MXPA03007089A - Construccion de polinucleotidos para produccion incrementada de lisina. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a la produccion de lisina y proporciona varias moleculas aisladas de polinucleotidos utiles para la produccion de L-lisina. Este polinucleotido codifica una aspartato cinasa (ask), aspartato-semialdehido deshidrogenasa (asd) y una dihidrodipicolinato reductasa (dapB). Otros polipeptidos codifican ask, asd, dapB y una diaminopimelato deshidrogenasa (ddh); el polipeptido de ask, asd, dapB, ddh y ORF2; y ask, asd, dapB, ddh, ORF2 y diaminopimelato descarboxilasa (lysA) La invencion ademas proporciona metodos para elaborar y utilizar los polinucleotidos y metodos para incrementar la produccion de L-lisina.

Description

CONSTRUCCIONES DE POLINUCLEÓTIDOS PARA PRODUCCIÓN INCREMENTADA DE LISINA Campo de la Invención La invención se refiere a la producción de lisina y proporciona varias moléculas aisladas de polinucleótidos útiles para la producción de L-lisina. Este polinucleótido codifica una aspartato cinasa (ask) , una aspartato-semialdehído deshidrogenasa (asd) y una dihidrodipicolinato reductasa (dapB) . Otros polipéptidos codifican ask, asd, dapB y una diaminopimelato deshidrogenasa (ddh) ; ask, asd, dapB, ddh y un polipéptido de ORF2 ; y ask, asd, dapB, ddh, OKP2 y una diaminopimelato descarboxilasa (lysA) . La invención además proporciona métodos para elaborar y utilizar los polinucleótidos y métodos para incrementar la producción de L-lisina .

Antecedentes de la invención La L-lisina es un producto económico, importante que se obtiene principalmente por medio de la fermentación a escala industrial utilizando las bacterias Gram positivas Corynebacterium gluta icum, Brevibacterium flavum y Brevibacterium lactofermentum ( leemann, A. y colaboradores, REP: 149075 Amino Acids, en ULLMANN'S ENCICLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY, volumen A2, páginas 57-97, Weinham: VCH-Verlagsgesellschaft (1985)). La estereoespecificidad de los aminoácidos producidos por medio de la fermentación hace ventajoso el proceso comparado con los procesos sintéticos; generalmente, los aminoácidos de forma L son producidos por medio del proceso de fermentación microbiana. La producción de L-lisina y otros aminoácidos a través de la fermentación, utilizando fuentes de carbono económicas tales como molasas, glucosa, ácido acético y etanol, es un medio de producción relativamente poco costoso. Varios procesos de fermentación que utilizan diversas cepas aisladas por sus propiedades auxotróficas o de resistencia son conocidos en el campo para la producción de L-lisina: la patente norteamericana No. 2,979,439 describe imitantes que requieren la complementación de aminoácidos (homoserina o I-metionina y L-treonina) ; la patente norteamericana No. 3,700,557 describe mutantes que tienen un requerimiento nutricional de L-treonina, L-metionina, L-arginina, L-histidina, L-leucina, L-isoleucina, L-fenilalaninar L-cistina, o L-cisteina, la patente norteamericana -¾o. 3,707,441 describe un mut nte que tiene resistencia a un análogo de L-lisina; la patente norteamericana No. 3,687,810 describe un mutante que tiene tanto capacidad para producir L-lisina como resistencia a bacitracina, penicilina G o polimixina; la patente norteamericana No. 3,708,395 describe mutantes que tienen un requerimiento nutricional de homoserina, L-treonina, L-treonina y L-metionina, L-leucina, L-isoleucina o mezclas de las mismas y resistencia a L-lisina, L-treonina, L-isoleucina o análogos de las mismas; la patente norteamericana No. 3,825,472 describe un mutante que tiene resistencia a un análogo de L-lisina; la patente norteamericana No. 4,169,763 describe cepas mutantes de Corynebacterium que producen L-lisina y son resistentes a por lo menos uno de los análogos aspárticos y fármacos sulfa; la patente norteamericana No. 5,846,790 describe una cepa mutante capaz de producir ácido L-glutámico y L-lisina en ausencia de cualquier agente de supresión de acción de biotina; y la patente norteamericana No. 5,650,304 describe una cepa que pertenece al género Corynebacterium o Brevibacterium para la producción de L-lisina que es resistente a 4-N- (D-alanil) -2, 4-diamino-2, 4-didesoxi-L-arabinosa, 2 , 4-didesoxi-L-arabinosa o un derivado de las mismas. Se conoce una cantidad considerable sobre la vía bioquímica para la síntesis de L-lisina en ~ la' especie Corynebacterium (recientemente revisada por j3ahm y colaboradores, Ann. IV. Y. Acad. Sci. 782:25-39 (1996)). La entrada en la vía de L-lisina comienza con L-aspartato (véase la figura 1), el cual en sí es producido por la transaminación de oxaloacetato . Una característica especial de C. glutamicum es su capacidad para convertir el producto intermediario de L-lisina, 2, 6-dicarboxilato de piperidina, a diaminopimelato por dos diferentes rutas, es decir, por reacciones que involucran los productos intermediarios succinilados o por medio de la reacción individual de diaminopimelato deshidrogenasa . Por lo general, el flujo de carbono dentro de la vía es regulado en dos puntos: primero, a través de la inhibición de retroalimentación de aspartato cinasa por los niveles de tanto L-treonina como L-lisina; y segundo, a través del control del nivel de dihidrodipicolinato sintasa. Por lo tanto, la producción incrementada de L-lisina se puede obtener en la especie Corynebacterium por medio de la desrregulación e incremento de la actividad de estas dos enzimas. Los desarrollos más recientes en el área de la producción fermentativa de L-lisina involucran el uso de técnicas de biología molecular para aumentar la producción de L-lisina. Se proporcionan los siguientes ejemplos: las patentes norteamericanas Nos. 4,560,654 y 5,236,831 describen una cepa mutante productora de L-lisina obtenida por medio de la transformación de un microorganismo hospedero de la especie Corynebacterium o Brevibacteriu , el cual es sensible a la S- (2-aminoetil) -cisterna con una molécula de ADN recombinante en donde el fragmento de ADN que confiere tanto resistencia a S- (2-aminoetil) -cisterna como capacidad de producción de L-lisina es insertado en un ADN del vector; la patente norteamericana No. 5,766,925 describe una cepa mutante producida por medio de la integración de un gen que codifica la aspartocinasa, que se origina de bacterias corineforraes, con la inhibición de la retroalimentación desensibilizada por L-lisina y L-treonina, en el ADN cromosómico de una bacteria de la especie Corynebacterium que hospeda una homoserina deshidrogenasa de tipo penetrable o una especie Corynebacterium deficiente en el gen de homoserina deshidrogenasa; la producción incrementada de L-lisina se obtiene mediante la amplificación de genes por medio de un vector de plásmido o utilizando una estrategia de reemplazo de genes . Las solicitudes de patente europeas EP 0 811 682 A2 y EP 0 854 189 A2 ambas proporcionan la producción incrementada de L-lisina en la especie ¦ Corynejacte uzn por medio de la amplificación de genes basada en el número de copias de plásmidos .

Sumario de la invención Un objetivo de la invención es proporcionar una molécula aislada de polinucleótido, referida en este texto como el polinucleótido de DB, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de aspartato cinasa (ask) ; una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de aspartato semialdehido deshidrogenasa (asd) y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de dihidrodipicolinato reductasa (dapB) . El polinucleótido puede comprender además un ácido nucleico que codifica un polipéptido de diaminopimelato deshidrogenasa (ddh) completo o truncado (el polinucleótido de KDBH) , o un ácido nucleico que codifica el polipéptido de 0RF2 completo o truncado (el polinucleótido de KDB2) . Además, la invención proporciona una molécula aislada de polinucleótido, referida en este texto como el polinucleótido de KDB2HL, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica polipéptidos de ask, asd, dapB, ddh, oRF2 y diaminopimelato descarboxilasa (lysA) , en los cuales los polipéptidos de ddh, ORF2 y lysA pueden estar completos o truncados. En una modalidad preferida, una molécula de polinucleótido de la invención además comprende un promotor Pl adyacente al extremo 5r de la molécula de nucleótidos que codifica a lysA. El objetivo adicional de la invención es proporcionar un método para la producción incrementada de L-lisina en una célula hospedera por medio de la transformación de una célula hospedera con las moléculas de polinucleótidos ^ descritas anteriormente. De acuerdo con el método de la presente invención, las moléculas aisladas de polinucleótidos descritas anteriormente se integran establemente en un cromosoma de la célula hospedera, o se mantienen como ADN extracromosómico, tal como un plásmido, y las células hospederas transformadas se seleccionan por la producción incrementada de L-lisina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Un diagrama esquemático de la vía biosintetica de L-lisina en Corynebacterium glutamicum. Figuras 2A, 2B. La secuencia de nucleótidos (SEC ID N0:1) y aminoácidos (SEC ID NO: 2) de ask (secuencia ATCC 21529) . Figuras 3A, 3B. La secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 3) y aminoácidos (SEC ID NO: 4) de asd (secuencia ATCC 21529) . Figura 4. La secuencia de nucleótidos (SEC ID N0:5) y aminoácidos (SEC ID NO: 6) de dapB (NR L-B11474) . Figuras 5A, 5B. La secuencia de nucleótidos (SEC ID N0:7) y aminoácidos (SEC ID N0:8) de ddh (NR L-B11474) . Figura 6. La secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 9) y aminoácidos (SEC ID NO: 10) de ORF2. Figuras 7A, 7B, 7C. La secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 11) y aminoácidos (SEC ID NO:12) de lysA. Figura 8. La secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 13) y aminoácidos (SEC ID NO: 14) de ORF2 truncado. Figura 9. La secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 15) del promotor Pl, el primer promotor del operón argS-lysA de pRS6. Figura 10. Comparación de la secuencia de aminoácidos de aspartocinasa {ask} de ATCC13032, Ni3 y ATCC21529. Figuras 11A y 11B. Un diagrama esquemático de la estructura de la construcción pDElia2FC5- DB. Figura 12. Un diagrama esquemático de la estructura de la construcción p l84-KDBH. Figura 13. Un diagrama esquemático de la estructura de la construcción pDElia2Fcs-KDB2. Figuras 14A, 14B. Un diagrama esquemático de la estructura de la construcción pDElia2FC5- DB2HPlL .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS A. Definiciones A fin de proporcionar un entendimiento claro y consistente de la especificación y reivindicaciones, inclusive el alcance que se le dará a .esos términos, se proporcionan las siguientes definiciones. También se observará que el término "una" entidad, se refiere a una o más de esa entidad, por ejemplo, "un polinucleótido" se entiende que representa uno o más polinucleótidos . Auxotrófico . Como se utiliza en este texto, el término se refiere una cepa de microorganismos que requiere para el crecimiento de una fuente externa de un metabolito específico que no puede ser sintetizado debido a un defecto genético adquirido. Complemento de Aminoácido. Como se utiliza en este texto, el término se refiere a un aminoácido requerido para el crecimiento y adicionado a los medios mínimos para soportar el crecimiento auxotrófico. Integración Cromosómica. Como se utiliza en este texto, el término se refiere a la inserción de un fragmento de ADN exógeno dentro del cromosoma de un organismo hospedero; más particularmente, el término se utiliza para referirse a la recombinación homologa entre un fragmento de ADN exógeno y la región apropiada del cromosoma de la célula hospedera. Derivado de Alto Rendimiento. Como se utiliza en este texto, el término se refiere a una cepa de microorganismos que produce un rendimiento más alto a partir de dextrosa de un aminoácido específico cuando se compara con la cepa de origen de la cual se deriva. Célula Hospedera. Como se utiliza en este texto, el término célula hospedera" se propone que es intercambiable con el término "microorganismo". Donde se propone una diferencia, la diferencia se hará clara. Molécula Aislada de Ácido Nucleico. Como se utiliza en este texto, se propone que el término significa una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, la cual ha sido removida de su ambiente nativo. Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un . ector se consideran aisladas para los propósitos de la presente invención. Los ejemplos adicionales de moléculas aisladas de ADN incluyen moléculas de ADN recombinante mantenidas en células hospederas heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas aisladas de ARN incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN de la presente invención. Las moléculas aisladas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención incluyen además estas moléculas producidas de manera sintética. Genes de la Via Biosintética de Lisina. Como se utiliza en este texto, el término "gen (es) de la via biosintética de lisina" significa que incluye aquellos genes y fragmentos de genes que codifican péptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas, los cuales están involucrados directamente en la síntesis de lisina. Estos genes pueden ser idénticos a aquellos de origen natural dent.ro de una célula hospedera y están involucrados en la síntesis de lisina dentro de una célula hospedera. Alternativamente, puede haber modificaciones o mutaciones de tales genes, por ejemplo, los genes pueden contener modificaciones o mutaciones las cuales no afectan significantemente la actividad biológica de la proteina codificada. Por ejemplo, el gen natural puede ser modificado por medio de la mutagénesis o por medio de la introducción o sustitución de uno o más nucleótidos o por medio de la remoción de las regiones no esenciales del gen. Estas modificaciones se realizan fácilmente por medio de técnicas estándar. Proteina de la Via Biosintética de Lisina. Como se utiliza en este texto, el término "proteina de la via biosintética de lisina" significa que incluye aquellos péptidos, polipéptidos , proteínas y enzimas, los cuales están involucrados directamente en la sintesis de lisina a partir de aspartato. También están incluidas las secuencias de aminoácidos codificadas por medio de marcos de lectura abiertos (ORF, por sus siglas en inglés) , donde el ORF está asociado con un operón de la via biosintética de lisina. Estas proteínas pueden ser idénticas a aquellas de origen natural dentro de una célula hospedera y están involucradas en la sintesis de lisina dentro de esa célula hospedera. Alternativamente, puede haber modificaciones o mutaciones de tales proteínas, por ejemplo, las proteínas pueden contener modificaciones o mutaciones las cuales no afectan significantemente la actividad biológica de la proteína. Por ejemplo, la proteina natural puede ser modificada por medio de la mutagénesis o por medio de la introducción o sustitución de uno o más aminoácidos, preferiblemente por medio de la sustitución conservadora de aminoácidos o por medio de la remoción de regiones no esenciales de la proteina. Estas modificaciones se realizan fácilmente por medio de técnicas estándar. Alternativamente, las proteínas biosintéticas de lisina pueden ser heterólogas a la célula hospedera particular. Estas proteínas pueden ser de cualquier organismo que tenga genes que codifican las proteínas que tengan papeles biosintéticos iguales o similares. Mutagénesis. Como se utiliza en este texto, el término se refiere a .un proceso mediante el cual se genera una mutación en el ADN. Con la mutagénesis "aleatoria", no es predecible el sitio exacto de la mutación, que ocurre en cualquier parte en el genoma .del microorganismo, y la mutación se produce como resultado de un daño físico causado por agentes tales como radiación o tratamiento químico. La mutagénesis de ADNr se dirige al ADN clonado de interés y puede ser aleatoria o dirigida al sitio. Mutación. Como se utiliza en este texto, el término se refiere a un cambio, inserción o supresión de uno o más pares de bases p;^una combinación de los mismos, en la secuencia de nucleótidos de interés. Enlazado de Manera Operable. Como se utiliza en este texto, el término "enlazado de manera operable" se refiere a un enlace de elementos de polinucleótidos en una relación funcional. Un ácido nucleico es "enlazado de manera operable" cuando es colocado dentro de una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o intensificador es enlazado de manera operable a una secuencia de codificación si éste afecta la transcripción de la secuencia de codificación. Enlazado de manera operable significa que las secuencias de ADN que son enlazadas son típicamente contiguas y, donde sea necesario, unen dos regiones de codificación de proteína, contiguas y en el marco de lectura. Sin embargo, puesto que los intensificadores funcionan generalmente cuando están separados del promotor por varias kilobases y las secuencias intrónicas pueden ser de longitudes variables, algunos elementos de polinucleótidos pueden ser enlazados de manera operable pero no contiguos. Operón . Como se utiliza en este texto, el término se refiere a una porción contigua de un complejo transcripcional en el cual dos o más marcos de lectura abiertos que codifican los polipéptidos son transcritos como un ARN mensajero, muíti-cistronico, controlado por un promotor de acción cis y otras secuencias de acción- c'is necesarias para la transcripción eficiente, así como también secuencias de acción cis adicionales que son importantes para la transcripción y traducción eficiente (por ejemplo, regiones que controlan la estabilidad del ARNm y regiones de terminación de transcripción) . El término también se refiere generalmente a una unidad de expresión y regulación de genes , que incluye los genes estructurales y elementos reguladores en el ADN. Cepa Paren eral . Como se utiliza en este texto, el término se refiere a una cepa de una célula hospedera sujetada a alguna forma de tratamiento para producir la célula hospedera de la invención. Porcentaje de Producción a Partir de Dextrosa. Como se utiliza en este texto, el ' término se refiere a la producción de aminoácidos a partir de dextrosa definida por la fórmula [ (g de aminoácidos producidos/g de dextrosa consumida) *100] = % de rendimiento. Fenotipo. Como se utiliza en este texto, el término se refiere a características físicas, observables que son dependientes de la constitución genética de una célula hospedera . Promotor. Como se utiliza en este texto, el término "promotor" tiene su significado reconocido en el campo, que representa una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la unión de la polimerasa de ARN y la iniciación de la transcripción y de esta manera se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. Las secuencias promotoras son comúnmente, pero no siempre, encontradas en las regiones no codificadoras 5' de los genes. En general, una secuencia codificadora está localizada 3' con respecto a una secuencia promotora. Los elementos de secuencia dentro de los promotores que funcionan en el inicio de la transcripción están caracterizados frecuentemente por las secuencias de nucleótidos consensúales. La secuencia promotora consiste de elementos corriente arriba próximos y más distales (intensificadores) . Como se utiliza en este texto, el término "promotor endógeno" se refiere a una secuencia promotora la cual es una secuencia promotora de origen natural en ese microorganismo hospedero. El término "promotor heterologo" se refiere a una secuencia promotora que es una secuencia promotora de origen no natural en ese microorganismo hospedero. La secuencia promotora de origen heterologo puede ser de cualquier organismo procariótico o eucariótico. Un promotor sintético es una secuencia de nucleótidos, que tiene actividad promotora y no se encuentra naturalmente en existencia. Los promotores se pueden derivar en su totalidad de un gen nativo, o pueden ser promotores híbridos. Los promotores híbridos están compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o aún comprenden segmentos de ADN sintético. Los promotores híbridos pueden ser constitutivos, inducibles o sensibles ambientalmente. Los promotores útiles incluyen promotores constitutivos e inducibles. Muchas de estas secuencias promotoras son conocidas en el campo. Véase, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,980,285; 5,631,150; 5,707,828; 5,759,828; 5,888,783; 5,919,670, y Sambrook y colaboradores, Molecular Clonlng: A Laboratory Manual. 2-Edición, Cold Spring Harbor Press (1989) . Otros promotores útiles incluyen los promotores que ni son constitutivos ni son sensibles a una molécula inductora, específica (o conocida) . Estos promotores pueden incluir aquellos que responden a señales de desarrollo (tales como la fase de crecimiento del cultivo) o señales ambientales (tales como pH, osmosis, calor o densidad de células, por ejemplo). Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción por medio de los promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada o la presencia de luz. Aquellas personas expertas en el campo entenderán que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tipos de células o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores que causan que un gen sea expresado en la mayoría de tipos de células en la mayoría de momentos son referidos comúnmente como "promotores constitutivos". Se reconoce además que puesto en la mayoría de casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no han sido definidos completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener actividad promotora idéntica o similar. Crecimiento Relativo. Como se utiliza en este texto, el término se refiere una medición que proporciona una valoración del crecimiento al comparar directamente el crecimiento de una cepa de origen .con aquel . de una cepa progenie durante un periodo de tiempo definido y con un medio definido .

B. Metodologías de ADN Microbiológico y Recombinante La presente invención se refiere a . un polinucleótido de KDB, el cual comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de ask, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de asd y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de dapB, en donde ??" representa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de ask. "D" representa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de asd; y WB" representa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de dapB. En' una modalidad, la presente invención se refiere a una molécula aislada del polinucleótido de KDB que comprende : 1. una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de aspartato cinasa (ask) ; 2. una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de aspartato-semialdehido deshidrogenasa (asd) ; y 3. una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de dihidrodipicolinato reductasa (dapB) . En otra modalidad, la molécula del polinucleótido de KDB consiste esencialmente de una molécula, de ácido nucleico que codifica un polipéptido de ask, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de asd y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de dapB . La presente invención también se refiere a un polinucleótido de KDBH, el cual comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de ask, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de asd, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de dapB y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de ddh, en donde "K" representa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de ask ; "D" representa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de asd; "B" representa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de dapB; y "H" representa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de ddh. En una modalidad, la molécula del polinucleótido de KDBH comprende adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de 0RF2 completo o truncado. La presente invención también se refiere a un polinucleótido de KDB2, el cual comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de ask, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de asd, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de dapB y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de 0RF2, y en donde " " representa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de ask ; "D" representa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de asd; "B" representa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de dapB; y "2" representa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de 0RF2. La presente invención también se refiere a un polinucleótido de KDB2HL, el cual comprende un nucleótido que codifica un polipéptido de ask, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de asd, una molécula de ácido' nucleico que codifica un polipéptido de dapB, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de ORF2, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de ddh y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de lysA. En una modalidad preferida, la molécula de polinucleótido de KDB2HL también comprende un promotor Pl adyacente al extremo 5' de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de lysA. En una modalidad preferida, las moléculas de polinucleótidos de la presente invención no comprenden ninguna molécula de ácido nucleico que codifica algún polipéptido de vía de lisina diferente de ask, asd, dapB, ddh y lysA. En una modalidad, un polipéptido de ask es definido como un polipéptido que tiene la actividad enzimática de la aspartato cinasa bacteriana. La actividad enzimática de la aspartato cinasa bacteriana convierte el L-aspartato a L-aspartilfosfato . En una modalidad preferida, un polipéptido de ask tendría la actividad enzimática de aspartato cinasa de ATCC21529. En una modalidad preferida, la secuencia de aminoácidos aislada ask descrita en la SEC ID NO: 2 posee propiedades únicas con respecto a la resistencia a la retroalimentación de la actividad de la enzima ask para los niveles acumulados de L-lisina y L-treonina en el medio de cultivo. Cuando se compara con las secuencias de ADN de otras secuencias del gen ask-asd. de Corynebacterium glutamicum, se observa un cambio de treonina a isoleucin^ en el residuo de aminoácido 380 que da por resultado la resistencia a la inhibición de retroalimentación. Otros cambios de aminoácidos en el residuo 380 también pueden dar por resultado una sensibilidad disminuida de la enzima ask a L-treonina y/o lilisina. Un polipéptido de asd es definido como un polipéptido que tiene la actividad enzimática de aspartato-semialdehido deshidrogenasa. La actividad enzimática de aspartato-semialdehido deshidrogenasa convierte el L-aspartilfosfato a L-aspartatosemialdehído. En una modalidad preferida, un polipéptido de asd tendría la actividad enzimática de la aspartato-semialdehido deshidrogenasa de ATCC21529. Un polipéptido de dapB es definido como un polipéptido que tiene la actividad enzimática de la dihidrodipicolinato reductasa. La actividad enzimática de la dihidrodipicolinato reductasa convierte el L-2,3-dihidrodipicolinato a L-piperidein-2 , 6-dicarboxilato . En una modalidad preferida, un polipéptido de dapB tendría la actividad enzimática de la dihidrodipicolinato reductasa de NRRL-B11474. Un polipéptido de dd es definido como un polipéptido que tiene la actividad enzimática de diaminopimelato deshidrogenasa. La actividad enzimática de diaminopimelato deshidrogenasa convierte el L-piperidein-2, 6-dicarboxilato a D, L-diaminopimelato . En una modalidad preferida, un polipéptido de ddh tendría la actividad enzimática de diaminopimelato deshidrogenasa de NRRL-B11474. Un polipéptido de lysA es definido como un polipéptido que tiene la actividad enzimática de diaminopimelato descarboxilasa. . La actividad de diaminopimelato descarboxilasa convierte el D,L-diaminopimelato a L-lisina. En una modalidad preferida, un polipéptido de lysA tendría la actividad enzimática de diaminopimelato descarboxilasa de AS019. Los polipéptidos de ask, asd, dapB, ddh, 0RF2 y lysA codificados por las moléculas de polinucleótidos de la presente invención pueden ser formas truncadas de los polipéptidos codificados por las copias genómicas de los genes ask y asd de ATCC21529, los genes dapB, ddh, 0RF2 de NRRL-B1147 y el gen lysA de AS019. Se debe observar que además de las secuencias de polipéptidos indicadas que son codificadas por las secuencias de ácido nucleico aisladas representadas por "K", "D", ??", ???", "2" y "1", aquellas secuencias aisladas de ácido nucleico también pueden incluir elementos promotores nativos para los operones representados en este texto. De esta manera, las secuencias de ask-asd pueden incluir los elementos del ~ operón ask-asd nativos, respectivos y las secuencias dapB y'^dh pueden incluir sus elementos promotores nativos, respectivos. El promotor preferido para la molécula de nucleótidos que codifica el polipéptido de lysA es el promotor Pl, el primer promotor del operón argS-.lysA. La invención proporcionada en este texto utiliza algunos métodos y técnicas que son conocidos para aquellas personas expertas en el · campo de la microbiología y tecnologías de ADN recombinante . Los métodos y técnicas para el crecimiento de células bacterianas, la introducción de moléculas aisladas de ADN en células hospederas y el aislamiento, clonación y secuenciación de moléculas aisladas de ácido nucleico, etcétera, son algunos ejemplos de tales métodos y técnicas. Estos métodos y técnicas son descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis y colaboradores, Basic Methods In Molecular Biology (1996) , J.H. Miller, Experimente in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1972); J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1992); M. Singer y P. Berg, Genes & Genomes, üniversity Science Books, Mili Valley, California (1991) ; J.Sambrook, E.F.Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); P.B. Kaufman y colaboradores, Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Ratón, Florida (1995) ; Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick y J.E. Thompson, eds . , CRC Press, Boca Ratón, Florida (1993); y P.F. Smith-Keary, Molecular Genetic of Escherichia coli, The Guilford Press, Nueva York, NY (1989), todas los cuales se incorporan en este texto a manera de referencia en su totalidad. En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de ask seria al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la SEC ID NO:l. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de asd sería al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la SEC ID N0:3. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de dapB seria al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la SEC ID NO: 5, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de ddh sería al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la SEC ID NO: 7, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de ORF2 sería al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEC ID NO: 9 y un ácido nucleico que codifica un polipéptido de lysA sería al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEC ID NO: 11 o el complemento de la misma. En una modalidad preferida, la secuencia de ácido nucleico de un promotor Pl sería al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEC ID NO: 15. En una modalidad, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de 0RF2 truncado sería al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a la SEC ID NO: 13. Como sabrá una persona experta en el campo, cualquier cepa de la especie Corynebacterium, particularmente de Corynebacterium glutamicu , . se puede utilizar para el aislamiento de moléculas ácido nucleico que serían utilizadas para amplificar el número de genes de la vía biosintética de aminoácido localizada cromosómicamente . Particularmente, las cepas preferidas incluyen: NRRL-B11474, ATCC 21799, ATCC 21529, ATCC 21543 y E12. Como un tema práctico, si cualquier secuencia de ácido nucleico particular es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que consiste de la SEC ID NO:l, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC' ID NO: 13, SEC ID NO: 15 o una secuencia complementaria de las mismas, se puede determinar convencionalmente utilizando programas de computadora para el análisis de secuencias tales como OMIGA® Versión 2.0 para Windows, disponible de Oxford Molecular, Ltd. (Oxford, U.K.). OMIGA utiliza el algoritmo de alineamiento CLUSTAL W utilizando el método de alineamiento de programación dinámico, completo, lento con parámetros por omisión de una penalidad por espacio abierto de 10 y una penalidad por espacio extendido de 5.0, para encontrar el mejor alineamiento entre dos secuencias de nucleótidos.

Cuando se utiliza CLUSTAL W o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros son establecidos, por supuesto, de tal manera que el porcentaje de identidad sea calculado sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia de tal manera que se permitan espacios, malapareamientos o inserciones de hasta 5% del .número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Otros programas de análisis de secuencias, conocidos en el campo, se pueden utilizar en la práctica de la invención. A menos que se indique de otra manera, todas las secuencias de nucleótidos descritas en este texto se determinaron utilizando un secuenciador de ADN automatizado (tal como el Modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.) y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de ADN descritas en este texto se predijeron por medio de la traducción de la secuencia de ADN relativa. Por lo tanto, como se sabe en el campo, para cualquier secuencia de ADN determinada por este planteamiento automatizado, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en este texto puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por medio de la automatización son típicamente al menos aproximadamente 90% idénticas, más típicamente al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99.9% idénticas a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real puede ser determinada de manera más precisa por otros planteamientos que incluyen los métodos de secuenciación manual de ADN bien conocidos en el campo. Es bien sabido en el campo que los aminoácidos son codificados al nivel de ácido nucleico por uno o más codones (degeneración de códigos) . También se sabe en el campo que la selección de codones puede influir en la expresión de una secuencia de aminoácidos particular (proteína, polipéptido, etcétera) . De esta manera, la invención se dirige además a moléculas de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos de ask de la SEC ID NO: 2 en donde la molécula de ácido nucleico comprende cualquier codón conocido que codifica un aminoácido particular. De igual manera, la invención se dirige a los polinucleótidos de KDB, KDBH, KDB2 y KDB2HL que comprenden secuencias de ácido nucleico que comprenden codones alternativos a fin de optimizar la expresión de la proteína o polipéptido. Será reconocido en el campo que algunas secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser variadas sin un efecto significante de la estructura o función de las proteínas descritas en este texto. Las variantes incluidas pueden constituir supresiones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones de tipos siempre y cuando la actividad de la enzima no sea afectada significantemente. La guia concerniente a que cambios de aminoácidos probablemente deben de ser taciturnos fenotipicamente se puede encontrar en Bowie, J.U. y colaboradores, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, " Science 247:1306-1310 (1990). - Se prefiere que los polipéptidos obtenidos mediante la expresión de las moléculas de polinucleótidos de la presente invención tendrían al menos aproximadamente 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14. El polipéptido truncado de 0RF2 tiene al menos aproximadamente 25% de la longitud completa de un polipéptido de ORF2, preferiblemente el polipéptido de ORF2 de la SEC ID NO: 10. En una modalidad, un polipéptido truncado de ORF2 tiene la secuencia de la SEC ID NO: 14. Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido se propone que la secuencia de aminoácidos del polipéptido reclamado ~seá idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia del polipéptido reclamado puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos del aminoácido de referencia del polipéptido. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 5% de los residuos .de aminoácidos en la secuencia de referencia pueden ser suprimidos o sustituidos con otro aminoácido o un número de aminoácidos de hasta 5% de los residuos de aminoácidos totales en la secuencia de referencia pueden ser insertados en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, interpuestas ya sea individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos sin la secuencia de referencia. Como un tema práctico, si cualquier polipéptido particular es al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14 o la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico se puede determinar convencionalmente utilizando programas de computadora conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package,~ Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University <^ Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) . Cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se establecen, por supuesto, de tal manera que el porcentaje de identidad sea calculado sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y que se permitan espacios en la homología de hasta 5% del número total de residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia. En una modalidad específica, la identidad entre una secuencia de referencia (secuencia en cuestión, una secuencia de la presente invención) y una secuencia objetivo, también referida como alineamiento de secuencia global, se determina utilizando el programa de computadora FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y colaboradores, (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). Los parámetros preferidos que se utilizan en un alineamiento de aminoácidos FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-clave=2, Penalización por malapareamiento=l, Penalización por unión=20, Longitud de Grupo de Aleatorización=0 , Registro de Corte=l, Tamaño de Ventana=longitud de secuencia, Penalización por Espacio=5, Penalización por Tamaño de Espacio=0.05, Tamaño de Ventana=500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos objetivo, sí es más corta. De acuérdo con esta modalidad, si la secuencia objetivo es más corta que la secuencia en cuestión debido a las supresiones N- o C-terminales, no debido a las supresiones internas, se hace una corrección manual a los resultados para tomar en consideración el hecho que el programa FASTDB no da cuenta de los truncamientos N- y C-terminales de la secuencia objetivo cuando se calcula el porcentaje global de identidad. Para las secuencias objetivo truncadas en las terminaciones N y C, con relación a la secuencia en cuestión, el porcentaje de identidad es corregido al calcular el número de residuos de la secuencia en cuestión que son N- y C-terminales de la secuencia objetivo, los cuales no son igualados/alineados con un residuo objetivo correspondiente, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia en cuestión. Una determinación de si un residuo es igualado/alineado se determina por los resultados del alineamiento de secuencias FASTDB. Este porcentaje entonces es restado del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior utilizando los parámetros especificados, para llegar al registro de porcentaje final de identidad. Este registro de porcentaje final de identidad es lo que se utiliza para los propósitos de esta invención. Solo los residuos para las terminaciones N y C de la secuencia objetivo, los cuales no son igualados/alineados con la secuencia en cuestión, son considerados para los propósitos de 'ajuste manual del registro de porcentaje de identidad. ;¾sto es, solo las posiciones de los residuos en cuestión fuera de los residuos N- y C-terminales más lejanos de la secuencia objetivo. Por ejemplo, una secuencia objetivo de 90 residuos de aminoácidos es alineada con una secuencia en cuestión de 100. residuos para determinar el porcentaje de identidad. La supresión ocurre en la terminación N de la secuencia objetivo y por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra un igualamiento/alineamiento de .los primeros 10 residuos en la terminación N. Los 10 residuos no apareados representan 10% de la secuencia (número de residuos en las terminaciones N y C no igualados/número total de residuos en la secuencia en cuestión) de modo que 10% es restado del registro de porcentaje de identidad calculado por el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes fueran igualados perfectamente, el porcentaje de identidad seria 90%. En otro ejemplo, una secuencia objetivo de 90 residuos es comparada con una secuencia en cuestión de 100 residuos. En este momento, las supresiones son supresiones internas de manera que no existen residuos en las terminaciones y C de la secuencia objetivo que no sean igualados/alineados con la secuencia en cuestión. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no es corregido manualmente. Una vez más, solo las posiciones de residuos fuera de los extremos N- y C-terminales de la secuencia objetivo, exhibida en el alineamiento FASTDB, que no son .igualadas/alineadas con la secuencia en cuestión son corregidas manualmente.

C. Métodos y Procesos de la Invención Varias modalidades de la invención proporcionan métodos para utilizar las moléculas de polinucleótidos de KDB, KDBH, KDB2 y KDB2HL. En, una modalidad preferida, cualquiera de estas moléculas de polinucleótidos se utiliza para incrementar la producción de lisina a partir de una célula hospedera. La vía de aminoácido para la biosíntesis de L-lisina es bien conocida para aquellos artífices expertos de la producción de aminoácidos. Los genes que codifican las enzimas importantes para la conversión de L-aspartato a L-lisina incluye los genes ask, asd, dapA, dapB, ddh y lysA (figura 1) . De esta manera, la invención proporciona en este texto las modalidades específicas que utilizan los genes de la vía biosintética de L-lisina. Las moléculas aisladas de polinucleótidos de la invención son propagadas y mantenidas preferiblemente en un vector de ácido nucleico apropiado. Los métodos para el aislamiento y clonación de las moléculas aisladas de ácido nucleico de la invención son bien conocidos para aquellas personas expertas en el campo de la tecnología de ADN recombinante. Los vectores y métodos apropiados para el uso con hospederos procarióticos y eucarióticos son descritos por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, la descripción de la cual se incorpora por este acto a manera de referencia. En la invención se puede utilizar una gran variedad de vectores. Estos vectores incluyen vectores cromosómieos, episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos y de bacteriófagos, asi como también vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos, todos se pueden utilizar de acuerdo con este aspecto de la presente invención. Los vectores retrovirales pueden ser capaces de la replicación o pueden ser defectuosos para la replicación. En el último caso, la propagación viral ocurrirá generalmente solo en las células hospederas complementarias. Se prefieren los vectores adecuados para mantener y propagar un polinucleótido en un hospedero bacteriano. Se conoce un gran número de vectores y promotores adecuados para el uso en bacterias, muchos de los cuales son comercialmente disponibles. Los vectores procarióticos preferidos incluyen plásmidos tales como aquellos capaces de la replicación en E. coli (tales como, por ejemplo, pBR322, ColEl, pSClOl, pACYC 184, VX) . .Estos plásmidos son, por ejemplo, descritos por Maniatis, T. y colaboradores, In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). Los siguientes vectores se proporcionan a manera de ejemplo: pET (Novagen) , pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) , pBs, phagescript, psiX174, pBlueScript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNHl8a, pNH46a (Stratagene) , pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia) . Los vectores preferidos para las moléculas aisladas de ácido nucleico de la invención incluyen la familia novedosa de pFCl a- pFC7 de los vectores de clonación combinatoria (Lonsdale, D.M. y colaboradores, Plant Molecular Blology Repórter 23:343-345 (1995)) y el vector pK184 (Jobling, M.G. y Homes, R.K., Nuclelc Acld Research 18:5315-5316 (1990) ) . Otro grupo de vectores preferidos son aquellos que son capaces de la replicación autónoma en especies de Corynebacterium. Estos vectores son bien conocidos para aquellas personas expertas en el campo de la producción de aminoácidos por medio de la fermentación microbiana, ejemplos de los cuales incluyen pSRl, p F101 a y vectores derivados de los mismos. Otros vectores adecuados serán fácilmente aparentes para el artífice experto. Un polinucleótido de KDB, KDBH, KDB2 o KDB2HL puede ser unido a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación^,en un hospedero. Los vectores pueden incluir al menos un marcador seleccionable. En este respecto, los vectores contienen preferiblemente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotipico para la selección de células hospederas transformadas . Estos marcadores incluyen resistencia a dihidrofolato reductasa, G418 o neomicina para el cultivo de células eucarióticas y genes de resistencia a tetraciclina, canamicina o ampicilina, o ún gen autotrófico que permite que la célula hospedera se desarrolle en ausencia de un nutriente por lo que la cepa de células hospederas es autotrófica normalmente . Los ejemplos representativos de hospederos apropiados incluyen, pero no están limitados a, células bacterianas, tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngales, tales como células de levadura y células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9. Los medios y condiciones de cultivo apropiados para las células hospederas descritas anteriormente son conocidos en el campo. Si se propone que el vector sea mantenido en la célula hospedera extra-cromosómicamente, éste contendrá, además y procedente de la replicación, que permitirá que éste se duplique en la célula hospedera. Alternativamente, si se desea que el vector se integre en el cromosoma, el vector se construye de manera que no pueda duplicarse en la célula hospedera. Por ejemplo, un vector podría ser capaz de la propagación en otro organismo, por ejemplo E. coli, pero puede carecer del origen apropiado de replicación para ser propagado en Corynebacterium. En otro aspecto de esta modalidad, el vector es un vector transportador el cual se puede duplicar y se puede mantener en más de una especie de células hospederas, por ejemplo, este vector transportador podría ser capaz de la replicación en una célula hospedera de Corynebacterium tal como una célula hospedera de C. glutamicum, y también en una célula hospedera de E. coli. En una modalidad de la invención, las copias adicionales del (los) gen(es) de la via de biosintesis de L-lisina seleccionado (s) de ask, asd, dapB, ddh, 0RF2 y lysA se pueden integrar en el cromosoma. Otra modalidad de la invención proporciona que las copias adicionales del (los) gen (es) de la via de biosintesis de L-lisina son llevadas extra-cromosómicamente . Las amplificaciones por un factor de 5 o menos se pueden obtener al introducir las copias de genes adicionales dentro del cromosoma de la cepa hospedera por medio de la recombinación homologa de eventos individuales . En una modalidad más preferida, el evento de recombinación da por resultado la introducción de una copia adicional de la copia del gen o genes de interés. Si se desean más de 5 copias de los genes, se pueden utilizar plásmidos multicopias que. -llevan la construcción de ADN recombinante de la invención. En otra modalidad de la invención, la actividad de enzima es incrementada por la sobreexpresión de uno o más genes del grupo que comprende ask, asd, dapB, ddh, 0RF2 y lysA que codifican una o más enzimas de la vía biosintética de lisina. En una modalidad de la invención, uno o más genes son enlazados de manera operable directamente o indirectamente a una o más secuencias promotoras. En otra modalidad de la invención, las secuencias promotoras enlazadas de manera operable son heterólogas, endógenas o híbridas. En una modalidad preferida de la invención, las secuencias promotoras son una o más de: una secuencia promotora del extremo 5' de los genes endógenos para C. glutamicum, una secuencia promotora de los plásmidos que se duplican en C. glutamicum y una secuencia promotora del genoma del fago que infecta a C. glutamicum. En otra modalidad, se modifican una o más de las secuencias promotoras. En otra modalidad preferida, la modificación comprende el truncamiento en el extremo 5', truncamiento en el extremo 3', inserción no terminal de uno o más nucleótidos, supresión no terminal de uno o más nucleótidos, adición de uno o más nucleótidos en el extremo 5', adición de uno o más nucleótidos en el extremo 3' y combinaciones de los mismos. En una modalidad preferida, el promotor Pl, el primer promotor del operón argS-lysA se utiliza ; ;omo el promotor para el gen lysA. Los elementos promotores de genes alternativos se pueden utilizar en las construcciones de la invención. Por ejemplo, los promotores bacterianos conocidos que son adecuados para el uso en la presente invención incluyen los promotores lacl y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores lambda PR y PL, el promotor trp o promotores endógenos para las células bacterianas de la presente invención. Otros promotores útiles en la invención incluyen promotores regulados, promotores desrregulados y promotores heterólogos. Muchos de estos promotores son conocidos para una persona experta en el campo. Véase Sambrook, E.F. y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) . Además, el vector puede contener regiones de control que regulan, asi como también causan la expresión. Generalmente, estas regiones serán operadas al controlar la transcripción, tal como sitios de unión de inductores o represores e intensificadores , entre otros. En una modalidad preferida de la invención, la molécula del polinucleótido de KDB está incluida en el vector pDElia2FC5-KDB · En otra modalidad preferida, la molécula del polinucleótido de KDBH está incluida en el vector pK184-KDBH. En otra modalidad preferida, la molécula de polinucleótido de KDB2 está incluida en el vector pDElia2Fc5-KD32. En una modalidad adicionalmente preferida, el polinucleótido de KDB2HL está incluido en el vector pDElia2FC5- DB2HL. Un objetivo adicional de la invención es proporcionar una célula hospedera que comprende un vector que comprende cualquiera de las moléculas aisladas de los polinucleótidos de KDB, KDBH, DB2 o KDB2HL. La introducción de la construcción en la célula hospedera se puede efectuar por medio de la transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lipidos cationicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Estos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis y colaboradores, Basic ethods In Molecular Biology (1986) . Si el vector es un virus, puede ser empacado in vitro utilizando una linea de células de empaque apropiada y luego transducido en células hospederas. Ejemplos representativos de células hospederas apropiadas para las moléculas de ácido nucleico aisladas, descritas anteriormente incluyen, pero no están limitadas a, células bacterianas tales como células de C. glutamicum, Escherichia coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; y células fúngales tales como células de levadura. Los medios de cultivo y condiciones apropiados para las células hospederas descritas anteriormente son conocidos en el campo. Las células bacterianas, tales como E. coli y bacterias corineformes son preferidas como células hospederas.

Las especies de Corynebacterium y Brevibacterium particularmente preferidas de los métodos y procesos de la invención incluyen: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum y otras especies de Cornynebacteria y Brevibacteria conocidas en el campo. Como será entendido por aquellas personas expertas en el campo, el término "especie Corynebacterium" incluye aquellos organismos identificados previamente en la bibliografía como "especies de Brevibacterium", por ejemplo Brevibacterium flavum y Brevibacterium lactofermentum las cuales han sido ahora reclasificadas en el género Corynebacterium {Int. J. Syst. Bacteriol. 42:255 (1981)). Un objetivo adicional es proporcionar una célula hospedera en donde la célula . hospedera sea una célula de Brevibacterium seleccionada del grupo que consiste de Brevibacterium flavum NRRL-B30218, Brevibacterium flavum NRRL-B30458, Brevibacterium flavum NRRL-B30410, Brevibacterium flavum NRRL-B30459, Brevibacterium flavum NRRL-B30522, Brevibacterium flavum ' NRRL-B30219, Brevibacterium lactofermentum NRRL-B30220, Brevibacterium lactofermentum NRRL-B30221, Brevibacterium lactofermentum NRRL-B30222, Brevibacterium flavum NRRL-30234 ' y Brevibacterium lactof rmentum NRRL-30235. En otra modalidad, la célula hospedera es Escherichia coli. En una modalidad preferida, la célula hospedera es E. coli DH5 a MCR NRRL-B30228. En otra modalidad, la célula hospedera es una célula de C. glutamicum seleccionada del grupo que consiste de C. glutamicum NRRL-B30236 y C. glutamicum NRRL-B30237. Los métodos . para incrementar la producción de lisina y los procesos para la producción de lisina de la invención pueden ambos utilizar un paso que requiera la transformación de una molécula aislada de ácido nucleico dentro de una célula hospedera. Los métodos para incrementar la producción de lisina y los procesos para la producción de lisina de la invención pueden utilizar un paso que requiera la amplificación de al menos un gen de la vía de biosintesis de lisina. Como es bien sabido para aquellas personas expertas en el campo, el término amplificación significa incrementar el número de un gen o genes de la vía biosintética de lisina mediante cualquier medio conocido en el campo. Los medios de amplificación particularmente preferidos incluyen: (1) la adición de una molécula aislada de ácido polinucléico de KDB, KDBH, KDB2 o KDB2HL mediante la inserción en el cromosoma de una célula hospedera, por ejemplo, mediante la recombinación homologa y (2) la adición de una molécula aislada de ácido polinucléico de KDB, KDBH, KDB2 o KDB2HL en una célula hospedera por medio de un vector extra-cromosómico, auto-duplicador, por ejemplo un plásmido. Los métodos para insertar una molécula aislada de ácido nucleico dentro del cromosoma de una célula hospedera son conocidos para aquellas personas expertas en el campo. Por ejemplo, la inserción de moléculas aisladas de ácido nucleico dentro del cromosoma de la especie Corynebacterium se puede hacer utilizando el plásmido pK184 descrito por Jobling, M. y colaboradores, Nucleic Acids Research 18(17): 5315-5316 (presentada en 1990) . Debido a que estos vectores carecen de un origen de replicación de la especie Corynebacterium y contienen un marcador seleccionable tal como canamicina (kan) , las células solo serán capaces de desarrollarse bajo la selección si el vector ha sido insertado en el cromosoma de la célula hospedera mediante la recombinación homologa. En las modalidades alternativas, la invención también proporciona métodos para incrementar la producción de lisina y procesos para la producción de lisina en donde la amplificación del gen de la vía biosintética se realiza a través de la introducción en una célula hospedera de un vector extra-cromosómico, auto-duplicador, por ejemplo, un plásmido, que comprende una molécula aislada de polinucleótido de KDB, KDBH, KDB2 o KDB2HL. Los plásmidos adecuados para estas modalidades incluyen pSRl y otros derivados de pSRl (Archer,- J'. y colaboradores, J. Gen. Microbiol. 139: 1753-1759 (1993)0,. Para varias modalidades de la invención atraídas a un método para incrementar la producción de L-lisina, la selección para la producción incrementada de L-lisina se puede determinar al comparar directamente la cantidad de L-lisina producida en cultivo por una cepa hospedera de la especie Corynebacterium a aquella de una cepa hospedera transformada de la especie Corynebacterium en la cual el gen o genes de la biosintesis de leucina son amplificados. El nivel de producción de lisina se puede determinar convenientemente por la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de rendimiento a partir de dextrosa: [ (g de lisina/L / (g de dextrosa consumida/L) ] *100. En una modalidad, la invención proporciona un método para incrementar la producción de .lisina que comprende: (a) transformar una célula hospedera con una molécula aislada del polinucleótido de KDBH, (b) seleccionar una célula hospedera transformada; y (c) seleccionar la producción incrementada de lisina de la célula hospedera transformada con relación a la célula hospedera. En otra modalidad del método, el método comprende además desarrollar la célula hospedera transformada en un medio; y purificar la lisina producida por la célula hospedera transformada. Se puede utilizar una variedad de medios conocidos para aquellas personas expertas en el campo para soportar el desarrollo de las células para la producción de lisina. Ejemplos ilustrativos de fuentes de carbono adecuadas incluyen, pero no están limitadas a: carbohidratos, tales como glucosa, fructuosa, sacarosa, hidrolizado de almidón, hidrolizado de celulosa y melaza; ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido fórmico, ácido málico, ácido cítrico y ácido fumárico; y alcoholes, tal como glicerol. Ejemplos ilustrativos de fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen, pero no están limitadas a: amoníaco que incluye gas de amoníaco y amoníaco acuoso; sales de amonio de ácidos orgánicos o inorgánicos tales como cloruro de amonio, fosfato de amonio, sulfato de amonio y acetato de amonio; y otras fuentes que contienen nitrógeno que incluyen extracto de carne, peptona, licor de infusión de maíz, hidrolizado de caseína, hidrolizado de torta de semilla de soya, urea y extracto de levadura. Una variedad de técnicas de fermentación son conocidas en el campo, las cuales se pueden emplear en los procesos de la invención atraídos a la producción de aminoácidos. Generalmente, los aminoácidos se .pueden producir comercialmente a partir de la invención en procesos de fermentación tales como del tipo por lotes o del tipo por lotes alimentados. En las fermentaciones del tipo por lotes, todos los nutrientes son adicionados al inicio de la fermentación. En las fermentaciones del tipo por lotes alimentados o por lotes alimentados extendidos, uno o una variedad de nutrientes son suministrados continuamente al cultivo, justo desde el principio de la fermentación o después de que el cultivo ha alcanzado una cierta edad o cuando el (los) nutriente (s) que son alimentados fueron agotados del fluido de cultivo.- üna variante del lote extendido de la fermentación del tipo por lotes alimentados es la fermentación del tipo por lotes alimentados repetidos o de llenado y vaciado, donde parte de los contenidos del fermentador son removidos en algún momento, por ejemplo, cuando el fermentador está lleno, mientras que continúa la alimentación de un nutriente. De esta manera, la fermentación puede ser extendida durante un tiempo más largo. Otro tipo de fermentación, la fermentación continua o cultivo de quimiostato, utiliza la alimentación continua de un- medio completo, mientras que el fluido de cultivo es retirado de manera continua o semi-continua de tal manera que el volumen del caldo en el fermentador se mantenga aproximadamente constante, üna fermentación continua puede ser mantenida en principio durante un tiempo infinito. En una fermentación por lotes, un organismo se desarrolla hasta que uno de los nutrientes esenciales en el medio llega a agotarse o hasta que las condiciones de fermentación llegan a ser desfavorables (por ejemplo, el pH disminuye a un valor inhibitorio del crecimiento microbiano) . En las fermentaciones del tipo por lotes alimentados, normalmente se toman medidas para mantener las condiciones de crecimiento favorables, por ejemplo, al utilizar el control de H y se previene la exhaustación de uno o más nutrientes esenciales mediante la alimentación de ese (esos) nutriente (s) al cultivo. El microorganismo continuará creciendo, a una velocidad de crecimiento dictada por la velocidad de alimentación de nutrientes. Generalmente, un nutriente individual, muy frecuentemente la fuente de carbono, llegará a ser limitante del crecimiento. El mismo principio se aplica a una fermentación continua, usualmente un nutriente en el medio alimentado es limitante, todos los otros nutrientes están en exceso. El nutriente limitante estará presente en el fluido de cultivo en una concentración muy baja, con frecuencia desmedidamente baja. Se pueden emplear diferentes tipos de limitaciones de nutrientes. La limitación de la fuente de carbono es la más frecuentemente utilizada. Otros ejemplos son la limitación de la fuente de nitrógeno, limitación por oxigeno, limitación por un nutriente especifico tal como una vitamina o un aminoácido (en el caso que el microorganismo sea auxotrófico para tal compuesto) , limitación por azufre y limitación por fósforo. La lisina puede ser recuperada por cualquier método conocido en el campo. Los procedimientos ejemplares se proporcionan en los siguientes: Van Walsem, _H.J. y Thompson, M.C., J. Biotechnol. 59: 127-132 (1997) y patente norteamericana No. 3,565,951, las cuales son ambas incorporadas en este texto a manera de referencia.

Las construcciones pDElia2c5-KDB, p 184-KDBH, pDElia2FC5-KDB2 y pDElia2FC5-KDB2HL en las células hospederas NRRL-B11474 fueron depositadas en una Autoridad Depositaría Internacional aceptable de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente. Los depósitos se han hecho en the Agricultural Research Service, Culture Collection (NRRL) , 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604. Todas las patentes y publicaciones referidas en este texto son incorporados expresamente a manera de referencia en su totalidad.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación de Construcciones Multigenes de la Vía L-Lisina Las construcciones que comprenden una molécula de polinucleótido de KDB, KDBH, KDB2HL o KDB2 se hicieron a partir de las siguientes fuentes: Gen (es) Fuente ask-asd Cepa ATCC 21529; dapB Cepa NRRL B11474; ddh Cepa NR L B11474; 0RF2 Cepa NRRL B11474; lysA Cepa AS019; Promotor I operón argS-lysA de pR56 La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) se utilizó para estructurar las construcciones de KDB, KDBH, KDB2 y KDBHL. Los procedimientos de PCR y subclonación estándar se utilizaron en la clonación de las regiones de codificación de ask-asdr dapB-0RF2-dapA, ddh. Los cebadores utilizados para los experimentos de clonación incluyeron: Nombre del cebador Secuencia. ask 5 ' -GGGTACCTCGCGAAGTAGCACCTGTCAC-3' asd 5' -GCGGATCCCCCATCGCCCCTCAAAGA-3' dapB 5' -AACGGGCGGTGAAGGGCAACT-3'' ORF2 5 ' -GCTCATAGAGTTCAAGGTTACCTTCTTCCC-3 ' ddhl 5 ' -CCATGGTACCAAGTGCGTGGCGAG-3' ddh2 5' -CCATGGTACCACACTGTTTCCT GC-3' lysA(AIG) 5f -CCGGAGAAGATGTAACAATGGCTÁC-3' lysA3B 5' -CCTCGACTGCAGACCCCTAGACACC-3' dapA 5' -TGAAAGACAGGGGTATCCAGA-3' Los procedimientos de construcción y los plásmidos intermediarios se describen en las figuras 11-14. Los siguientes pasos (figura 11) se realizaron en la construcción del vector pDElia2FC5-KDB: 1. pGEMT-ask-asd: un producto de PCR de aproximadamente 2.6 Kb gue contiene el operón ask-asd de ATCC21529 utilizando los cebadores ask y asd fue clonado en pGEM-T (sistemas de vectores pGEM-T de Promega) . 2. pFC3-ask-asd: un fragmento de Nsil-Apal de aproximadamente 2.6 Kb de pGEMT-ask-asd fue clonado en pFC3 cortado con PstI y Apal . 3. pFC3-dapB-ORF2-dapA: un producto de PCR de aproximadamente 2.9 Kb de la región de codificación de dapB-ORF2-dapA NRRL-B11474 fue clonado en pFC3 en el sitio EcoRV. 4. pFC3-dapB: el fragmento grande Clal de pFC3-dapB-ORF2-dapA fue ligado. 5. pUCl8-ddh: un fragmento de Kpnl de aproximadamente 1.3 Kb de pADM21 gue contenia ddh (posición NRRL-B11474) fue subclonado en püC18 en el sitio Kpnl. 6. pFCl-ddh: un fragmento de SalI-EcoRI de aproximadamente 1.3 Kb de pUC18-ddh fue clonado en pFCl cortado con Salí y EcoRI . 7. pFCl-ddh-lysA: un fragmento de EcoRI-PstI de aproximadamente 2.1 Kb (que contenía el ADN intacto de lysA) de pRS6 fue clonado en pFCl-ddh cortado con EcoRI y PstI. 8. pFCl-ask-asd-ddh-lysA: un fragmento de S al-Fsel de aproximadamente 2.6 Kb de pFC3-ask-asd fue clonado en pFCl-ddh-lysA cortado con SwaI y Fsel. 9. pFC3-ask-asd-dapB-ddh-lysA: un fragmento de Spel de aproximadamente 6 Kb de pFCl-ask-asd-ddh-lysA fue clonado en pFC3-dapB en el sitio Spel. 10. pDElia2FC5-ask-asd-dapB-ddh-lysA: (pDElia2FC5-KDBHL) : un fragmento de Notl-Pmel de aproximadamente 7.38 Kb de pFC3-ask-asd-dapB-ddh-lysA fue clonado en pDElia2FC5 cortado con Notl y Pmel. 11. pDElia2: un fragmento de PstI enromado de aproximadamente 1.24 Kb de püC4K fue ligado con el fragmento de Dral-SspI de aproximadamente 1.75 Kb de pUCl9. 12. pDElia2FC5: el fragmento pequeño de PvuII de pFC5 fue ligado con el fragmento grande de PvuII de pDElia2. 13. pDElia2FC5-ask-asd~dapB (pDElia2FC5-KDB) : un fragmento de Apal de aproximadamente 4 Kb de pDElia2FC5-KDBHL fue clonado en pDElia2FC5 en el sitio Apal. El organismo Corynejacterium (NRRL-B11474) que contenia la construcción pDElia2FCs-KDB fue depositado en una Autoridad Depositaría Internacional aceptable de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente. El depósito se ha hecho en the Agricultural Research Service, Culture Collection (NRRL) , 1815 North üniversity Street, Peoría, Illinois 61604 el 1 de febrero de 2001. El depósito es numerado NRRL-B30458. Los siguientes pasos (figura 12) se realizaron en la estructuración de la construcción pK148-KDBH: 1. pGEMT-ask-asd: un producto de PCR de aproximadamente 2.6 Kb que contenia el operón ask-asd de ATCC21529 utilizando los cebadores ask y asd fue clonado en pGEM-T (sistemas de vectores pGEM-T de Promega) . 2. pFC3~ask-asd: un fragmento de Nsil-Apal de aproximadamente 2.6 Kb de pGEMT-ask-asd fue clonado en pFC3 cortado con PstI y Apal . 3. pFC3-ask-asd-ddh: un fragmento de Kpnl de aproximadamente 1.3 Kb que contenia el ddh NRRL-B1147 fue clonado en pFC3-ask-asd en el sitio Kpnl. 4. pFC3-dapB-ORF2-dapA: un producto de PCR de aproximadamente 2.9 Kb de la región de codificación de dapB-ORF2-dapA NRRL-B11474 fue clonado en pFC3 en el sitio EcoRV. 5. pFC3-dapB: el fragmento grande de Clal de pFC3-dapB-ORF2-dapA fue ligado nuevamente. 6. pFC3-ask-asd-dapB-ddh: un fragmento de Notl- Swal de aproximadamente 4 Kb de pFC3-ask-asd-ddh fue clonado en pCF3-dapB digerido con Notl y Smal . 7. pK184-ask-asd-dapB-ddh(pKl84-KDBH) : un fragmento de Pmel de aproximadamente 5.3 Kb que contenia ask-asd-dapB-ddh fue clonado en pK184 en el sitio Smal.

El organismo Corynebacterium (NRRL-B11474) que contenia la construcción pK184-KDBH fue depositado en una Autoridad Depositaría Internacional aceptable de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente. El depósito se ha hecho en the Agricultural Research Service, Culture Collection (NRRL) , 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604 el 1 de febrero de 2001= El depósito es numerado NRRL-B30410. Los siguientes pasos (figura 13) se realizaron en la estructuración del vector pDElia2FC5-KDB2 : 1. pGEMT-ask-asd: un producto de PCR de aproximadamente 2.6 Kb que contenía el operón ask-asd de ATCC21529 utilizando los cebadores ask y asd fue clonado en pGEM-T (sistemas de vectores pGEM-T de Promega) . 2. pUC18-ddh: un fragmento de Kpnl de aproximadamente 1.3 Kb de pADM21 que contenía ddh (posición BF100) fue subclonado en pUC18 en el sitio Kpnl. 3. pFC3-ask-asd: un fragmento de Nsil-Apal de aproximadamente 2.6 Kb de pGEMT-ask-asd fue clonado en pFC3 cortado con PstI y Apal. ~ 4. pFCl-dapB-0RF2: un producto de PCR de aproximadamente 2 Kb de la región de codificación de dapB-ORF2 NRRL-B11474 fue clonado en pFCl en el sitio EcoRV. 5. pFCl-ddh: un fragmento de PstI-EcoRI de aproximadamente 1.3 Kb de pUC18-ddh fue clonado en pFCl cortado con PstI y EcoRI. 6. püC19-Pl: un fragmento de Hpal-PvuII de aproximadamente 550 pb (que contenía el primer promotor, Pl, del operón argS-lysA) de pRS6 fue clonado en pUC19 en el sitio Smal. 7. pUC19-PllysA: un producto de PCR sin promotor de aproximadamente 1.45 Kb, utilizando los cebadores LysA(ATG) y LysA3B, de la región de codificación lysA AS019 es clonado en püC19-Pl en el sitio HincII. 8. pFCl-PllysA: un fragmento de EcoRI-HindIII de aproximadamente 2 Kb de pUC19-PllysA fue clonado en pFCl cortado con EcoRI y HindIII. 9. pFCl-ddh-PllysA: un fragmento de EcoRI-Notl de aproximadamente 1.3 Kb de pFCl-ddh fue clonado en pFCl-PllysA cortado con EcoRI y Notl . 10. pFCl-ask-asd-ddh-PllysA: un fragmento de Swal-Fsel de aproximadamente 2.6 Kb de pFC3-ask-asd fue clonado en pFCl-ddh-lysA cortado con SwaI y Fsel. 11. pFCl-ask-asd-dapB-ORF2-ddh-PllysA(pFCl- KDB2HP1L) : un fragmento de Spel de aproximadamente 5.9 Kb de pFCl-ask-asd-ddh-PllysA fue clonado en- pFCl-dapB-0RF2 en el sitio Spel . 12. pDElia2FC5: un fragmento pequeño de PvuII de pFC5 fue ligado con el fragmento grande de PvuII de pDElia2. 13. pDElia2FC5-ask-asd-dapB-ORF2 (pDElia2FC5-KDB2) : un fragmento de Apal de aproximadamente 4.7 Kb que contenia KDB2 de pFCl-KDB2ELPlL fue clonado en pDElia2FC5 en el sitio Apal . El organismo Corynebacterium (NRRL-B1147 ) que contenia la construcción pDElia2FC5- DB2 fue depositado en una Autoridad Depositaría Internacional aceptable de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente. El depósito se ha hecho en the Agricultural Research Service, Culture Collection (NRRL) , 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 el 1 de febrero de 2001. El depósito es numerado NRRL-B30459. Los siguientes pasos (figura 14) se realizaron en la estructuración del vector pDElia2FC5-KDB2HPlL: 1. pGEMT-ask-asd: un producto de PCR de aproximadamente 2.6 Kb que contenía el operón ask-asd de ATCC21529 utilizando los cebadores ask y asd fue clonado en pGEM-T (sistemas de vectores pGEM-T de Promega) . 2. pUC18-ddh: un fragmento de Kpnl de aproximadamente 1.3 Kb de pADM21 que contenía ddh (posición NRRL-B11474) fue subclonado en pUC18 en el sitio Kpnl. 3. pFC3-ask-asd: un fragmento de Nsil-Apal de aproximadamente 2.6 Kb de pGEMT-ask-asd fue clonado en pFC3 cortado con PstI y Apal. 4. pFCl-dapB-0RF2 : un producto de PCR de aproximadamente 2 Kb de la región de codificación dapB-ORF2 NRRL-B11474 fue clonado en pFCl en el sitio EcoRV. 5. pFCl-ddh: un fragmento de PstI-EcoRI de aproximadamente 1.3 Kb de pUC19-ddh fue clonado en pFCl cortado con PstI y EcoRI . 6. püC19-Pl: un fragmento de Hpal-PvuII de aproximadamente 550 pb (que contenia el primer promotor, Pl, del operón argS-lysA) de pRS6 fue clonado en püC19 en el sitio Smal. 7. pUC19-PllysA: un producto de PCR sin promotor de aproximadamente 1.45 kb, utilizando los cebadores LysA(ATG) y LysA3B, de la región de codificación lysA de AS019 es clonado en püC19-Pl en el sitio HincII. 8. pFCl-PllysA: un fragmento de EcoRI-HindIII de aproximadamente 2 Kb de pUC19-PllysA fue clonado en pFCl cortado con EcoRI y HindIII. 9. pFCl-ddh-PllysA: un fragmento de EcoRI-Notl de aproximadamente 1.3 Kb de pFCl-ddh fue clonado en pFCl-PllysA cortado con EcoRI y Notl. 10. pFCl-ask-asd-ddh-PllysA: un fragmento de Swal-Fsel de aproximadamente 2.6 Kb de pFC3-ask-asd fue clonado en pFCl-ddh-PllysA cordado con S aI y Fsel. 11. pFCl-ask-asd-dapB-ORF2-ddh-PllysA (pFCl-KDB2HP1L) : un fragmento de Spel de aproximadamente 5.9 Kb de pFCl-ask-asd-ddh-PllysA fue clonado en pFCl-dapB-0RF2 en el sitio Spel . 12. pDElia2FC5: el fragmento pequeño de PvuII de pFC5 fue ligado con el fragmento grande de PvuII de pDElia2. 13. pDElia2FC5-ask-asd-dapB-ORF2-ddh-PllysA (pDElia2FC5-KDB2HPlL) : un fragmento de NHE de aproximadamente 7.9 Kb de pFCl-ask-asd-dapB-0RF2-ddh-PllysA fue clonado en pDElia2FC5 en el sitio NHE. El organismo Corynebacterium (NRRL-B11474) que contenia la construcción pDElia2FC5-KDB2HPlL fue depositado en una Autoridad Depositaría Internacional aceptable de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de . Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente. El depósito se ha hecho en Agricultural Research Service, Culture Collection (NRRL) , 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604 el 1 de febrero de 2001. El depósito es numerado NRRL-B30522.

EJEMPLO 2 Examen y Selección de Cepas con Producción Mejorada de L- Lisina La producción de L-lisina por células transformadas de manera estable con construcciones multi-genes se resume en la tabla 1.

Tabla 1. Producción de Lisina por diversas bacterias paren-bales y transfectadas de manera estable Cepa sometida a prueba Titulo de Rendimiento Depósito de lisina de L-lisina células (g/L) (%) NRRL-B11474 31 30 NRRL-B11474: :pDElia2FC5- DB 34 37 NRRL-B30458 NRRL-B11474 31 31 NRRL-B11474: :pK 184-KDBH 38 37.4 NRRL-B30410 NRRL-B11474 30 30 NRRL-B11474 : :pDElia2FC5 39 37 NRRL-B30 59 NRRL-B11474 31 33 NRRL-B11474: :pDElia2FC5 38 41 NRRL-B30522 KDB2HP1L Habiendo descrito completamente ahora la presente invención en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio para una persona experta en el campo que se puede realizar alguna modificación o cambio de la invención con un rango amplio y equivalente de condiciones, formulaciones y otros parámetros de la misma y que se propone que estas modificaciones o cambios estén incluidos dentro del alcance de las reivindicaciones anexas . Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de experiencia de aquellas personas expertas en el campo al cual pertenece esta invención y son incorporadas en este texto a manera de referencia al mismo grado como si se indicara especifica e individualmente que cada publicación, patente o solicitud de patente individual es incorporada a manera de referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una molécula aislada de polinucleotido, caracterizada porque comprende: (a) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de aspartato cinasa (ask) ; (b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de aspartato-semialdehxdo deshidrogenasa (asd) ; y (c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de dihidrodipicolinato reductasa (dapB) . 2. La molécula de polinucleotido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de polinucleotido comprende adicionalmente un ácido nucleico que codifica un polipéptido de diaminopimelato deshidrogenasa (ddh) completo o truncado. 3. La molécula de polinucleotido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de polinucleotido comprende adicionalmente un ácido nucleico que codifica un polipéptido de 0RF2 completo o truncado. 4. La molécula de polinucleotido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de polinucleotido comprende adicionalmente un ácido nucleico que codifica polipéptidos de ddh, ORF2 y diaminopimelato descarboxilasa (lysA) completos o truncados. 5. La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la molécula de polinucleótido comprende adicionalmente un elemento promotor Pl de la SEC ID NO: 15. 6. La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el elemento promotor Pl está adyacente al ácido nucleico que codifica lysA. 7. La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los polipéptidos de ask, asd y dapB son codificados por Corynebacterium, Brevibacteriu flavum o Brevibacterium lactovermentum. 8. La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los polipéptidos de ask y asd son codificados por el operón ask-asd de ATCC21529. 9. La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido de ddh es codificado por Corynejacterium, Brevi-bacteriun? flavum o Brevibacterium lactovermentum. 10,¿" La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el polipéptido de ORF2 es codificado por Corynejacteriizm, Brevijacterium flavum o Brevibacterium lactovermentu . 11. La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el polipéptido de lysA es codificado por Corynebacterium, Brevibacterium flavum o Brevibacverium lactovermentum. 12. La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido de dapB es codificado por la región de codificación del gen dapB de NRRL-B11474. 13. La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido de ddh es codificado por la región de codificación del gen ddh de NRRL-B11474. 14. La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el polipéptido de ORF2 es codificado por la región de codificación del gen ORF2 de NRRL-B11474. 15. La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el polipéptido de lysA es codificado por la región de codificación del gen lysA de AS01 . 16. Un vector, caracterizado porque compi?en¾e la molécula aislada de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1. 17. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 16. 18. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la célula es una célula procariótica . 19. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la célula es una célula eucariótica. 20. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la célula hospedera es una célula de Brevibacteríum flavum, Brevibacterium lactofermentum o Corynebacterium glutamicum. 21. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la célula hospedera es una célula de Escherichia coli. 22. ün método para transformar una célula hospedera, caracterizado porque comprende: (a) transformar una célula hospedera con la molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación .1, en donde la molécula aislada de polinucleótido es integrada de manera estable en el cromosoma de la célula hospedera; y (b) seleccionar una célula hospedera transformada. 23. Un método para transformar una célula hospedera, caracterizado porque comprende: (a) transformar una célula hospedera con la molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, en donde la molécula aislada de polinucleótido se mantiene en la célula hospedera como ADN extracromosómico; y (b) seleccionar una célula hospedera transformada. 24. Un método para producir Usina, caracterizado porque comprende cultivar las células hospederas de conformidad con la reivindicación 17 en un medio de cultivo, en donde las células hospederas producen lisina en el medio de cultivo. 25. La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de polinucleótido no comprende una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos de dihidrodipicolinato sintasa (dapA) , tetrahidrodipicolinato succinilasa (dapD) , N-succinilaminocetopimelato transaminasa (dapC) , N-succinil-diaminopimelato desuccinilasa (dapE) o diaminopimelato epimerasa (dapF) .