KR100345592B1 - L-라이신에의한피드백억제가해제된돌연변이를갖는dna,당해dna로형질전환된 세포 및 당해세포를 사용하는발효법에의한l-라이신의제조방법 - Google Patents

L-라이신에의한피드백억제가해제된돌연변이를갖는dna,당해dna로형질전환된 세포 및 당해세포를 사용하는발효법에의한l-라이신의제조방법 Download PDF

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Abstract

L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 에스케리키아속 세균 유래의 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코드하는 DNA 및 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 에스케리키아속 세균 유래의 아스파르토키나아제 III를 코드하는 DNA를 세포내에 도입함으로써 형질전환된 에스케리키아속 세균, 바람직하게는 디하이드로피콜리네이트 환원효소 유전자, 및 코리네형 세균 유래의 디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제 유전자( 또는 석시닐다이미노피멜레이트 트랜스아미나아제 유전자 및 석시닐디아미노피멜레이트 데아실라아제 유전자)를 증강시킨 에스케리키아속 세균을 적절하게 배지중에서 배양하고 당해 배양물중에 L-라이신을 생산축적시키고, 배양물로부터 L-라이신을 수집한다.

Description

L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 DNA, 당해 DNA로 형질전환된 세포 및 당해 세포를 사용하는 발효법에 의한 L-라이신의 제조 방법
기술분야
본 발명은 미생물공학에 관련된 것으로, 특히 발효법에 의한 L-라이신의 제조 방법, DNA 및 이의 제조 방법에 사용되는 미생물에 관한 것이다.
기술적 배경
종래, 발효법에 의해 L-라이신을 제조하는 경우 생산성을 향상시키기 위해, 자연계로부터 분리한 균주 또는 당해 균주의 인공 변종 균주가 사용되었다. L-라이신을 생산하는 인공 변종 균주는 다수 알려져 있고, 이의 대다수는 S-2-아미노에틸시스테인(AEC) 내성 변종 균주이고, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 바실러스(Bacillus) 속 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속한다. 또한, 재조합 DNA를 사용한 형질전환체를 사용함으로써, 아미노산의 생산을 증가시키는 많은 종류의 기술이 공지되어 있다(참조: 미합중국 특허원 제4,278,765호).
예를 들어, 에스케리키아 속에 있어서는 참조문헌[참조: 일본국 특허공개공보 제56-18596호, 미합중국 특허원 제4,346,170호 및 Applied Microbiology and Biotechnology, 15, pp.227-231(1982)]에 디하이드로디피콜리네이트 신타제(이하,DDPS로 약칭한다)를 증강시킨 균주를 사용한 L-라이신의 제조 방법이 나타나 있다. 그러나, 여기서 사용된 DDPS는 야생형이고, L-라이신에 의한 피드백 억제(feedback inhibition)를 받기 때문에, 충분히 만족스러운 L-라이신의 생산성이 수득되지 않았다. 그러므로, 참조문헌[Applied Microbiology and Biotechnology, 15, pp.227-231(1982)]에 기재된 L-라이신 생산량은 75g/l 글루코즈로부터 L-라이신 하이드로클로라이드 3g/l이고, 소비계수(당 1g으로부터 생산되는 L-라이신의 g수, 또는 이의 백분율)는 0.04(또는 4%)로 계산된다.
한편, L-라이신에 의한 피드백 억제를 받지 않는 것으로 공지되어 있는 코리네박테리움 속 유래의 DDPS를 도입한 에스케리키아 속 세균을 이용한 L-라이신의 제조 방법이 대한민국 특허 공보 제92-8382호에 나타나 있다(소비 계수 : 17%). 그러나, 코리네박테리움 속 균주의 생육 상한 온도는 에스케리키아 속 세균의 생육 상한 온도보다 약 10℃ 정도 낮기 때문에, 코리네박테리움 속 균주 유래의 DDPS를 암호화하는 DNA를 에스케리키아 속 세균에 도입하여 L-라이신 생산에 이용하기 위해서는 배양온도를 낮추어 배양할 필요가 있다고 생각된다. 따라서, 생육 온도가 높고 생육 속도가 빠르고 L-라이신 생산 속도도 빠르다는 에스케리키아 속 세균의 이점을 발휘시키는 것이 곤란할 것으로 예상된다. 또한, 일반적으로 이종 유기체 유래의 유전자를 발현시키는 경우에는 발현산물이 프로테아제에 의해 분해되고 불용성의 봉입체를 형성하는 경우가 있어 동종의 유전자를 발현시키는 경우보다도 곤란한 것으로 예상된다. 더우기, 코리네박테리움 속 균주 유래의 DDPS를 암호화하는 DNA를 에스케리키아 속 세균에 도입하여 공업적으로 L-라이신을 생산시키는 경우에는, 재조합 DNA 가이드라인에 따라서 동종 유전자를 도입한 재조합체를 사용하는 경우 보다도 엄격한 조절이 부과된다.
그런데, 디하이드로디피콜리네이트 신타제(DDPS)는 아스파르토세미알데히드 및 피루브산을 탈수 축합시켜 디하이드로디피콜린산을 합성하는 효소이고, 이 반응은 아스파르트산계 아미노산의 생합성에 있어서, L-라이신 생합성 시스템으로 진행되는 분지의 입구에서 이루어진다. 에스케리키아 속 세균에 있어서의 아스파르토키나제처럼, 상기 효소는 L-라이신 생합성 시스템의 중요한 조절 부위를 담당하고 있는 것으로 공지되어 있다.
DDPS는 이. 콜라이(에스케리키아 콜라이: 대장균)에서는 dapA로 불리우는 유전자에 의해 암호화되고 있다. 이 dapA는 전부 클로닝되어 있고, 뉴클레오타이드 서열도 결정되어 있다[참조: Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297(1986)].
한편, 아스파르토키나제(이하, AK라고 약칭한다)는 아스파르트산을β-포스포아스파르트산으로 변화시키는 반응을 촉매하는 효소이고, 아스파르트산계의 아미노산의 생합성 시스템의 주된 조절효소로서 작용한다. 이. 콜라이의 AK는 3개의 종류(AKI, AKII, AKIII)이고, 이 중에서 2개는 호모세린 디하이드로게나제(이하, HD라고 약칭한다)와의 복합효소이다. 복합효소 중의 하나는 thrA 유전자에 의해 암호화된 AKI-HDI이고, 또 하나는 metLM 유전자에 의해 암호화된 AKII-HDII이다. AKI는 트레오닌과 이소루이신에 의한 협력된 억제 및 트레오닌에 의한 저해를 받고, AKII는 메티오닌에 의한 억제를 받는다.
반면, AKIII는 단순 기능효소이고, lysC로 명명된 유전자의 산물이고, L-라이신에 의한 억제 및 피드백 억제를 받는다고 공지되어 있다. 세포내의 이들의 활성의 비율은 AKI:AKII:AKIII = 약 5:1:4이다.
상술한 바와 같이, 코리네박테리움 속 균주 유래의 DDPS는 L-라이신에 의한 피드백 억제를 받지 않지만, 이들을 에스케리키아 속 세균에 도입시켜 L-라이신 생산에 이용하기에는 배양 온도면에서 문제가 있다. L-라이신에 의한 피드백 억제를 받지 않는 에스케리키아 속 세균 유래의 DDPS 또는 AKIII의 변종 효소를 취득할 수 있다면, 에스케리키아 속 세균을 사용하여 고 효율로 L-라이신을 발효 생산할 수 있다고 기대가 되지만, DDPS의 변종효소를 나타내는 선행문헌은 없으며, 비록 AKIII의 변종효소에 관해서 보고된 바가 있다고는 하나(참조: Boy, E. et al., J. Bacteriol., 112. 84(1972)], 이러한 변종 효소가 L-라이신의 생산성을 개선시킬 수 있음을 나타내는 예는 공지되어 있지 않다.
발명의 개시
본 발명은 상기 관점으로부터 이루어진 것으로, L-라이신에 의한 피드백 억 제가 충분히 해제된 에스케리키아 속 세균 유래의 DDPS와 AKIII을 수득하고, 종래 보다 더욱 개량된 발효법에 의한 L-라이신을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 연구를 거듭한 결과, L-라이신에 의한 피드백 억제가 충분히 해제된 에스케리키아 속 세균 유래의 DDPS를 암호화하 는 DNA를 수득하는데 성공했다. 또한, L-라이신에 의해 피드백 억제가 해제된 이.콜라이 유래의 DDPS를 암호화하는 DNA를 본 명세서에서 돌연변이 dapA 또는 dapA*로 부른다.
또한, 본 발명자들은 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제 및 돌연변이체 dapA를 갖는 에스케리키아 속 세균을 창제하였다. 또한, L-라이신에 의한 피드백 억제가 충분히 해제된 이. 콜라이 유래의 아스파르토키나제를 암호화하는 DNA를 본 명세서에서 돌연변이 lysC 또는 lysC*로 부른다.
또한, 본 발명자들은 돌연변이 dapA 및 돌연변이 lysC를 갖는 에스케리키아 속 세균을 창제하였다. 그리고, 상기 에스케리키아 속 세균을 적당한 배지에서 배 양함으로써 배양물중에서 현저한 양의 L-라이신을 생산 및 축적할 수 있음을 발견 하였다.
또한, 본 발명자들은 돌연변이 dapA 및 돌연변이 lysC를 갖는 에스케리키아 속 세균의 L-라이신 생합성계의 기타 유전자를 증강시킴으로써 L-라이신의 생산능력을 향상시킬 수 있음을 발견하였다.
즉, 본 발명은 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 에스케리키아 속 세균 유래의 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 DNA에 관한 것이다. 이 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이로서는 서열목록의 서열확인번호:4에 기재된 디하이드로디피콜리네이트 신타제의 아미노산 서열에서, N-말단으로부터 81번 알라닌 잔기가 발린 잔기로 치환된 돌연변이, 118번 히스티딘 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이 및 81번 알라닌 잔기가 발린 잔기로 치환되고 동시에 118번 히스티딘 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 돌연변이를 들 수 있다.
또한, 본 발명은 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 에스케리키아 속 세균 유래의 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 DNA를 세포내에 도입시킴으로써 형질전환된 에스케리키아 속 세균에 관한 것이다. L-라이신에 의한 피드백 억제를 해제시키는 돌연변이로서는 서열목록의 서열확인번호: 4에 개재된 디하이드로디피콜리네이트 신타제의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 81번 알라닌 잔기가 발린 잔기로 치환된 돌연변이, 118번 히스티딘 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이 및 81번 알라닌 잔기가 발린 잔기로 치환된 동시에 118번 히스티딘 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이를 들 수 있다.
게다가, 본 발명은 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제를 갖는 것을 특징으로 하는 에스케리키아 속 세균에 관한 것이다. L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제를 에스케리키아 속 세균이 지니도록 하는 방법으로서는 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 에스케리키아 속 세균 유래의 아스파르토키나제 III을 암호화하는 DNA를 세포내에 도입하는 방법을 들 수 있다.
L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제 III의 돌연변이는 서열목록의 서열확인번호: 8에 기재된 아스파르토키나제 III의 아미노산 서열중에서, N-말단으로부터 323번 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환된 돌연변이, 323번 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되고 동시에 408번 글리신 잔기가아스파르트산 잔기로 치환된 돌연변이, 34번 아르기닌 잔기가 시스테인 잔기로 치환되고 동시에 323번 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환된 돌연변이, 325번 루이신 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이, 318번 메티오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환된 돌연변이, 318번 메티오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환되고 동시에 349번 발린 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이, 345번 세린 잔기가 루이신 잔기로 치환된 돌연변이, 347번 발린 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이, 352번 트레오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환된 돌연변이, 352번 트레오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환되고 동시에 369번 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 및 164번 글루탐산 잔기가 라이신 잔기로 치환된 돌연변이 및 417번 메티오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환되는 동시에 419번 시스테인 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이를 들 수 있다.
L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 에스케리키아 속 세균 유래의 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 DNA 및 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 아스파르토키나제 III을 암호화하는 DNA는 각각의 에스케리키아 속 세균 유래의 염색체 상에 갖고 있거나, 세포내 동일한 플라스미드 또는 별개의 플라즈미드 상에 있을 수 있다. 또한, 각각의 DNA중 하나는 염색체 상에 있고, 또 다른 하나는 플라즈미드 상에 있을 수 있다.
본 발명은 또한 디하이드로디피콜리네이트 환원효소 유전자가 증강된 에스케리키아 속 세균에 관한 것이다. 디하이드로디피콜리네이트 환원효소 유전자는 에스케리키아 속 세균 세포내에서 자율적으로 복제가능한 벡터에 디히드로디피콜리네이트 환원효소 유전자를 연결하여 작제한 재조합 DNA로 형질전환시킴으로써 증강시킬 수 있다.
본 발명은 또한 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)과 같은 코리네(coryne)형 세균으로부터 유래된 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제(diaminopimelate dehydrogenase) 유전자가 삽입된 에스케리키아 속 세균에 관한 것이다. 코리네형 세균 유래의 증강된 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 유전자는 당해 유전자를 에스케리키아 속 세균의 세포내에서 자율적으로 복제가능한 벡터에 연결하여 작제한 재조합 DNA로 형질전환시킴으로써 에스케리키아 속 세균에 도입된다. 코리네형 세균으로서는 코리네박테리움 속 또는 브레비박테리움 속 세균이고, 글루탐산 생산능력을 갖는 야생형 균주 및 기타의 아미노산 생산능력을 갖는 이들의 돌연변이 균주를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 브레비박테리움 락토퍼멘툼뿐만 아니라 브레비박테리움 플라붐(Bravibacterium Flavum), 브레비박테리움 디바리카툼(Bravibacterium divaricatum), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 및 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium)이 본 발명에 사용하기 위한 코리네형 세균으로 예시된다.
또한, 본 발명은 디아미노디피멜레이트 데하이드로게나제 유전자 대신에 테 트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제 유전자 및 숙시닐디아미노피멜레이트 데아 실라제 유전자를 증강시킨 에스케리키아 속 세균에 관한 것이다. 이들 유전자는 에스케리키아 속 세균 세포내에서 자율적으로 복제가능한 동일하거나 상이한 벡터에연결하여, 작제한 단일 또는 2개의 재조합 DNA로 형질전환시킴으로써 증강시킬 수 있다.
본 발명은 또한 에스케르키아 속 세균을 적당한 배지에 배양시키고, 당해 배양물 중에 L-라이신을 생산 및 축적시킨 후, 당해 배양물로부터 L-라이신을 수거함을 포함하는, L-라이신의 제조방법을 제공한다.
본 명세서에 있어서, DDPS 또는 AKIII을 암호화하는 DNA 또는 이의 프로모터를 추가로 함유하는 DNA를 "DDPS 유전자" 또는 "AKIII 유전자"라고 부른다. 또한, L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이 효소를 단순히 "돌연변이 효소"로 부르고, 이를 암호화하는 DNA 또는 이의 프로모터를 추가로 함유하는 DNA를 "돌연변이 유전자"로 부른다. 더욱이, "L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된"이라는 것은 실질적으로 억제가 해제되면 충분하며, 완전히 해제될 필요는 없다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
<1>본 발명의 돌연변이 디하이드로디피콜리네이트 신타제(DDPS)를 암호화하는 DNA
본 발명의 돌연변이 DDPS을 암호화하는 DNA는 야생형 DDPS를 암호화하는 DNA 내에 암호화된 DDPS의 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 것이다. DDPS로서는 에스케리키아 속 세균에서 유래한 것으로, 특히 이. 콜라이 유래의 DDPS를 들 수 있다. 또한, DDPS의 L-라이신에 의한 피드백 억제를 해제하는 돌연변이로서는 서열목록의 서열확인번호: 4에 기재된 DDPS의 아미노산 서열에서, DDPS의 N-말단으로부터(1) 81번 알라닌 잔기가 발린 잔기로 치환된돌연변이,(2)118번 히스티딘 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이 및(3)81번 알라닌 잔기가 발린 잔기로 치환된 동시에 118번 히스티딘 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이를 들 수 있다.
야생형 DDPS를 암호화하는 DNA로서는 에스케리키아 속 유래의 세균의 DDPS를 암호화하는 것이면 특히 제한되지 않지만, 구체적으로는 서열확인번호: 4에 나타난 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 들 수 있고, 더욱 구체적으로 서열확인번호: 3에 나타난 염기서열에서 염기번호 272번 내지 1147번으로 나타나는 서열을 들 수 있다. 이러한 서열에 있어서, 뉴클레오타이드 서열내에 상기 아미노산 잔기의 치환을 유발하는 돌연변이를 갖는 것은 본 발명의 돌연변이 DDPS를 암호화하는 DNA이다. 치환된 아미노산 잔기에 대응하는 코돈은 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 것이면 종류는 특히 상관없다. 또한, 세균의 종류 및 세균 균주의 차이에 따라 소유된 DDPS의 서열이 다소 상이한 것이 예상되지만, 이와 같은 효소의 활성에 관여하지 않는 위치에서의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것도 본 발명의 돌연변이 DDPS 유전자에 포함된다.
이와 같은 돌연변이 유전자를 취득하는 방법은 하기와 같다. 우선, 야생형 DDPS 유전자 또는 기타의 돌연변이를 갖는 DDPS 유전자를 함유하는 DNA를 시험관내 돌연변이 처리하고, 돌연변이 처리후의 DNA와 숙주에 적합한 벡터 DNA를 연결시켜 재조합 DNA를 수득한다. 재조합 DNA를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환체를 수득 하고, 형질전환체 중에서 돌연변이 DDPS를 발현시키는 것을 선택하면, 당해 형질전환체는 돌연변이 유전자를 갖고 있다. 또한, 야생형 DDPS 유전자 또는 기타의 돌연변이를 갖는 DDPS 유전자를 함유하는 DNA를 숙주에 적합한 벡터 DNA와 연결시켜 재조합 DNA를 수득하고, 이 재조합 DNA를 시험관내 돌연변이 처리하고, 돌연변이 처리후의 재조합 DNA를 숙주 미생물에 도입시켜 형질전환체를 수득하고, 당해 형질전환체 중에서 돌연변이체 DDPS를 발현시키는 것을 선택하여도 이러한 형질전환체는 돌연변이 유전자를 갖고 있다.
야생형 효소를 생산하는 미생물을 돌연변이 처리하여 돌연변이 효소를 생산하는 돌연변이 균주를 제조한 후, 당해 돌연변이 균주로부터 돌연변이 유전자를 취득하는 것도 바람직하다. 혹은, 야생형 유전자가 연결된 재조합 DNA가 도입된 형질전환체를 돌연변이 처리하여 돌연변이 효소를 생산하는 돌연변이 균주를 제조한 후, 당해 돌연변이 균주로부터 재조합 DNA를 회수하면 DNA상에 돌연변이 유전자가 생성 된다.
DNA를 시험관내 돌연변이 처리하기 위한 약제로서는 하이드록실아민 등을 들수 있다. 하이드록실아민은 사이토신을 N4-하이드록시사이토신으로 변화시킴으로써 사이토신으로부터 티민으로 돌연변이를 일으키는 화학적 돌연변이 처리제이다. 또는, 미생물 자체를 돌연변이 처리하는 경우, 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 아질산 등의 통상적인 인공돌연변이에 사용되는 돌연변이제로 처리한다.
야생형 DDPS 유전자 또는 위에서 기술한 기타의 돌연변이를 갖는 DDPS 유전자를 함유하는 DNA의 공급 미생물로서는 에스케리키아 속에 속하는 미생물이면 어떤 것을 사용하여도 상관없다. 구체적으로는, 문헌[참조: Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1208, 표 1]에 열거된 것을 이용할 수 있다. 예를 들면, 이. 콜라이 JM109 균주 및 MC1061 균주 등을 를 수 있다. DDPS 유전자를 함유하는 DNA용 공급 미생물로서 야생형 균주를 이용하여 야생형 DDPS 유전자를 함유하는 DNA를 수득할 수 있다.
(1) 야생형 DDPS 유전자의 제조
이하, DDPS 유전자를 함유하는 DNA 제조예에 관하여 서술한다. 우선, 야생형 dapA를 갖는 이. 콜라이, 예를 들면 MC1061 균주를 배양하여 배양물을 수득한다. 이 미생물을 배양하는 경우는 통상의 고체배양법으로 배양하여도 되나, 세균의 수거효율을 고려하여 액체배양법을 채용하는 것이 바람직하다. 또한, 배양 배지로서는 예를 들면 효모 추출액, 펩톤, 육즙, 옥수수액 추출물 또는 대두 또는 밀의 침출액과 같은 하나 이상의 질소원에 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 염화 마그네슘, 염화 제2구리, 황산 제2철 또는 황산 망간과 같은 하나 이상의 무기염을 첨가한 것, 또한 경우에 따라 당 원료, 비타민 등의 물질을 적당히 첨가한 것을 사용할 수 있다. 또한, 배양 배지의 최초 pH는 6 내지 8로 조정된 것이 적당하다. 또한, 배양은 30 내지 42℃, 바람직하게 37℃ 전후에서 4 내지 24시간 동안 통기교반침부배양, 진탕배양 또는 정치배양 등에 의해 수행한다.
이와 같이 수득된 배양액을 예를 들면 3,000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 이. 콜라이 MC1061 균주의 세포 펠렛을 수득한다. 이 세포 펠렛으로부터 예를 들면, 사이토와 미우라의 방법[참조: Biochem. Biophys. Acta., 72, 619(1963)] 또는 케이. 에스. 키르비의 방법[참조: Biochem. J. 64, 405(1956)]을 사용하여 염색체 DNA를 수득할 수 있다.
이와 같이 수득된 염색체 DNA로부터 DDPS 유전자를 단리하기 위해, 염색체 DNA 라이브러리를 작제한다. 우선, 염색체 DNA를 적당한 제한효소로 부분분해하여 각종 제한효소의 단편 혼합물을 수득한다. 절단 반응시간 등을 조절하여 절단 정도를 조절하는 경우, 광범위한 종류의 제한효소가 사용된다. 예를 들면, Sau3Al을 온도 30℃이상, 바람직하게는 37℃, 효소 농도 1 내지 10단위/ml에서 다양한 시간(1분 내지 2시간)동안 염색체 DNA상에 작용시켜 이를 절단한다.
수득된 염색체 DNA 단편을 에스케리키아 속 세균 세포내에서 자율적으로 복제가능한 벡터 DNA에 연결하여 재조합 DNA를 작제한다. 구체적으로는, 염색체 DNA의 절단에 사용된 제한효소 Sau3AI에 의해 생성된 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 말단 뉴클레오타이드 서열을 생성시키는 제한효소, 예를 들면, BamHI를 온도 30℃ 이상, 효소 농도 1 내지 100 단위/ml의 조건하에서 1시간 이상, 바람직하게는 1 내지 3시간동안 벡터 DNA에 작용시켜 이를 완전히 절단시킨다, 이어서, 이와 같이 수득된 염색체 DNA 단편 혼합물과 절단된 벡터 DNA를 혼합하고, 여기에 DNA 리가제, 바람직하게는 T4 DNA 리가제를 온도 4 내지 16℃, 효소 농도 1 내지 100단위 /ml의 조건하에서 1시간 이상동안, 바람직하게는 6 내지 24시간 동안 작용시켜 재조합 DNA를 수득한다.
수득된 재조합 DNA를 사용하여, 에스케리키아 속 미생물, 예를 들면 이. 콜라이 K-12 균주, 바람직하게는 JE7627 균주(ponB704, dacB12, pfv+, tonA2, dapA, lysA, str, malA38, metB1, ilvH611, leuA371, proA3, lac-3, tsx-76)과 같은 DDPS 결손 돌연변이체를 형질전환시켜 염색체 DNA 라이브러리를 작제한다. 이 형질전환은 모리슨의 방법[참조:D. M. Morrison, Methods in Enzymology 68, 326(1979)] 또는 수용 균주 세포를 염화 칼슘으로 처리하여 DNA 투과성을 증대시키는 방법[참조: Mandel, M. and Higa, A., J., Mol. Biol., 53, 159(1970)] 등에 의해 수행할 수 있다. 즉, JE7627 균주는 국립유전학연구소(일본국 미시마시 시즈오카켄)에서 입수가능하다.
수득된 염색체 DNA 라이브러리 중에서 DDPS 활성이 증식된 균주 또는 DDPS 유전자 결손에 기인한 영양요구성이 보상된 균주로부터 DDPS 유전자의 재조합 DNA 를 함유하는 균주를 수득한다. 예를 들어, DDPS 결손 돌연변이 균주는 디아미노피멜산을 필요로 한다. 따라서, DDPS 결손 돌연변이 균주를 숙주로서 사용할 경우, DDPS 유전자를 함유하는 DNA 단편은 디아미노피멜산을 함유하지 않는 배지상에서 생육가능한 균주를 단리하고, 당해 균주로부터 재조합 DNA를 회수함으로써 수득할 수 있다.
DDPS 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 갖는 후보 균주가 실질적으로 DDPS 유전자가 클로닝된 재조합 DNA를 갖는지의 여부는, 후보 균주로부터 세포추출액을 제조하고, 이로부터 조 효소액을 제조하여 DDPS 활성이 증대되는 것을 확인함으로써 알 수 있다. DDPS의 효소활성의 측정은 유가리 등의 문헌[참조: Yugari, Y. andGilvarg, C., J.Biol.Chem., 240, 4710(1962)]의 방법에 의해 수행될 수 있다.
균주로부터 DDPS 유전자를 함유하는 DNA가 벡터 DNA에 삽입된 재조합 DNA를 예를 들면, 문헌[참조: P Guerry et al., J.Bacteriol., 116, 1064,(1973), 또는 D. B. Clewell., J. Bacteriol., 110, 667,(1972)]의 방법 등에 의해 단리할 수 있다.
야생형 DDPS 유전자는 염색체 상에 DDPS 유전자를 갖는 균주로부터 사이토와 미우라 등의 방법에 의해 염색체 DNA를 제조하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR;polymerase chain reaction; White, T.J. et al.; Trends Genet., 5, 185(1989)]에 의해 DDPS 유전자를 증폭시킴으로써 제조할 수 있다. 증폭반응에 사용하는 DNA 프라이머는 DDPS 유전자의 전체 영역 또는 일부 영역을 함유하는 DNA 이본쇄의 양 3'-말단에 상보적인 것을 사용한다. DDPS 유전자의 일부 영역만을 증폭시키는 경우에는 이러한 DNA 단편을 프라이머로서 사용하여 염색체 DNA 라이브러리로부터 전체 영역을 함유하는 DNA 단편을 스크리닝할 필요성이 있다. DDPS 유전자의 전체 영역을 증폭시키는 경우, 증폭된 DDPS 유전자를 함유하는 DNA 단편을 함유하는 PCR 반응액을 아가로즈 겔 전기영동한 후, 목적 DNA 단편을 추출함으로써 DDPS 유전자를 함유하는 DNA 단편을 회수할 수 있다.
DNA 프라이머는 예를 들면 이. 콜라이에 있어서 공지되어 있는 서열[참조: Richaud, F. et al., J.Bacteriol., 297(1986)]을 기준으로 적절히 작제하는 것이 바람직하지만, 구체적으로는 DDPS 유전자를 암호화하는 1150개의 염기로 이루어진 영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머가 바람직하고, 서열확인번호:1 및 2로 정의된 2종류의 프라이머가 적당하다. 프라이머의 합성은 포스포아미디트법 [참조: Tetrahedron Letters, 22, 1859(1981)] 등의 통상적인 방법에 의해 시판되는 DNA 합성 장치(예: Applied Biosystems Inc.의 DNA 합성기 모델 380B)를 사용하여 수행할 수 있다. 또한, PCR 반응은 시판되는 PCR 반응장치(예: Takara Shuzo Co., Ltd.의 DNA Thermal Cycler Model PJ2000)를 사용하고, Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo Co. Ltd.에 의해 생산됨)를 사용하여 공급자에 의해 지정된 방법에 따라서 수행될 수 있다.
PCR 방법에 의해 증폭된 DDPS 유전자는 에스케리키아 속 세균 세포내에서 자율적으로 복제가능한 벡터 DNA에 연결시키고, 에스케리키아 속 세균 세포에 도입함으로써 DDPS 유전자에 돌연변이의 도입 등을 조작하는 것이 쉽다. 이용되는 벡터 DNA, 형질전환법 및 DDPS 유전자의 존재의 확인방법은 상술된 방법과 동일하다.
(2) DDPS 유전자에 돌연변이의 도입
아미노산 잔기의 치환, 삽입 및 결실 등의 돌연변이를 실시하는 방법으로서는 재조합 PCR 방법[참조: Higuchi, R., 61, in PCR Technology(Erlich, H. A. Eds , Stockton press(1989)], 부위 특이적 돌연변이 방법[참조: Kramer, W. and Frits, H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987); Kunkel, T A. et al., Meth, in Enzymol., 154, 367(1987)] 등이 있다. 이들 방법을 사용하면 목적 부위의 돌연변이를 일으킬 수 있다.
또한, 목적 유전자를 화학 합성하는 방법을 사용하여, 목적 부위로 돌연변이 또는 비-특이적 돌연변이를 도입하는 것이 가능하다.
또한, 염색체 혹은 플라즈미드 상의 DDPS 유전자를 직접 하이드록실아민으로 처리하는 방법[참조: Hashimoto,T. and Sekiguchi, M., J.Bacteriol., 159, 1039(1984)]이 있다. 또한, DDPS 유전자를 갖는 에스케리키아 속 세균에 자외선을 조사하는 방법 또는 N-메틸-N'-니트로소구아니딘 혹은 아질산 등과 같은 화학적 약제의 처리에 의한 방법이 사용될 수도 있다. 이들 방법에 의하면 비-특이적으로 돌연변이를 일으킬 수 있다.
돌연변이 유전자의 선택 방법으로는 우선 DDPS 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터 DNA로 이루어진 재조합 DNA를 직접 하이드록실아민 등으로 돌연변이 처리하고, 이들을 사용하여 예를 들면, 이. 콜라이 W3110 균주를 형질전환시킨다. L-라이신의 유사체로서 S-2-아미노에틸시스테인(AEC)를 함유하는 최소배지, 예를 들면 M9 배지에서 형질전환 균주를 배양한다. 야생형 DDPS 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 갖는 균주는, 이의 재조합 DNA로부터 발현되는 DDPS가 AEC에 의해 억제되기 때문에, L-라이신 및 디아미노피멜산(DAP)의 합성이 불가능하여 생육이 억제 된다. 이에 반해, L-라이신에 의한 억제가 해제된 DDPS 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 지닌 균주는 AEC에 의해 억제되지 않는, 위에서 설명한 재조합 DNA 내에 DDPS 유전자가 암호화하는 돌연변이 효소를 지니므로 AEC가 첨가된 최소배지상에서의 생육이 가능하게 된다. 이 현상을 이용하여 생육시 L-라이신 유사체인 AEC에 내성이 있는 균주, 즉 억제가 해제된 돌연변이 DDPS 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 갖는 균주를 선택할 수 있다.
이와 같이 수득된 돌연변이 유전자를 재조합 DNA로서 적당한 숙주 미생물내에 도입시키고 발현시킴으로써, 피드백 억제가 해제된 DDPS를 갖는 미생물을 수득 할 수 있다. 숙주로서는 에스케리키아 속에 속하는 미생물이 바람직하고, 예를 들어, 이. 콜라이를 들 수 있다.
또한, 재조합 DNA로부터 돌연변이 DDPS 유전자 단편을 취하여, 이를 기타의 벡터 DNA에 삽입할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 벡터 DNA로서는 플라즈미드 벡터 DNA가 바람직하고, 예를 들어 pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 등을 들 수 있다. 파지 DNA 벡터도 또한 사용할 수 있다.
더욱이, 돌연변이 DDPS 유전자를 효율적으로 발현시키기 위해서는, 돌연변이 DDPS를 암호화하는 DNA 서열의 상부에 lac, trp 및 PL 등의 미생물 내에서 작용하는 기타의 프로모터를 연결시킬 수도 있고, DDPS 유전자에 함유된 프로모터를 그대로 또는 증폭시켜 사용할 수도 있다.
또한, 상기와 같이, 돌연변이 유전자를 플라즈미드와 같이 염색체 외의 DNA로서 숙주가 보유할 수 있는 자율복제 가능한 벡터 DNA에 삽입시키고 이것을 숙주에 도입한다. 또는, 돌연변이 유전자를 형질도입, 트랜스포존[참조: Berg, D.E and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417(1983)], Mu 파아지[참조:일본국 특허원 제 2-109985호] 또는 상동성 재조합[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)]을 사용하는 방법으로 숙주 미생물의 염색체에 도입할 수도 있다.
<2>본 발명에서 사용된 돌연변이 아스파르토키나제 III(AKIII)를 암호화하는 DNA
본 발명에서 사용된 돌연변이 AKIII를 암호화하는 DNA는 야생형 AKIII을 암호화하는 DNA에서 암호화 AKIII의 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 것이다. 또한, AKIII의 L-라이신에 의한 피드백 억제를 해제한 돌연변이로서는 서열 목록의 서열확인번호:8에 나타나는 AKIII의 아미노산 서열중 AKIII의 N-말단으로부터(a) 323번 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환된 돌연변이, (b) 323번 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환된 동시에 408번 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환된 돌연변이, (c) 34번 아르기닌 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 동시에 323번 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환된 돌연변이, (d) 325번 루이신 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이, (e) 318번 메티오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환된 돌연변이, (f) 318번 메티오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환된 동시에 349번 발린 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이, (g) 345번 세린 잔기가 루이신 잔기로 치환된 돌연변이, (h) 347번 발린 잔기가 메티오 닌 잔기로 치환된 돌연변이, (i) 352번 트레오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환된 돌연변이, (j) 352번 트레오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환된 동시에 369번 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이, (k) 164번 글루탐산 잔기가 라이신 잔기로 치환된 돌연변이 및 (1) 417번 메티오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환된 동시에 419번 시스테인 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이를 들 수 있다.
야생형 AKIII을 암호화하는 DNA는 특히 제한되지 않지만, 에스케리키아 속 세균, 예를 들면, 이. 콜라이 유래의 AKIII을 암호화하는 DNA를 들 수 있고, 구체적으로는 서열확인번호: 8로 정의되는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA, 및 서열확인번호:7로 정의되는 염기서열 중 염기서열 584번 내지 1930번에서 나타난 서열을 들 수 있다. 이. 콜라이의 AKIII은 lysC 유전자에 의해 암호화된다.
이들 서열에서, 상기 아미노산 잔기의 치환이 일어난 염기서열의 돌연변이를 갖는 것이 본 발명의 돌연변이 AKIII을 암호화하는 DNA이다. 치환된 아미노산 잔기에 대응하는 코돈은 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 것이면 종류에 상관없다. 또한, 세균의 종류 및 균주의 차이에 의한 야생형 AKIII 아미노산 서열에는 약간의 차이는 있다. 이와 같은 효소의 활성에 관여하지 않는 위치에서 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것도 본 발명의 돌연변이 AKIII 유전자에 포함된다. 예를 들면, 후술하는 실시예 2에서 수득된 야생형 lysc 유전자의 염기서열(서열확인번호: 7)은 이미 발표된 이. 콜라이 K-12 JC411 균주의 lysC 서열[참조: Cassan, M., Parsot, C.Cohen, G.N., and Patte,J.C., J.Biol.Chem., 261,1052(1986)]과 여섯 곳에서 상이하고, 이중 2곳에서 암호화된 아미노산 잔기가 상이하다(JC411 균주의 lysC는 서열확인번호: 8에서 나타나는 lysC의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 58번의 글리신 잔기가 시스테인 잔기로, 401번 글리신 잔기가 알라닌 잔기로 치환된다) 이. 콜라이 K-12 JC411 균주의 lysC과 동일한 서열을 갖는 lysC에 있어서도, 상기(a) 내지(l)의 어느 돌연변이를 도입하면 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 lysC를 수득할 수 있을 것으로 예상된다.
L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이 AKIII을 암호화하는 DNA를 취득하는 방법은 하기와 같다. 우선, 야생형 AKIII 유전자 또는 기타의 돌연변이를갖는 AKIII 유전자를 함유하는 DNA를 시험관내 돌연변이 처리하고, 돌연변이 처리 후의 DNA와 숙주에 적응된 벡터 DNA를 연결하여 재조합 DNA를 수득한다. 이 재조합 DNA를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 동 형질전환체중에서 돌연변이 AKIII을 발현시키는 것을 선택하면, 당해 형질전환체는 돌연변이 유전자를 갖고 있다. 또한, 야생형 AKIII 유전자 또는 기타의 돌연변이를 갖는 AKIII 유전자를 함유하는 DNA를 숙주에 적합한 벡터 DNA와 연결하여 재조합 DNA를 수득하고, 이 재조합 DNA를 시험관내 돌연변이 처리하고, 돌연변이 처리후의 재조합 DNA를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 형질전환체중에서 돌연변이 AKIII을 발현하는 것을 선택하여도 당해 형질전환체는 돌연변이 유전자를 갖고 있다.
또는, 야생형 효소를 생산하는 미생물을 돌연변이 처리하여 돌연변이 효소를 생산하는 돌연변이 균주를 제조한 후, 당해 돌연변이 균주로부터 돌연변이 유전자를 취득할 수도 있다. DNA를 직접 돌연변이 처리하기 위한 약제로서는 하이드록실아민 등을 들 수 있다. 하이드록실아민은 사이토신을 N4-하이드록시사이토신으로 변화시킴으로써 사이토신으로부터 티민으로 변화시키는 화학적 돌연변이 처리제이다. 또한, 미생물 자체를 돌연변이 처리하는 경우에는 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 통상적인 인공돌연변이에 사용되는 돌연변이제로 처리한다.
상기 야생형 AKIII 유전자 또는 기타 돌연변이를 갖는 AKIII 유전자를 함유하는 DNA의 공급 미생물로서는 에스케리키아 속에 속하는 미생물이면 어느 것을 사용하여도 상관없다. 구체적으로는 문헌 [참조: Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, 표 1]에 기재된 것을 이용할 수 있다. 예 를 들면, 이. 콜라이 JM109 균주, MC1061 균주 등을 들 수 있다. 이들 균주로부터 AKIII 유전자를 취득하는 경우에, 염색체 DNA의 제조, 염색체 DNA 라이브러리의 작제 등은 상기 DDPS 유전자의 취득과 동일하게 수행될 수 있다. 라이브러리 작제에 사용되는 숙주로서는 AKI, II, III 전체를 결실한 균주, 예를 들면 이. 콜라이 GT3 균주 [이. 콜라이 Genetic Stock Center (미합중국 코넥티컷 주)로부터 입수가능]등을 이용하는 것이 바람직하다.
수득된 염색체 DNA 라이브러리로부터 AKIII 활성이 증대된 균주 또는 영양 요구성이 보상된 균주로 AKIII 유전자의 재조합 DNA를 갖는 세균 균주를 수득한다. 후보 균주로부터 세포 추출액을 제조하고, 이로부터 조 효소액을 제조하여 AKIII 활성을 확인한다. AKIII 효소 활성의 측정법은 스타트만 등의 방법에 의해 수행될 수 있다[참조: Stadtman, E.R., Cohen, G.N., LeBras, G., and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033(1961)].
예를 들면, AK 전체 결실 돌연변이 균주를 숙주로 사용하는 경우는 L-라이신, L-트레오닌, L-메티오닌 및 디아미노피멜산을 함유하지 않는 배지상에서 생육 가능한 형질전환체를 단리하고, 이 세균 균주로부터 재조합 DNA를 회수함으로써 AKIII 유전자를 함유하는 DNA 단편을 수득할 수 있다.
PCR 법에 의해 염색체 DNA로부터 AKIII 유전자를 증폭하는 경우, PCR 반응에서 사용되는 DNA 프라이머는 예를 들면, 이. 콜라이에서 공지된 서열[참조: Cassan, M., Parsot, C.,Cohen, G.N., and Patte, J.C., J.Biol.Chem., 261,1052(1986)]에 기초하여 적절히 제조하지만, lysC 유전자를 암호화하는 1347개의 염기로 이루어진 영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머가 적당하고, 예를 들면, 서열착인번호: 5 및 6의 서열을 갖는 2개의 프라이머가 적당하다.
위와 같이 수득된 AKIII 유전자에 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및 결실 등의 돌연변이를 실시하는 방법으로서는 위에서 기술한 DDPS 유전자의 돌연변이 처리와 동일하게 재조합 PCR 방법, 부위 특이적 돌연변이 방법 등이 있다.
또한, 목적 유전자를 화학 합성하는 방법에 의하면, 목적 부위로 돌연변이 또는 무작위 돌연변이를 도입하는 것이 가능하다.
더욱이, 염색체 혹은 염색체외의 재조합 DNA상의 AKIII 유전자 DNA를 직접 하이드록실아민으로 처리하는 방법[참조: Hashimoto, T. and Sekiguchi,M., J.Bacteriol., 159,1039(1984)]이 있다. 또한, 염색체 또는 염색체 이외의 재조합 DNA 상에 AKIII 유전자를 갖는 에스케리키아 속 세균을 자외선 조사하는 방법, 또는 N-메틸-N'-니트로소구아니딘 혹은 아질산 등의 화학약제로 처리하는 방법을 사 용할 수 있다.
돌연변이 AKIII 유전자의 선택방법으로서는 우선 돌연변이 처리한 AKIII을 함유하는 재조합 DNA로 AK 완전 결실 균주, 예를 들면, 이. 콜라이 GT3 균주를 형질전환시킨다. 이어서, 형질전환된 균주를 상당량의 L-라이신을 함유하는 최소배지, 예를 들어, M9에서 배양한다. 야생형의 AKIII 유전자를 함유하는 재조합 DNA를갖는 균주는 단지 AK가 L-라이신에 의해 억제되기 때문에, L-트레오닌, L-이소루이신, L-메티오닌 및 디아미노피멜산(DAP)이 합성하지 않으며 생육이 억제된다. 이에 반해, L-라이신에 의한 억제가 해제된 돌연변이 AKIII 유전자를 함유하는 재조합 DNA 보유 균주는 상당량의 L-라이신이 첨가된 최소 배지상에서 생육이 가능하게 된다. 이러한 현상을 이용하여, L-라이신 또는 L-라이신 유사체인 AEC에서의 생육에 대해 내성이 있는 균주, 즉 억제가 해제된 돌연변이 AKIII 유전자를 함유하는 재조합 DNA 보유 균주를 선택할 수 있다.
이와 같이 수득된 돌연변이 유전자를 재조합 DNA로서 적당한 미생물(숙주)에 도입하고 발현시킴으로써, 피드백 억제가 해제된 AKIII을 갖는 미생물을 수득할 수 있다. 숙주로서는 에스케리키아 속에 속하는 미생물이 바람직하고, 이. 콜라이를 예로 들 수 있다.
이와 달리, 재조합 DNA로부터 돌연변이 AKIII 유전자 단편을 취득하여, 다른 벡터 DNA에 삽입하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 벡터 DNA로서는 플라즈미드 벡터 DNA가 바람직하고, 예를 들어, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 및 pMW218 등을 들 수 있다. 이외에 기타 파아지 DNA의 벡터도 이용될 수 있다.
더욱이, 돌연변이 AKIII 유전자를 효율적으로 발현시키기 위해서, 돌연변이 AKIII를 암호화하는 DNA 서열상의 상부에 미생물에서 작용하는 lac, trp, PL 등의 프로모터를 연결시킬 수도 있고, AKIII 유전자에 함유된 프로모터를 그대로 또는 증폭시켜 사용할 수도 있다.
또한, 상기와 같이, 돌연변이 유전자를 플라즈미드와 같은 염색체외의 DNA로서 숙주가 보유할 수 있는 자율 복제가능한 벡터 DNA에 삽입시키고, 이것을 숙주에 도입한다. 또는, 돌연변이 유전자를 형질도입, 트랜스포존[참조: Berg,D.E. and Berg,C.M., Bio/Technol., 1,417(1983)], Mu 파아지[참조: 일본국 특허원 제(평)2-109985호] 또는 상동성 재조합[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)]을 사용하는 방법으로 숙주 미생물의 염색체에 도입할 수도 있다.
<3>본 발명에 의한 L-라이신의 제조
상기와 같이 수득된 돌연변이 DDPS 유전자를 도입함으로써 형질전환시키고, 또한 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 AK를 갖는 에스케리키아 속 세균을 적당한 배지중에 배양하여 배양물중에 L-라이신을 생산축적시키고, 배양물로부터 L-라이신을 채취함으로써 L-라이신을 효율적으로 제조할 수 있다. 즉, 돌연변이 DDPS와 돌연변이 AKIII 둘다를 에스케리키아 속 세균내에 가지게 함으로써 L-라이신을 효율적으로 제조할 수 있다.
L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 AK를 보유하는 에스케리키아 속 세균으로서는 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 AKIII을 암호화하는 DNA가 염색체 DNA에 도입됨으로써 형질전환된 에스케리키아 속 세균, 또는 DNA와 에스케리키아 속 세균 세포중에서 자율 복제가능한 벡터 DNA를 연결시킨 재조합 DNA가 세포내에 도입됨으로써 형질전환된 에스케리키아 속 세균을 들 수 있다. 또한, L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 AK는 L-라이신에 의한 피드백 억제를 받지않는 야생형 AK일 수 있고, 이와 같은 야생형 AK 유전자를 동일하게 하여 에스케리키아 속에 도입시킨 것 일 수도 있다. 또한, 에스케리키아 속 세균 세포를 돌연변이 처리함으로써 돌연변이 AKIII을 생산하게 된 에스케리키아 속 세균 돌연변이체일 수도 있다.
한편, 돌연변이 DDPS 유전자를 에스케리키아 속 세균에 도입하여 형질전환시키기 위해서는 돌연변이 DDPS 유전자를 염색체 DNA에 삽입하여 형질전환시킬 수 있고, 돌연변이 DDPS 유전자와 에스케리키아 속 세균 세포 중에서 자율 복제가능한 벡터 DNA를 연결한 재조합 DNA를 세포 내에 도입함으로써 형질전환시킬 수도 있다.
돌연변이 DDPS 유전자 및 돌연변이 AKIII 유전자 모두를 에스케리키아 속 세균에 도입하는 경우에는 양자의 돌연변이 유전자가 에스케리키아 속 세균의 염색체 DNA상에 삽입되어 보유될 수도 있고, 세포 내에서 동일한 또는 상이한 플라즈미드 상에 염색체외 DNA로서 유지될 수 있다. 상이한 플라즈미드를 사용하는 경우, 각 플라즈미드가 세포내에서 온전히 유지될 수 있는 안정된 분배 메카니즘을 갖는 플라즈미드를 사용하는 것이 바람직하다. 게다가, 이들 돌연변이 유전자 중 하나는 염색체 DNA 상에 삽입되어 유지될 수 있고, 다른 하나는 염색체외 DNA로서 세포내 플라즈미드 상에 유지될 수 있다. 돌연변이 DDPS 유전자 및 돌연변이 AKIII 유전자를 에스케리키아 속 세균에 도입하는 경우에, 양 유전자의 도입 순서는 무관하다.
돌연변이 DDPS 유전자 및 돌연변이 AKIII 유전자를 도입시킨 에스케리키아속 세균의 디하이드로피콜리네이트 환원효소 유전자를 증강시켜 L-라이신의 생산성을 더 향상시킬 수 있다. 디하이드로피콜리네이트 환원효소 유전자가 증강된 에스케리키아 속 세균에 코리네형 세균 유래의 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 유전자를 도입함으로써 L-라이신 생산성을 더 향상시킬 수 있다. 이 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 유전자를 증강시킬 필요성이 있다. 이와 달리, 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 유전자를 도입하는 대신에 테트라하이드로디피콜리네이트 석시닐라제 유전자 및 석시닐디아미노피멜레이트 데아실라제 유전자를 증강시킴으로써 유사한 정도로 L-라이신의 생산성을 향상시킬 수 있다.
여기에, 유전자의 증강이란 유전자의 발현산물인 효소의 세포당 활성을 증강시키는 것을 의미한다. 구체적으로는, 예를 들면, 유전자의 세포내 복제수를 높이는 것, 발현 효율이 높은 프로모터를 사용하여 유전자당 발현량을 높이는 것, 효소 활성을 높이는 돌연변이를 유전자에 도입하는 것 등을 들 수 있다. 세포내의 유전자의 복제수를 높이기 위해서는, 에스케리키아 속 세균내에서 자율 복제가능한 벡터에 당해 유전자를 삽입하고, 이 벡터로 에스케리키아 속 세균을 형질전환시키면 된다. 이 벡터는 다복제형 플라즈미드인 것이 바람직하다. 또는, Mu 파아지 등을 사용하여 염색체 DNA에 도입시킨 DNA를 증폭시킴으로써 복제수를 증가시킬 수 있다. 플라즈미드를 사용하는 경우, 이들의 플라즈미드를 세포내에 함께 안정하게 유지시키는 안정한 분배 기작을 갖는 플라즈미드를 사용하는 것이 바람직하다. 각 유전자의 도입 순서는 무관하다.
상기와 같이 L-라이신 생합성계 유전자를 순차적으로 증강시킴으로써 L-라이신 생산성을 단계적으로 향상시킬 수 있는 매카니즘을 하기에 설명한다. 복수반응으로 이루어진 생합성계는 직렬로 연결된 두께가 상이한 복수의 파이프를 흐르는액체에 비교할 수 있다. 여기서, 각각의 파이프는 개개의 효소에 상당하고, 이의 파이프 두께는 효소반응 속도에 상당한다. 파이프를 흐르는 액체의 양을 증가시키 는 위해서는 가장 가는 파이프의 두께를 두껍게 하는 것이 효율적이다. 또한, 두꺼운 파이프를 두껍게 하여도 효과는 기대되지 않는다. 또한, 유량을 증가시키기 위해서는 2번째로 가는 파이프를 두껍게 하는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 이와 같은 관점에서 L-라이신 생합성계를 강화시키기 위해 노력하였다. 이로 인하여 후술하는 실시예 6에 나타난 바와 같이, 이. 콜라이에 이. 콜라이 유래의 L-라이신 생합성계 유전자를 단계적으로 도입하는 것에 의해 L-라이신 생합성계의 속도 결정단계의 순서를 판명했다. 이 경우, 생합성계의 하류에 위치한 dapC(석시닐디아미노피멜레이트 트랜스아미나제 유전자), dapD(테트라하이드로디피콜리네이트 석시닐라제 유전자), dapE(석시닐디아미노피멜레이트 데아실라제 유전자) 및 dapF(디아미노피멜레이트 에피머라제 유전자) 등 4개의 유전자를 이들 유전자 산물에 의해 반응이 촉매될 수 있는 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 DDH(디아미노피멜레이트 데하이드로게나제)를 암호화하는 유전자 DDH로 대체한다. 즉, 도입된 L-라이신 생합성계 효소 유전자와 이들이 암호화하는 효소는 하기와 같다.
ppc: 포스포에놀피루베이트 카복실라제
aspC: 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제
lysC: 아스파르토키나제 III
lycC*: 억제-헤제된 아스파르토키나제 III
asd: 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제
dapA: 디하이드로디피콜리네이트 신타제
dapA*: 억제-해제된 디하이드로디피콜리네이트 신타제
dapB: 디하이드로디피콜리네이트 환원효소
DDH: 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제
(브레비박테리움 락토퍼멘툼에서 유래됨)
lysA: 디아미노피멜레이트 데카복실라제
이. 콜라이에 각 유전자를 별개로 도입한 결과, lysC*, dapA 또는 dapA*를 도입한 균주에서 L-라이신 산물이 확인되었고, dapA*도입균주가 가장 높은 L-라이신 생산량을 나타내었다. 이 결과로부터 dapA가 촉매인 반응이 제1 속도 결정 단계인 것을 알 수 있었다. 이어서, dapA*도입균주에 각 L-라이신 생합성계 유전자를 도입하면, lysC*이 L-라이신 생산성 향상에 가장 효과가 있어서 lysC가 제2 속도 결정 단계임을 알수 있었다. 이와 동일하게, dapB가 촉매하는 반응이 제3 속도 결정 단계이고, DDH가 촉매하는 반응이 제4 속도 결정 단계임을 알 수 있었다. 또한, DDH로 대체된 dapC, dapD, dapE 및 dapF에 의한 반응간의 속도 결정 단계를 조사한 결과, dapD 및 dapE가 속도 결정에 관여하는 것을 알았다.
하기에 이. 콜라이의 L-라이신 생합성계 유전자 및 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 DDH 유전자의 수득법을 예시한다.
ppc 유전자는 이 유전자를 갖는 플라즈미드 pS2 [참조: Sabe,H. et al., Gene,31,279(1984)], 또는 pT2로부터 수득될 수 있다. pS2를 Aatll 및 AflII로 절단하여 ppc 유전자를 갖는 DNA 단편을 수득할 수 있다. 또한, pT2를 SmaI과 ScaI으로 절단하여 ppc 유전자를 갖는 DNA 단편을 수득할 수 있다. pT2를 갖는 이. 콜라이 F15 균주(AJ12873)는 공업기술원 생명공학공업기술연구소(우편번호 305, 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-3)에 수탁번호 FERM BP-4732로 부다페스트 조약에 근거하여 국제기탁되어 있다.
aspC 유전자는 이 유전자를 갖는 플라즈미드 pLF4 [참조: Inokuchi, K. et al., Nucleic Acids Res., 10 6957(1982)]로부터 수득될 수 있다. pLF4를 PvuII와 StuI으로 절단하여 aspC 유전자를 갖는 DNA 단편을 수득할 수 있다.
asd 유전자는 이 유전자를 갖는 플라즈미드 pAD20 [참조: Haziza,C. et al., EMBO, 1, 379(1982)]로부터 수득될 수 있다. pAD20을 Ase I과 Cla I으로 절단하여 asd 유전자를 갖는 DNA 단편을 수득할 수 있다.
dapB 유전자는 이미 공지된 dapB 유전자의 뉴클레오타이드 서열[참조: Bouvier, J. et al., J.Biol, Chem., 259, 14829(1984)]를 기초로 하여 작성한 2 종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열확인번호: 9 및 10)을 사용하는 PCR 방법에 의해 이. 콜라이 염색체 DNA를 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
DDH 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 DDH 유전자의 공지된 뉴클레오타이드 서열[참조: Ishino,S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917(1987)]을 기초로 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예: 서열확인번호: 11 및 12)를 사용하는 PCR 방법에 의해 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 염색체 DNA를 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
lysA 유전자는 공지된 lysA 유전자의 뉴클레오타이드 서열[참조: Stragier,P. et al., J.Mol. Biol., 168, 321(1983)]를 기초로 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예: 서열확인번호: 13 및 14)를 사용한 PCR 방법에 의해 이. 콜라이의 염색체 DNA를 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
dapD 유전자는 공지된 dapD 유전자의 뉴클레오타이드 서열[참조: Richaud,C. et al., J.Biol. Chem., 259. 14824(1984)]를 기초로 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예: 서열확인번호: 15 및 16)를 사용한 PCR 방법에 의해 이. 콜라이 W3110 균주의 염색체 DNA를 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
dapE 유전자는 공지된 dapE 유전자의 뉴클레오타이드 서열[참조: Bouvier, J. et al., J.Bacteriol., 174, 5265(1992)]를 기초로 작성한 2종류의 올리고뉴클 레오타이드 프라이머(예: 서열확인번호: 17 및 18)를 사용한 PCR 방법에 의해 이. 콜라이 DNA를 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
dapF 유전자는 공지된 dapF 유전자의 뉴클레오타이드 서열[참조: Richaud, C. et al., Nucleic Acid Res., 16, 10367(1988)]를 기초로 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예: 서열확인번호: 19 및 20)를 사용한 PCR 방법에 의해 이. 콜라이 염색체 DNA를 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 숙주로서 사용되는 에스케리키아 속 세균으로서는 이의 세포 내에서 돌연변이 DDPS 유전자 및 AKIII 유전자, 또는 기타의 L-라이신 생합성계 유전자 또는 이들의 유전자를 발현시키기 위한 기타의 프로모터가 기능하고, 또한 돌연변이 DDPS 유전자, 돌연변이 AKIII 유전자, 또는 기타의 L-라이신 생합성계 유전자를 기타의 플라즈미드 상에 염색체외 DNA로서 도입하는 경우에 도입에 사용되는 벡터 DNA의 복제기점이 세포 내에서 기능하여 복제가능한 것이면 이용가능하다.
예를 들면, L-라이신을 생산하는 이. 콜라이, 구체적으로는 L-라이신 유사체에 대해 내성을 갖는 돌연변이 균주가 예시될 수 있다. 이러한 L-라이신 유사체는 에스케리키아 속 세균의 증식을 억제하는 것이지만, L-라이신이 배지 중에 공존하면 이의 억제가 전체적 또는 부분적으로 해제된 것과 같은 것이다. 예를 들면, 옥살라이신, 라이신 하이드록사메이트, AEC,r-메틸라이신,α-클로로카프로락탐 등과 같은 것이 있다. 이들 라이신 유사체에 대한 내성을 갖는 돌연변이 균주는 통상적인 인공돌연변이 조작을 에스케리키아 속 미생물에서 실시함으로써 수득된다. L-라이신 제조에 이용되는 세균 균주로서는 구체적으로는 에스케리키아 콜라이 AJl1442(FERM, BP-1543 및 NRRL B-12185로 수탁됨. 참조: 일본국 특허원 제 56-18596호 및 미합중국 특허원 제4,346,170호)을 들 수 있다. 상기 미생물의 아스파르토키나제는 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제되어 있다.
이외에도, 예를 들면 L-트레오닌을 생산하는 균주를 들 수 있는데, 왜냐하면 L-트레오닌-생산 균주에서도 일반적으로는 L-라이신에 의한 아스파르토키나제의 억제가 해재되어 있기 때문이다. 이. 콜라이에 속하는 L-트레오닌-생산 균주로서는 B-3996 균주가 현재 공지되어 있는 것 중에는 가장 높은 생산성을 갖고 있다. B-3996 균주는 기관[Research Institute for Genetics and Industrial MicroorganismBreeding]에 등륵번호 RIA 1867로 기탁되어 있다.
본 발명에 의한 돌연변이 유전자를 갖는 형질전환체의 배양에 사용하는 배지는 탄소원, 질소원, 무기이온 및 임의로 기타의 유기 성분을 함유하는 통상의 배지이다. 탄소원으로서는 글루코즈, 락토즈, 갈락토즈, 프럭토즈 또는 전분 하이드롤리세이트와 같은 당류; 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 알콜; 또는 푸마르산, 시트르산 또는 석신산과 같은 유기산을 사용할 수 있다.
질소원으로서는 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드 또는 암모늄 포스페이트와 같은 무기 암모늄염; 대두 가수분해물 등의 유기질소; 암모니아 기체 또는 암모니아 수 등을 사용할 수 있다.
유기 미량 영양원으로서는 비타민 B1, L-이소루이신 등의 요구물질 또는 효모추출액 등을 적당량 함유할 수 있다. 이외에, 필요한 경우에는 칼륨 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 철 이온, 망간 이온 등을 소량 첨가할 수 있다.
배양은 호기성 조건하에서 16 내지 72시간 실시하는 것이 바람직하며, 배양 온도는 25℃ 내지 45℃로, 배양시의 pH는 5 내지 8로 조절한다. pH 조절에는 무기 또는 유기 산성 또는 알칼리성 물질 또는 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다.
발효액으로부터 L-라이신을 통상적인 이온 교환 수지법, 침지법 이외의 기타 공지된 방법을 조합함으로써 실시할 수 있다.
제1도는 pdapA1과 pdapA2의 제조공정을 도시한 도면이다.
제2도는 야생형 및 돌연변이 DDPS의 L-라이신에 의한 억제를 도시한 도면이다.
제3도는 이중 돌연변이 dpaA*유전자를 갖는 플라즈미드 pdapAS824의 제조공정을 도시한 도면이다.
제4도는 pLYSC1과 pLYSC2의 제조공정을 도시한 도면이다.
제5도는 하이드록실아민 처리후 형질전환체의 출현율과 돌연변이율을 도시한 도면이다.
제6도는 야생형 및 돌연변이 AKIII의 L-라이신에 의한 억제를 도시한 도면이다.
제7도는 dapA*24를 갖는 RSF1010 유래의 플라즈미드 RSF24P의 제조공정을 도시한 도면이다.
제8도는 플라즈미드 pLLC*80의 제조공정을 도시한 도면이다.
제9도는 dapA*24 및 lysC*80을 갖는 RSF1010 유래의 플라즈미드 RSFD80의 제조공정을 도시한 도면이다.
제10도는 dapA 및 dapA*를 가진 플라즈미드 pdapA 및 pdapA*의 구조를 도시한 도면이다.
제11도는 lysC 및 lysC*80을 갖는 플라즈미드 plysC 및 plysC*의 구조를 도시한 도면이다.
제12도는 ppc를 갖는 플라즈미드 pppc의 구조를 도시한 것이다.
제13도는 aspC를 갖는 플라즈미드 paspC의 구조를 도시한 것이다.
제14도는 asd를 갖는 플라즈미드 pasd의 구조를 도시한 것이다.
제15도는 dapB를 갖는 플라즈미드 pdapB의 구조를 도시한 것이다.
제16도는 DDH를 갖는 플라즈미드 pDDH의 구조를 도시한 것이다.
제17도는 lysA를 갖는 플라즈미드 plysA의 구조를 도시한 것이다.
제18도는 dpaA*24, lysC*80 및 dapB을 갖는 RSF1010 유래의 플라즈미드 pCAB1의 제조공정을 도시한 도면이다.
제19도는 dapA*24, lysC*80, dapB 및 DDH를 갖는 RSF1010 유래의 플라즈미드 pCABD2의 제조공정을 도시한 도면이다.
제20도는 dapD를 갖는 플라즈미드 pdapD의 구조를 도시한 도면이다.
제21도는 dapE를 갖는 플라즈미드 pdapE의 구조를 도시한 도면이다.
제22도는 dapF를 갖는 플라즈미드 pdapF의 구조를 도시한 도면이다.
제23도는 dapD 및 dapE를 갖는 플라즈미드 pMWdapDE1의 제조공정을 도시한 도면이다.
제24도는 dpaA*24, lysC*80, dapB, dapD 및 dapE를 갖는 플라즈미드 pCABDE1의 제조공정을 도시한 도면이다.
발명의 실시하기 위한 최선의 실시양태
하기에 실시예를 통해 본 발명을 더 구체적으로 설명한다.
실시예 1: 돌연변이 DDPS 유전자의 제조
<1> 야생형 dapA 유전자의 클로닝
이. 콜라이 dapA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 이미 공지되어 있고 [참조: Richaud,F. et al., J.Bacteriol., 297(1986)], 이의 개방 판독 프레임(ORF)은 867개의 염기쌍을 포함하여 292개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질을 암호화하는 것으로 알려져 있다. 이 dapA 유전자가 어떻게 조절되고 있는 가는 불분명하기 때문에, 프로모터 영역을 제거하고 SD 서열과 ORF만을 함유하는 영역을 PCR 방법을 사용하여 증폭하여 클로닝하기로 한다.
이. 콜라이 K-12 MC1061 균주의 전체 게놈 DNA를 사이토 및 미우라 방법 [참조: Biochem, Biophys Acta., 72, 619(1963)]으로 회수하고, 서열확인번호: 1 및 2에 나타난 서열을 갖는 2종류의 프로모터를 작제하고, 이를 이용하여 에를리히 방법[참조: PCR Technology, Stockton press(1989)]에 따라 PCR 반응을 수행하고, 목적 DNA를 증폭한다. 수득된 DNA를 시판 PCR 단편용 클로닝 벡터 pCR1000 [Invitrogen Ltd.(미합중국 캘리포니아주)로부터 구입 가능]에 삽입한다. pCR1000은 lacZ 프로모터(Placz)를 함유하고 있고, lacZ 프로모터의 하부의 부위에서 절단된 상태로 시판되고 있다. 이 pCR1000 양 절단 말단에 PCR 단편을 연결하여 수득된 재조합 DNA를 이. 콜라이에 도입하면 lacZ 프로모터 억제하에서 PCR 단편을 전사할 수 있다. PCR 단편을 PCR1000에 연결하는 경우, 이 lacZ 프로모터에 의한 전사 방향에 대하여 dapA의 전사 방향이 정방향이 되도록 연결된 플라즈미드로서 pdapA1,역방향이 되도록 연결된 플라즈미드로서 pdapA2인 2 종류의 플라즈미드를 수득한다(제1도).
이들 플라즈미드를 DDPS 결실 균주인 이. 콜라이 JE7627에 도입하는 경우, 플라즈미드를 도입한 균주는 숙주인 JE7627의 디아미노피멜산의 요구성이 보상된다. 그러므로, 양 플라즈미드에 삽입된 DNA 단편은 활성 DDPS를 암호화하는 유전자 dapA를 함유하는 것으로 확인된다.
pdapA1을 야생형 이. 콜라이 W3110 균주(일본국 시즈오카켄 미시마시)에 도입하여 수득된 형질전환 균주를 W3110/pdapA1로, 이. 콜라이 W3110 균주에 도입하여 수득된 형질전환 균주를 W3110/pdapA2로 각각 명명한다. 그래서, 하기의 조성을 갖는 최소배지 M9에 라이신의 유사체인 AEC를 첨가하고, 이들 2종류의 형질전환 균주를 각각 배양한다. 대조군으로서 플라즈미드를 도입하지 않은 W3110 균주도 동일 배지에 배양한다. 2종류의 형질전환 균주도 플라즈미드를 갖지 않은 W3110 균주도 AEC에 의해 생육이 억제되지만, 이 생육의 억제는 L-라이신의 첨가에 의해 회복되 었다.
(최소 배지 M9)
상기 A, B, C 및 D는 별개로 멸균되고, A:B:C:D:물=5:0.1:1:0.1:95의 비율로 혼합된다.
<2> 돌연변이 DDPS 유전자(dapA*)의 제조
L-라이신에 의한 억제가 해제된 DDPS를 암호화하는 dapA*를 함유하는 플라즈미드 보유 균주는 상당한 양의 AEC가 첨가된 최소배지 M9상에서 생육이 가능하게 될 것으로 예상되고, AEC에 내성이어서 생육하는 균주를 선택함으로써 daPA*를 함유하는 플라즈미드 보유 균주를 선별한다.
dapA*를 효율적으로 취득하기 위해서는 <1>에서 작제한 pdapA1 및 pdapA2상의 dapA에 돌연변이 처리를 수행한다.
(1-2-1) dapA*를 함유하는 플라즈미드 보유 균주의 선택 조건의 검토
상기에서 수득한 W3110/pdapA1 균주 및 W3110/pdapA2 균주를 각각 다양한 농도의 AEC를 함유하는 M9 한천 평판 배지 상에서 배양한다. 그리고, AEC에 의한 생육 억제 농도를 비교하여, dapA*를 함유하는 플라즈미드 보유 균주의 선택조건을 검토한다.
다양한 농도로 AEC를 함유하는 M9 배지에서의 형질전환 균주의 생육을 표 1에 나타낸다. 표에서 +는 형질전환 균주가 생육하는 것을 나타내고, -는 생육하지 않음을 나타낸다.
pdapA1상의 dapA 유전자의 전사 방향은 lacZ 프로모터에 의한 전사 방향과 일치한다(제 1도). 따라서, 발현양이 lacZ 프로모터에 의해 증폭되므로, pdapA1상의 dapA가 야생형인 경우에도 상당히 고농도의 AEC에 대해 내성이 있으나, pdapA2상의 dapA 유전자는 전사 방향이 lacZ 프로모터에 대하여 역방향이고 dapA 자신의 프로모터도 결실되어 있기 때문에, 발현양이 적고 보다 저농도의 AEC에서 생육이 억제되는 것으로 이해되었다(W3110/pdapA1 균주에서는 30mM, W3110/pdapA2 균주는 15mM의 첨가시에 생육이 억제되었다). 또한, 이러한 생육 억제는 L-라이신의 동시 첨가에 의해 제거되는 것이 확인되었다.
따라서, 돌연변이 도입 대상에는 pdapA2를 사용하고, 최소배지 M9에 AEC 60mM를 첨가한 배지를 dapA*을 함유하는 플라즈미드 보유 균주의 선별에 사용하며, 하기의 실시예 1에 있어서 이러한 배지를 '선택 배지'로 일컫는다.
(1-2-2) 하이드록실아민에 의한 pdapA2의 시험관내 돌연변이 처리
pdapA2 플라즈미드 내로의 돌연변이 도입에는 플라즈미드를 하이드록실아민으로 직접 처리하는 시험관내 돌연변이 처리법을 사용한다.
DNA 2㎍을 0.4M 하이드록실아민[0.1M KH2P04-1mM EDTA(pH6.0) 100㎕, 1M 하이드록실아민-1mM EDTA(pH6.0) 80㎕, DNA 2㎍, 물을 첨가하여 총 200㎕로 한다]중에서 75℃에서 1 내지 4시간 동안 처리한다. 처리후의 DNA를 유리분말로 정제한 후, 이. 콜라이 W3110에 도입하고, 완전배지(L-육즙:1% 박토 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 1.5% 한천)상에 스프래딩하여 콜로니를 형성시킨다. 이들을(1-2-1)에서 서술된 선택 배지에 레플리카시키고, 선택배지 상에서 콜로니를 형성하는 것을 선택한다. 2번의 실험에서 합계 36개의 균주의 돌연변이 플라즈미드의 후보를 수득한다.
이와 같이 수득된 후보 균주의 총 36개 균주를 다시 선택배지에 스폿팅하여 AEC 내성을 확인한다.
(1-2-3) dapA*유전자의 단리 및 dapA*산물의 검토
상기 36개의 균주로부터 돌연변이 pdapA2를 회수하고, 이들과 야생형 pdapA2 각각으로 dapA 결실 균주 JE7627을 형질전환시켜, 각각의 형질전환 균주로부터 세포 유리된 추출액을 제조하고, DDPS의 효소 활성을 측정한다.
세포 유리된 추출액(조 효소액)은 하기와 같이 제조한다. 형질전환 균주를 2x TY배지(1.6% 박토 트립톤, 1% 효모 추출액, 0.5%, NaCl)에서 배양하고, 600nm에서 광학밀도(OD660) 약 0.8에서 수거한다. 세포 펠렛을 0℃의 조건하에서, 0.85% NaCl로 세정하고, 400mM KCl을 함유하는 20mM 칼륨 포스페이트 완충액(pH7.5)에 현탁하고, 초음파 처리(0℃, 200W, 10분)하여 균체를 파쇄한다. 파쇄된 세포 용액을 0℃에서 1시간동안 33krpm으로 원심분리하여 상청액을 취한 후, 이에 80% 포화가 되도록 황산 암모늄을 첨가하여 0℃에서 하룻밤 보존한 후 원심분리시키고, 펠렛을 20mM 칼륨 포스페이트 완충액(pH7.5) 400mM KCl에 용해시킨다.
DDPS 효소활성의 측정은 유가리 방법 [참조: Yugari, Y. and Gilvarg, C., J. Biol. Chem., 240, 4170(1962)]로 수행한다. 즉, 하기 조성의 반응액의 흡광도를 37℃에서 분광광도계로 270nm의 파장에서 시간에 따라 측정하고, 생성된 디하이 드로디피콜리네이트를 측정한다. 블랭크로서는 반응계로부터 나트륨 피루베이트를 제외한 것으로 한다.
(반응액 조성)
50mM 이미다졸-HCl pH7.4
20mM L-아스파르테이트 세미알데히드
20mM 나트륨 피루베이트
효소 용액
물(발란스)
총 1.0ml
DDPS 효소 활성을 측정하는 경우, 효소 반응액 중에 다양한 농도의 L-라이신을 첨가하고, L-라이신에 의한 억제도를 측정한다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 야생형 DDPS는 L-라이신에 의해 억제된다. 야생형에 비해 L-라이신에 의한 억제를 받지 않는 DDPS를 갖는 형질전환 균주 유래의 돌연변이 플라즈미드는 후보 플라즈미드 36 종류 중에서 3 종류이다. 이들을 각각 pdapAS8, pdapAS9 및 pdapAS24로 명명한다. 뉴클레오타이드 서열을 다음과 같이 결정함에 따라, pdapAS8 및 pdapAS9가 동일한 돌연변이를 갖는 것이 판명되었다.
pdapAS8, pdapAS9 및 pdapAS24에 의해 암호화되는 3 종류의 돌연변이 DDPS의 L-라이신에 의한 억제의 해제 정도는 다양하지만, 3 종류 모두 L-라이신에 의한 억제가 해제되어 있다. 효소의 비활성(specific activity)은 균체의 생육 상황 및 시료의 제조에 의해 영향받지만, 모두 야생형보다 약간 저하된다. 그러나, 종균 배양용 물질로서는 실질적으로 문제가 없는 정도인 것으로 판명되었다.
(1-2-4) 돌연변이 dapA 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 결정
DNA 서열기 ABI 모델 373A(Applied Biosystem사 제조)를 사용하여 통상적인 방법에 따라 돌연변이 dapA 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정한다. 이 결과, 서열확인번호:3에 나타나는 야생형 dapA 유전자의 서열상에서 pdapAS8 및 pdapAS9는 487번의 C가 T로, pdapAS24는 597번 C가 T로 변화된 것이 밝혀졌다. 따라서, 서열확인번호:4에 나타나는 DDPS의 아미노산 서열에 있어서, pdapAS8 및 pdapAS9가 암호화하는 DDPS에서 81번 알라닌 잔기가 발린 잔기로, pdapAS24가 암호화하는 DDPS에서 118번 히스티딘 잔기가 타이로신 잔기로 변화된 것으로 밝혀졌다.
(1-2-5) 이중 돌연변이 dapA의 작제
상술된 바와 같이, 2 종류의 돌연변이 dapA 유전자를 수득할 수 있다. 이들 돌연변이에 있어서, 억제의 해제가 부가적으로 작용하는가를 검토하기 위해, 2개의 돌연변이를 동시에 갖는 돌연변이 dapA를 함유하는 플라즈미드를 제조한다. 제조 순서는 제 3도에 나타난 바와 같다. 수득된 이중 돌연변이를 갖는 플라즈미드를 pdapAS824로 명명한다.
실시예 2: 돌연변이 AKIII 유전자의 제조
<1> 야생형 lysC 유전자의 클로닝
이. 콜라이의 AKIII 유전자(lysC)의 뉴클레오타이드 서열은 이미 보고되어 있고[참조: Casan, M., Parsot, C., Cohen, G.N,, and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986)], 이의 개방 판독 프레임(ORF)은 1347개 염기쌍을 포함하고, 449개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질을 암호화하는 것으로 공지되어 있다. 이들 유전자에는 작동 유전자(Operator)가 존재하고, 이는 L-라이신에 의해 억제를 받는다. 이 작동유전자 영역을 제거하기 위해, SD 서열과 0RF만을 함유하는 영역을 PCR법을 사용하여 증폭하고 클로닝한다.
이. 콜라이 K-12 MC1061 균주의 전체 게놈 DNA를 사이토와 미우라의 방법 [참조: Biochem, Biophys, Acta., 72, 619(1963)]에 의해 조절하고, 서열확인번 호:5 및 6에 나타나는 서열을 갖는 2 종류의 플라즈미드를 작제하고, 이들을 사용 하여 에를리히 방법[참조: PCR Technology, Stockton press(1989)에 따라서 PCR 반응을 수행하여 lysC 유전자를 증폭시킨다. 수득된 DNA를 BamHI과 AseI으로 절단시켜 평활말단을 만들고, 다복제 벡터 pUC18의 SmaI 부위에 삽입한다. 이 SmaI 부위는 벡터내에 존재하는 lacZ 프로모터의 하부에 위치하고, pUC18의 SmaI 부위에 DNA 단편을 삽입하여 수득된 재조합 DNA를 이. 콜라이에 도입하면 lacZ 프로모터 조절에 의한 판독을 통한(Reading-through) 전사에 의해 삽입된 DNA 단편이 전사된다. pUC18의 SmaI 부위내로 PCR 단편의 삽입시, lacZ 프로모터에 의한 전사방향에 대하여 lysC의 전사 방향이 역방향으로 되도록 도입된 플라즈미드로서 pLYSC1 및 정방향으로 삽입된 플라즈미드로서 pLYSC2의 2 종류의 플라즈미드를 수득한다(제 4도).
이들 플라즈미드로 AK I, II III 전체 결실 균주인 이. 콜라이 GT3(thrA1016b, metLM1005, lysC1004)를 형질전환시키는 경우, GT3의 호모세린 및 디아미노피멜산의 영양요구체가 보상된다. 따라서, 이로부터 양 플라즈미드에 삽입된 DNA 단편은 활성 AKIII을 암호화하는 유전자 lysC를 함유하는 것을 확인할 수 있다.
pLYSC1을 AK 완전 결실 균주 이. 콜라이 GT3에 도입하여 수득된 형질전환 균주를 GTB/pLYSC1로 명명하고, pLYSC2를 이. 콜라이 GT3에 도입하여 수득된 형질전환 균주를 GT3/pLYSC2 균주로 명명한다. 최소 배지 M9에 상당량의 L-라이신을 첨가하고, GT3/pLYSC1 균주 및 GT3/pLYSC2 균주를 각각 배양한다. GT3/pLYSC1 균주 및 GT3/pLYSC2 균주는 모두 야생형 lysC를 함유하는 플라즈미드를 보유하고, 이 플라즈미드상의 lysC에 의해 암호화된 AKIII은 유일한 AK이다. 상당량의 L-라이신 존재하에서 유일한 AK로서의 야생형 AKIII이 L-라이신에 의해 억제되기 때문에, 양 균주 모두 L-트레오닌, L-이소루이신, L-메티오닌 및 디아미노피멜산(DAP)을 합성 할 수 없고 생육이 억제되었다.
<2> 돌연변이 AKIII 유전자(lysC*)의 제조
L-라이신에 의한 억제가 해제된 AK를 암호화하는 lysC*를 함유하는 플라즈미드 보유 균주는 상당량의 L-라이신이 첨가된 최소배지 M9상에서 생육이 가능한 것으로 예상되고, 생육이 L-라이신 또는 L-라이신의 유사체인 AEC에 내성인 균주를 선택함으로써 lysC*을 함유하는 플라즈미드 보유 균주를 선택한다.
lysC*를 효을적으로 취득하기 위해 <1>에서 작제한 pLYSC1 및 pLYSC2상의 lysC에 돌연변이 처리를 한다.
(2-2-1) lysC*를 함유하는 플라즈미드 보유 균주의 선택조건의 검토
GT3/pLYSC1 균주 및 GT3/pLYSC2 균주를 각각 각종 농도의 L-라이신 또는 AEC를 함유하는 M9 한천 평판 배지 상에서 배양한다. 그리고, L-라이신 또는 AEC에 의한 생육 억제 농도를 시험하고, lysC*를 함유하는 플라즈미드 보유 균주의 선택 조건의 검토를 수행한다. 각종 농도의 L-라이신 또는 AEC를 함유하는 M9 배지에서의 형질전환체 생육을 표 2에 나타내었다. 표에서 +는 형질전환 균주가 생육하는 것을 나타내고, ± 는 약간 생육한 것을 나타내고, -는 생육하지 않은 것을 나타낸다.
pLYSC2상의 lysC 유전자의 전사 방향은 lacZ 프로모터에 의한 전사 방향과 일치한다(제 4도). 따라서, pLYSC2상의 lysC 유전자는 lacZ 프로모터에 의해 발현량이 증가되므로 lysC가 야생형인 경우에도 상당히 고농도의 L-라이신 및 AEC에 대해 내성을 나타내나, pLYSC1상의 lysC 유전자는 적은 양만이 발현되고 낮은 농도의 L-라이신 또는 AEC에 의해서도 생육이 억제되는 데, 이는 전사 방향이 lacZ 프로모터에 대해 역방향이며 프로모터 자체도 결실되어 있기 때문이다(GT3/pLYSC2 균주의경우 L-라이신에 관하여서는 100mM의 첨가분까지 생육이 억제되지 알고, AEC에 관해서는 3mM의 첨가분까지 생육이 억제되지 않는데 반하여, GT3/pLYSC1 균주에서는 L-라이신 및 AEC 모두 0.2mM의 첨가분까지 생육이 완전히 억제된다). 또한, 이러한 생육 억제는 호모세린 및 디아미노피멜산의 동시 첨가에 의해 제거되는 것으로 확인되었다.
따라서, 돌연변이 도입 실험에는 pLYSC1을 사용하고, 최소배지 M9에 L-라이신 10mM 혹은 AEC 0.2mM을 첨가하여 제조한 배지를 lysC*을 함유하는 플라즈미드-보유 균주의 선택에 이용한다. 이하, 실시예 2에서 이 배지를 선택배지로 한다.
(2-2-2) 하이드록실아민을 사용한 pLYSC1의 시험관내 돌연변이 처리
pLYSC1 플라즈미드내로의 돌연변이의 도입은 플라즈미드를 하이드록실아민으로 직접 처리하는 시험관내 돌연변이 처리법 및 돌연변이에 다양성을 주기 위하여, 즉 하이드록실아민에 의한 사이토신으로부터 티민으로의 돌연변이 이외의 돌연변이를 기대하여, 플라즈미드를 보유하는 균체를 니트로소구아니딘(NTG)으로 처리한 후, 플라즈미드를 추출하는 생체내 돌연변이 처리법의 2가지 방법을 이용한다.
(하이드록실아민을 사용한 시험관내 돌연변이 처리)
2㎍의 DNA를 0.4M 하이드록실아민 [O.1M KH2P04-1mM EDTA(pH 6.0) 100㎕, 1M 하이드록실아민-1mM EDTA(pH 6.0) 80㎕, DNA 2㎍, 물을 첨가하여 총 200㎕가 되게 한다]에서 75℃에서 1 내지 4시간 동안 처리한다. 처리 후 DNA를 유리분말로 정제한 후, AK 완전 결핍 균주인 이. 콜라이 GT3 균주에 도입하고, 완전배지(L-육즙:1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 1.5% 아가)에 스프레딩하여 콜로니를 형성시킨다. 이를(2-2-1)에서 설정한 선택배지에 레플리카하여 선택배지 상에서 생육가능한 균주를 후보 균주로 한다. 형질전환체의 출현율과 돌연변이율은 제 5도와 같은 추이가 관찰된다. 4시간 동안 처리하여, 0.5 내지 0.8%의 상당히 고효율로 돌연변이 균주를 수득하였다.
(NTG를 사용한 시험관내 돌연변이 처리)
pLYSC1을 이. 콜라이 MC1061에 도입하고, 균체마다 NTG 처리를 수행한다. 처리후의 균체를 하룻밤 배양하여 돌연변이를 고정한 후, 플라즈미드를 추출하여 이. 콜라이 GT3에 도입한다. 즉, 형질전환체를 2x TY 배지(1.6% 박토트립톤, 1% 효모 추출액, 0.5% NaCl)에서 배양하고, OD660이 약 0.3이 되는 경우에 균체를 수거하고, 하기에 나타난 TM 완충액으로 세정한 후, NTG액(0.2mg/ml 농도에서 NTG를 TM 완충액에 용해시켜 제조)에 현탁시키고, 37℃에서 0 내지 90분 처리한다. 균체를 TM 완충액 및 2x TY 배지에서 세정한 후, 2x TY 배지에거 하룻밤 배양하여 돌연변이를 고정한 후, 균체로부터 플라즈미드 DNA를 추출하여 이. 콜라이 GT3 균주에 도입하고, 후보 균체의 스크리닝을 시험관내 돌연변이와 동일한 방식으로 수행하고, 라이신 내성(LysR), AEC 내성(AECR)의 돌연변이체를 수득한다.
상기에서 수득된 총 180개의 후보 균주(하이드록실아민 처리 균주: 48개 균주, NTG 처리 균주: 132개 균주)를 선택 배지에 스폿팅하고, AEC 및 L-라이신 내성을 확인하여 153개의 균주를 수득한다. 배지중의 아미노산 축적 양식이 상이한 것에 주목하고, 이 153개의 균주를 14개의 그룹으로 분할한 후 각 그룹의 대표 균주를 선택하여 AK 활성을 측정한다. 또한, 하이드록실아민 처리에 의해 수득된 돌연변이 균주와 NTG 처리에 의해 수득한 돌연변이 균주간은 AK의 활성이 크게 차이가 없기 때문에 이들 각각을 구별하지 않고 이하의 실험으로 수행한다.
(2-2-3) 1ysC*유전자의 단리 및 lysC*산물의 검토
상기 14개 그룹의 대표 균주로서 24번, 43번, 48번, 50번, 80번, 117번, 126번, 149번, 150번, 156번, 158번, 167번, 169번, 172번을 선택하고, 이들 각각으로부터 pLYSC1에서 유래한 돌연변이 플라즈미드를 회수하고, 각각 pLYSC1*24, pLYSC1*43, pLYSC1*48, pLYSC1*60, pLYSC1*80, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLYSC1*149, pLYSC1*150, pLYSC1*156, pLYSC1*158, pLYSC1*167, pLYSC1*169, pLYSC1*172로 명명한다. 이들과 야생형 pLYSC1으로 AK 완전 결핍 균주 GT3를 형질전환시키고, 각 형질전환 균주로부터 세포 유리된 추출액을 제조하여 AKIII의 효소 활성을 측정한다.
세포 유리된 추출액(조 효소액)은 다음과 같이 제조한다. 형질전환 균주를 2xTY배지에서 배양하고, OD660약 0.8에서 수거한다. 균체를 0℃에서, 0.02M KH2P04(pH 6.75)-0.03M β-머캅토에탄올로 세정하고, 초음파 처리(0℃, 100W, 30분 x 4)하여 균체를 파쇄한다. 균체 파쇄액을 0℃의 조건하에서 33krpm으로 1시간 동안 원심분리하여 상층액을 분리하고, 여기에 암모늄 설페이트를 첨가하여 80% 포화시키고, 원심분리 후 펠렛을 0.O2M KH2P04(pH 6.75) -0.03M β-머캅토에탄올에 용해 시키고, 0℃에서 밤새 보존한다.
AKIII 효소 활성을 스타트만 등의 방법[참조: Stadtman, E.R., Cohen, G.N. , LeBras, G., and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033(1961)]에 따라 측정한다. 즉, 하기 조성의 반응액을 27℃에서 45분간 인큐베이트하고, FeCl3용액(2.8N HCl 0.4ml + 12% TCA 0.4ml + 5% FeCl3·6H20/0.1N HCl 0.7ml)을 첨가 발색시켜, 이를 원심분리한 후, 상층액을 540nm에서 흡광도를 측정한다. 활성은 1분당 생성되는 하이드록삼산의 양(1U=1u mol/분)으로 나타낸다. 몰 흡광 계수는 600이었다. 반응액으로부터 칼륨 아스파르테이트를 제거한 것을 블랭크로 사용한다.
*1: 1M 트리스-HCl(pH 8.1) 9ml + 0.3M MgSO40.5ml + 0.2M ATP(pH 7.0) 5ml
*2: 8M 하이드록실아민 용액을 사용 직전에 KOH로 중화시킨 것
AK의 효소 활성을 측정하는 경우, 효소 반응액에 각종 농도의 L-라이신을 첨가하고, L-라이신에 의한 억제 정도를 시험한다. 결과를 제6도 및 표 3에 나타내었다. 야생형 및 24번, 43번, 48번, 60번, 80번, 117번 및 125번에 관해서는 제6A도에, 149번, 150번, 156번, 158번, 167번, 169번 및 172번에 관해서는 제6B도에 나타낸다.
이 결과에서 나타내는 바와 같이, 야생형 AKIII은 L-라이신에 의해 매우 강하게 억제되었다(L-라이신 약 0.45mM에서 50% 억제되고, 5mM에서 100% 억제되었다). 이에 반하여, 이번에 수득된 돌연변이 AKIII은 해제의 정도가 다양하지만, 14개 종류 모두 L-라이신에 의한 억제가 해제되었다. 특히, 24번, 80번, 117번, 169번 및 172번에서는 L-라이신 100mM에서도 전혀 억제되지 않고, 50% 억제 농도는 야생형의 것과 비교하여 200배 이상이었다. 또한, 층 단백질당 비-활성은 균체의 생육상황 및 시료의 제조방법에 의해 영향을 받지만, 모두 야생형과 동일하거나 그 이상이고, 돌연변이 도입에 의한 활성 저하의 문제는 없었다(표 3). 이에 따라, AKIII의 활성 중심과 L-라이신에 의한 조절 부위가 각각 독립적인 것이 예상되었다. 표 3에서 억제 해제도(%)는 반응액 중 L-라이신이 존재하지 않는 AK 활성에 대한 L-라이신 100mM 존재하에서 AK 활성이다. 열 안정성(%)은 55℃에서 15시간 처리 후 활성 보유율이다.
*1: L-라이신의 부재하에서 AK 활성에 대한 L-라이신 100mM 존재하에서의 AK 활성(%)
*2: 55℃에서 15시간 동안 처리 후 활성 보유율(%)
계속하여 돌연변이 효소의 열안정성을 조사한다. 효소를 개량하여 활성을 상승시키는 경우, 생성된 효소가 세포내에서 안정하게 보유되는 것이 중요하다. 세포내 및 세포외에서의 프로테아제 활성의 차이, 효소의 시험관내 보존을 위한 보존용 완충액의 영향 등으로 인하여 시험관내 측정은 문제가 있지만, 간편하기 때문에 하나의 매개변수로서 돌연변이 AKIII의 열안정성에 관하여 시험관내에서 검토한다.
AKIII가 활성을 잃는 온도를 각종의 조건에서 검토한 결과로부터 55℃, 90분 동안 처리한 후의 활성 보유율을 측정하기로 하였다. 표 3에 나타난 바와 같이, 효소중 반이 야생형보다 우수하다. 통상적인 돌연변이 효소는 야생형에 비하여 불안정한 것이 많지만, 이번에 수득된 돌연변이 AKIII은 안정성이 야생형 보다 우수하며 이들 중 대부분이 L-라이신의 생산면에서 실제 사용시 상당히 유리한 것으로 여겨진다.
(2-2-4) 야생형 lysC 및 돌연변이 lysC의 염기 서열의 결정
DNA 서열기 ABI 모델 373A(Applied Biosystems사 제조)를 사용하여 통상적인 방법에 따라 이번에 수득된 야생형 lysC 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정한다(서열확인번호:7). 그 결과, 이미 공지되어 있는 이. 클라이 K-12 JC411 균주의 lysC의 서열[참조: Cassan, M., Rarsot, C., Cohen, G.N., and Patte, J.C., J.Biol.Chem., 251, 1052(1986)]과 여섯 부위(아미노산 수준에서 두 부위)에서 차이가 있다. 이 여섯 부위의 차이는 사용 균주의 차이에 의한 것으로 생각된다.
이와 동일하게, 14개 종류의 돌연변이 pLYSC1상에 존재하는 lysC*각각에 관하여 염기 서열을 결정하고, 돌연변이점을 밝혔다. 이 결과를 표 4에 나타내었다. 이 표에서, 괄호 안의 내용은 뉴클레오타이드의 돌연변이에 기초한 아미노산 잔기의 돌연변이를 나타낸다. 14개 종류 중 전부 동일한 돌연변이가 2세트(48번과 167번, 및 24번과 80번)이 있기 때문에 돌연변이의 종류는 12종류이다. 돌연변이의 종류와 관련하여 149번, 150번, 156번, 158번, 167번, 169번 및 172번은 하이드록실아민 처리에 의해, 24번, 43번, 48번, 60번, 80번, 117번 및 126번은 NTG처리에 의해 수득된 돌연변이이지만, 돌연변이의 형태는 모두 사이토신으로부터 티민으로의 돌연변이 또는 비암호화 쇄상의 사이토신으로부터 티민으로의 돌연변이로 인한 암호화 쇄상의 구아닌으로부터 아데닌으로의 돌연변이였다.
*H; 하이드록실아민처리, N;NTG 처리
실시예 3: dapA * 를 도입한 균주에 의한 L-라이신의 발효 생산
이. 콜라이에서 L-라이신을 생산시키기 위해서는 일본국 특허공보 제56-18596호 및 미합중국 특허원 제4,346,170호 공보 및 문헌[참조: Applied Microbiology and Biotechnology, 15, pp.227-231(1982)]에 나타난 바와 같이 DDPS를 증강시키기 위한 숙주에서 아스파르토키나제가 L-라이신에 의해 억제를 받지 않도록 변화시키는 것이 필수적인 것으로 고려된다. 이와 같은 균주로서, 예를 들면, L-트레오닌 생산 균주를 들 수 있다. 트레오닌-생산 이. 콜라이 균주로서는 B-3996이 현재 공지되어 있는 가운데 최고의 생산능력을 가지고 있다. 그리고, dapA*를 평가하기 위한 숙주로서 B-3996 균주를 사용한다. B-3996 균주는 염색체외적으로 단일 플라즈미드로서 pVIC40을 보유한다. 상세하게는 일본국 특허공보 제3-501682호(PCT)에 기재되어 있다. 당해 미생물은 리서치 인스티튜트 포 제네틱스 앤드 인더스트리얼 마이크로오르가니즘 브리딩(Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding)에 등록번호 RIA 1867로 수탁되어 있다.
반면, 이. 콜라이에 도입한 dapA*로서는 효소의 억제해제도 및 비활성으로부터 판단하여, pdapAS24에 함유되어 있는 dapA*(118번 히스티딘 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 것)을 선택한다. 우선, dapA*발현량 및 플라즈미드의 안정성을 증가시키기 위해, pdapAS24상에 있는 돌연변이 dapA*(이하 'dapA*24'로 부른다)를 pVIC40의 테트라사이클린 내성 유전자 프로모터의 하부에 연결하고, 제 7도에 나타난 바와 같이 RSF24P를 수득한다.
RSF24P 플라즈미드를 이. 콜라이 JM109 균주에 도입하여 수득한 균주를 AJ12395로 명명하고, 1993년 10월 28일에 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 수탁번호 FERM P-13935로 수탁하였고, 1994년 11월 1일에 부다페스트 조약에 근거하여 국제기탁기관으로 이관하였으며, FERM BP-4858의 수탁번호로 수탁되었다. pdapAS8 및 pdapAS9을 보유하는 균주는 수탁하지 않았지만, 각 플라즈미드상의 dapA*의 돌연변이점은 전술한 바와 같이 모두 밝혀져 있기 때문에, 상기 수탁 균주로부터 플라즈미드를 마니아티스의 방법[참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21(1989)]에 의해 회수하고, 부위-지시된 돌연변이 방법[참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15.63(1989)]에 의해 목적 유전자를 수득하는 것은 당업자에게는 용이하다.
B-3996 균주로부터 pVIC40을 통상적인 방법에 따라 결실시키고, 플라즈미드를 갖지 않는 균주로서 B-399 균주를 수득한다. RSF24P 플라즈미드를 통상적인 방법에 따라 B-399 균주에 도입시켜 B-399/RSF24P를 수득한 후, 이의 L-라이신 생산성을 평가한다.
한편, 대조군의 플라즈미드로서 RSFP를 작제한다. 즉, 제 7도에 나타나는 pVIC40의 BamHI 및 DraI에 의한 이중 절단물로부터 큰 단편을 선택하고, 이를 DNA 폴리머라제 클레나우 단편으로 평활말단화 처리한다. 평활말단화 처리된 큰 단편을 자기연결시켜 플라즈미드 RSFP를 수득한다. B-399 균주에 RSFP를 통상적인 방법에 따라 도입하여 B-399/RSFP를 수득한다. B-399/RSFP에 관하여도 L-라이신 생산성을평가한다.
이하의 배지를 이용하여 배양시간 48시간, 온도 37℃의 조건하에서 114-116rpm으로 교반하면서 배양한다. 결과를 표 5에 나타내었다.
KOH로 pH 7.0으로 조정하고, 115℃에서 10분간 오토클레이브(16/20용적)한다.
B: 20% 글루코즈(115℃에서 10분간 오토클레이브)(4/20용적)
C: 약전 CaC03(180℃에서 2일간 건열 멸균)(30g/L)
A 및 B를 4:1(A:B)로 혼합하고, 이 혼합물 1L에 C 30g을 가하여 용해시키고, 항생 물질(스트렙토마이신 100㎍/ml, 카나마이신 5㎍/ml)를 첨가한다.
실시예 4: dapA * 및 lysC * 를 도입한 균주를 사용한 L-라이신의 발효 생산(1)
실시예 3에서 돌연변이 DDPS의 L-라이신 생산에 대한 효과를 보여주지만, 이를 더욱 개량하기 위해 실시예 2에서 수득된 돌연변이 AKIII 유전자를 돌연변이 DDPS 유전자와 공존시킨다. 돌연변이 DDPS 유전자와 공존시킨 돌연변이 AKIII 유전자로서는 효소 활성, 열 안정성 등으로부터 판단하여 80번 균주 유래의 것(lysC*80)을 선택한다.
lysC*80은 lysC*의 발현량을 증가시키기 위해 pLYSC1*80상에 존재하는 lysC*(이하 'lysC*80'으로 부른다)을 pUC18에 대하여 역으로 삽입된 부위를 갖는 벡터 pHSG399(Takara Shuzo Co사 제조)의 lacZ 프로모터의 하부에 연결시켜 제조된 플라즈미드 pLLC*80(제 8도)으로부터 절단한 것을 사용한다. pLLC*80은 pLYSC1*80상의 lysC*80의 전사방향이 lacZ 프로모터에 대하여 역방향으로 배치되어 있기 때문에, L-라이신의 생산성을 향상시키기 위해 lacZ 프로모터에 대하여 전사방향이 정방향으로 되도록 lysC*80을 배치시키기 위해 작제된 플라즈미드이다.
pLLC*80과 실시예 3에서 수득된 RSF24P로부터 dapA* 및 lysC*를 갖는 플라즈미드 RSFD80을 제 9도와 같이 작제한다. RSFD80에는 테트라사이클린 내성 유전자의 프로모터(tetP)의 하부에 tetP에 대해 전사 방향이 정방항이 되도록 하기 위해 dapA*24 및 lysC*80이 이 순서로 배치되어 있다.
RSFD80 플라즈미드를 이. 콜라이 JM109 균주에 도입한 것을 AJ12396으로 명 명한다. AJ12396은 1993년 10월 28일 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 수탁번호 FERM P-13936으로 수탁되었고, 1994년 11월 1일에 부다페스트조약에 근거하여 국제기탁기관으로 이관되었고, FERM BP-4859의 수탁번호로 수탁되어 있다. pLYSC1*24, pLYSC1*43, pLYSC1*48, pLYSC1*60, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLYSC1*149, pLYSC1*150, pLYSC1*156, pLYSC1*158, pLYSC1*167, pLYSC1*169 및 pLYSC1*172를 보유하는 균주는 기탁하지 않았지만, 각 플라즈미드 상의 lysC*의 모든 돌연변이점은 상기한 바와 같이 명백하다. 따라서, 상기 수탁세균으로부터 플라즈미드를 마니아티스 방법[참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21(1989)]에 의해 회수하고, 부위-지시된 돌연변이 방법[참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15.63(1989)]에 의해 목적 유전자를 수득하는 것은 당업자에게는 용이하다. RSFD80을 통상적인 방법에 따라 B-399 균주에 도입하여 B-399/RSFD80을 수득한다. B-399/RSFD80의 L-라이신의 생산성을 평가한다. 대조군으로서 B-399/RSFP에 관하여도 L-라이신 생산성을 평가한다.
실시예 3과 동일하게, L-라이신 생산 배지를 사용하고, 배양시간 48시간 및 온도 37℃의 조건하에서 114-116rpm으로 교반하면서 배양한다. 결과를 표 6에 나타내었다.
실시예 5: dapA* 및 lysC*를 도입한 균주를 사용한 L-라이신의 발효 생산(II)
에스케리키아 속 세균에 돌연변이 dapA 유전자와 돌연변이 lysC 유전자를 보유시켜, L-라이신의 생산성을 개선시킬 수 있는 것이 실시예 4에서 확인되었다. 이 효과가 숙주를 변경한 경우에도 유지되는 지를 실험한다.
숙주로서는 이. 콜라이 W3110(tyrA) 균주를 사용한다. W3110(tyrA) 균주는 유럽특허공보 제92-488424호에 상세히 기재되어 있지만, 이의 제법에 관해 간단히 설명하면 이하와 같다. 국립 유전학 연구소(일본국 시즈오카켄 미시마시)로부터 이. 콜라이 W3110 균주를 입수한다. 동 균주를 스트렙토마이신 함유의 LB 플레이트에 스프레딩하고, 콜로니를 형성하는 균주를 선택하여 스트렙토마이신 내성 균주를 수득한다. 선택된 스트렙토마이신 내성 균주와 이. 콜라이 K-12 ME8424 균주를 혼합하고, 완전배지(L-육즙: 1% 박토 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl)에서 37℃의 조건하에서 15분 동안 정치 배양시켜 접합을 유도한다. 이. 콜라이 K-12ME8424 균주는(HfrP045, thi, relAl, tyrA::Tn1O, ung-1, nadB)의 유전형질을 갖고, 국립 유전학연구소로부터 입수가능하다.
이어서, 배양물을 스트렙토마이신, 테트라사이클린 및 L-타이로신을 함유하는 완전배지(L-육즙: 1% 박토 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 1.5% 한천)에 스프레딩하고, 콜로니를 형성하는 균주를 선택한다. 이 균주를 이. 콜라이 W3110(tyrA) 균주로 명명한다.
그런데, 유럽특허공보 제92-488424호에는 W3110(tyrA) 균주에 플라즈미드를 도입하여 형성된 균주가 많이 기재되어 있다. 예를 들면, 플라즈미드 pHATerm을 도입하여 수득된 균주는 이. 콜라이 W3110(tyrA)pHATerm 균주로 명명하고, 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁되어 있고, 등록번호 FERM BP-3653이 부여되어 있다. 이. 콜라이 W3110(tyrA)/pHATerm 균주로부터 플라즈미드 pHATerm을 결실(curing)시켜 W3110(tyrA) 균주를 수득할 수 있다. 플라즈미드의 결실은 통상적인 방법으로 수행할 수 있다.
전술한 바와 같이 수득된 W3110(tyrA) 균주에 실시예 4에서 수득된 dapA*와 lysC*를 모두 함유하는 플라즈미드 RSFD80을 도입하여 W3110(tyrA)/RSFD80을 수득한다. W3110(tyrA)/RSFD80의 L-라이신의 생산성을 평가한다. 대조군으로서 W3110(tyrA) 균주에 RSFP를 통상적인 방법에 따라 도입하고, W3110(tyrA)/RSFP를 수득한다. 대조군으로서 W3110(tyrA)/RSFP에 관해서도 L-라이신의 생산성을 평가한다.
전술한 L-라이신 생산배지를 사용하고, 배양시간 48시간 및 온도 37℃의 조건하에서 114-116rpm으로 교반하면서 배양을 수행한다. 결과를 표 7에 나타내었다.
실시예 6: L-라이신 생합성계의 속도조절단계 및 L-라이신 생산 에스케리키아 속 세균의 L-라이신의 생산성 향상 분석
이. 콜라이의 L-라이신 생합성계의 속도 측정 단계 및 이러한 단계들을 촉매하는 효소에 의한 증감 유전자를 분석하여 L-라이신 생산성을 증가시키려고 노력하였다.
<1> 제1 속도 결정 단계의 특성
(6-1-1) L-라이신 생합성계 유전자의 제조
속도 결정 단계의 측정은 각종 라이신 생합성계 유전자를 단리하고, 이들의 유전자를 이. 콜라이에 도입하여 각각의 유전자의 L-라이신 생성 능력에 대한 효과를 조사함으로써 수행한다. 도입한 L-라이신 생합성계 유전자와 이들을 암호화하는 효소는 다음과 같다.
ppc: 포스포에놀피루베이트 카복실라제
aspC: 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제
lysC: 아스파르토키나제 III
lysC*80: 억제-해제된 아스파르토키나제 III
asd: 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제
dapA: 디하이드로디피콜리네이트 신타제
dapA*24: 억제-해제된 디하이드로디피콜리네이트 신타제
dapB: 디하이드로디피콜리네이트 환원효소
DDH: 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제
(브레비박테리움 락토퍼멘툼으로부터 유래)
lysA: 디아미노피멜레이트 데카복실라제
이상의 유전자에 의해 포스포에놀피루브산으로부터 L-라이신에 이르는 L-라이신 생합성계가 망라되어 있다. 본래 이. 콜라이가 보유하는 L-라이신 생합성계 유전자 중에서 dapC, dapD, dapE 및 dapF 유전자는 이들의 유전자 산물이 관여하는 반응을 단독으로 촉매할 수 있는 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 DDH(디아미노피멜레이트 데하이드로게나제)를 암호화하는 유전자 DDH로 대체한다. 또한, 이들의 유전자를 도입하는 숙주로서는 이. 콜라이 K-12계의 W3110(tyrA) 균주를 사용한다.
dapA 및 dapA*24 유전자는 각각 pdapA2 및 pdapAS24(실시예 1 참조)로부터 EcoRI 및 KpnI으로 절단함으로써 수득한다(제10도). 이들의 유전자를 EcoRI 및 KpnI으로 절단한 pMW118과 연결하여 pdapA 및 pdapA*를 수득한다. 또한 lysC 및 lysC*80 유전자는 각각 pLYSC1 및 pLLC*80(실시예 2 참조)으로부터 EcoRI 및 SphI 으로 절단함으로써 수득한다. 이들의 유전자를 EcoRI 및 SphI으로 절단한 pMW119와 연결하여 plysC 및 PlysC*를 수득한다(제 11도).
ppc 유전자는 이들 유전자를 갖는 플라즈미드 pT2로부터 수득한다. pT2는SmaI 및 ScaI으로 절단하고, 말단을 평활화한 후 pMW118의 SmaI 부위에 삽입하여, 플라즈미드 pppc를 수득한다(제 12도). pT2를 보유하는 이. 콜라이 F15 균주(AJ12873)는 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 FERM BP-4732의 수탁번호로 기탁되어 있다.
aspC 유전자는 이의 유전자를 갖는 플라즈미드 pLF4[참조: Inokuchi, K. et al., Nucleic Acid Res., 10, 6957(1982)]로부터 수득한다(제 13도). pLF4를 PvuII 및 StuI으로 절단하고, 말단을 평활화시킨 후 pMW119의 SmaI 부위에 삽입하여 플라즈미드 paspC를 수득한다.
asd 유전자는 이의 유전자를 갖는 플라즈미드 pAD20[참조: Haziza, C., et al., EMBO, 1, 379(1982)]로부터 수득한다. pAD20을 AseI 및 ClaI로 절단하고나서, 말단을 평활화시킨 후, pMW118의 SmaI 부위에 삽입하여 플라즈미드 pasd를 수득한다(제 14도).
dapB 유전자는 주치의 dapB 유전자의 뉴클레오타이드 서열[참조: Bouvier, J. et al., J. Biol. Chem., 259, 14829(1984)]에 기초해 제조한 2종류의 올리고 뉴클레오타이드 프라이머(서열확인번호: 9 및 10)를 사용하여 PCR 법에 의해, 이. 콜라이 W3110 균주의 염색체 DNA로부터 dapB 유전자를 증폭함으로써 수득한다(제 15도). 수득된 증폭 DNA 단편을 Ase I 및 Dra I으로 절단하고, 말단을 평활화한 후 pMW119의 SmaI 부위에 삽입하여 플라즈미드 pdapB를 수득한다.
DDH 유전자를 코리네박레리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 DDH 유전자의 주지의 뉴클레오타이드 서열(참조: Ishino, S. et al., NucleicAcids Res., 15, 3917(1987)]을 기준으로 작성한 2종류 올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열확인번호: 11 및 12)를 사용한 PCR 법에 의해 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC13689의 염색체 DNA로부터 DDH 유전자를 증폭시킴으로써 수득한다. 수득된 증폭 DNA 단편을 EcoT22I 및 AyaI으로 절단하고, 말단을 평활화한 후 pMW119의 SamI 부위에 삽입하여 플라즈미드 pDDH를 수득한다(제 16도).
lysA 유전자를 주지의 lysA 유전자의 뉴클레오타이드 서열[참조: Stragier, P et al., J. Mol Biol., 168, 321(1983)]을 기준으로 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열확인번호: 13 및 14)를 사용한 PCR 방법에 의해 이. 콜라이 W3110 균주의 염색체 DNA로부터 lysA 유전자를 증폭함으로써 수득한다. 수득된 증폭 DNA 단편을 SplI 및 BclI으로 절단하고, 말단을 평활화한 후 pMW118의 SmaI 부위에 삽입하여 플라즈미드 plysA를 수득한다(제 17도).
상기 각 유전자가 클로닝된 것은 도면에 나타난 제한효소로 이들을 절단함으로써 확인한다. 또한, 이들 유전자의 클로닝에 이용된 벡터 pMW118 및 pMW119(닛폰 유전자 제조)는 후술하는 라이신 생산용 플라즈미드의 작제에 사용한 벡터인 RSF1010 및 이. 콜라이 세포 내에서 공존가능하고, 안정 분배 기구도 갖기 때문에 선택된다.
(6-1-2) L-라이신 생합성계 유전자를 도입한 이. 콜라이의 L-라이신 생산성
이. 콜라이 W3110(tyrA)를 상술한 L-라이신 생합성계 유전자를 함유하는 각 플라즈미드로 형질전환시키고, 수득된 형질전환체를 배양하여 L-라이신을 생산한다. 이하의 배지를 사용하여 배양 온도 37℃, 114-116rpm의 교반 조건하에서 30분동안 배양한다. 결과를 표 8에 나타내었다.
KOH로 pH 7.0으로 조정하고, 115℃에서 10분간 오토클레이브(글루코즈 및 MgS04·7H2O는 별도로 멸균시킨다)한다.
약전 CaCO325g/L(180℃에서 2일간 건열 멸균)
항생물질(도입한 플라즈미드의 종류에 의존하여 스트렙토마이신 20mg/l 또는엠피실린 50mg/l)
이. 콜라이 W3110(tyrA)는 plysC*, pdapA 또는 pdapA*의 도입으로 L-라이신을 생산하게 된다. lysC 산물, dapA 산물 모두 L-라이신에 의한 피드백 억제를 받기 때문에 이들의 효소가 L-라이신 생합성에 있어서 주요한 조절점인 것으로 예상할 수 있다. dapA 산물이 촉매하는 반응은 L-트레오닌, L-메티오닌 및 L-이소루이신의 생합성계 및 L-라이신 생합성계의 분지 위치에 존재하고 L-라이신 고유의 생합성계의 최초의 단계이다. 야생형 dapA의 증폭에 의해 이. 콜라이가 L-라이신을 생산하도록 하는 것이 이미 보고되어 있고 [참조: Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 15, 227(1982)], 이는 상술한 결과로부터도 확인된다. 한편, 이. 콜라이에 억제 해제형 유전자인 dapA*를 도입하면 L-라이신 수율이 더욱 증식되는 것을 실시예 3의 결과가 재확인시켜준다.
W3110(tyrA), W3110(tyrA)/pddpA 및 W3110(tyrA)/pdapA*로부터 실시예 1과 동일하게 조 효소액을 조제하고 DDPS(디하이드로디피콜리네이트 신타제) 활성을 측정하고, DDPS 활성의 L-라이신에 의한 억제의 정도를 조사한다. 결과를 표 9에 나타내었다.
*1: ㎛/분/mg단백질
*2: L-라이신 5mM 존재시의 활성 보유율(%)
억제 해제형의 dapA* 산물은 야생형 효소와 비교하여 비활성은 낮지만(약 1/2), 억제 해제도가 높기 때문에 L-라이신 생산에 대한 효과는 클 것으로 생각되고, L-라이신 생산에 있어서 dapA 산물이 억제 해제될 필요성이 나타난다.
또한, lysC*가 L-라이신 생산에 효과가 있다는 것에 관하여는 이하와 같이 생각할 수 있다. 제1 속도 결정 단계는 생합성계의 분지점이 되는 기질로서 ASA(아스파르테이트-β-세미알데히드)를 수득시 HD(호모세린 데하이드로게나제: thrA 또는 metLM의 산물) 및 DDPS(dapA 산물)이 경쟁하는 단계이고, 상술한 바와 같이 dapA를 증강시키면 반응은 L-라이신 생합성의 방향으로 흐른다. 한편, dapA로부터 더 상부의 반응에 관여하는 lysC를 증감시킴으로써 ASA 공급량을 증가시키는 경우,HD 및 DDPS가 관여하는 모든 반응이 증진되어 L-라이신의 생산량도 증가되는 것으로 생각할 수 있다. 단, 야생형 lysC만을 증강시켜서는 이러한 효과를 거의 얻을 수 없다. 이러한 이유는 야생형 AKIII(lysC 산물)의 L-라이신에 의한 억제가 야생형 DDPS의 것에 비해 엄격하기 때문이다(L-라이신 5mM의 존재에 의해 AKIII은 약 100%, DDPS는 약 80% 억제된다).
이상과 같이, 라이신 생산효과가 보다 높은 DDPS에 의한 반응이 제1 속도 결정 단계인 것으로 판단되고, 더욱이 AKIII에 의한 반응이 제2 속도 결정 단계인 것으로 추정된다.
<2> 제2 속도 결정 단계의 특정
dapA*가 도입된 균주에 있어서, L-라이신 생합성계의 각종 유전자를 증강시켜, 제2 속도 결정 단계를 특정한다. dapA*를 함유하는 플라즈미드를 보유하는 이. 콜라이에 기타의 플라즈미드를 도입하는 경우 이들의 플라즈미드가 안정되게 보유되도록 dapA*를 pdapA로부터 RSF1010에 이전하고 RSF24P를 수득한다(제 7도). dapA*를 갖는 플라즈미드 RSF24P로 이. 콜라이 W3110(tyrA)를 형질전환시킨다.
이. 콜라이 W3110(tyrA)/RSF24P에 L-라이신 생합성계 유전자를 갖는 플라즈미드를 도입한다. 수득된 각각의 형질전환체내에서는 2가지의 플라즈미드, 즉 RSF24P 및 기타의 L-라이신 생합성계 유전자를 함유하는 플라즈미드가 공존한다. 이들의 균주에 대해(6-1-2)와 동일하게 L-라이신 생산성을 조사한다. 결과를 표 10에 나타내었다.
이 결과, lysC*만이 현저한 L-라이신 생산 증강 효과를 보인다. 야생형의 lysC로는 전혀 효과가 없고, 이는 전술한 바와 같이 L-라이신에 의한 억제가 강하기 때문인 것으로 생각된다. 이와 같이 lysC*가 관여하는 반응이 제2 속도결정단계인 것이 확인된다.
lysC*를 RSF24P에 삽입하여 RSFD80을 수득한다(제 9도). 이와 동일하게, lysC를 RSF24P에 삽입하여 수득된 플라즈미드를 RSFD1으로 명명한다. 이들 플라즈미드를 이. 콜라이 W3110(tyrA)에 도입하고,(6-1-2)와 동일하게 조 효소액을 제조하여 AK 활성 및 AK 활성의 L-라이신에 의한 억제의 정도를 조사한다. 결과를 표11에 나타내었다.
*l: mol/분/mg단백질
*2: L-라이신 5mM 존재시의 활성 보유율(%)
RSF24P에 lysC 및 lysC*를 삽입함으로써, 이 플라즈미드를 보유하는 균주인 AK의 비활성은 20 내지 30배로 증가한다. 이. 콜라이에는 AK 3종류가 존재하고, lys는 이중 AKIII을 암호화하지만, 상기 실험에서는 3종류의 AK의 총 활성을 측정한다. 야생형 lysC를 삽입한 RSFD1을 보유하는 균주에서는 대조군(W3110(tyrA)/RSF24P)와 비교하여 AKIII이 점유하는 비율이 AKI 및 AKII가 점유하는 비율보다 높아 L-라이신에 의한 억제도 높고, 결과로서 L-라이신 생산능 증강에는 효과를 나타내지 않는 것으로 생각된다. 한편, RSFD80을 보유하는 균주에서는 AKIII의 약 100%가 억제 해제되어 있고, 이것이 L-라이신 생산의 향상에 기여하는 것으로 이해된다.
<3>제3 속도결정단계의 특정
이어서, 이. 콜라이 W3110(tyrA)/RSFD80에 각종 L-라이신 생합성계 플라즈미드를 도입하고, L-라이신 생산 배양을 수행한다. 배양효과를 표 12에 나타내었다.
dapB에서만 L-라이신 생산 증강 효과가 보이고, dapB가 관여하는 반응이 제3속도 결정 단계인 것으로 이해된다. 이로써 dapB를 RSFD80에 삽입하고 pCAB1을 수득한다(제 18도). 이 플라즈미드를 이. 콜라이 W3110(tyrA)에 도입하고, 조 효소액을 제조하고 문헌 [참조: Tamir, H. and Gilvarg, C., J. Biol. Chem., 249, 3034(1974)]에 기재된 방법에 따라 DDPR(디하이드로디피콜리네이트 환원효소)의 활성을 측정한다. 동일한 방법으로, RSFD80만을 보유하는 균주와 RSFD80 및 pdapB를 동시에 보유하는 균주로부터 조 효소액을 제조하고 DDPR활성을 측정한다. 결과를표 13에 나타내었다.
DDPR 활성은 대조군(RSFD80만을 보유하는 균주)과 비교하여 RSFD80 및 pdapB를 보유하는 균주는 약 3배, RSFD80에 dapB를 삽입한 pCAB1을 보유하는 균주는 약 6.5배 증가한다. L-라이신의 축적은 W3110(tyrA)/RSFD80+pdapB와 W3110(tyrA)/pCAB1 모두 동등하게 10.08g/L이기 때문에 dapB는 L-라이신 생산에는 충분한 양이고, 속도 결정 단계는 다음 단계로 이전된 것으로 판단된다.
<4>제4 속도 결정 단계의 특정
이어서, lysC*, dapA* 및 dapB를 갖는 플라즈미드 pCAB1을 사용하여 제4 속도 결정 단계를 특정한다. 이. 콜라이 W3110(tyrA)/pCAB1에 각종의 L-라이신 생합성계 플라즈미드를 도입하고 L-라이신 생산배양을 수행한다. 배양 결과를 표 14에나타내었다.
DDH에서만 L-라이신 생산성 증강 효과가 보이고, DDH가 촉매한 반응이 제4속도 견정 단계인 것으로 이해된다. DDH를 도입하지 않은 균주의 배양 육즙 중에서 검출된 SDAP (N-석시닐-L,L-α,ε-디아미노피멜산)이 DDH-도입 균주의 배양 육즙에서는 검출되지 않았다. SDAP 검출은 TLC 전개에 의해 수행한다(전개 용매의 조성; 메탄올:물:10N HCl:피리딘 = 80:17.5:2.5:10)[참조: Bouvier, J., Richaud, C., Higging, W., Bogler, O. and Stragier, P., J. Bacteriol., 174, 5265(1992)]. 더욱이, 육즙의 색깔이 비-도입 균주에서는 갈색이지만 DDH 도입 균주에서는 황색으로 변한다. 따라서, DDH를 pCAB1에 삽입한 플라즈미드 pCABD2를 작제하고(제 19도), 이 플라즈미드로 형질전환시킨 이. 콜라이 W3110(tyrA)의 DDH 활성을 측정한다. DDH 효소 활성의 측정은 문헌 [참조: Azizono, Haruo, Fermentation and Industry, 45, 964(1987)]에 따라서 수행된다. 결과를 표 15에 나타내었다.
이. 콜라이에는 원래 DDH가 존재하지 알기 때문에 대조군(W3110(tyrA)/pCAB1)에서는 DDH 활성이 검출되지 않는다. pCABD2 보유 균주(W3110(tyrA)/pCABD2)의 DDH의 비활성은 pDDH 보유 균주(W3110(4yrA)/PCAB1+pDDH)의 약 2.5배이지만, 양 군주 모두 L-라이신의 축적량은 동등(12.23g/L)하기 때문에 pCABD2의 DDH 발현량은 충분한 양인 것으로 판단된다.
<5>dapC, dapD, dapE 및 dapF간의 속도 결정 단계의 해석
이어서, DDH에 의해 대체된 dapC, dapD, dapE 및 dapF의 속도 결정 순위를 조사하기 위해 우선 이들의 유전자를 클로닝한다. dapC에 관하여서는 염기서열이 알려져 있지 않기 때문에 클로닝할 수는 없지만, 나머지 3종류의 유전자에 관해서는 PCR 방법에 의해 클로닝을 수행한다.
dapD 유전자는 주지의 dapD 유전자의 뉴클레오타이드 서열[참조: Richaud, C. et al., J. Biol Chem., 259, 14824(1984)]을 기초로 하여 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열확인번호: 15 및 16)를 사용한 PCR 방법에 의해 이. 콜라이 W3110의 염색체 DNA로부터 dapD 유전자를 증폭함으로써 수득한다. 수득된 증폭 DNA 단편을 EcoR109I 및 SacI으로 절단하고, 말단을 평활화한 후, pMW118의 SmaI 부위에 살입하여 플라즈미드 pdapD를 수득한다(제 20도).
dapE 유전자는 주지의 dapE 유전자의 뉴클레오타이드 서열[참조: Bouvier J. et al., J. Bacteriol., 174, 5265(1992)]을 기초로 하여 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열확인번호: 17 및 18)을 사용한 PCR 방법에 의해 이. 콜라이 W3110 염색체 DNA로부터 dapE 유전자를 증폭함으로써 수득한다. 수득된 증폭 DNA 단편을 MunI 및 BglII으로 절단하고, 말단을 평활화한 후, pMW118의 SmaI 부위에 삽입하여 플라즈미드 pdapE를 수득한다(제 21도).
dapF 유전자는 주지의 dapF 유전자의 뉴클레오타이드 서열[참조: Richaud, C. et al., Nucleic Acids Res., 16, 10367(1988)]을 기초로 하여 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라미어(서열확인번호: 19 및 20)을 사용한 PCR 방법에 의해 이. 콜라이 W3110의 염색체 DNA로부터 dapF 유전자를 증폭함으로써 수득한다. 수득된 증폭 DNA 단편을 PstI으로 절단하고, 말단을 평활화한 후, pMW118의 SmaI 부위에 삽입하여 플라즈미드 pdapF를 수득한다(제 22도).
상술한 바와 같이 수득된 각 플라즈미드를 W3110(tyrA)/pCAB1에 도입하여 L-라이신 생산 배양을 수행한다. 앞의 실험으로 DDH의 도입 전후사이의 L-라이신 생산량이외에 기타 육즙의 색, 중간체(SDAP)의 축적의 유무에 관해서도 변화를 보이기 때문에, 이들을 표지로서 사용하여 속도 조절 단계의 해석을 수행한다. 결과를표 16에 나타내었다.
L-라이신의 생산량은 dapD 또는 dapE의 증강에 의해 약각 증가되었지만 DDH에는 미치지 못한다. 또한, DDH의 도입에 의해 관찰된 육즙의 색의 변화 및 중간체인 SDAP의 축적은 각각 독립적인 현상이고, 육즙의 색의 변화는 dapD에 기인하고, SDAP의 소실은 dapE에 기인하는 것을 이해할 수 있다. darE와 SDAP 사이의 관계는 L-라이신의 생합성 경로로부터 결정되는 것으로 측정될 수 있다. dapF의 증강은 L-라이신 생산성에 증진 효과가 없다.
pdapE로부터 dapE를 절단하고, pdapD에 삽입하여 dapE 및 dapD를 모두 갖는 플라즈미드 pMWdapDE1을 작제한다(제 23도). 더욱이, pMWDE1으로부터 dapE 및 dapD를 함유하는 단편을 절단하고 이것을 pCAB1에 삽입하여 pCABDE1을 작제한다(제 24도). pCAB1, pCABDE1 또는 pCABD2를 보유하는 균주, 및 pCABDE1 및 pdapF를 모두 보유하는 균주를 작제하고, 이들의 균주로 L-라이신 생산 배양을 수행한다. 결과를표 17에 나타내었다.
L-라이신 생산량, 육즙의 색 및 SDAP의 축적 여부는 dapD 및 dapE를 조합하여 증강시켜 DDH를 생성하는 경우에서와 동등한 것으로 이해된다. 또한, dapF를 증강시켜도 L-라이신 생산성 향상에는 효과가 없고, dapF가 관여하는 반응은 속도 결정에 관련되지 않은 것으로 이해된다. 이상의 결과는 하기와 같이 해석할 수 있다.
pCAB1을 도입한 단계에서 중간체는 SKAP(N-석시닐-ε-케토-L-α-아미노피멜산) 및 SDAP의 2단계에서 축적된다. 이들의 중간체 중에서 SDAP는 세포외 육즙에서 검출된다. SKAP는 검출되지 않았지만, 아마 균체내에 축적되는 것으로 생각된다. 이렇게 생각되는 이유로는 육즙의 색깔 때문이다. L-라이신을 생산하지 않는 야생형 균주(W3110(tyrA))등에서 육즙의 색은 황색이지만, 생육에 부담이 있으면 용균 등에 의해 육즙이 갈색으로 되는 것으로 생각된다. SDAP는 균체외로 배출되기 때문에 생육에 대한 부담은 적고, 따라서 dapD만의 증강에 의해 SKAP가 대사되 면 SDAP의 축적량은 증가하지만 육즙은 황색으로 개선되는 것으로 생각된다. 단, dapD를 증가시켜도 보다 하부의 dapE에 의한 속도 결정이 해제되지 않으면 L-라이 신의 축적량은 증가하지 않는다.
<6>결론
이상의 결과로부터, 에스케리키아 속 세균에 있어서 ①dapA*의 도입, ② lysC*의 도입, ③dapB의 증강, ④DDH, 또는 dapD 및 dapE의 증강을 수행함으로써 단계적으로 L-라이신 생산성을 향상시키는 것으로 이해된다. 또한, 단계적으로 L-라이신 생산성이 향상된 이. 콜라이를 수득한다.
<7> 이. 콜라이 C 균주에 있어서 L-라이신 생합성계의 속도 결정 단계의 해석
상기에서 수득된 결론이 이. 콜라이 K-12계열 외의 균주에 있어서도 적용가능한지를 조사하기 위해 이. 콜라이 C 균주(IFO 13891)의 L-라이신 생합성계의 속도 결정 단계의 해석을 상기와 동일하게 수행한다. 배양 조건은 W3110(tyrA)와 동일하게 하여 수행하지만, 배지에는 L-타이로신을 첨가하지 않는다.
(1)제1 속도 결정 단계의 특정
L-라이신 생합성계 유전자를 함유하는 플라즈미드로 형질전환시킨 이. 콜라이 C 균주(IFO 13891)을 L-라이신 생산배지에서 배양하고, L-라이신 하이드로클로라이드의 생산량을 측정한다. 결과를 표 18에 나타내었다.
W3110(tyrA)의 경우와 동일하게 C 균주에 있어서도 야생형 dapA 및 억제해제형 dapA*의 도입에 의해 L-라이신을 배지중에 축적하도록 한다. lyscC*는 L-라이신 생산성에 효과가 없다.
(2)제2 속도 결정 단계의 특정
이. 콜라이 C 균주에 dapA*를 함유하는 플라즈미드 RSF24P를 도입하고 L-라이신 생합성계 유전자를 함유하는 플라즈미드를 추가로 도입하여 수득된 형질전환체를 L-라이신 생산배지에서 배양하고 L-라이신 하이드로클로라이드의 생산량을 측정한다: 결과를 표 19에 나타내었다.
dapA*를 도입한 C 균주에서도 L-라이신 생산성에 향상 효과가 있는 것은 lysC*이고, lysC*가 관여하는 반응이 제2 속도 결정 단계인 것을 알 수 있다.
(3)제3 속도 결정 단계의 특정
이. 콜라이 C 균주에 dapA* 및 lysC*를 함유하는 플라즈미드 RSFD80을 도입하고, L-라이신 생합성 유전자를 함유하는 플라즈미드를 추가로 도입하여 수득된 형질전환체를 L-라이신 생산배지에서 배양한 후 L-라이신 하이드로클로라이드의 생산량을 측정한다. 결과를 표 20에 나타내었다.
W3110 균주와 동일하게, dapB만이 L-라이신 생산성에 향상 효과가 있고 제3 속도 결정 단계인 것으로 이해된다.
(4)제4 속도 결정 단계의 특정
이. 콜라이 C 균주에 dapA*, lysC*및 dapB를 함유하는 플라즈미드 pCAB1을 도입하고, L-라이신 생합성계 유전자를 함유하는 플라즈미드를 추가로 도입하여 수득된 형질전환체를 L-라이신 생산배지에서 배양한 후 L-라이신 하이드로클로라이드의 생산량을 측정한다. 결과를 표 21에 나타내었다.
W3110 균주에서와 동일하게, DDH만이 L-라이신 생산성에 향상 효과가 있고 제4 속도 결정 단계인 것을 알 수 있다.
(5) dapC, dapD, dapE 및 dapF간의 속도 결정 단계의 해석
pCAB1을 보유하는 이. 콜라이 C 균주에 DDH 대신에 dapD, dapE 또는 dapF 유전자를 갖는 플라즈미드를 도입하고, L-라이신 생산 배양을 수행한다. 결과를 표22에 나타내었다.
C 균주에 있어서도 W3110 균주와 동일하게 dapD 및 dapE의 2단계가 속도 결정을 하는 것으로 이해된다.
이상과 같이 K-12 및 C와 계열이 상이한 균주도 동일한 속도 결정 순위를 가지므로 dapA* 및 lysC*의 도입, dapB 및 DDH(또는 dapD 및 dapE)의 증강을 이러한 순서대로 수행함으로써 L-라이신 생산성을 단계적으로 향상시킬 수 있다는 개념은 이. 콜라이 전체에 적용되는 것으로 생각된다.
본 발명에 의해, L-라이신에 의한 피드백 억제가 충분히 해제된 에스케리키아 속 세균 유래의 DDPS 돌연변이 유전자를 수득한다. 이 유전자는 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제를 보유하는 에스케리키아 속 세균에 도입함으로써 종래보다도 더욱 개량된 L-라이신 생산 세균을 수득하는 것이 가능하다.
더욱이, 상기 L-라이신 생산 세균의 dapB 및 DDH(또는 dapD 및 dapE)를 이러한 순서로 증강시킴으로써 L-라이신 생산성을 향상시킬 수 있다.
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(ii)발명의 명칭: 발효법에 의한 L-라이신의 제조방법
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특징을 나타내는 기호: 프라이머 결합
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Claims (7)

  1. 서열 목록의 서열확인번호:3에 기재된 디하이드로디피콜리네이트 신타제(DDPS)의 아미노산 서열중 N-말단으로부터 계수하여, 81번의 알라닌 잔기가 발린 잔기로 치환된 돌연변이, 118번 히스티딘 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이, 및 81번 알라닌 잔기가 발린 잔기로 치환되고 118번 히스티딘 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된, L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 에스케리키아(Escherichia) 속 세균 유래의 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 DNA.
  2. 서열 목록의 서열확인번호:4에 기재된 디하이드로디피콜리네이트 신타제의 아미노산 서열중 N-말단으로부터 계수하여, 81번 알라닌 잔기가 발린 잔기로 치환된 돌연변이, 118번 히스티딘 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이, 및 81번 알라닌 잔기가 발린 잔기로 치환되고 118번 히스티딘 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된, L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 에스케리키아 속 세균 유래의 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 DNA를 세포내에 도입함으로써 형질전환시킨 에스케리키아 속 세균.
  3. 제2항에 있어서, 서열 목록의 서열확인번호:8에 기재된 아스파르토키나제III의 아미노산 서열중 N-말단으로부터 계수하여,
    (a) 323번 글라이신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환된 돌연변이,
    (b) 323번 글라이신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되고 408번 글라이신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환된 돌연변이,
    (c) 34번 아르기닌 잔기가 시스테인 잔기로 치환되고 323번 글라이신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환된 돌연변이,
    (d) 325번 루이신 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이,
    (e) 318번 메티오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환된 돌연변이,
    (f) 318번 메티오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환되고 349번 발린 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이,
    (g) 345번 세린 잔기가 루이신 잔기로 치환된 돌연변이,
    (h) 347번 발린 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이,
    (i) 352번 트레오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환된 돌연변이,
    (j) 352번 트레오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환되고 369번 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이,
    (k) 164번 글루탐산 잔기가 라이신 잔기로 치환된 돌연변이 및
    (l) 417번 메티오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환되고 419번 시스테인 잔기가 타이로신 잔기로 치환된 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된, L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 돌연변이를 갖는 에스케리키아 속 세균 유래의 아스파르토키나제 III을 암호화하는 DNA를 세포내에 도입시킴으로써 L-라이신에 의한피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제를 보유함을 특징으로 하는 에스케리키아 속 세균.
  4. 제3항에 있어서, 디하이드로디피콜리네이트 환원효소 유전자를 에스케리키아 속 세균 세포내에서 자율적으로 복제가능한 벡터에 연결한 재조합 DNA로 형질전환시킨 에스케리키아 속 세균.
  5. 제4항에 있어서, 코리네형 세균 유래의 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 유전자를 에스케리키아 속 세균 세포내에서 자율적으로 복제가능한 벡터에 연결한 재조합 DNA로 형질전환시킨 에스케리키아 속 세균.
  6. 제4항에 있어서, 테트라하이드로디피콜리네이트 석시닐라제 유전자 및 석시닐디아미노피멜레이트 데아실라제 유전자를 에스케리키아 속 세균속에서 자율적으로 복제가능한, 동일하거나 상이한 벡터에 연결시킨 단일의 재조합 DNA 또는 2개의 재조합 DNA로 형질전환시킨 에스케리키아 속 세균.
  7. 제2항 내지 제6항 중의 어느 한 항에서 기재된 에스케리키아 속 세균을 적절한 배지에서 배양하고 배양물 중에 L-라이신을 생산 축적시키고, 배양물로부터 L-라이신을 수집함을 포함하는, L-라이신의 제조 방법.
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