2003-01-29 2019-01-24 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Einsatz von Methanol verwertenden Bakterien
WO2005007848A1 (ja) 2003-07-16 2005-01-27 Ajinomoto Co., Inc. 腸内細菌科の細菌を用いたｌ−ヒスチジンの製造法
EP2818554A2 (en) 2004-10-07 2014-12-31 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing a basic substance
EP2818556A2 (en) 2004-10-07 2014-12-31 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing a basic substance
WO2007086546A1 (en) 2006-01-26 2007-08-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of enterobacteriaceae family with attenuated expression of the aldh gene
WO2007088970A1 (ja) 2006-02-02 2007-08-09 Ajinomoto Co., Inc. メタノール資化性細菌を用いたｌ－リジンの製造法
EP2055771A2 (en) 2006-03-23 2009-05-06 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA
EP2186881A1 (en) 2006-03-23 2010-05-19 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA
EP2351830A1 (en) 2006-03-23 2011-08-03 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA
WO2007114465A1 (ja) 2006-03-30 2007-10-11 Ajinomoto Co., Inc. メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法
WO2007119890A1 (en) 2006-04-18 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE
US7794988B2 (en) 2006-07-04 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of the rspAB operon
EP2460873A1 (en) 2006-12-12 2012-06-06 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using a bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of any of the cynT, cynS, cynX or cynR genes or a combination thereof
DE102008049533A1 (de) 2007-09-27 2009-06-18 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zum Herstellen von Aminosäuren unter Verwendung eines Bakteriums der Familie Enterobacteriaceae
EP2749652A2 (en) 2008-01-10 2014-07-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing a target substance by fermentation
WO2009088049A1 (ja) 2008-01-10 2009-07-16 Ajinomoto Co., Inc. 発酵法による目的物質の製造法
WO2009093703A1 (ja) 2008-01-23 2009-07-30 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ-アミノ酸の製造法
US8535915B2 (en) 2008-01-31 2013-09-17 Cj Cheiljedang Corporation Promoter, and a production method for L-lysine using the same
JP2009261286A (ja) * 2008-04-23 2009-11-12 Toyota Motor Corp 変異体酵母及びこれを用いた物質生産方法
US8741610B2 (en) 2008-04-23 2014-06-03 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Yeast mutant and substance production method using the same
US8647838B2 (en) 2008-12-09 2014-02-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-arginine using a bacterium of enterobacteriaceae family, having attenuated expression of a gene encoding an L-arginine transporter
EP2196535A1 (en) 2008-12-09 2010-06-16 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-arginine using a bacterium of enterobacteriaceae family, having attenuated expression of a gene encoding an l-arginine transporter
WO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 味の素株式会社 Ｌ-アミノ酸の製造法
WO2011016301A1 (ja) 2009-08-03 2011-02-10 味の素株式会社 ビブリオ属細菌を用いたｌ－リジンの製造法
WO2011024555A1 (ja) 2009-08-28 2011-03-03 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2011043485A1 (en) 2009-10-05 2011-04-14 Ajinomoto Co.,Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-CYSTEINE, L-CYSTINE, A DERIVATIVE OR PRECURSOR THEREOF OR A MIXTURE THEREOF USING A BACTERIUM OF Enterobacteriaceae FAMILY
WO2011055710A1 (ja) 2009-11-06 2011-05-12 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2011152565A1 (en) 2010-06-03 2011-12-08 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family, having attenuated expression of gene(s) encoding peptidase
WO2011152568A1 (en) 2010-06-03 2011-12-08 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family, having attenuated expression of genes encoding a lysine/arginine/ornithine transporter
WO2012011595A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Ajinomoto Co.,Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY HAVING ATTENUATED EXPRESSION OF THE astCADBE OPERON
JP2013543727A (ja) * 2010-10-28 2013-12-09 アディッソ・フランス・エス．エー．エス． ２，４−ジヒドロキシ酪酸の生成の方法
JP2017070285A (ja) * 2010-10-28 2017-04-13 アディッソ・フランス・エス．エー．エス．Ａｄｉｓｓｅｏ Ｆｒａｎｃｅ Ｓ．Ａ．Ｓ． ２，４−ジヒドロキシ酪酸の生成の方法
US9029104B2 (en) 2011-04-25 2015-05-12 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an L-amino acid belonging to the glutamate family, using a coryneform bacterium
WO2012147989A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid belonging to the glutamate family, using a coryneform bacterium
WO2013024904A1 (en) 2011-08-18 2013-02-21 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having enhanced expression of the flagella formation and motility cascade genes
EP2559754A2 (en) 2011-08-18 2013-02-20 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having enhanced expression of the flagella formation and motility cascade genes
WO2013151174A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Ajinomoto Co.,Inc. Auto-inducible expression system, and the use thereof for producing useful metabolites using a bacterium of the family enterobacteriaceae
WO2014027702A1 (en) 2012-08-17 2014-02-20 Ajinomoto Co.,Inc. Method for producing l-arginine using bacterium of the family enterobacteriaceae having n-acetylornithine deacetylase with downregulated activity
EP2796560A1 (en) 2013-04-23 2014-10-29 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family Enterobacteriaceae having attenuated expression of the yjjK gene
WO2015030019A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Ajinomoto Co.,Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE FAMILY ENTEROBACTERIACEAE HAVING ATTENUATED EXPRESSION OF THE znuACB GENE CLUSTER
WO2015050276A1 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having attenuated expression of a phosphate transporter-encoding gene
US9873898B2 (en) 2013-10-02 2018-01-23 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family Enterobacteriaceae having attenuated expression of a phosphate transporter-encoding gene
US9840725B2 (en) 2013-10-28 2017-12-12 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family Enterobacteriaceae having a disrupted putrescine degradation pathway
US9493777B1 (en) 2014-02-14 2016-11-15 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having overexpressed the yajL gene
WO2015122544A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Ajinomoto Co.,Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE FAMILY ENTEROBACTERIACEAE HAVING OVEREXPRESSED THE yajL GENE
EP3085705A1 (en) 2015-04-22 2016-10-26 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-isoleucine using a bacterium of the family enterobacteriaceae having overexpressed the cyca gene
US9896704B2 (en) 2015-04-22 2018-02-20 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-isoleucine using a bacterium of the family Enterobacteriaceae having overexpressed the cycA gene
EP3098319A1 (en) 2015-05-28 2016-11-30 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having an attenuated expression of a gsha gene
US11746345B2 (en) 2015-05-28 2023-09-05 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family Enterobacteriaceae having an attenuated expression of a gshA gene
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US10392638B2 (en) 2016-02-25 2019-08-27 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
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US11390896B2 (en) 2018-05-04 2022-07-19 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-methionine using a bacterium of the genus Pantoea
WO2020067487A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-methionine using a bacterium
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
US11965198B2 (en) 2018-10-05 2024-04-23 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
WO2020138178A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing basic l-amino acids or salts thereof by fermentation of an enterobacteriaceae bacterium
US11999983B2 (en) 2018-12-27 2024-06-04 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing basic L-amino acids or salts thereof by fermentation of an Enterobacteriaceae bacterium
WO2020171227A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE
WO2020204179A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing l-amino acids
WO2021060438A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation

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