HU219608B - Eljárás L-lizin fermentációval történő előállítására - Google Patents

Eljárás L-lizin fermentációval történő előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU219608B
HU219608B HU9601535A HU9601535A HU219608B HU 219608 B HU219608 B HU 219608B HU 9601535 A HU9601535 A HU 9601535A HU 9601535 A HU9601535 A HU 9601535A HU 219608 B HU219608 B HU 219608B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
lysine
mutation
bacterium
strain
Prior art date
Application number
HU9601535A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9601535D0 (en
HUT74961A (en
Inventor
Kazue Kawamura
Hiroyuki Kojima
Yuri Ogawa
Konosuke Sano
Original Assignee
Aj Inomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=17980578&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU219608(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Aj Inomoto Co., Inc. filed Critical Aj Inomoto Co., Inc.
Publication of HU9601535D0 publication Critical patent/HU9601535D0/hu
Publication of HUT74961A publication Critical patent/HUT74961A/hu
Publication of HU219608B publication Critical patent/HU219608B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/01—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.3.1)
    • C12Y103/01026—Dihydrodipicolinate reductase (1.3.1.26)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01016—Diaminopimelate dehydrogenase (1.4.1.16)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás L-lizin fermentációval történőelőállítására, valamint az előállítási eljárásban alkalmazható DNS-molekulák és mikroorganizmusok. A találmány szerinti eljárásbanelőnyösen olyan baktériumokat alkalmaznak, melyek olyandihidrodipikolinát-- szintetázt vagy aszpartát-kinázt kódoló DNS-thordoznak, amely az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlástdeszenzitizáló hatású mutációt tartalmaz. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás L-lizin fermentációval történő előállítására, valamint az előállítási eljárásban alkalmazható DNS-molekulák és mikroorganizmusok.
A találmány szerinti eljárás előnyösen alkalmazható L-lizin ipari méretű előállítására.
Korábban az L-lizin fermentációval történő előállítása során, a termelékenység fokozása érdekében, természetes környezetétől elkülönített mikrobatörzset vagy ilyen mikrobatörzsből származó mesterséges mutáns törzset alkalmaztak. Számos L-lizint termelő, mesterséges mutáns törzs létezik, melyek közül a legtöbb Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus vagy Escherichia nemzetségbe tartozó, S-2-amino-etil-cisztein(AEC)-rezisztens mutáns törzs. Az aminosavtermelés fokozására különböző technikákat írtak le, melyek egyikében, például rekombináns DNS-t felhasználó transzformánst alkalmaztak (US 4,278,765 számú szabadalmi leírás).
Az Escherichia nemzetségbe tartozó törzseket illetően, például az 56-18569 számú közrebocsátott japán szabadalmi leírásban, az US 4,346,170 számú szabadalmi leírásban, valamint az „Applied Microbiology and Biotechnology” folyóiratban [15, 227 (1982)], eljárásokat imák le L-lizin előállítására, mely eljárásokban olyan baktériumtörzseket alkalmaznak, amelyekben fokozták a dihidrodipikolinát-szintetáz (melyet a továbbiakban „DDPS”-nek rövidítünk) mennyiségét. Az ilyen esetekben alkalmazott DDPS azonban vad típusú, amely az L-lizin „feedback” gátlása alatt áll, következésképpen, az L-lizin kielégítő mértékű termelékenységét nem érték el. Az „Applied Microbiology and Biotechnology” fentebb említett cikkében [75, 227 (1982)] az L-lizin-termelés szintje 75 g/1 glükózból 3 g/1 Llizin-hidroklorid termelődésének felelt meg, ahol a felhasználási koefficiens [1 g cukorból termelődött L-lizin mennyisége (grammokban, illetve százalékban)] 0,04, illetve 4% volt.
A 92-8382 számú koreai közzétételi iratban eljárást írnak le L-lizin termelésére, melynek során olyan - Escherichia nemzetségbe tartozó - baktériumot alkalmaznak, amelybe egy Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktériumból származó DDPS-t vittek be (mely DDPS-ről ismert, hogy az L-lizin „feedback” gátlása alatt áll; felhasználási koefficiens=17%). A Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktériumok növekedésének felső hőmérsékleti határa azonban körülbelül 10 °C-kal alacsonyabb, mint az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumoké, következésképpen úgy tűnik, hogy amennyiben egy Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktériumból származó DDPS-t kódoló DNS-t Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumba viszünk be (abból a célból, hogy az utóbbi baktérium ezt a DNS-t használja az L-lizin-termeléshez) - a tenyésztést alacsonyabb hőmérsékleten kell végezni. Ennek megfelelően várható, hogy az Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium által biztosított előnyöket - azaz a magas növesztési hőmérsékletet, a nagy növekedési sebességet és a gyors L-lizin-termelést - nehéz kimutatni. Általában, ha egy heterológ (idegen eredetű) organizmusból származó gént expresszálunk, esetenként egy expressziós termék proteáz által történő lebontását, és oldhatatlan zárványtest kialakulását okozzuk, melyek kapcsán több nehézséggel kell számolnunk, mint egy homológ gén expresszálása esetében. Ezenkívül, ha - az L-lizin nagyüzemi méretű előállítása érdekében - egy Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktériumból származó DDPS-t Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumba viszünk be, szigorúbb szabályozásra van szükség, mint abban az esetben, ha rekombináns baktériumot alkalmazunk, amelybe (a rekombináns DNS-ekre vonatkozó irányelveknek megfelelően) homológ gént viszünk be.
A dihidrodipikolinát-szintetáz (DDPS) az aszpartátszemialdehidet és a piroszőlősavat dehidratáló és kondenzáló enzim, amely a dehidratálás és a kondenzálás eredményeként dihidropikolinsavat szintetizál. Ez a reakció az aszparaginsavcsaládba tartozó aminosavak bioszintézisében - L-lizin-bioszintézis-rendszerbe továbbhaladó - elágazásban helyezkedik el. A DDPS-enzimről ismeretes, hogy olyan fontos szabályozóhely szerepét tölti be, mint amilyet az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokban az aszpartát-kináz képvisel.
A DDPS-t Escherichia co/íban (E. coli) a dapA elnevezésű gén kódolja. A dapA-gént klónozták, és meghatározták nukleotidszekvenciáját is [Richaud, F. és munkatársai: J. Bacteriol. 297 (1986)].
Az aszpartát-kináz (rövidítése „AK”) az aszparaginsavat β-foszfo-aszparaginsawá alakító reakciót katalizáló enzim, amely az aszparaginsavcsaládba tartozó aminosavak bioszintézis-rendszerének fő szabályozóenzimeként működik. Az E. coli AK-enzimének három típusa létezik (AKI, AKII, AKIII), melyek közül kettő a homoszerin-dehidrogenázzal (rövidítése HD) enzimkomplexet alkot. Az egyik enzimkomplexet (az AKI-HDI-t) a thrA-gén, míg a másikat (az AKII-HDII-t) a metLMgén kódolja. Az AKI a treonin és izoleucin összehangolt szuppressziója alatt áll, és a treonin gátolja, míg az AKII-t a metionin szuppresszálja.
A fentiekkel ellentétben, ismert, hogy az AKIII (a lysC-gén terméke) egyíúnkciós enzim, amely az L-lizin szuppressziója és „feedback” gátlása alatt áll. A három enzim intracelluláris aktivitásának aránya körülbelül „AKI”: „AKII”: ,,ΑΚΠ”=5:1:4.
Amint fentebb leírtuk, a Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktériumból származó „DDPS” nem áll az L-lizin „feedback” gátlása alatt, azonban ha ezt az enzimet Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumba visszük be (annak érdekében, hogy a baktérium az Llizin-termeléshez ezt az enzimet használja fel), a tenyésztési hőmérsékletet illetően problémák merülnek fel. Azt várjuk, hogy Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium alkalmazásával végzett fermentációval hatékonyan állíthatunk elő L-lizint, ha Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó, mutáns „DDPS” vagy „AKIII” enzimet (melyek nem állnak az L-lizin „feedback” gátlása alatt) sikerül előállítanunk. Az idevonatkozó irodalomban egy olyan forrás sincs, amelyben ilyen mutáns „DDPS”-enzimet írnának le, és bár egy cikkben beszámolnak egy mutáns „ΑΚΠΓ’-enzimről [Boy, E. és munkatársai: J. Bacteriol. 772, 84 (1972)],
HU 219 608 Β egy olyan példa sem ismeretes, amelyben felvernék az ilyen enzim L-lizin-termelékenységet javító képességének lehetőségét.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során, a fentebb említett szempontok figyelembevételével, célul tűztük ki olyan Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokból származó DDPS- és AKIII-enzimek előállítását, amelyek elégséges mértékben deszenzitizáltak az L-lizin „feedback” gátlásával szemben. Célul tűztük ki továbbá, hogy eljárást fejlesszünk ki L-lizin fermentációs módszerekkel történő előállítására, mely eljárás tökéletesebb, mint a korábbi, hasonló eljárások.
A találmány kitűzött céljainak gyakorlati megvalósítása érdekében végzett aprólékos és ismételt kutatásaink eredményeként sikerült Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó, az L-lizin „feedback” gátlásával szemben elégséges mértékben deszenzitizált DDPS-t kódoló DNS-t előállítanunk. Az E. coliból származó, az L-lizin „feedback” gátlásával szemben elégséges mértékben deszenzitizált DDPS-t kódoló DNS-t a leírásban néha „mutáns dapA” vagy „dapA*” néven említjük.
Kialakítottunk továbbá egy olyan Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumot, amely dapA-t és (az Llizin „feedback” gátlásával szemben deszenzitizált) aszpartát-kinázt tartalmaz. Az E. coliból származó (az Llizin „feedback” gátlásával szemben deszenzitizált) aszpartát-kinázt kódoló DNS-t a leírásban „mutáns lysC” vagy „lysC*” néven említjük.
Kialakítottunk továbbá egy olyan, Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumot, amely mutáns dapA-t és mutáns lysC-t tartalmaz, és azt találtuk, hogy az említett, Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumot előnyösen megválasztott tápközegben tenyésztve a tenyészetben jelentős mennyiségű L-lizin termelhető és halmozható fel.
Felismertük továbbá, hogy az L-lizin-termelékenysége tovább javítható oly módon, hogy egy Escherichia nemzetségbe tartozó, mutáns dapA-t és mutáns lysC-t tartalmazó baktérium L-lizin-bioszintézis-rendszerében szerepet játszó egyéb géneket erősítünk.
A találmány tárgyát képezi az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó dihidrodipikolinát-szintetázt kódoló DNS, amely L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutációt tartalmaz. Az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutáció példáiként említhetjük a dihidrodipikolinát-szintetáz aminosavszekvenciája (melyet a szekvencialista 4. azonosító számú szekvenciájaként mutatunk be) N-terminálisától számítva a 81. alanint valinnal helyettesítő mutációt, a 118. hisztidint tirozinnal helyettesítő mutációt, valamint a 81. alanint valinnal és a 118. hisztidint tirozinnal helyettesítő mutációt.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, amelyet úgy transzformáltunk, hogy sejtjeibe egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó - az Llizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutációt tartalmazó - dihidrodipikolinát-szintetázt kódoló gént vittünk be. Az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutáció példáiként említhetjük a dihidrodipikolinát-szintetáz aminosavszekvenciája (melyet a szekvencialista 4. azonosító számú szekvenciájaként mutatunk be) N-terminálisától számítva a 81. alanint valinnal helyettesítő mutációt, a 118. hisztidint tirozinnal helyettesítő mutációt, valamint a 81. alanint valinnal és a 118. hisztidint tirozinnal helyettesítő mutációt.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentebb említett, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, amely az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlással szemben szintén deszenzitizált aszpartát-kinázt tartalmaz. Az Llizin által kiváltott „feedback” gátlással szemben deszenzitizált aszpartát-kinázt például úgy juttathatjuk be az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumba, hogy sejtjeibe Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó - az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutációt tartalmazó - aszpartát-kináz-III-at kódoló DNS-t viszünk be.
Az aszpartát-kináz-III - L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású - mutációja példáiként említhetjük az aszpartát-kináz-III aminosavszekvenciája (melyet a szekvencialista 8. azonosító számú szekvenciájaként mutatunk be) N-terminálisától számított 323. glicint aszparaginsavval helyettesítő mutációt; a 323. glicint aszparaginsavval és a 408. glicint aszparaginsavval helyettesítő mutációt; a 34. arginint ciszteinnel és a 323. glicint aszparaginsavval helyettesítő mutációt; a 325. leucint fenil-alaninnal helyettesítő mutációt; a 318. metionint izoleucinnal helyettesítő mutációt; a 318. metionint izoleucinnal és a 349. valint metioninnal helyettesítő mutációt; a 345. szerint leucinnal helyettesítő mutációt; a 347. valint metioninnal helyettesítő mutációt; a 352. treonint izoleucinnal helyettesítő mutációt; a 352. treonint izoleucinnal és a 369. szerint fenil-alaninnal helyettesítő mutációt; a 164. glutaminsavat lizinnel helyettesítő mutációt; valamint a 417. metionint izoleucinnal és a 419. ciszteint tirozinnal helyettesítő mutációt.
Az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó, az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutációt tartalmazó, dihidropikolinát-szintetázt kódoló DNS-t, és az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutációt tartalmazó, aszpartát-kináz-III-at kódoló DNS-t egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium kromoszómáján vagy a sejtekben egy plazmidon vagy külön plazmidokon helyezhetjük el. A DNS-ek úgy is elhelyezhetők, hogy az egyik DNS egy kromoszómán, a másik DNS pedig egy plazmidon helyezkedjen el.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentebb említett, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, amelyben a dihidrodipikolinát-reduktáz-gént erősítettük. A dihidropikolinát-reduktáz-gén erősítését („enhancement”) úgy valósíthatjuk meg, hogy a dihidrodipikolinát-reduktáz-gént - Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjeiben önálló replikációra képes - vektorba ligáivá rekombináns DNS-t hozunk létre, és a baktériumot az így kapott konstrukcióval transzformáljuk.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentebb említett, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, amely3
HU 219 608 Β be coryneform baktériumokból, például Brevibacterium lactofermentuniból származó, erősített diamino-pimelátdehidrogenáz-gént vittünk be. A coryneform baktériumokból származó, erősített diamino-pimelát-dehidrogenáz-gén bevitelét úgy valósíthatjuk meg, hogy a gént - Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjeiben önálló replikációra képes - vektorba ligáivá rekombináns DNS-t hozunk létre, és a baktériumot az így kapott konstrukcióval transzformáljuk. Coryneform baktériumként, például glutaminsavat termelő, vad típusú törzseket, valamint ezek - más aminosavakat termelő mutáns törzseit alkalmazhatjuk, melyek a Corynebacterium vagy a Brevibacterium nemzetségbe tartoznak. Közelebbről, a találmány gyakorlati megvalósításában alkalmazható coryneform baktériumok példáiként a Brevibacterium flavum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium glutamicum és Corynebacterium lilium, valamint a Brevibacterium lactofermentum említhető.
A találmány tárgyát képezi továbbá az olyan Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, amelyben a fentebb említett diamino-pimelát-dehidrogenáz-gén helyett tetrahidrodipikolinát-szukciniláz-gént és szukcinildiamino-pimelát-deaciláz-gént erősítettünk. E gének erősítését egy vagy két rekombináns DNS-sel végzett transzformációval valósíthatjuk meg, mely rekombináns DNS-eket úgy hozzuk létre, hogy a szóban forgó géneket - Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjeiben önálló replikációra képes - azonos vagy különböző vektorokba ligáljuk.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás Llizin előállítására, melynek során a fentebb leírt, Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok bármelyikét alkalmas tápközegben tenyésztjük, a sejtek tenyészetében ezáltal előállítjuk és felhalmozzuk az L-lizint, majd összegyűjtjük a tenyészetből.
A találmány leírásában a DDPS-t vagy AKIII-at kódoló DNS-t, illetve a DDPS és az AKIII kódolószekvenciáin kívül promotert is tartalmazó DNS-t néha „DDPS-géri’-nek vagy „AKIII-géri’-nek nevezzük. Az L-lizin „feedback” gátlásával szemben deszenzitizált mutáns enzimet, és az ilyen enzimet kódoló DNS-t (vagy a kódolószekvenciákon kívül promotert is tartalmazó DNS-t) néha egyszerűen „mutáns enzim”-nek, illetve „mutáns gén”-nek nevezzük. Az „L-lizin által kiváltott feedback gátlással szemben deszenzitizált” kifejezés azt jelenti, hogy elégséges a gátlás alapjában vett deszenzitizálása, és nem szükséges a teljes deszenzitizálás.
A találmány szerinti megoldást az alábbiakban ismertetjük részletesen.
A találmány szerinti mutáns dihidrodipikolinát-szintetázt (DDPS) kódoló DNS
A találmány szerinti mutáns DDPS-t kódoló DNS olyan mutációt hordoz, amely deszenzitizálja a vad típusú DDPS-t kódoló DNS által kódolt DDPS - L-lizin által kiváltott - „feedback” gátlását. A DDPS példáiként az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokból származó DDPS-t, különösen az E. coliból származó DDPS-t említhetjük. A DDPS - L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású - mutációinak példái a következők:
(1) a 81. alanint valinnal helyettesítő mutáció;
(2) a 118. hiszti dint tirozinnal helyettesítő mutáció; és (3) 81. alanint valinnal, és a 118. hisztidint tirozinnal helyettesítő mutáció (az aminosavak számozását a DDPS - 4. azonosító számú szekvenciaként bemutatott - aminosavszekvenciájának N-terminálisától kezdjük).
A vad típusú DDPS-t kódoló DNS-t illetően nincsenek különösebb megszorítások, feltéve, hogy egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó DDPS-t kódol; az ilyen DNS konkrét példája a 4. azonosító számú aminosavszekvenciát kódoló DNS, közelebbről, a 3. azonosító számú nukleotidszekvencia 272-1147. bázisaiból álló DNS. E szekvenciák közül azok képezik a találmány szerinti DDPS-t kódoló DNS-eket, amelyek a fentebb leírt aminosavhelyettesítéseket előidéző mutációkat tartalmazzák. A helyettesített aminosavat kódoló bármilyen kodon megfelelő, függetlenül fajtájától, feltéve, hogy ugyanazt az aminosavat kódolja. A DDPS szekvenciájában - a baktériumfajok és -törzsek különbségeitől függően - léteznek csekély eltérések, ilyenformán, azok a DDPS-gének, amelyek az enzimaktivitás szempontjából lényegtelen helye(ke)n tartalmaznak aminosavhelyettesítés(eke)t, -deléció(ka)t vagy -inszerció(ka)t eredményező mutációkat, szintén a találmány szerinti mutáns DDPS-gének közé tartoznak.
Ilyen mutáns gén létrehozásának módszere a következő. Először egy vad típusú DDPS-gént vagy egy másik mutációt hordozó DDPS-gént tartalmazó DNS-t in vitro mutációs kezelésnek vetünk alá, és a mutációs kezelés után kapott DNS-t egy gazdához adaptált vektorDNS-sel ligáljuk, miáltal rekombináns DNS-t kapunk. Transzformánsok kialakítása érdekében a rekombináns DNS-t egy gazdamikroorganizmusba visszük be. Ha a kapott transzformánsok közül mutáns DDPS-t expreszszáló transzformánst szelektálunk, a kiválasztott transzformáns mutáns gént tartalmaz. Más lehetőség szerint, rekombináns DNS előállítása érdekében, egy gazdához adaptált vektor-DNS-sel olyan DNS-t ligálhatunk, amely vad típusú DDPS-gént vagy egy másik mutációt hordozó DDPS-gént tartalmaz, és a kapott, rekombináns DNS-t ezt követően vetjük alá az in vitro mutációs kezelésnek. A mutációs kezelés után kapott rekombináns DNS-t - transzformánsok kialakítása érdekében - gazdamikroorganizmusba visszük be. Ha az így kapott transzformánsok közül mutáns DDPS-t expreszszáló transzformánst szelektálunk, az ilyen transzformáns szintén tartalmaz mutáns gént.
Egy másik megvalósítási mód szerint, mutáns enzimet termelő mutáns törzs kialakítása érdekében egy vad típusú enzimet termelő mikroorganizmust vetünk alá mutációs kezelésnek, majd a mutáns gént kinyerjük a mutáns törzsből. Más lehetőség szerint, olyan transzformánst vetünk alá mutációs kezelésnek, amelybe vad típusú génhez ligáit rekombináns DNS-t vittünk be. Ha a mutáns törzsből rekombináns DNS-t nyerünk ki, az ilyen DNS-en mutáns gén jön létre.
A DNS in vitro mutációs kezeléséhez alkalmazható szerek példáiként a hidroxil-amin és hasonlók említhetők. A hidroxil-amin olyan mutagén vegyszer, amely a
HU 219 608 Β citozint N4-hidroxi-citozinná alakítva citozin—>timin mutációt eredményez. Más módon, ha magát a mikroorganizmust vetjük alá mutációs kezelésnek, a kezelést ultraibolya sugárzás vagy a mesterséges mutációhoz általánosan alkalmazott mutagén ágens, például N-metilN’-nitro-N-nitrozo-guanidin (NTG) vagy salétromossav alkalmazásával végezzük.
A fentebb leírt vad típusú DDPS-gént (vagy más mutációt hordozó DDPS-gént) tartalmazó DNS donormikroorganizmusaként bármilyen, Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmust alkalmazhatunk, így alkalmazhatók a Neidhardt és munkatársai által leírt mikroorganizmusok (Neidhardt, F. C. és munkatársai: „Escherichia coli and Salmonella Typhimurium”, American Society fór Microbiology, Washington D. C., 1208, 1. táblázat). Példaként említjük a JM109 és MCI061 E. coli törzset. Amennyiben a DDPS-gént tartalmazó DNS donormikroorganizmusaként vad típusú törzset alkalmazunk, vad típusú DDPS-gént tartalmazó DNS-t kapunk.
(1) Vad típusú DDPS-gén előállítása
Az alábbiakban egy DDPS-gént tartalmazó DNS előállítására mutatunk be példát. Először vad típusú dapA-t tartalmazó E. colit, például MCI061 E. coli törzset tenyésztünk. A mikroorganizmus tenyésztéséhez szokványos szilárd táptalajt alkalmazhatunk, azonban
- tekintettel a baktérium begyűjtésének hatékonyságára - előnyösen folyadéktenyésztést végzünk. A tenyésztéshez olyan tápközeget alkalmazhatunk, amelyhez egy vagy több nitrogénforrást, például élesztőkivonatot, peptont, húskivonatot, gabonaáztató lét („com steep liquor”) és szójabab- vagy búzanedvet („exudate”), valamint egy vagy több szervetlen sót, mint például kálium-dihidrogén-foszfátot, kálium-hidrogén-foszfátot, magnézium-szulfátot, nátrium-kloridot, magnéziumkloridot, vas(Ill)-kloridot, vas(IIl)-szulfátot vagy mangán-szulfátot, továbbá adott esetben, megfelelő cukrokat, vitaminokat és hasonlókat adunk. A tápközeg kezdeti pH-ját előnyösen 6-8-ra állítjuk be. A tenyésztést 30-42 °C-on, előnyösen körülbelül 37 °C-on, levegőztetés és keverés alkalmazásával mélytenyészetben, illetve rázatott tenyészetben, állótenyészetben vagy hasonló módon, 4-24 órán keresztül végezzük.
A kapott tenyészetet, például 3000-es percenkénti fordulatszámmal 5 percig centrifügáljuk, hogy az MCI601 E. coli törzs sejtüledékét kapjuk. A sejtüledékből a kromoszomális DNS-t, például, Saito és Miura eljárásának [Biochem. Biophys. Acta. 72, 619 (1963)] vagy K. S. Kirby eljárásának [Biochem. J. 64, 405 (1956)] alkalmazásával nyerhetjük ki.
Annak érdekében, hogy a fenti módon kapott kromoszomális DNS-ből DDPS-gént izoláljunk, kromoszomális DNS-könyvtárat készítünk. Először a kromoszomális DNS-t megfelelő restrikciós enzimekkel részlegesen emésztjük, hogy különböző fragmensek elegyét kapjuk. E célra nagyon sok különféle enzim alkalmazható, feltéve, hogy a hasítás mértéke a hasítási reakcióidővel és egyéb faktorokkal szabályozható. Például
- a kromoszomális DNS emésztése érdekében - a Sau3AI-enzimet 1-10 egység/ml koncentrációban, különböző (1 perctől 2 óráig terjedő) időtartamban, legalább 30 °C-on, előnyösen 37 °C-on reagáltatjuk a kromoszomális DNS-sel. A következő lépésben a kapott DNS-fragmenseket - Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjeiben önálló replikációra képes - vektor-DNS-sel ligáljuk, hogy rekombináns DNS-t hozzunk létre. Az egyik megvalósítási módban - a Sau3 Al restrikciós enzim által kialakított szekvenciát kiegészítő - terminális nukleotidszekvenciát létrehozó restrikciós enzimet, például BamHI-et 1-100 egység/ml enzimkoncentrációban, legalább 30 °C-on legalább 1 óra hosszat (előnyösen 1-3 óra hosszat) reagáltatjuk a vektor-DNS-sel, hogy teljesen megeméssze, vágja és hasítsa azt. A következő lépésben a kromoszomális DNS-ffagmensek fentiek szerint kapott elegyét összekeverjük a hasított és vágott vektor-DNS-sel, s a rekombináns DNS kialakítása érdekében a kapott újabb elegygyel (4-16 °C hőmérsékleten, 1-100 egység/ml enzimkoncentrációban, legalább 1 óra hosszat, előnyösen
6-24 óra hosszat) DNS-ligázt, előnyösen T4-DNS-Hgázt reagáltatunk.
A kapott rekombináns DNS-t Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmus, például DDPS-hiányos mutáns törzs [mint például az E. coli K.-12 törzs, előnyösen a JE7627 törzs (ponB704, dacB12, pfv+, tonA2, dapA, lysA, str, malA38, metBl, ilvHőll, leuA371, proA3, lac-3, tsx-76)] transzformálásához alkalmazzuk, hogy kromoszomális DNS-könyvtárat hozzunk létre. A transzformációt, például D. M. Morrison eljárásával [Methods in Enymology 68, 326 (1979)] vagy egy olyan eljárással végezzük, amelyben a recipiens baktériumsejteket - a DNS permeabilitásának fokozása érdekében - kalcium-kloriddal kezeljük [Mandel, M. és Higa, A.: J. Mól. Bioi. 53, 159 (1970)}. A JE7627 törzs a „National Institute of Genetics” intézettől (Mishimashi, Shizouka-ken, Japán) szerezhető be.
A kapott kromoszomális DNS-könyvtárban a DDPSgén rekombináns DNS-ét tartalmazó baktériumtörzset a fokozott DDPS-aktivitást mutató törzsekből vagy az olyan törzsekből kapjuk, amelyekben a DDPS-gén hiányából adódó auxotrófia ki van egészítve. Például egy DDPS-hiányos mutáns törzs diamino-pimelinsavat igényel, így ha a DDPS-hiányos mutáns törzset alkalmazzuk gazdaként, úgy kaphatunk DDPS-gént tartalmazó DNS-ffagmenst, hogy azt a baktériumtörzset izoláljuk, amely képessé vált a diamino-pimelinsavat nem tartalmazó tápközegen történő növekedésre, és az izolált baktériumtörzsből kinyeijük a rekombináns DNS-t.
Annak igazolása érdekében, hogy a DDPS-gént tartalmazó rekombináns DNS-t hordozó lehetséges mutáns törzs valóban tartalmazza-e azt a rekombináns DNS-t, amelybe a DDPS-gént klónoztuk, a kiszemelt törzsből celluláris kivonatot készítünk, majd ebből nyersenzimoldatot készítünk, hogy megállapítsuk, fokozódott-e a DDPS-aktivitás. A DDPS enzimaktivitásának mérését Yugari és munkatársai eljárásának alkalmazásával végezhetjük [Yugari, Y. és Gilvarg, C.: J. Bioi. Chem. 240, 4710 (1962)].
A fentebb leírt baktériumtörzsből olyan rekombináns DNS-t, amelyet a DDPS-gént tartalmazó DNS
HU 219 608 Β vektor-DNS-be történő inszertálásával kaptunk, például, P. Guerry és munkatársai eljárásával [J. Bacteriol. 116, 1064 (1972)] vagy D. B. Clewell eljárásával [J. Bacteriol. 110, 667 (1972)] izolálhatunk.
A vad típusú DDPS-gént úgy is előállíthatjuk, hogy egy (kromoszómáján DDPS-gént tartalmazó) törzsből, Saito és Miura eljárásával vagy más, hasonló eljárással, kromoszomális DNS-t készítünk, és a DDPS-gént polimeráz-láncreakció (PCR) eljárással amplifikáljuk [lásd: White, T. J. és munkatársai: Trends Génét. 5, 185 (1989)]. Az amplifikációs reakcióhoz olyan DNS-láncindítókra van szükség, amelyek a DDPS-gén teljes régióját vagy egy részleges régióját tartalmazó, kétszálú DNS mindkét 3’-végével komplementerek. Amennyiben a DDPS-gén csupán egy részleges régióját amplifikáljuk, láncindítókként ilyen DNS-ffagmenseket kell alkalmazni, hogy a kromoszomális DNS-könyvtárban a teljes régiót tartalmazó DNS-ffagmens „screenelését” elvégezhessük. Ha a DDPS-gén teljes régióját amplifikáljuk, az amplifikált DDPS-gént tartalmazó DNS-ffagmenseket magában foglaló PCR-reakcióelegyet agarózgél-elektroforézisnek vetjük alá, majd kivonjuk a megcélzott DNS-ffagmenst. Ezzel a módszerrel DDPS-gént tartalmazó DNS-ffagmenst nyerhetünk ki.
A DNS-láncindítók megfelelő módon, például E. coliban ismert szekvencia alapján állíthatók elő [Richaud, F. és munkatársai: J. Bacteriol. 297 (1986)]. Közelebbről, olyan láncindítók előnyösek, amelyek a DDPS-gént magában foglaló, 1150 bázispárból álló régiót képesek amplifikálni, mint például a szekvencialista 1. és 2. azonosító számú szekvenciájaként bemutatott két láncindító. A láncindítókat ismert módszerrel, például foszfo-amidites eljárással [lásd: Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981)] szintetizálhatjuk, amihez kereskedelmi forgalomban beszerezhető DNS-szintetizáló készüléket (például „DNA Synthesizer Model 380B”, az Applied Biosystems Inc. terméke) alkalmazunk. A polimeráz-láncreakciót kereskedelmi forgalomban beszerezhető PCR-készülék (például „DNA Thermal Cycler Model PJ2000”, a Takara Shuzo Co., Ltd. terméke) alkalmazásával, a Takara Shuzo Co., Ltd. által forgalmazott Taq-DNS-polimeráz felhasználásával (a forgalmazó által megadott eljárással) végezhetjük.
A PCR-eljárással amplifikált DDPS-gént illetően, az olyan műveletek, mint például egy mutáció DDPSgénbe történő bevitele, egyszerű, ha a gént - egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium sejtjeiben önálló replikációra képes - vektor-DNS-sel Egáljuk, és így visszük be az Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium sejtjeibe. Az ilyen esetben alkalmazott vektorDNS, transzformációs eljárás és a DDPS-gén jelenlétét igazoló eljárás megegyezik a fentebb említett eljárásban alkalmazottakkal.
(2) Mutáció bevitele a DDPS-génbe
Egy génben mutációt (például aminosavhelyettesítést, -inszerciót vagy -deléciót) létrehozó eljárás példájaként egy rekombináns PCR-eljárást [Higuchi, R.: „PCR Technology”, szerkesztő: Erlich, H. A., „Stockton press”, 61. oldal (1989)] és egy helyspecifikus mutagenezises eljárást említünk [Kramer, W. és Frits, H. J.:
Meth. in Enzymol. 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. és munkatársai: Meth. in Enzymol. 154, 367 (1987)]. Az említett eljárások alkalmazásával a kívánt mutáció a kívánt helyen alakítható ki.
A fenti eljárásokon kívül egy megcélzott gén kémiai szintézisével szintén lehetőség nyílik arra, hogy egy kívánt helyre mutációt vagy véletlenszerű mutációt vigyünk be.
Alkalmazhatunk egy olyan eljárást is, melynek során a kromoszómán vagy plazmidon lévő DDPS-gént közvetlenül hidroxil-aminnal kezeljük [Hashimoto, T. és Sekiguchi, M.: J. Bacteriol. 159, 1039 (1984)]. Más lehetőség szerint alkalmazhatunk olyan eljárást is, amelyben egy Escherichia nemzetségbe tartozó, DDPSgént tartalmazó baktériumot ultraibolya fénnyel sugárzunk be, továbbá alkalmazhatunk egy másik, kémiai reagenssel (például N-metil-N’-nitrozo-guanidinnel vagy salétromossavval) végzett kezelésen alapuló eljárást is. Ezen eljárások alkalmazásával a mutáció véletlenszerűen vihető be.
A mutáns gén szelektálásához először a DDPS-gént tartalmazó DNS-ffagmensből és vektor-DNS-ből álló rekombináns DNS-t hidroxil-aminnal végzett (vagy hasonló) mutációs kezelésnek vetjük alá, és az így kapott rekombináns DNS-t, például, E. coli W3110 törzs transzformálásához alkalmazzuk. Ezután a transzformáit törzseket minimáltáptalajon, például - az L-lizin analógjaként S-2-amino-etil-ciszteint (AEC) tartalmazó - M9 táptalajon tenyésztjük. A vad típusú DDPSgént tartalmazó rekombináns DNS-t hordozó törzsek nem képesek L-lizint és diamino-pimelinsavat (DAP) szintetizálni, s ezáltal növekedésük visszafogott, mivel a rekombináns DNS által expresszált DDPS-t gátolja az AEC. Ezzel szemben - az L-lizin által kiváltott gátlást deszenzitizáló hatású mutációt tartalmazó DDPS-gént hordozó - rekombináns DNS-t tartalmazó törzs tartalmazza a fentebb említett rekombináns DNS-ben lévő DDPS-gén által kódolt mutáns enzimet, amelyet az AEC nem gátol, következésképpen, az ilyen törzs képes növekedni az AEC-vel kiegészített minimáltáptalajon. Ez a jelenség felhasználható olyan törzs kiválasztásához, amely az L-lizin analógját képező AEC-vel szemben (növekedést illetően) rezisztens; az ilyen törzs tartalmazza azt a rekombináns DNS-t, amely olyan DDPS-gént tartalmaz, amelyben a gátlás deszenzitizált.
Az így kapott mutáns gént rekombináns DNS-ként bevihetjük egy megfelelő gazdamikroorganizmusba, s abban expresszálhatjuk, s így olyan mikroorganizmushoz juthatunk, amely a „feedback” gátlással szemben deszenzitizált DDPS-t tartalmaz. Gazdasejtként előnyösen Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmust alkalmazunk, melyek közül példaként az E. colit említjük.
Más módon, a rekombináns DNS-ből kivehetünk egy mutáns DDPS-gén-ffagmenst, és ezt egy másik vektorba inszertálhatjuk. A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában vektor-DNS-ként előnyösen plazmidvektor-DNS-t alkalmazunk, amelynek példájaként a pUC19-, pUC18-, pBR322-, pHSG229-, PHSG298-, pHSG399-, pHSG398-, RSF1010-,
HU 219 608 Β pMW119-, pMW118-, pMW219- és pMW218-vektort említhetjük. A felsoroltakon kívül fág-DNS-vektorok is alkalmazhatók.
A mutáns DDPS-gén hatékony expresszálása érdekében, a mutáns DDPS-t kódoló DNS-szekvenciától „upstream” irányban egy másik (mikroorganizmusokban működőképes) promotert, például lac-, trp- és PL-promotert ligálhatunk, továbbá alkalmazhatunk egy DDPSgénben lévő promotert is (változtatás nélkül vagy amplifikálás után).
A mutáns gént önálló replikációra képes vektorDNS-be is inszertálhatjuk (amint azt fentebb leírtuk), amit bevihetünk egy gazdasejtbe, s a gazdasejt ezt a konstrukciót extrakromoszomális DNS-ként, például plazmádként fogja tartalmazni. Más lehetőség szerint a mutáns gént - például transzdukció, transzpozon [Berg, D. E. és Berg, C. M.: Bio/Technol. 1, 417 (1983)], Mufág (2-109985 számú közrebocsátott japán szabadalmi leírás) vagy homológ rekombináció [„Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Láb. (1972)] alkalmazásával végzett eljárással - egy gazdamikroorganizmus kromoszómájába foglalhatjuk.
<2> A találmány szerinti megoldás céljaira alkalmazott mutáns aszpartát-kináz-III-at (AKIII) kódoló DNS
A találmány szerinti megoldás céljaira alkalmazott mutáns aszpartát-kináz-III-at (AK1II) kódoló DNS - a vad típusú AKIII-at kódoló DNS-ben kódolt AKIII (Llizin által kiváltott) „feedback” gátlását deszenzitizáló hatású - mutációt tartalmaz. Az AKIII - L-lizin által kiváltott - „feedback” gátlását deszenzitizáló hatású mutáció példái a következők:
(a) a 323. glicint aszparaginsavval helyettesítő mutáció;
(b) a 323. glicint aszparaginsavval és a 408. glicint aszparaginsavval helyettesítő mutáció;
(c) a 34. arginint ciszteinnel és a 323. glicint aszparaginsavval helyettesítő mutáció;
(d) a 325. leucint fenil-alaninnal helyettesítő mutáció;
(e) a 318. metionint izoleucinnal helyettesítő mutáció;
(f) a 318. metionint izoleucinnal és a 349. valint metioninnal helyettesítő mutáció;
(g) a 345. szerint leucinnal helyettesítő mutáció;
(h) a 347. valint metioninnal helyettesítő mutáció;
(i) a 352. treonint izoleucinnal helyettesítő mutáció;
(j) a 352. treonint izoleucinnal és a 369. szerint fenil-alaninnal helyettesítő mutáció;
(k) a 164. glutaminsavat lizinnel helyettesítő mutáció; és (l) a 417. metionint izoleucinnal és a 419. ciszteint tirozinnal helyettesítő mutáció (az aminosavak számozását az AKIII - szekvencialistában 8. azonosító számú szekvenciaként megadott - aminosavszekvenciájának N-terminálisától kiindulva adtuk meg).
A vad típusú AKIII-at kódoló DNS-t illetően nincsenek különösebb megszorítások; az ilyen DNS-re példaként egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból, például E. coliból származó AKIII-at kódoló DNS-t említhetünk. Konkrét példaként említjük a 8. azonosító számú aminosavszekvenciát kódoló DNS-t, valamint a 7. azonosító számú nukleotidszekvencia 584-1930 bázisai által alkotott szekvenciát. (Az E. coli AKIII-enzimét egyébként egy lysC-gén kódolja.)
E szekvenciák közül azok képezik a találmány szerinti mutáns AKIII-at kódoló DNS-eket, amelyek nukleotidszekvenciájukban a fentebb felsorolt aminosavhelyettesítéseket eredményező mutációkat tartalmazzák. A helyettesített aminosavat kódoló bármilyen kodon megfelelő, függetlenül fajtájától, feltéve, hogy ugyanazt az aminosavat kódolja. A vad típusú AKIII aminosavszekvenciájában - a baktériumfajok és -törzsek különbségeitől függően - léteznek csekély eltérések, ilyenformán azok az AKIII-gének, amelyek az enzimaktivitás szempontjából lényegtelen helye(ke)n tartalmaznak aminosavhelyettesítés(eke)t, -deléció(ka)t vagy -inszerció(ka)t eredményező mutációkat, szintén a találmány szerinti mutáns AKIII-gének közé tartoznak. Például a későbbiekben leírt 2. példában kapott vad típusú lysCgén nukleotidszekvenciája (7. azonosító számú szekvencia) egy E. coli K-12-JC411 törzs lysC-génjének korábban publikált szekvenciájától hat helyen különbözik [Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N. és Patté, J. C.: J. Bioi. Chem. 216, 1052 (1986)], ezáltal a kódolt aminosavak két helyen különböznek (a JC411 törzs lysC-génje által kódolt AKIII aminosavszekvenciájában - az AKIII 8. azonosító számú aminosavszekvenciájának N-terminálisától kiindulva - 58. glicint cisztein, a 401. glicint pedig alanin helyettesíti). Még az E. coli K-12-JC411 törzsből származó lysC-vel azonos szekvenciával rendelkező lysC esetében is azt várjuk, hogy - amennyiben a fentebb említett (a)-(l) mutációk valamelyikét hozzuk létre - olyan lysC-t kapunk, amely az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutációt tartalmaz.
A mutáns AKIII-at (melyben az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlás deszenzitizált) kódoló DNS egyik előállítási eljárását a következők szerint valósítjuk meg. Először egy vad típusú AKIII-gént vagy egy másik mutációt hordozó AKIII-gént tartalmazó DNS-t in vitro mutációs kezelésnek vetünk alá, és a mutációs kezelés után kapott DNS-t egy gazdához adaptált vektor-DNS-sel ligáljuk, miáltal rekombináns DNS-t kapunk. Transzformánsok kialakítása érdekében a rekombináns DNS-t egy gazdamikroorganizmusba visszük be. Ha a kapott transzformánsok közül mutáns AKIII-at expresszáló transzformánst szelektálunk, az ilyen transzformáns mutáns gént tartalmaz. Más lehetőség szerint, rekombináns DNS előállítása érdekében, egy gazdához adaptált vektor-DNS-sel olyan DNS-t ligálhatunk, amely vad típusú AKIII-gént vagy egy másik mutációt hordozó AKIII-gént tartalmaz, és a kapott, rekombináns DNS-t ezt követően vetjük alá az in vitro mutációs kezelésnek. A mutációs kezelés után kapott rekombináns DNS-t - transzformánsok kialakítása érdekében - gazdamikroorganizmusba visszük be. Ha az így kapott transzformánsok közül mutáns DDPS-t expreszszáló transzformánst szelektálunk, az ilyen transzformáns szintén tartalmaz mutáns gént.
Egy másik lehetőség szerint, mutáns enzimet termelő mutáns törzs kialakítása érdekében egy vad típusú enzimet termelő mikroorganizmust vetünk alá mutációs
HU 219 608 Β kezelésnek, majd a mutáns törzsből mutáns gént nyerünk ki. A DNS közvetlen in vitro mutációs kezeléséhez alkalmazható szerek példáiként a hidroxil-amin és hasonlók említhetők. A hidroxil-amin olyan mutagén vegyszer, amely a citozint N4-hidroxi-citozinná alakítva citozin —> timin mutációt eredményez. Más módon, ha magát a mikroorganizmust vetjük alá mutációs kezelésnek, a kezelést ultraibolya sugárzás vagy a mesterséges mutációhoz általánosan alkalmazott mutagén ágens, például N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidin (NTG) alkalmazásával végezzük.
A fentebb leírt, vad típusú AKIII-gént (vagy más mutációt hordozó AKIII-gént) tartalmazó DNS donormikroorganizmusaként bármilyen, Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmust alkalmazhatunk, így például alkalmazhatók a Neidhardt és munkatársai könyvében leírt mikroorganizmusok [Neidhardt, F. C. és munkatársai: „Escherichia coli and Salmonella Typhimurium”, American Society fór Microbiology, Washington D. C., 1208, 1. táblázat], példaként az E. coli JM109 és MC1061 törzset említjük. Miután e törzsekből kinyertük az AKIII-gént, a kromoszomális DNS előállítását, a kromoszomális DNS-könyvtár kialakítását és hasonló műveleteket a DDPS-gén előállításával kapcsolatban fentebb leírt módon végezzük. A könyvtár kialakításához előnyösen teljesen AKI-, AKII- és AKIII-hiányos törzset, például E. coli GT3 törzset alkalmazunk [amely a „Genetic Stock Center”-től (Connecticut, Egyesült Államok) szerezhető be].
A kialakított kromoszomális DNS-könyvtárból az AKIII-gént tartalmazó rekombináns DNS-t hordozó baktériumtörzset olyan törzsként kapjuk, amelyben az AKIII-aktivitás fokozott szintű, vagy amelyben az auxotrófia ki van egészítve. A kiszemelt törzsekből celluláris kivonatokat készítünk, melyekből - az AKIIIaktivitás igazolásához - nyersenzimoldatokat készítünk. Az AKIII-enzim aktivitásának méréséhez Stadtman és munkatársai eljárását [Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras, G. és Robichon-Szulmajster, H.: J. Bioi. Chem. 236, 2033 (1961)] alkalmazhatjuk.
Például ha gazdaként teljesen AK-hiányos mutáns törzset alkalmazunk, úgy kaphatunk AKIII-gént tartalmazó DNS-ffagmenst, hogy L-lizint, L-treonint, L-metionint és diamino-pimelinsavat nem tartalmazó táptalajon vagy homoszerint és diamino-pimelinsavat nem tartalmazó táptalajon növekedni képes, transzformált törzset izolálunk, és az izolált baktériumtörzsből kinyerjük a rekombináns DNS-t.
Ha az AKIII-gént kromoszomális DNS-ből, PCReljárással amplifikáljuk, a PCR-reakcióhoz szükséges DNS-láncindítókat, például E. coliban ismert szekvencia alapján pontosan előállíthatjuk [Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N. és Patté, J. C.: J. Bioi. Chem. 261, 1052 (1986)]. Ennek ellenére, a lysC-gént alkotó, 1347 bázisból álló régiót amplifikálni képes láncindítók az előnyösek, mint például az 5. és 6. azonosító számú szekvenciákból állók.
A fentiek szerint kapott AKIII-génen aminosav(ak) helyettesítését, inszercióját és delécióját előidéző mutációkat - hasonlóan a DDPS-gén fentebb leírt mutációs kezeléséhez -, például, rekombináns PCR-eljárással, helyspecifikus mutagenezissel és hasonló módszerekkel hozhatjuk létre.
Egy kívánt gén kémiai szintézisével lehetőség nyílik arra, hogy kívánt helyre mutációt vagy véletlenszerű mutációt vigyünk be.
A fentieken kívül alkalmazhatunk egy olyan eljárást is, melynek során kromoszómán vagy egy extrakromoszomális rekombináns DNS-en lévő AKIII-gén DNS-ét közvetlenül hidroxil-aminnal kezeljük [Hashimoto, T. és Sekiguchi, M.: J. Bacteriol. 159, 1039 (1984)]. Más módon, alkalmazhatunk olyan eljárást is, melynek során egy Escherichia nemzetségbe tartozó - kromoszómáján AKIII-gént vagy extrakromoszomális DNS-ként rekombináns DNS-t tartalmazó - baktériumot ultraibolya fénnyel sugárzunk be, továbbá alkalmazhatunk kémiai reagenssel, például N-metil-N’-nitrozo-guanidinnel vagy salétromossawal végzett kezelést is.
A mutáns AKIII-gén szelektálásához először egy teljesen AK-hiányos törzset, például E. coli GT3 törzset - mutációs kezelésnek alávetett AKIII-gént tartalmazó - rekombináns DNS-sel transzformálunk. Ezután a transzformált törzseket minimáltáptalajon, például jelentős mennyiségű L-lizint tartalmazó M9táptalajon tenyésztjük. A vad típusú AKIII-gént hordozó rekombináns DNS-t tartalmazó törzsek nem képesek L-treonint, L-izoleucint, L-metionint és diamino-pimelinsavat szintetizálni, így növekedésük visszafogott, mivel az L-lizin csak egy AK-t gátol. Ezzel szemben - az L-lizin által kiváltott gátlást deszenzitizáló hatású mutációt tartalmazó gént hordozó - rekombináns DNS-t tartalmazó törzs képes növekedni a jelentős mennyiségű L-lizinnel kiegészített minimáltáptalajon. Ez a jelenség felhasználható olyan törzs kiválasztására, amely az Llizin analógját képező AEC-vel szemben (növekedést illetően) rezisztens; az ilyen törzs tartalmazza azt a rekombináns DNS-t, amely olyan mutáns AKIII-gént tartalmaz, melyben a gátlás deszenzitizált.
Az így kapott mutáns gént rekombináns DNS-ként bevihetjük egy megfelelő gazdamikroorganizmusba, s abban expresszálhatjuk, miáltal olyan mikroorganizmushoz juthatunk, amely a „feedback” gátlással szemben deszenzitizált AKIII-at tartalmaz.
Gazdaként előnyösen Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmust alkalmazunk, melyek közül példaként az E. colit említjük.
Más módon, a rekombináns DNS-ből kivehetünk egy mutáns DDPS-gén-ffagmenst, és ezt egy másik vektorba inszertálhatjuk. A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában vektor-DNS-ként előnyösen plazmidvektor-DNS-t alkalmazunk, amelynek példájaként a következőket említjük: pUC19, pUC18, pBR322, pHSG229, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 és pMW218. Ezeken kívül, fág-DNS-vektorok is alkalmazhatók.
A mutáns AKIII-gén hatékony expresszálása érdekében, a mutáns AKIII-at kódoló DNS-szekvenciától „upstream” irányban egy másik (mikroorganizmusokban működőképes) promotert, például lac-, trp- és PLpromotert ligálhatunk, továbbá alkalmazhatunk egy
HU 219 608 Β
AKIII-génben lévő promotert is (változtatás nélkül vagy amplifikálás után).
A mutáns gént - a fentebb leírtak szerint - önálló replikációra képes vektor-DNS-be is inszertálhatjuk, amit bevihetünk egy gazdasejtbe, miáltal a gazdasejt ezt a konstrukciót extrakromoszomális DNS-ként, például plazmádként fogja tartalmazni. Más lehetőség szerint, a mutáns gént - például transzdukció, transzpozon [Berg, D. E. és Berg, C. M.: Bio/Technol. 1, 417 (1983)], Mufág (2-109985 számú közrebocsátott japán szabadalmi leírás) vagy homológ rekombináció [„Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Láb. (1972)] alkalmazásával végzett eljárással - egy gazdamikroorganizmus kromoszómájába foglalhatjuk.
<3> L-lizin előállítása a találmány szerinti eljárással
Az L-lizin hatékony előállítása érdekében, a fentebb leírtak szerint, mutáns DDPS-gén bevitelével transzformáit, az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlással szemben deszenzitizált AK-t tartalmazó baktériumot előnyös tápközegben tenyésztünk, a tenyészetben Llizint termelünk és halmozunk fel, majd a tenyészetből összegyűjtjük azt. Közelebbről, az L-lizint úgy állíthatjuk elő hatékonyan, hogy olyan (Escherichia nemzetségbe tartozó) baktériumot hozunk létre, amely a mutáns DDPS-t és a mutáns AKIII-at egyaránt tartalmazza.
Az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlással szemben deszenzitizált AK-t tartalmazó, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium példájaként olyan Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokat említhetünk, amelyeket úgy transzformáltunk, hogy kromoszomális DNS-ükbe - az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású - mutációt hordozó AKIII-at kódoló DNS-t foglaltunk. Másik példaként említhetjük az olyan (Escherichia nemzetségbe tartozó) baktériumokat, amelyeket úgy transzformáltunk, hogy sejtjükbe a DNS (Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjében önálló replikációra képes) vektor-DNS-sel végzett ligálásával kialakított - rekombináns DNS-t vittünk be. Az aszpartát-kináz, amelyben az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlás deszenzitizált, lehet vad típusú AK, amely nem áll az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlás alatt, továbbá lehet olyan AK is, amelyet úgy hoztunk létre, hogy egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumba az említett, vad típusú AK-gént vittük be. Ezenkívül alkalmazhatunk olyan (Escherichia nemzetségbe tartozó) mutáns baktériumtörzset is, amelyet úgy tettünk alkalmassá mutáns AKIII-termelésére, hogy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjeit mutációs kezelésnek vetettük alá.
A mutáns DDPS-gén (Escherichia nemzetségbe tartozó) baktériumba történő bevitelével végzett transzformáció megvalósítása érdekében a mutáns DDPS-gént kromoszomális DNS-be foglalhatjuk, vagy más módon, a sejtekbe - a mutáns DDPS-gén (Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjében önálló replikációra képes) vektor-DNS-sel végzett ligálásával kialakított rekombináns DNS-t vihetünk be.
Ha egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumba a mutáns DDPS-gént és a mutáns AKIII-gént egyaránt bevisszük, a két mutáns gént az Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium kromoszomális DNS-ébe foglalva helyezhetjük el, vagy más módon, extrakromoszomális DNS-ként, azonos plazmidon vagy külön plazmidokon helyezhetjük el. Amennyiben külön plazmidokat alkalmazunk, előnyösen stabil megoszlási mechanizmusú plazmidokat használunk, ami lehetővé teszi, hogy a sejtben összeférhetően helyezkedjenek el. A mutáns géneket elhelyezhetjük úgy is, hogy az egyiket kromoszomális DNS-be foglaljuk, a másikat pedig (extrakromoszomális DNS-ként) egy plazmidon helyezzük el a sejtben. A mutáns DDPS-gént és a mutáns AKIII-gént bármilyen sorrendben bevihetjük az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumba.
Az L-lizin termelékenységét tovább javíthatjuk, ha az Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium (amelybe bevittük a mutáns DDPS-gént és a mutáns AKIIIgént) dihidrodipikolinát-reduktáz-génjét erősítjük. Az L-lizin termelékenysége még tovább javítható, ha az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumba (amelyben a dihidrodipikolinátgént erősítettük) coryneform baktériumból származó diamino-pimelát-dehidrogenáz-gént viszünk be. Ezt a diamino-pimelát-reduktázgént erősíteni kell. Más lehetőség szerint, az L-lizin termelékenysége hasonló mértékben javítható oly módon, hogy tetrahidrodipikolinát-szukciniláz-gént erősítünk, és a baktériumba diamino-pimelát-dehidrogenáz helyett szukcinil-diamino-pimelát-deaciláz-enzimet viszünk be.
A leírásban használt „gén erősítése” kifejezés egy sejtben - a gén expressziós termékeként - egy enzim aktivitásának fokozását jelenti. Az ilyen „erősítés” példájaként egy sejtben a gén kópiaszámának növelését, a génenkénti expressziós szint (nagy expressziós hatékonyságú promoter alkalmazásával végzett) fokozását, valamint egy enzimaktivitást fokozó mutáció génbe történő bevitelét említhetjük. Egy sejtben egy gén kópiaszámának növeléséhez a gént egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumban önálló replikációra képes vektorba inszertáljuk, és ezzel a vektorral Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumot transzformálunk. Az említett vektorként előnyösen nagy kópiaszámú típusú plazmidot alkalmazunk. Más lehetőség szerint a kópiaszámot - Mu-fág vagy hasonló alkalmazásával - kromoszomális DNS-be foglalt DNS amplifikálásával is növelhetjük. Amennyiben a mutáns DDPS-gén és a mutáns AKIII-gén beviteléhez plazmidokat alkalmazunk, előnyösen stabil megoszlási mechanizmusú plazmidokat használunk, ami lehetővé teszi a sejtben a plazmidok együttes, stabil elhelyezkedését. A gének bevitelét bármilyen sorrendben végezhetjük.
A következőkben olyan eljárást írunk le, amellyel az L-lizin-termelékenysége lépésenként, az L-lizin-bioszintézis-rendszer génjeinek egymás utáni erősítésével javítható. Egy több reakcióból álló bioszintézis-rendszer egy olyan folyadékáramlási rendszerhez hasonlítható, amelyben a folyadék több, különböző vastagságú, egymással sorba kapcsolt csövön áramlik. Ebben az összehasonlításban minden egyes cső egy adott enzimnek felel meg, s a csövek vastagsága az enzim reakciósebességét tükrözi. A csöveken átfolyt folyadék mennyiségét úgy fokozhat9
HU 219 608 Β juk, hogy a legvékonyabb cső átmérőjét növeljük. Nem várhatunk eredményt abban az esetben, ha egy vastag cső átmérőjét növeljük. Az átfolyt folyadékmennyiség további növelése érdekében a második legvékonyabb cső átmérőjét növelhetjük. Az L-lizin-bioszintézis-rendszer hatékonyságának fokozására tett kísérleteinkkel ebből a megközelítésből indultunk ki. E célból - amint azt az alábbi, 6. példában leírjuk - az L-lizin-bioszintézisrendszer sebességmeghatározó lépéseinek értelmezése érdekében az L-lizin-bioszintézis-rendszer - E. coliból származó - génjeit lépésenként E. coliba vittük be. Ennek során a bioszintézises reakcióidban előrehaladó irányban elhelyezkedő négy gént (a szukcinil-diamino-pimeláttranszaminázt kódoló dapC-gént, a tetrahidrodipikolinátszukcinilázt kódoló dapD-gént, a szukcinil-diamino-pimelát-deacilázt kódoló dapE-gént és a diamino-pimelátepimerázt kódoló dapF-gént) a Brevibacterium lactofermentum diamino-pimelát-dehidrogenáz (DDH) enzimét kódoló DDH-génnel helyettesítettük (a DDH egymagában képes katalizálni azokat a reakciókat, amelyekben az említett gének termékei vesznek részt). A L-lizin-bioszintézis-rendszer enzimeit kódoló, bevitt gének, és az általuk kódolt enzimek a következők:
ppc: foszfo-enol-piruvát-karboxiláz; aspC: aszpartát-aminotranszferáz; lysC: aszpartát-kináz-III;
lysC*: gátlással szemben deszenzitizált aszpartátkináz-III;
ásd: aszpartát-szemialdehid-dehidrogenáz;
dapA: dihidrodipikolinát-szintetáz;
dapA*: gátlással szemben deszenzitizált dihidrodipikolinát-szintetáz;
dapB: dihidrodipikolinát-reduktáz;
DDH: (Brevibacterium lactofermentumbói származó) diamino-pimelát-dehidrogenáz; lysA: diamino-pimelát-dekarboxiláz.
Az egyes gének egyenkénti, E. coliba történő bevitelének eredményeként az L-lizin termelődését azokban a törzsekben észleltük, amelyekbe lysC*-, dapA- vagy dapA*-gént vittünk be, s ezek közül is abban figyeltük meg a legnagyobb L-lizin-termelékenységet, amelyikbe a dapA*-gént vittük be. A kapott eredményből azt állapítottuk meg, hogy az első sebességmeghatározó lépést a dapA által katalizált reakció képezte. A következő lépésben, amikor a L-lizin-bioszintézis-rendszer minden egyes génjét bevittük abba a törzsbe, amelybe előzőleg dapA*-gént vittünk be, az L-lizin termelékenységét legnagyobb mértékben a lysC* fokozta. Ezek alapján megállapítottuk, hogy a lysC által katalizált reakció képezte a második sebességmeghatározó lépést. Hasonló módon azt találtuk, hogy a dapB által katalizált reakció képezte a harmadik, a DDH által katalizált reakció pedig a negyedik sebességmeghatározó lépést. A DDH-val helyettesített dapC, dapD, dapE és dapF által katalizált sebességmeghatározó lépések vizsgálatának eredményeként megállapítottuk, hogy a dapD és a dapE szerepet játszik a sebességmeghatározásban.
A következőkben az L-lizin-bioszintézis-rendszer génjeinek és a Brevibacterium lactofermentum DDHgénjének előállítási eljárásaira említünk példákat.
A ppc-gént - ilyen gént tartalmazó - pS2-plazmidból [Sabe, H. és munkatársai: Gene, 31, 279 (1984)] vagy pT2-plazmidból nyerhetjük. A ppc-gént tartalmazó DNS-fragmenst úgy kapjuk, hogy a pS2-plazmidot AatlI-vel és AflII-vel hasítjuk, ppc-gént tartalmazó DNS-fragmentet úgy is kialakíthatunk, hogy a pT2plazmidot Smal-gyel és Sacl-gyel hasítjuk. A pT2plazmidot tartalmazó E. coli F15 törzset (AJ12873) a Budapest Szerződés értelmében, a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology” intézetnél (postai irányítószám: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japán), FERM BP-4732 deponálási számon nemzetközi letétbe helyeztük.
Az aspC-gént - ilyen gént tartalmazó - pLF4-plazmidból [Inokuchi, K. és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 10, 6957 (1982)] nyerjük. Az aspC-gént tartalmazó DNS-fragmentet úgy kapjuk, hogy a pLF4-plazmidot PvuII-vel és Stul-gyel hasítjuk.
Az asd-gént - ilyen gént tartalmazó - pAD20-plazmidból [Haziza, C. és munkatársai: EMBO 1, 379 (1982)] nyerjük. Az asd-gént tartalmazó DNS-fragmentet úgy kapjuk, hogy a pAD20-plazmidot Asel-gyel és Clal-gyel hasítjuk.
A dapB gént E. coli kromoszomális DNS-ének - PCR-eljárással végzett - amplifikálásával kapjuk. A PCR-reakcióhoz egy ismert dapB-gén [Bouvier, J. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 259, 14 829 (1984)] nukleotidszekvenciája alapján előállított kétféle láncindító oligonukleotidot (például a 9. és 10. azonosító számú nukleotidszekvenciákat) alkalmazunk.
A DDH-gént a Brevibacterium lactofermentum kromoszomális DNS-ének - PCR-eljárással végzett amplifikálásával kapjuk. A PCR-reakcióhoz a Corynebacterium glutamicum DDH-génjének ismert nukleotidszekvenciája [Ishino, S. és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 15, 3917 (1987)] alapján előállított kétféle láncindító oligonukleotidot (például a 11. és 12. azonosító számú nukleotidszekvenciákat) alkalmazunk.
A lysA-gént E. coli kromoszomális DNS-ének PCR-eljárással végzett - amplifikálásával kapjuk, amihez egy ismert lysA-gén nukleotidszekvenciája [Stragier, P. és munkatársai: J. Mól. Bioi. 168, 321 (1983)] alapján előállított kétféle láncindító oligonukleotidot (például a 13. és 14. azonosító számú nukleotidszekvenciákat) alkalmazunk.
A dapD-gént egy E. coli W3110 törzs kromoszomális DNS-ének - PCR-eljárással végzett - amplifikálásával kapjuk, amihez egy ismert dapD-gén nukleotidszekvenciája [Richaud, C. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 259, 14 824 (1984)] alapján előállított kétféle láncinditó oligonukleotidot (például a 15. és 16. azonosító számú nukleotidszekvenciákat) alkalmazunk.
A dapE-gént E. coli-ONS - PCR-eljárással végzett - amplifikálásával kapjuk, amihez egy ismert dapE-gén nukleotidszekvenciája [Bouvier, J. és munkatársai: J. Bacteriol. 174, 5265 (1992)] alapján előállított kétféle láncindító oligonukleotidot (17. és 18. azonosító számú nukleotidszekvenciák) alkalmazunk.
HU 219 608 Β
A dapF-gént E. coli kromoszomális DNS-ének - PCR-eljárással végzett - amplifikálásával kapjuk, amihez egy ismert dapF-gén nukleotidszekvenciája [Richaud, C. és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 16, 10 367 (1988)] alapján előállított kétféle láncindító oligonukleotidot (például a 19. és 20. azonosító számú nukleotidszekvenciákat) alkalmazunk.
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában gazdaként bármilyen, Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumot alkalmazhatunk, feltéve, hogy sejtjeiben működik - a mutáns DDPS-gén, a mutáns AKIIIgén vagy az L-lizin-bioszintézis-rendszer egy másik génjének - promotere, továbbá hogy sejtjeiben a gének sejtekbe történő beviteléhez alkalmazni kívánt vektor-DNS replikációs kezdőhelye működőképes, ami képessé teszi a vektor-DNS-t a replikációra (olyan esetben, amikor a mutáns DDPS-gént, a mutáns AKIII-gént vagy az Llizin-bioszintézis-rendszer egy másik génjét extrakromoszomális DNS-ként egy plazmidba visszük be).
Gazdaként alkalmazhatunk, például L-lizint termelő E. colit, közelebbről, olyan mutáns törzset, amely az L-lizin-analógokkal szemben rezisztens. A lizinanalóg olyan vegyület, amely gátolja az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok proliferációját, de ez a gátlás teljesen vagy részben deszenzitizálódik, ha a tápközegben L-lizin van jelen. A lizinanalógok példájaként megemlíthetjük az oxalizint, lizin-hidroxamátot, AEC-t, γ-metil-lizint, α-klór-kaprolaktámot stb. A lizinanalógokkal szemben rezisztens mutáns törzseket úgy hozzuk létre, hogy az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusokat általánosan alkalmazott, mesterséges mutációs kezelésnek vetjük alá. Az L-lizin előállításához alkalmazott baktériumtörzs konkrét példájaként az Escherichia coli AJ11442 törzset említjük, melyet FERM-BP-1543 és NRRL-B-12185 deponálási számokon helyeztünk letétbe (lásd 56-18596 számú közrebocsátott japán szabadalmi leírás vagy 4,346,170 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A fentebb leírt mikroorganizmusok aszpartát-kinázában az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlás deszenzitizált.
A fentieken kívül példaként említhetjük az L-treonint termelő mikroorganizmusokat, mivel ezek aszpartátkinázának L-lizin által kiváltott gátlása szintén deszenzitizált. Az L-treonint termelő E. coli baktériumok közül a B-3996 törzs a jelenleg ismert legnagyobb termelékenységű törzs. Ezt a törzset a „Research Institute fór Genetics and Industrial Microorganism Breeding” intézetnél RIA-1867 deponálási számon helyeztük letétbe.
A találmány szerinti mutáns gént tartalmazó transzformáns tenyésztéséhez - szénforrást, nitrogénforrást, szerves ionokat, és adott esetben, egyéb szerves vegyületeket tartalmazó - szokványos tápközeget alkalmazunk.
Szénforrásként alkalmazhatunk cukrokat, például glükózt, laktózt, galaktózt, ffuktózt vagy keményítőhidrolizátumot; alkoholokat, például glicerint vagy szorbitolt; valamint szerves savakat, mint például fumársavat, citromsavat vagy borostyánkősavat.
Nitrogénforrásként szervetlen ammóniumsókat, például ammónium-szulfátot, ammónium-kloridot vagy ammónium-foszfátot; szerves eredetű nitrogént, például szójabab-hidrolizátumot; ammóniagázt; illetve vizes ammóniaoldatot alkalmazhatunk.
A tápközegben, megfelelő mennyiségben, előnyösen alkalmazhatunk szerves kiegészítőanyagokat is, mint például B-vitamint, L-izoleucint vagy élesztőkivonatot. Az eddig felsoroltak mellett, kívánt esetben, kis mennyiségben alkalmazhatunk kálium-foszfátot, magnéziumszulfátot, vasiont, mangániont és hasonlókat.
A tenyésztést előnyösen aerob körülmények között, 16-72 óra hosszat végezzük. A tenyésztés során a hőmérsékletet 25 °C és 45 °C közötti hőmérsékleten tartjuk, a pH-t pedig 5-8 értékre állítjuk be. A pH beállításához szervetlen vagy szerves savak vagy lúgok, valamint ammóniagáz és hasonlók alkalmazhatók.
A fermentációs folyadékból az L-lizint rendszerint ioncserélő gyanta felhasználásával végzett eljárás, kicsapási eljárás és egyéb, ismert eljárások kombinációival nyeljük ki.
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1. ábrán a pdapAl- és pdapA2-plazmid előállításának lépéseit mutatjuk be.
A 2. ábrán az L-lizin - vad típusú és mutáns DDPSenzimekre vonatkozó - gátlóhatását mutatjuk be.
A 3. ábrán egy kettős mutációt hordozó dapA*-gént tartalmazó pdapAS824-plazmid előállításának lépéseit mutatjuk be.
A 4. ábrán a pLYSCl- és pLYSC2-plazmid előállításának lépéseit mutatjuk be.
Az 5. ábrán a hidroxil-aminos kezeléssel létrehozott transzformánsok megjelenési arányát és mutációs arányát mutatjuk be.
A 6. ábrán az L-lizin - vad típusú és mutáns ΑΚΠΙenzimekre vonatkozó - gátlóhatását mutatjuk be.
A 7. ábrán egy - dapA*24-gént tartalmazó RSF1010plazmidból származó - RSF24P-plazmid előállításának lépéseit mutatjuk be.
A 8. ábrán egy pLLC*80-plazmid előállításának lépéseit mutatjuk be.
A 9. ábrán egy - dapA*24 és lysC*80 gént tartalmazó RSFlOlO-plazmidból származó - RSFD80-plazmid előállításának lépéseit mutatjuk be.
A 10. ábrán a dapA-, illetve dapA*-gént tartalmazó pdapA- és pdapA*-plazmid szerkezetét mutatjuk be.
All. ábrán a lysC-, illetve lysC*80-gént tartalmazó plysC- és plysC*-plazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 12. ábrán egy - ppc-gént tartalmazó - pppcplazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 13. ábrán egy - aspC-gént tartalmazó - paspCplazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 14. ábrán egy - asd-gént tartalmazó - pasd-plazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 15. ábrán egy - dapB-gént tartalmazó - pdapBplazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 16. ábrán egy - DDH-gént tartalmazó - pDDHplazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 17. ábrán egy - lysA-gént tartalmazó - plysAplazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 18. ábrán egy - dapA*24-, lysC*80- és dapB-gént tartalmazó RSFlOlO-plazmidból származó - pCABlplazmid előállításának lépéseit mutatjuk be.
HU 219 608 Β
A 19. ábrán egy - dapA*24-, lysC*80-, dapB- és DDH-gént tartalmazó RSFlOlO-plazmidból származó pCABD2-plazmid előállításának lépéseit mutatjuk be.
A 20. ábrán egy - dapD-gént tartalmazó - pdapDplazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 21. ábrán egy - dapE-gént tartalmazó - pdapEplazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 22. ábrán egy - dapF-gént tartalmazó - pdapFplazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 23. ábrán egy - dapD- és dapE-gént tartalmazó - pMWdapDEl-plazmid előállításának lépéseit mutatjuk be.
A 24. ábrán egy - dapA*24-, lysC*80-, dapB-, dapDés dapE-gént tartalmazó - pCABDEl-plazmid előállításának lépéseit mutatjuk be.
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban a példák segítségével ismertetjük részletesebben.
1. példa
Mutáns DDPS-gén előállítása <1> A vad típusú dapA-gén klónozása
Az E. coli dapA-génjének nukleotidszekvenciáját korábban már leírták [Richaud, F. és munkatársai: J. Bacteriol. 297 (1986)], és ismert, hogy nyitott leolvasási kerete (ORF) 876 bázispárt tartalmaz, és 292 aminosavas proteint kódol. Mivel e dapA-gén szabályozását nem ismerjük, PCR-eljárással olyan régiót amplifikáltunk, majd klónoztunk, amely csak egy SD-szekvenciát és a - promoterrégió nélküli - nyitott leolvasási keretet tartalmazza.
Egy E. coli K-12-MC1061 törzs teljes genomiális DNS-ét Saito és Miura eljárásával vontuk ki [Saito és Miura: Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)]. Kétféle - az 1. és 2. azonosító számú szekvenciákkal rendelkező - „primer”-t állítottunk elő, és ezeket az Erlich és munkatársai által [„PCR Technology”, Stockton Press (1989)] leírtak szerint végzett PCR-eljárásban alkalmaztuk, és cél-DNS-t amplifikáltunk. A kapott DNS-t változtatás nélkül - a PCR-fragmensekhez alkalmas, szokványos pCRlOOO-klónozóvektorba [melyet az Invitrogen Ltd.-től (Kalifornia, Egyesült Államok) szereztünk be] inszertáltuk. A pCRlOOO lacZ-promotert tartalmaz („placZ”), és a lacZ-promotertől „downstream” irányban lévő helyen hasított állapotban forgalmazzák. Ha egy PCR-fragmenst a pCRlOOO-klónozóvektor két hasított vége közé ligálunk, és az így kapott rekombináns DNS-t E. coliba visszük be, a PCR-fragmens transzkripciója a lacZ-promoter szabályozása alatt megy végbe. A PCR-fragmens pCRlOOO-plazmidba történő ligálásával kétféle plazmidot kaptunk; a pdapAlplazmidot, amely a dapA-gént - a dapA-gén transzkripcióját a lacZ-promoter által szabályozott transzkripció irányához viszonyítva - normális orientációban tartalmazta, és a pdapA2-plazmidot, amely a dapA-gént az előbbi viszonyítás értelmében - fordított orientációban tartalmazta (lásd 1. ábra).
Amikor ezeket a plazmidokat DDPS-hiányos E. coli JE7627 törzsbe vittük be, a bevitt plazmidokat tartalmazó törzsekben a JE7627 gazdatörzs diamino-pimelinsavra vonatkozó auxotrófiája megszűnt, ezzel igazoltuk, hogy a két plazmidba inszertált DNS-fragmensek az aktív DDPS-t kódoló dapA-gént tartalmazzák.
A pdapAl-plazmid [„National Institute of Genetics”, (Mishima-shi, Shizouka-ken, Japán)] történő bevitelével létrehozott transzformáns törzset W3110/pdapAl-nek, a pdapA2-plazmid vad típusú E. coli W3110 törzsbe történő bevitelével kialakított transzformáns törzset pedig W3110/pdapA2-nek neveztük el. Ezt a két transzformáns törzset az alábbi összetételű - az L-lizin analógjaként AEC-vel kiegészített M9 minimáltáptalajon tenyésztettük. A bevitt plazmidot nem tartalmazó W3110 törzset (kontrollként) azonos táptalajon tenyésztettük. A két transzformáns törzs és a plazmidot nem tartalmazó W3110 törzs növekedése az AEC hatása miatt gátolt volt, azonban e gátlást L-lizin hozzáadásával meg tudtuk szüntetni. Az M9 minimáltáptalaj összetétele a következő:
A: (20xM9)
Na2HPO4.12 H2O 303 g/1
KH2PO4 60 g/1
NaCl 10 g/1
NH4C1 20 g/1
Β: 1 M MgSO4
C: 50% glükóz
D: 1 g/1 tiamin.
A fenti A, B, C és D komponenseket külön-külön sterilizáltuk, majd A:B:C:D:víz=5:0,l: 1:0,l :95 arányban összekevertük.
<2> Mutáns DDPS-gén (dapA*) előállítása
Feltételeztük, hogy az L-lizin által kiváltott gátlással szemben deszenzitizált DDPS-t kódoló dapA*-gént tartalmazó plazmidot hordozó törzs képes - jelentős mennyiségű AEC-t tartalmazó - M9 minimáltáptalajon növekedni. Az AEC-vel szembeni növekedési rezisztenciája alapján dapA*-gént tartalmazó plazmidot hordozó törzset szelektáltunk.
A dapA* hatékony kinyerése érdekében az <1> pontban leírtak szerint előállított pdapAl- és pdapA2plazmidokban lévő dapA-géneket mutációs kezelésnek vetettük alá.
(1—2—1) A dapA*-gént tartalmazó plazmidot hordozó törzs szelekciós feltételeinek vizsgálata
A fentebb leírtak szerint előállított W3110/pdapAl és W3110-pdapA2 törzset különböző koncentrációjú AEC-t tartalmazó M9 agartáptalajon tenyésztettük. A kísérletben az AEC növekedést gátló koncentrációját és a dapA*-gént tartalmazó plazmidot hordozó törzs szelektálásának feltételeit vizsgáltuk.
A transzformánsok - különböző koncentrációjú AEC-t tartalmazó - M9 táptalajon megfigyelt növekedését az 1. táblázatban mutatjuk be. Ebben a táblázatban a „+” jelek a transzformáns növekedését, a „-'jelek pedig a növekedés hiányát jelzik.
1. táblázat
AEC-koncentráció (mM) W3110/pdapAl W3110-pdapA2
250 - -
125 - -
HU 219 608 Β
1. táblázat (folytatás)
AEC-konccntráció (mM) W3110/pdapAl W3110-pdapA2
60 - -
30 - -
15 + -
8 + +
4 + +
2 + +
A pdapAl-plazmidon lévő dapA-gén transzkripciójának iránya megegyezik a transzkripció lacZ-promoter által meghatározott irányával (1. ábra). Ilyenformán azt találtuk, hogy pdapA2-plazmidon lévő dapA-gén rezisztenciát biztosított az AEC viszonylag nagy koncentrációival szemben, még akkor is, ha a plazmidon a dapA-gén vad típusú maradt, mivel expressziós szintjét növelte a lacZ-promoter; eközben a pdapA2-plazmidon lévő dapA-gén expressziós szintje alacsonyabb volt, és az AEC kisebb koncentrációi számára is lehetővé tette a növekedés gátlását, mivel transzkripciója a lacZ-promoterhez képest fordított volt, és a dapAgén saját promotere szintén hiányos volt (a W3110/ /pdapAl törzs esetében a növekedés gátlása 30 mM koncentrációjú AEC hozzáadásakor, a W3110/pdapA2 törzs esetében pedig 15 mM koncentrációjú AEC hozzáadásakor került gátlása alá. Bebizonyosodott, hogy a növekedés gátlása L-lizin egyidejű hozzáadásával megszüntethető.
A fentiek eredményeként a mutáció bevitelének célpontjaként a pdapA2-plazmidot alkalmaztuk. A dapA*gént tartalmazó plazmidot hordozó törzs szelektálásához 60 mM AEC-vel kiegészített M9 minimáltáptalajt készítettünk. Ezt a táptalajt az 1. példa további részében „szelekciós táptalaj” néven említjük.
(1-2-2) A pdapA2-plazmid hidroxil-aminnal végzett in vitro mutációs kezelése
A mutáció pdapA2-plazmidba történő beviteléhez in vitro mutációs kezelési eljárást alkalmazunk, melynek során a plazmidokat közvetlenül hidroxil-aminnal kezeltük.
pg DNS-t 75 °C-on 1-4 órán át 0,4 M hidroxilamin-oldatban kezeltünk [0,1 M KH2PO4-oldat és 1 mM EDTA (pH=6,0): 100 pl; 1 M hidroxil-aminoldat és 1 mM EDTA (pH=6,0): 80 pl; DNS: 2 pg; vízzel 200 pl végtérfogatra kiegészítve]. A kezelés után a DNS-t üvegporral tisztítottuk, majd E. coli W3110 törzsbe vittük be, és a sejteket komplett táptalajra kentük (L-tápleves: 1% „Bacto trypton”, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% NaCl, 1,5% agar), és telepeket alakítottunk ki. A kapott telepeket az (1-2-1) pontban leírt szelekciós táptalajra másoltuk át, s kiválasztottuk azokat a törzseket, amelyek a szelekciós táptalajon is telepeket képeztek. Kétszeri ismétléssel végzett kísérlet után öszszesen 36 törzsben kaptunk lehetséges mutáns plazmidokat.
Az így kapott, lehetséges mutáns plazmidokat tartalmazó, összesen 36 törzset ismét szelekciós táptalajra helyeztük, és igazoltuk az AEC-rezisztenciát.
(1-2-3) A dapA*-gén izolálása és a dapA*-géntermék vizsgálata
Az előző pontban említett 36 törzsből mutáns pdapA2 plazmidokat nyertünk ki, és a kapott plazmidokkal egy dapA-hiányos JE7627 törzset, illetve a vad típusú pdapA2 törzset transzformáltuk. Valamennyi transzformált törzsből sejtmentes kivonatot készítettünk, és mértük a DDPS enzimaktivitását.
A sejtmentes kivonatot (vagyis a nyersenzimoldatot) a következők szerint készítettük. Egy transzformáns törzset 2xTY tápközegben (1,6% „Bacto trypton”, 1% élesztőkivonat, 0,5% NaCl) tenyésztettünk, és a sejteket akkor gyűjtöttük össze, amikor a tenyészet 660 nm-nél mért optikai denzitása (OD660) körülbelül 0,8 értéket ért el. A sejtüledéket 0 °C-on 0,85%-os NaCl-oldattal mostuk, majd 400 mM KCl-ot tartalmazó 20 mM kálium-foszfát-pufferben (pH=7,5) újraszuszpendáltuk. A sejteket ultrahangozással (0 °C, 200 W, 10 perc) tártuk fel. A feltárt sejtek oldatát 33 000-es percenkénti fordulatszámmal, 0 °C-on 1 óra hosszat centrifugáltuk, s a kapott felülúszóhoz - 80%-os telítettség eléréséig - ammónium-szulfátot adtunk, majd az oldatot centrifúgálás után 1 éjszakán át 0 °C-on tartottuk. Az üledéket 400 mM KCl-ot tartalmazó 20 mM káliumfoszfát-pufferben (pH=7,5) oldottuk fel.
A DDPS enzimaktivitását Yugari és munkatársai által leírt eljárással mértük [Yugari, Y. és Gilvarg, C.: J. Bioi. Chem. 240, 4710 (1962)]. Ennek során az alábbi összetételű reakcióelegy abszorbanciáját 37 °C-on, 270 nm hullámhosszúságnál, időfüggő módon, spektrofotométerben mértük, s ezzel meghatároztuk a képződött dihidrodipikolinát mennyiségét. A vakpróbaként alkalmazott reakciórendszerből eltávolítottuk a nátriumpiruvátot.
A reakcióelegy összetétele:
mM imidazol-HCl (pH=7,4);
mM L-aszpartát-szemialdehid;
mM nátrium-piruvát; enzimoldat;
víz (az össztérfogat 1 ml-re történő kiegészítéséhez).
Az enzimes reakcióelegyhez a DDPS enzimaktivitásának mérése során különböző koncentrációjú L-lizint adtunk, és vizsgáltuk az L-lizin által kiváltott gátlás hatását. Amint a 2. ábrán látható, a vad típusú DDPS az L-lizin gátlása alatt állt. A 36 lehetséges plazmid közül három olyan volt, amely az L-lizinnel (a vad típushoz képest) nehezen gátolható DDPS-t tartalmazó transzformáns törzsből származott. Ezt a három plazmidot pdapAS8-nak, pdapAS9-nek és pdapAS24-nek neveztük el. A nukleotidszekvenciák következő pontban leírt meghatározása alapján kimutattuk, hogy a pdapAS8- és a pdapAS9-plazmid azonos mutációt tartalmaz.
Az L-lizin által kiváltott gátlás deszenzitizálásának mértéke a pdapAS8-, pdapAS9- és pdapAS24-plazmid által kódolt három mutáns DDPS esetében eltérő volt, de a gátlás mindegyik esetében létezett. Bár az enzim specifikus aktivitását befolyásolhatják a sejtek növekedési körülményei és a minták elkészítésének módja, azt találtuk, hogy a mutáns enzim specifikus aktivitása minden esetben alacsonyabb, mint a vad típusé. Ettől füg13
HU 219 608 Β getlenül, úgy ítéltük meg, hogy tenyésztési anyagként történő alkalmazásukat illetően nem fognak jelentős problémákat okozni.
(1-2-4) A mutáns dapA-gének nukleotidszekvenciájának meghatározása
A mutáns dapA-gének nukleotidszekvenciáját szokványos eljárással, „ABI Model 373A” DNS-szekvenáló (az Applied Biosystems Inc. terméke) alkalmazásával határoztuk meg. A szekvenálás eredményeként kimutattuk, hogy a szekvencialista 3. azonosító számú szekvenciájaként bemutatott vad típusú dapA-gén 487. citozinját (C) - a pdapAS8- és pdapAS9-plazmidban timin (T), és 597. citozinját - a pdapAS24-plazmidban - szintén timin helyettesíti. Következésképpen megállapítottuk, hogy a DDPS 4. azonosító számú aminosavszekvenciájának 81. alaninja helyett - a pdapAS8- és pdapAS9-plazmid által kódolt DDPS valint, a 118. hisztidin helyett pedig - a pdapAS24plazmid által kódolt DDPS - tirozint tartalmaz. (1-2-5) Kettős mutációt tartalmazó dapA-gén előállítása
Az előző pontban leírtak szerint kétféle mutáns dapA-gént kaptunk. Hogy megállapítsuk, vajon e mutációk esetében a gátlás deszenzitizálása additív módon érvényesül-e, olyan plazmidot állítottunk elő, amely mindkét mutációt hordozó mutáns dapA-gént tartalmazza. Az előállítási eljárást a 3. ábrán mutatjuk be. A kapott, kettős mutációt tartalmazó plazmidot pdapAS824nek neveztük el.
2. példa
Mutáns AKlII-gén előállítása < 1 > A vad típusú lysC-gén klónozása
Egy E. coli AKIII-gén (lysC) nukleotidszekvenciáját már korábban leírták [Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N. és Patté, J. C.: J. Bioi. Chem. 261, 1052 (1986)], és ismert, hogy nyitott leolvasási kerete (ORF) 1347 bázispárt tartalmaz, és 449 aminosavas proteint kódol. E gén tartalmaz egy operátort, amely az L-lizin gátlása alatt áll. Az operátorrégió eltávolítása érdekében olyan régiót amplifikáltuk (PCR-eljárással), illetve klónoztunk, amely csak SD-szekvenciát és nyitott leolvasási keretet tartalmazott.
Egy E. coli K-12-MC1061 törzs teljes genomiális DNS-ét Saito és Miura eljárása [Saito és Miura: Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)] szerint állítottuk elő. Kétféle - az 5., illetve 6. azonosító számú nukleotidszekvenciával rendelkező - „primer”-t szintetizáltunk, és a kapott láncindítókat az Erlich és munkatársai által leírt eljárással [Erlich és munkatársai: „PCR Technology”, Stockton press (1989)] végzett PCR-reakcióhoz alkalmaztuk. A kapott DNS-t BamHI és Asel restrikciós enzimekkel emésztettük, majd tompa végeket alakítottunk ki, és az így kapott fragmenst többkópiás pUC18-vektor Smal-helyére inszertáltuk. Ez a Smal-hely a vektorban jelen lévő lacZ-promotertől „downstream” irányban helyezkedik el, s ha - egy DNS-fragmensnek a pUC18-vektor Smal-helyére történő inszertálásával kapott - rekombináns DNS-t E. coliba viszünk be, az inszertált DNS-fragmens transzkripciója, a lacZ-promoter szabályozása alatt, „read-through” transzkripcióval történik. A PCR-fragmenst a pUC18-vektor Smal-helyére klónozva kétféle plazmidot kaptunk; a pLYSCl-plazmidot amely a lysCgént - a lysC-gén transzkripcióját a lacZ-promoter által szabályozott transzkripció irányához viszonyítva normális orientációban tartalmazta, és a pLYSC2plazmidot, amely a lysC-gént - az előbbi viszonyítás értelmében - fordított orientációban tartalmazta (4. ábra).
Amikor ezekkel a plazmidokkal egy teljesen AKI-, AKII- és AKIII-hiányos E. coli GT3 törzset (thrA1016b, metLM1005, lysC1004) transzformáltunk, a GT3 törzs homoszerin- és diamino-pimelinsav-auxotrófiája megszűnt, s ezzel bebizonyítottuk, hogy a két plazmidba inszertált DNS-ffagmensek tartalmazzák az aktív AKIIIat kódoló lysC-gént.
A teljesen AK-hiányos E. coli GT3 törzs pLYSClplazmiddal végzett transzformálásával kapott transzformáns törzset GT3/pLYSC 1-nek, az E. coli GT3 törzs pLYSC2-plazmiddal végzett transzformálásával kapott transzformáns törzset pedig GT3/pLYSC2-nek neveztük el. M9 minimáltáptalajhoz jelentős mennyiségű L-lizint adtunk, és a GT3/pLYSCl, illetve GT3/pLYSC2 törzset az így kapott táptalajon tenyésztettük. A GT3/pLYSCl és a GT3/pLYSC2 törzs egyaránt hordozta a vad típusú lysC-gént tartalmazó plazmidokat, amelyekben a lysCgén által kódolt AKIII az egyedüli aszpartát-kináz. Jelentős mennyiségű L-lizin jelenlétében az egyedüli aszpartát-kinázt képviselő AKIII az L-lizin gátlása alatt áll, így egyik törzs sem volt képes L-treonint, L-izoleucint, Lmetionint és diamino-pimelinsavat (DAP) szintetizálni, és növekedésük gátolt volt.
<2> Mutáns AKIII-gén (lysC*-gén) előállítása
Feltételeztük, hogy - egy L-lizin által kiváltott gátlással szemben deszenzitizált AK-t kódoló lysC*-gént tartalmazó - plazmidot hordozó törzs képes olyan M9 minimáltáptalajon növekedni, amelyhez jelentős mennyiségű L-lizint adtunk. A törzsek - L-lizinnel vagy (az L-lizin analógjaként) AEC-vel szemben rezisztens - növekedése alapján végzett szelekcióval lysC*-gént tartalmazó plazmidot hordozó törzset szelektáltunk.
A lysC*-gén hatékony kinyerése érdekében az < 1 > pontban előállított pLYSCl- és pLYSC2-plazmidot mutációs kezelésnek vetettük alá.
(2-2-1) A lysC*-gént tartalmazó plazmidot hordozó törzs szelekciós feltételeinek vizsgálata
A GT3/pLYSCl és GT3/pLYSC2 törzset különböző koncentrációjú L-lizint, illetve AEC-t tartalmazó M9 agartáptalajon tenyésztettük. A kísérletben az Llizin és AEC növekedést gátló koncentrációit, valamint a lysC*-gént tartalmazó plazmidot hordozó törzs kiválasztásához alkalmas feltételeket vizsgáltuk.
A transzformánsok - különböző koncentrációjú Llizint vagy AEC-t tartalmazó - M9 táptalajon megfigyelt növekedését a 2. táblázatban mutatjuk be. Ebben a táblázatban a „+” jelek a transzformáns növekedését, a „±” jelek kismértékű növekedést, a jelek pedig a növekedés hiányát jelzik.
HU 219 608 Β
2. táblázat
A növekedés és az L-lizin-koncentráció összefüggése
L-lizin-koncentráció (mM)
0 0,2 0,4 0,8 1,5 3 6 12 25 50 100 200
GT3/pLYSCl + - - - - - - - - - - -
GT3/pLYSC2 + + + + + + + + + + ± -
A növekedés és az AEC-koncentráció összefüggése
AEC-koncentráció (mM)
0 0,2 0,4 0,8 1,5 3 6 12 25 50
GT3/pLYSCl + - - - - - - - - -
GT3/pLYSC2 + + + ± ± + - - - -
A pLYSC2-plazmidon lévő lysC-gén transzkripciójának iránya megegyezik a lacZ-promoter által szabályozott transzkripció irányával (4. ábra), ilyenformán azt találtuk, hogy a pLYSC2-plazmidon lévő lysC-gén rezisztenciát biztosított a jelentős koncentrációban jelen lévő L-lizinnel és az AEC-vel szemben, még akkor is, ha a plazmidon a lysC-gén vad típusú maradt, mivel expressziós szintjét növelte a lacZ-promoter; eközben a pLYSCl-plazmidon lévő lysC-gén expressziós szintje alacsonyabb volt, és az L-lizin és AEC kisebb koncentrációi számára is lehetővé tette a növekedés gátlását, mivel transzkripciója a lacZ-promoterhez képest fordított volt, és a lysC-gén saját promotere szintén hiányos volt. A GT3/pLYSC2 törzs esetében a növekedés csak 100 mM L-lizin-koncentrációtól, illetve 3 mM AECkoncentrációtól volt gátolt, míg a GT3/pLYSCl törzs esetében a növekedés gátlása már 0,2 mM L-lizin-, illetve AEC-koncentrációtól teljes volt. Bebizonyítottuk, hogy a növekedés gátlása homoszerin és diamino-pimelinsav egyidejű hozzáadásával megszűnt.
A kapott eredmények alapján a pLYSCl-plazmidot alkalmaztuk a mutáció beviteléhez. A lysC*-gént tartalmazó plazmidot hordozó törzsek szelekciójához 10 mM L-lizinnel vagy 0,2 mM AEC-vel kiegészített M9 minimáltápközeget alkalmaztunk. Ezt a táptalajt a 2. példa további részében „szelekciós táptalajaként említjük.
(2-2-2) A pLYSCl-plazmid hidroxil-aminnal végzett in vitro mutációs kezelése
A mutáció pLYSCl-plazmidba történő beviteléhez kétféle eljárást alkalmaztunk: egy in vitro mutációs kezelést, melynek során a plazmidokat közvetlenül hidroxil-aminnal kezeltük; és egy in vivő mutációs kezelési eljárást, melynek során egy plazmidot tartalmazó sejtet nitrozo-guanidinnel (NTG) kezeltünk, majd kivontuk a plazmidot, hogy biztosítsuk a mutáció diverzitását, mivel a hidroxil-aminos kezeléssel kapott mutációtól (citozin—>timin) eltérő mutációt vártunk.
(A hidroxil-aminnal végzett in vitro mutációs kezelés) pg DNS-t 75 °C-on 1-4 órán át 0,4 M hidroxilamin-oldatban kezeltünk [0,1 M KH2PO4-oldat és mM EDTA (pH=6,0): 100 μΐ; 1 M hidroxil-aminoldat és 1 mM EDTA (pH=6,0): 80 μΐ; DNS: 2 pg; vízzel 200 pl végtérfogatra kiegészítve]. A kezelés után a DNS-t üvegporral tisztítottuk, majd teljesen AK-hiányos E. coli GT3 törzsbe vittük be, és a sejteket komplett táptalajra kentük (L-tápleves: 1% „Bacto trypton”, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% NaCl, 1,5% agar), és telepeket alakítottunk ki. A kapott telepeket a (2-2-1) pontban leírt szelekciós táptalajra másoltuk át, s lehetséges mutáns törzsként kiválasztottuk azokat a törzseket, amelyek a szelekciós táptalajon is telepeket képeztek. A transzformánsok megjelenési arányát és a mutációs arányt az 5. ábrán mutatjuk be. Az ábrából látható, hogy 4 órás kezelés után a mutáns törzseket igen nagy, 0,5-0,8%-os arányban kaptuk.
(NTG-vel végzett in vivő mutációs kezelés)
A pLYSCl-plazmidot E. coli MCI 061 törzsbe vittük be, és egy egész sejtet NTG-kezelésnek vetettünk alá. A kezelés után a sejtet - a mutáció rögzítése érdekében - 1 éjszakán keresztül tenyésztettük, majd a plazmidot kivontuk, és E. coli GT3 törzsbe vittük be. A transzformáit törzset 2xTY tápközegben (1,6% „Bacto trypton”, 1% élesztőkivonat, 0,5% NaCl) tenyésztettük, OD660=körülbelül 0,3 érték elérésekor a sejteket összegyűjtöttük, TM-pufferrel (lásd lentebb) mostuk, majd NTG-oldatban (melyet úgy készítettünk, hogy TM-pufferben, 0,2 mg/ml koncentrációban, NTG-t oldottunk) szuszpendáltuk, és 37 °C-on 0-90 percig kezeltük. A sejteket ezután TM-pufferrel és 2xTY tápközeggel mostuk, majd a mutációt 2xTY tápközegben 1 éjszakás tenyésztéssel rögzítettük. Ezt követően kivontuk a sejtből a plazmid-DNS-t, és E. coli GT3 törzsbe vittük be. A lehetséges mutáns törzsek szelekcióját az in vitro mutációs kezelésnél leírtak szerint végeztük, és lizinrezisztens (LysR), illetve AEC-rezisztens (AECR) mutánsokat kaptunk.
A TM-puffer összetétele a következő:
Tris 50 mM;
Maleinsav 50 mM;
(NH4)2SO4 1 g/1;
MgSO4.7 H2O 0,1 g/1;
HU 219 608 Β
Ca(NO3)2 5 mg/1;
FeSO4.7 H2O 0,25 mg/1;
(a pH-t nátrium-hidroxiddal 6,0-ra állítottuk be).
A kétféle kezeléssel kapott összesen 180 lehetséges mutáns törzset (hidroxil-aminos kezeléssel 48 törzs, NTG-kezeléssel 132 törzs) ismét a szelekciós táptalajra vittük, és az AEC- és L-lizin-rezisztencia bizonyításával 153 törzset kaptunk. Tekintettel az aminosavfelhalmozódás táptalajban tapasztalható különbségeire, a kapott 153 törzset 14 csoportba osztottuk, és az AK-aktivitást azután mértük, hogy minden egyes csoportból reprezentatív törzseket választottunk ki. A hidroxilaminos kezeléssel kapott törzsek és az NTG-kezeléssel kapott törzsek AK-aktivitása között nem volt nagy különbség, így a következő kísérleteket anélkül végeztük, hogy megkülönböztettük volna őket.
(2-2-3) A lysC*-gén izolálása és a lysC-termék vizsgálata
A fentebb említett 14 csoportból a 24., 43., 48., 60.,
80., 117., 126., 149., 150., 156., 158., 167., 169. és 170. törzset választottuk reprezentatív törzsként. Valamennyi törzsből - pLYSCl-plazmidból származó mutáns plazmidokat nyertünk ki, melyeket a törzsek sorszámának megfelelően neveztünk el: pLYSCl*24, pLYSCl*43, pLYSCl*48, pLYSCl*60, pLYSCl*80, pLYSCl*117, pLYSCl*126, pLYSCl*149, pLYSCl*150, pLYSCl*156, pLYSCl*158, pLYSCl*167,pLYSCl*169 éspLYSCl* 172. Ezekkel a plazmidokkal, valamint egy vad típusú pLYSCl-plazmiddal teljesen AK-hiányos GT3 törzset transzformáltunk. A kapott transzformánsok mindegyikéből sejtmentes kivonatot készítettünk, s ezekben mértük az AK1II enzimaktivitását.
A sejtmentes kivonatot (azaz a nyersenzimoldatot) a következők szerint állítottuk elő. Egy transzformált törzset 2xTY tápközegben tenyésztettünk, és a sejteket 00^=körülbelül 0,8 optikai denzitás elérésekor összegyűjtöttük. Az összegyűjtött sejteket 0 °C-on 0,02 M KH2PO4 (pH=6,75) és 0,03 M β-merkapto-etanol elegyével mostuk, majd ultrahangos kezeléssel (0 °C, 100 W, 4x30 perc) feltártuk. A feltárt sejtek oldatát 0 °C-on 1 órán át 33 000-es percenkénti fordulatszámmal centrifugáltuk, és a kapott felülúszóhoz - 80%-os telítettség eléréséig - ammónium-szulfátot adtunk. A centrifugálás után kapott üledéket 0,02 M KH2PO4 (pH=6,75) és 0,03 M β-merkapto-etanol elegyében oldottuk, és 1 éjszakán át 0 °C-on tároltuk.
Az AKIII enzimaktivitását Stadtman és munkatársai eljárása szerint mértük [Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras, G. és Robichon-Szulmajster, H.: J. Bioi. Chem. 236, 2033 (1961)]. Az alábbiakban megadott összetételű reakcióelegyet 27 °C-on 45 percig inkubáltuk, szín kialakítása érdekében FeCl3-oldatot (0,4 ml 2,8 N HCl+0,4 ml 12% TCA+0,7 ml 5% FeCl3.6 H2O/0,l N HC1) adtunk hozzá, majd az így kapott elegyet lecentrifugáltuk, és 540 nm-nél mértük a felülúszó abszorbanciáját. Az aktivitást a hidroxaminsav percenként képződött mennyiségével fejezzük ki (1 egység= 1 pmol/perc). A vakpróbaként alkalmazott reakcióelegyből eltávolítottuk a kálium-aszpartátot.
A reakcióelegy összetétele:
Reakcióelegy (1*) 0,3 ml;
Hidroxil-amin-oldat (2*) 0,2 ml;
0,1 M kálium-aszpartát (pH=7,0) 0,1 ml;
Enzimoldat
Víz 1 ml össztérfogathoz
1* 9 ml 1 M Tris-HCl (pH=8,1)+0,5 ml 0,3 M MgSO4+5 ml 0,2 M ATP (pH=7,0);
2* Közvetlenül a felhasználás előtt KOH-dal semlegesített 8 M hidroxil-amin-oldat.
Az AK enzimaktivitásának méréséhez az enzimes reakcióelegyhez - különböző koncentrációkban - Llizint adtunk, és vizsgáltuk az L-lizin által kiváltott gátlás mértékét. Az eredményeket a 6. ábrán és a 3. táblázatban mutatjuk be. A vad típusú és a 24., 43., 48., 60.,
80., 117. és 126. transzformáns törzsből származó enzimek eredményeit a 6A. ábrán, a 149., 150., 156., 158.,
167., 169. és 172. transzformáns törzsből származó enzimekét pedig a 6B. ábrán mutatjuk be.
Amint az eredményekből látható, a vad típusú AKJII-at igen nagy mértékben gátolta az L-lizin; körülbelül 0,45 mM L-lizin-koncentrációnál a gátlás 50%os, 5 mM koncentrációnál pedig körülbelül 100%-os volt. Ezzel szemben a kapott mutáns AKIII-enzimek közül mind a 14 - bár különböző szinten - deszenzitizált volt az L-lizin által kiváltott gátlással szemben. Különösen a 24., 80., 117., 169. és 172. enzim esetében, a gátlás még 100 mM L-lizin-koncentrációnál is alig volt észlelhető, és ezek az enzimek 50%-os gátlási koncentrációkkal rendelkeztek, ami a vad típusú enzim gátlási koncentrációjának nem kevesebb mint 200-szorosa. Az összes proteinre vonatkoztatott specifikus aktivitás - amit befolyásolhatnak a sejt növekedési körülményei és a minták elkészítésének módja -, szinte valamennyi esetben azonos vagy nagyobb volt, mint a vad típus specifikus aktivitása, azonban voltak kisebb problémák, ahol a mutáció bevitele az aktivitás csökkenését okozta (3. táblázat). E tény értelmében, feltételeztük, hogy az AKIII-enzim egy aktív centruma egy L-lizin által vezérelt szabályozóhelytől független volt. A 3. táblázatban a „gátlás deszenzitizáltságának mértéke (%)” a 100 mM koncentrációjú L-lizin jelenlétében mért AKaktivitás - L-lizin hiányában mért AK-aktivitáshoz viszonyított - arányát fejezi ki. A „hőstabilitás (%)” az 55 °C-on 1,5 óra hosszat végzett kezelés után megmaradt aktivitás százalékos arányát fejezi ki.
3. táblázat
Enzim Specifikus aktivitás (E/mg protein) Gátlás dcszenzitizáltságának mértéke (%)* Hőstabilitás (%)**
Vad típus 0,0247 0 18
117. 0,0069 120 0
24. 0,0218 100 30
80. 0,0244 99 36
172. 0,0189 97 0
HU 219 608 Β
3. táblázat (folytatás)
Enzim Specifikus aktivitás (E/mg protein) Gátlás deszenzitizáltságának mértéke (%)* Hőstabilitás (%)**
169. 0,0128 96 2
150. 0,0062 77 25
126. 0,0250 61 39
149. 0,0256 59 9
167. 0,0083 43 45
48. 0,228 38 42
60. 0,0144 35 9
158. 0,0244 22 42
156. 0,0101 18 2
43. 0, 0212 17 0
* a 100 mM koncentrációjú L-lizin jelenlétében mért AK-aktivitás - L-lizin hiányában mért AK-aktivitáshoz viszonyított - %-os aránya;
** 55 °C-on 1,5 óra hosszat végzett kezelés után megmaradt aktivitás %-os aránya.
A következő lépésben a mutáns enzimek hőstabilitását vizsgáltuk. Ha az a szándékunk, hogy egy enzimet úgy tökéletesítsünk, hogy fokozza aktivitását, lényeges, hogy a létrehozott enzim stabilan fennmaradjon a sejtekben. Az in vitro mérés - az intracelluláris és extracelluláris proteázaktivitás különbözősége, valamint az enzimek in vitro tárolásához alkalmazott pufferek hatásai miatt - bizonyos problémákat vet fel, azonban a könnyebbség érdekében, a mutáns AKIII-enzimek hőstabilitását (mint az enzimek egyik paraméterét) mégis in vitro módszerrel vizsgáltuk.
Az AKIII inaktiválási hőmérséklete - különböző körülmények közötti - vizsgálatának eredményei alapján a 90 percig 55 °C-on végzett kezelés után megmaradt aktivitás arányát mértük. Amint a 3. táblázatban látható, e tekintetben a mutáns enzimek fele sokkal előnyösebb volt. Általában egy mutáns enzim gyakran kevésbé stabil, mint a vad típus, azonban az általunk kialakított mutáns AKIII-enzimek közül néhány stabilitása felülmúlta a vad típusét, és sok közülük igen előnyösen alkalmazható az L-lizin-termelés gyakorlati megvalósításában. (2-2-4) A vad típusú lysC-gén és a mutáns lysC-gén bázisszekvenciájának meghatározása
Az. általunk kinyert vad típusú lysC-gén nukleotidszekvenciáját szokványos eljárással határoztuk meg, melynek során „ABI Model 373A” típusú DNS-szekvenálót (az Applied Biosystems Inc. terméke) alkalmaztunk. (A vad típusú lysC-gén nukleotidszekvenciáját a szekvencialista 7. azonosító számú szekvenciájaként mutatjuk be.) A szekvenálás eredményeként egy E. coli K-12-JC411 törzs korábban publikált szekvenciájához képest [Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N. és Patté, J. C.: J. Bioi. Chem. 261, 1052 (1986)] hat helyen (aminosavszinten két helyen) találtunk eltérést. Úgy véljük, hogy ez a különbség az alkalmazott eltérő baktériumtörzseknek köszönhető.
Hasonló módon, a 14 kiválasztott mutáns pLYSClplazmidon lévő valamennyi lysC*-gén bázisszekvenciáját meghatároztuk. Az eredményeket a 4. táblázatban mutatjuk be. A táblázatban az aminosavak - nukleotidok mutációi eredményeként kialakult - mutációit zárójelekben tüntettük fel. A 14 enzim mutációi 12 változatba tartoztak, mivel a 48. és 167. enzim, illetve a 24. és 80. enzim teljesen azonos mutációt tartalmazott. A mutációs típusokat illetően, a 149., 150., 156., 158.,
167., 169. és 172. enzimet a hidroxil-aminos kezelés eredményeként, a 24., 43., 48., 60., 80., 117. és 126. enzimet pedig az NTG-vel végzett kezelés eredményeként kaptuk. Ami a mutációs mintázatot illeti, a mutációk mindegyike citozin-»timin mutáció vagy - nem kódoló szálon lévő citozin->timin mutáció következtében a kódolószálon kialakult - guanin-»adenin mutáció volt.
4. táblázat
A lysC* mutációs pontjainak meghatározása
lysC* mutációs típus Mutagén Mutációs pont (aminosavcsere)
126. N GGT-»GA*T (323Gly—>Asp)
43. N GGT—»GA*T (323Gly-»Asp) GGC—>GA*C (408Gly-»Asp)
149. N CGT->T*GT (34Arg—>Cys) CGT—>GA*T (323Gly->Asp)
48./167. N/H CTC-»T*TC (325Leu—>Phe)
150. H ATG-»ATA* (318Met-»Ile)
172. H 77SC->T (csendes mutáció) ATG—>ATA* (3l8Met->Ile) GTG->A*TG (349Val—>Met)
117. N TCA-»TT*A (345Ser->Leu)
158. H GTG->A*TG (347Val—>Met)
24./80. N/N ACC—>AT*C (352Thr—>Ile)
169. H 923C—>T (csendes mutáció) ACC—»AT*C (352Thr—»Ile) TCT—»TT*T (369Ser->Phe)
60. N 859G->A (csendes mutáció) GAA-»A*AA (164Glu-»Lys)
156. H ATG—>ATA* (417Met->Ile) TGT—>TA*T (419Cys-»Tyr) 2°l4C-»T (csendes mutáció)
H: hidroxil-aminos kezelés; N; NTG-vel végzett kezelés.
3. példa
Az L-lizin fermentációs termelése bevitt dapA*-gént tartalmazó törzs alkalmazásával
Az L-lizin fermentációval történő előállítását [lásd 56-18596 számú közzétett japán szabadalmi leírás; 4,346,170 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Applied Microbiology and Biotechnology, 75, 227 (1982)] illetően kulcsfontosságúnak tartjuk, hogy a DDPS erősítéséhez alkalmazott gazda rendelkezzen olyan aszpartát-kinázzal, amelyet úgy változtattunk
HU 219 608 Β meg, hogy ne álljon az L-lizin gátlása alatt. Ilyen törzs példájaként az L-treonint termelő baktériumokat említhetjük. A jelenleg ismert L-treonin-termelő E. coli törzsek közül a B-3996 törzs biztosítja a legnagyobb termelékenységet, ilyenformán a dapA* értékeléséhez gazdaként - a B-3996 törzset alkalmaztuk. A B-3996 törzs extrakromoszomálisan, különálló plazmádként pVIC40-plazmidot tartalmaz. [A törzs részletes leírását lásd: 3-501682 számú közzétett japán szabadalom (PCT).] Ezt a mikroorganizmust a „Research Institute fór Genetics and Industrial Microorganism Breeding” intézetnél RIA 1867 deponálási számon helyeztük letétbe.
Az E. coliba történő bevitelhez a pdapAS24-plazmidban lévő dapA*-gént (amely a 118. hisztidint tirozinnal helyettesítő mutációt tartalmaz) választottuk ki (a gén által kódolt enzim gátlási deszenzitizáltságának mértéke és specifikus aktivitása alapján). Először a dapA*gén expressziós szintjének növelése és a plazmid stabilitásának fokozása érdekében a pdapAS24-plazmidban lévő mutáns dapA* -gént (a továbbiakban „dapA*24gén”) a pVIC40-plazmid tetraciklinrezisztencia-génjének promoterétől „downstream” irányba ligáitok, miáltal az RSF24P-plazmidot kaptuk (lásd 7. ábra).
Az RSF24P-plazmid E. coli JM109 törzsbe történő bevitelével kapott törzset AJ12395-nek neveztük el, amelyet 1993. október 28-án, FERM P-13935 deponálási számon a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology” intézetnél helyeztünk letétbe, majd, a „Budapesti Szerződés” értelmében, 1994. november 1jén (FERM P-13935 deponálási számon) nemzetközi letétbe helyeztük át. A pdapAS8- és pdapAS9-plazmidot tartalmazó törzseket nem helyeztük letétbe, azonban az egyes plazmidokon (a fentebb leírtak szerint) valamennyi dapA*-gén mutációs helyeit tisztáztuk, így a szakemberek az említett, letétbe helyezett baktériumból - Maniatis és munkatársai eljárásának [Sambrook, K„ Fritsch, E. F., Maniatis, T.: „Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989)] alkalmazásával - a plazmidokat könnyen kinyerhetik, és helyre irányuló („site-directed”) mutageneziseljárással [Sambrook, J. Fritsch, E. F., Maniatis, T.: „Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15.63 (1989)] célgént hozhatnak létre.
A pVIC40-plazmidot szokványos eljárással kivontuk a B-3996 törzsből, miáltal plazmidot nem tartalmazó B-399 törzset kaptunk. Ebbe a B-399 törzsbe szokványos eljárással - RSF24P-plazmidot vittünk be, és ezáltal a B-399/RSF24P törzset kaptuk, melynek értékeltük L-lizin-termelékenységét.
Kontrollplazmidként RSFP-plazmidot állítottunk elő, melynek során a BamHI-gyel és Dral-gyel emésztett pVIC40-plazmidból kiválasztottunk egy nagy fragmenst (lásd 7. ábra), és ezt DNS-polimeráz Klenowfragmensével tompa végűvé alakítottuk. Az így kapott nagy fragmenst önmagával ligáivá az RSFP-plazmidot kaptuk, melyet szokványos eljárással a B-399 törzsbe vittünk be, s ezáltal a B-399/RSFP törzset kaptuk, melynek szintén értékeltük az L-lizin-termelékenységét.
A törzseket 37 °C-on 48 óra hosszat percenkénti 114-116 fordulatszámmal keverve az alábbi tápközegben tenyésztettük. Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be.
Az L-lizin-termeléshez alkalmazott tápközeg összetétele:
A: (NH4)2SO4 16 g/1
kh2po4 1 g/i
MgSO4.7 H2O lg/1
FeSO4.7 H2O 0,01 g/1
MnSO4.5 H2O 0,01 g/1
Elesztőkivonat (Difco) 2 g/1
L-metionin 0,5 g/1
L-treonin 0,5 g/1
L-izoleucin 0,05 g/1
Az elegy pH-ját KOH-dal 7,0-ra állítottuk be, és
115 °C-on 10 percig autoklávoztuk (16/20 térfogat);
B: 20%-os glükózoldat (115 °C-on 10 percig autoklávoztuk) (4/20 térfogat);
C: gyógyszerkönyvi CaCO3 (száraz állapotban, 180 °C-on 2 napig hősterileztük) (30 g/1).
Az A és B oldatot A:B=4:1 arányban összekevertük, a kapott elegy 1 literéhez 30 g „C” komponenst adtunk, feloldottuk, s végül antibiotikumokat (sztreptomicin: 100 pg/ml, kanamicin: 5 pg/ml) adtunk hozzá.
5. táblázat
Baktériumtörzs A termelődött L-lizin-hidroklorid mennyisége
B-399/RSF24P 4,1 g/1
B-399/RSFP 0 g/1
4. példa
Az L-lizin fermentációs termelése bevitt dapA*-gént és lysC*-gént tartalmazó törzs alkalmazásával
A mutáns DDPS L-lizin-termelésre gyakorolt hatását a 3. példában bemutattuk. A 2. példában kapott mutáns AKIII-gént - további tökéletesítés érdekében - a mutáns DDPS-génnel együtt egy törzsbe vittük be. Erre a célra - az enzimaktivitás, hőstabilitás és hasonlók alapján - a 80. törzsből származó DDPS-gént (lysC*80gént) választottuk ki.
A pLYSCl*80-pazmidban lévő lysC*-gént (a továbbiakban lysC*80-gén) a pHSG399-vektor (a Takara Shuzo Co., Ltd. terméke, amely a lysC*-gén expressziós szintjének fokozása érdekében a pUC18-vektorhoz képest fordított irányú inszerciós helyet tartalmaz) lacZ-promoterétől „downstream” irányba történő alternatív ligálásával a pLLC*80-plazmidot állítottuk elő. Ezt a plazmidot a lysC*80-gén olyan átrendezése érdekében hoztuk létre, amely lehetővé teszi, hogy a transzkripció iránya (a lacZ-promoterhez viszonyítva) normális orientációjú legyen, ami javítja az L-lizin termelékenységét. Erre az átrendezésre azért van szükség, mert a pLYSCl*80-plazmidon lévő lysC*80-gén transzkripciós iránya a lacZ-promoterhez viszonyítva fordított orientációjú.
HU 219 608 Β
A pLLC*80-plazmidból és a 3. példában kapott RSF24P-plazmidból - dapA*-gént és lysC*-gént tartalmazó - RSFD80-plazmidot állítottunk elő (lásd 9. ábra). Az RSFD80-plazmid a két gént dapA*-génlysC*-gén sorrendben tartalmazza, ami lehetővé teszi, hogy a transzkripció iránya egy tetraciklinrezisztenciagén promoterétől (tetP) „downstream” irányban, a tetPpromoterhez viszonyítva normális orientációjú legyen.
Az RSFD80-plazmidot E. coli JM109 törzsbe vittük be, s az így kapott törzset AJ12396-nak neveztük el. Az AJ12396 törzset 1993. október 28-án, FERM P-13936 deponálási számon a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology” intézetnél helyeztünk letétbe, majd a „Budapesti Szerződés” értelmében, 1994. november 1-jén (FERM P-13935 deponálási számon) nemzetközi letétbe helyeztük át. A pLYSl*24-, pLYSCl*43-, pLYSCl*48-, pLYSCl*60-, pLYSCl*117-, pLYSCl*126-, pLYSCl*149-, pLYSCl*150-, pLYSCl*156-, pLYSCl*158-, pLYSCl*167-, pLYSCl*169- és pLYSCl*172-plazmidokat tartalmazó törzseket nem helyeztük letétbe, azonban az egyes plazmidokon (a fentebb leírtak szerint) valamennyi lysC*-gén mutációs helyeit tisztáztuk, így a szakemberek az említett, letétbe helyezett baktériumból - Maniatis és munkatársai eljárásának [Sambrook, K., Fritsch, E. F., Maniatis, T.: „Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989)] alkalmazásával - a plazmidokat könnyen kinyerhetik, és helyre irányuló („site-directed”) mutageneziseljárással [Sambrook, J. Fritsch, E. F., Maniatis, T.: „Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, 15.63 (1989)] célgént hozhatnak létre. Az RSFD80-plazmidot - szokványos eljárás alkalmazásával - B-399 törzsbe vittük be, miáltal a B-399/RSFD80 törzset kaptuk, és értékeltük L-lizintermelékenységét (kontrollként a B-399/RSFP törzs L-lizin-termelékenységét értékeltük).
A tenyésztést a 3. példában az L-lizin előállításához leírt tápközeg alkalmazásával, percenkénti 114-116 fordulatszámmal keverve, 37 °C-on 48 órán keresztül végeztük. Az eredményeket a 6. táblázatban mutatjuk be.
6. táblázat
Baktériumtörzs A termelődött L-lizin-hidroklorid mennyisége
B-399/RSFD80 9,2 g/1
B-399/RSFP 0g/l
5. példa
Az L-lizin fermentációs termelése bevitt dapA*-gént és lysC*-gént tartalmazó törzs alkalmazásával (II)
A 4. példában bebizonyítottuk, hogy az L-lizin termelékenysége javítható, ha az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumba mutáns dapA-gént és mutáns lysC-gént egyaránt beviszünk. Kísérleteket végeztünk annak bebizonyítása érdekében, hogy ez a hatás akkor is megmarad, ha a gazdatörzset megváltoztatjuk.
Gazdatörzsként E. coli W3110(tyrA) törzset alkalmaztunk. A W3110(tyrA) törzs részletes leírását lásd: 488424/92 számú európai közzétételi irat. A törzs kialakításának menetét a következők szerint végeztük. A „National Institute of Genetics”-től (Mishima-shi, Shizouka-ken, Japán) kapott E. coli W3110 törzset sztreptomicint tartalmazó LB táptalajra szélesztettük, és a telepeket képző törzsek kiválogatásával sztreptomicinrezisztens törzset kaptunk. A kapott rezisztens törzset E. coli K-12-ME8424 törzzsel kevertük, és az így kapott sejtelegyet a konjugáció indukálása érdekében, 37 °C-on 15 percig komplett tápközegben (L-tápleves: 1% „Bacto trypton”, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% NaCl) álló tenyészetben tenyésztettük. Az E. coli K-12-ME8424 törzs genetikai jellemzői: HfrPO45, thi, relAI, tyrA: :TnlO, ung-1, nadB. Ez a törzs a „National Institute of Genetics”-től szerezhető be.
A tenyészetet ezután sztreptomicint, tetraciklint és Ltirozint tartalmazó komplett táptalajra (L-tápleves: 1% „Bacto trypton”, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% NaCl+1,5% agar) szélesztettük, és kiszelektáltunk egy telepképző törzset, melyet E. coli W3110(tyrA) törzsnek neveztünk el.
A 488424/92 számú európai közzétételi iratban sok - plazmidok W3110 törzsbe történő bevitelével kialakított - törzs leírása található. Például a pHATermplazmid bevitelével kapott törzs elnevezése E. coli W331O(tyrA)/pHATerm, és a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology” intézetnél FERM BP-3653 deponálási szám alatt férhető hozzá. A W3110(tyrA) törzset az E. coli W3310(tyrA)/pHATerm törzsből származó pHATerm-plazmid megfelelő kezelésével („curing”) is kialakíthatjuk, amit szokványos eljárással valósíthatunk meg.
A 4. példában előállított, dapA*-gént és lysC*-gént egyaránt tartalmazó RSFD80-plazmidot bevittük a fentebb leírtak szerint kapott W3110(tyrA) törzsbe, miáltal a W3310(tyrA)/RSFD80 törzset kaptuk, s ennek értékeltük L-lizin-termelékenységét. Kontrollként az RSFPplazmid W3310(tyrA) törzsbe - szokványos eljárással - történő bevitelével kialakított W3110(tyrA)/RSFP törzs L-lizin-termelékenységét értékeltük.
A tenyésztést az L-lizin előállításához leírt tápközeg alkalmazásával, percenkénti 114-116 fordulatszámmal keverve, 37 °C-on 48 órán keresztül végeztük. Az eredményeket a 7. táblázatban mutatjuk be.
7. táblázat
Baktériumtörzs A termelődött L-lizin-hidroklorid mennyisége
W3110(tyrA)/RSFD80 9,2 g/1
W3110(tyrA)/RSFP 0g/l
6. példa
Az L-lizin-bioszintézis-rendszer sebességmeghatározó lépéseinek vizsgálata, és az Escherichia nemzetségbe tartozó, L-lizin-termelö baktériumok L-lizin-termelékenységének javítása
HU 219 608 Β
Az L-lizin-termelékenységet az E. coli L-lizin-bioszintézis-rendszere sebességmeghatározó lépéseinek vizsgálatával, illetve az e lépéseket katalizáló enzimeket kódoló gének erősítésével próbáltuk javítani.
< 1 > Az első sebességmeghatározó lépés azonosítása (6-1-1) Az L-lizin-bioszintézis-rendszer génjeinek előállítása
A sebességmeghatározó lépés azonosításához az Llizin-bioszintézis-rendszer különböző génjeit izoláltuk, majd ezeket a géneket E. coliba vittük be, és vizsgáltuk az egyes gének L-lizin-termelékenységre gyakorolt hatását. Az L-lizin-bioszintézis-rendszer enzimeit kódoló, bevitt gének, illetve az általuk kódolt enzimek a következők voltak:
ppc: foszfo-enol-piruvát-karboxiláz; aspC: aszpartát-aminotranszferáz; lysC: aszpartát-kináz-IH;
lysC*: gátlással szemben deszenzitizált aszpartátkináz-III;
ásd: aszpartát-szemialdehid-dehidrogenáz;
dapA: dihidrodipikolinát-szintetáz;
dapA*: gátlással szemben deszenzitizált dihidrodipikolinát-szintetáz;
dapB: dihidrodipikolinát-reduktáz;
DDH: (Brevibacterium lactofermentumbol származó) diamino-pimelát-dehidrogenáz; lysA: diamino-pimelát-dekarboxiláz.
A foszfo-enol-piruváttól az L-lizinig terjedő L-lizinbioszintézis-rendszert a fenti gének teljesen lefedik. Az L-lizin-bioszintézis-rendszer - E. coliban eredetileg jelen lévő - génjei közül a dapC-, dapD-, dapE- és dapFgéneket a Brevibacterium lactofermentumbol származó diamino-pimelát-dehidrogenázt (DDH) kódoló DDHgénnel helyettesítettük. A DDH-enzim önmaga képes katalizálni a helyettesített gének termékei által katalizált reakciókat. A gének beviteléhez gazdatörzsként az E. coli K-12-W331O(tyrA) törzset alkalmaztuk.
A dapA- és dapA*24-gént a pdapA2-, illetve a pdapAS24-plazmidból (lásd 1. példa) EcoRI-gyel és KpnI-gyel vágtuk ki (10. ábra). Ezeket a géneket EcoRI-gyel és KpnI-gyel emésztett pMWl 18-vektorba ligáltuk, miáltal a pdapA-, illetve pdapA*-plazmidot kaptuk. A lysC- és a lysC*80-gént a pLY SCI-plazmidból, illetve a pLLC*80-plazmidból (lásd 2. példa) EcoRI-gyel és SphI-gyel vágtuk ki, és EcoRI-gyel és SphI-gyel emésztett pMW 119-vektorba ligáltuk, miáltal a plysC-, illetve plysC*-plazmidot kaptuk (11. ábra).
A ppc-gént - ilyen gént tartalmazó - pT2-plazmidból nyertük. A pT2-plazmidot Smal-gyel és Scalgyel hasítottuk, a kapott ffagmens terminálisait tompa végűvé alakítottuk, majd a pMW118-vektor Smal-helyére inszertáltuk, miáltal a pppc-plazmidot kaptuk (12. ábra). A pT2-plazmidot tartalmazó E. coli F15(AJ12873) törzset FERM BP-4732 deponálási számon a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology” intézetnél helyeztük letétbe.
Az aspC-gént - ilyen gént tartalmazó - pLF4-plazmidból [Inokuchi, K. és munkatársai: Nucleic Acids
Rés., 10, 6957 (1982)] nyertük. A pLF4-plazmidot PvuII-vel és Stul-gyel hasítottuk, a kapott fragmens terminálisait tompa végűvé alakítottuk, majd a pMW119vektor Smal-helyére inszertáltuk, miáltal paspCplazmidot kaptunk (13. ábra).
Az asd-gént - ilyen gént tartalmazó - pAD20-plazmidból [Haziza, C. és munkatársai: EMBO 1, 379 (1982)] nyertük. A pAD20-plazmidot Asel-gyel és Clal-gyel hasítottuk, a kapott ffagmens terminálisait tompa végűvé alakítottuk, majd a pMWl 18-vektor Smal-helyére inszertáltuk, miáltal pasd-plazmidot kaptunk (14. ábra).
A dapB-gént egy E. coli W3310 törzs kromoszomális DNS-éből, PCR-eljárással amplifikáltuk, melynek során egy ismert dapB-gén nukleotidszekvenciája [Bouvier, J. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 259, 14 829 (1984)] alapján előállított kétféle láncindító oligonukleotidot (9. és 10. azonosító számú szekvenciák) alkalmaztunk. A kapott, amplifikált DNS-ffagmenst Aselgyel és Dral-gyel hasítottuk, a terminálisokat tompa végűvé alakítottuk, majd a pMWl 19-vektor Smal-helyére inszertáltuk, miáltal pdapB-plazmidot kaptunk (15. ábra).
A DDH-gént a Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 deponálási számú törzs kromoszomális DNS-éből származó DDH-gén - PCR-eljárással végzett - amplifikálásával kaptuk, melynek során a Corynebacterium glutamicum DDH-génjének ismert szekvenciája [Ishino, S. és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 75, 3917 (1987)] alapján előállított kétféle láncindító oligonukleotidot (11. és 12. azonosító számú szekvenciák) alkalmaztunk. Az amplifikált DNS-ffagmenst EcoT22I-gyel és Aval-gyel hasítottuk, terminálisait tompa végűvé alakítottuk, majd a pMW119-vektor Smal-helyére inszertáltuk, miáltal pDDH-plazmidot kaptunk (16. ábra).
A lysA-gént egy E. coli W3110 törzs kromoszomális DNS-éből származó lysA-gén - PCR-eljárással végzett - amplifikálásával kaptuk, amihez egy ismert lysA-gén nukleotidszekvenciája [Stragier, P. és munkatársai: J. Mól. Bioi. 168, 321 (1983)] alapján előállított kétféle láncindító oligonukleotidot alkalmaztunk. A kapott, amplifikált DNS-fragmenst SplI-gyel és BclI-gyel hasítottuk, terminálisait tompa végűvé alakítottuk, majd a pMW118-vektor Smal-helyére inszertáltuk, miáltal plysA-plazmidot kaptunk (17. ábra).
A fentebb említett gének klónozásának sikerességét úgy bizonyítottuk, hogy a géneket az ábrákon feltüntetett restrikciós enzimekkel hasítottuk. E gének klónozásához a Nippon Gene által előállított pMW118- és pMWl 19-vektort választottuk ki, mivel ezek E. coliban képesek a lizintermeléshez (az alábbiakban leírtak szerint) vektorként alkalmazott RSFlOlO-vektorral együtt jelen lenni, és stabil megoszlási mechanizmussal rendelkeznek.
(6-1-2) Az L-lizin-bioszintézisrendszer bevitt génjeit tartalmazó E. coli L-lizin-termelékenysége
Az E. coli W3310(tyrA) törzset az L-lizin-bioszintézisrendszer génjeit tartalmazó, fentebb leírt plazmidok mindegyikével transzformáltuk, s a kapott transz20
HU 219 608 Β formánsokat az L-lizin-termelés érdekében tenyésztettük. A tenyésztést az alábbi tápközeg alkalmazásával, percenkénti 114-116 fordulatszámmal keverve, 37 °Con 30 órán keresztül végeztük. Az eredményeket a 8. táblázatban mutatjuk be.
A tápközeg összetétele ;
Glükóz 40 g/1
MgSO4.7 H2O lg/1
(NH4)2SO4 16 g/1
kh2po4 1 g/i
FeSO4.7 H2O 0,01 g/1
MnSO4.5 H2O 0,01 g/1
Élesztőkivonat (Difco) 2 g/1
L-tirozin 0,1 g/1
Az elegy pH-ját KOH-dal 7,0-re állítottuk be, és
115 °C-on 10 percig autoklávoztuk (a glükózt és a MgSO4.7 H2O-ot elkülönítve sterilizáltuk).
Gyógyszerkőnyvi CaCO3 25 g/1 (180 °C-on két napig, száraz állapotban hősterileztük)
Antibiotikumok (a bevinni kívánt plazmidtól függően)
Sztreptomicin 20 mg/1
Ampicillin 50 mg/1
8. táblázat
Baktériumtörzs A termelődött L-lizin-hidroklorid mennyisége (g/1) Cukorra vonatkoztatott hozam (%)
W3110(tyrA) 0,08 0,2
W3110(tyrA)/pppc 0,08 0,2
W3110(tyrA)/paspC 0,12 0,3
W3110(tyrA)/plysC 0,08 0,2
W3110(tyrA)/plysC* 2,27 5,57
W3110(tyrA)/pasd 0,12 0,3
W3110(tyrA)/pdapA 2,32 5,70
W3110(tyrA)/pdapA* 3,63 8,90
W3110(tyrA)/pdapB 0,08 0,2
W3110(tyrA)/pDDH 0,08 0,2
W3110(tyrA)/plysA 0,12 0,3
Az E. coli W3110(tyrA) törzs a plysC*-, pdapAvagy pdapA*-plazmid bevitelének hatására képes lett az L-lizin termelésére. Mivel a lysC-gén terméke és a dapA-gén terméke egyaránt az L-lizin „feedback” gátlása alatt áll, feltételezhető, hogy ezek az enzimek az L-lizin-bioszintézis fő szabályozási pontjait képviselik. A dapA-gén-termék által katalizált reakció az Ltreonin, L-metionin és L-izoleucin bioszintézis-rendszerébe és az L-lizin bioszintézis-rendszerébe nyíló elágazásnál található, és ez az első lépése az L-lizin bioszintézisének. Korábban már beszámoltunk arról, hogy az E. coli egy vad típusú dapA-gén amplifikálása eredményeként is képessé válik az L-lizin-termelésre [Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnoi. 15, 227 (1982)], amit a fentebb leírt eredményekkel is igazoltunk. Ezenkívül a 3. példában kapott eredmények újabb bizonyítékát szolgáltatta az a tény, hogy az L-lizin termelékenysége tovább növekedett, amikor gátlással szemben deszenzitizált típusú génként dapA*-gént vittünk be E. coliba.
A W3110(tyrA), W331O(tyrA)/pdapA és W3110(tyrA)/pdapA* törzsből, az 1. példában leírt módon, nyersenzimoldatokat készítettünk, és mértük az oldat DDPS- (dihidro-dipikolinát-szintáz-)aktivitását, illetve vizsgáltuk a DDPS-aktivitás L-lizin hatására bekövetkező gátlását. Az eredményeket a 9. táblázatban mutatjuk be.
9. táblázat
Baktériumtörzs Specifikus aktivitás1 A gátlás deszcnzitizáltságának mértéke2
W3110(tyrA) 0,0423 50
W3110(tyrA)/pdapA 0,2754 22,9
W3110(tyrA)/pdapA* 0,1440 76,5
1 μπιοΐ/perc/mg protein;
2 az aktivitás megmaradásának százalékos aránya 5 mM L-lizin jelenlétében.
A gátlással szemben deszenzitizált dapA*-gén-termék valószínűleg nagy hatást gyakorol az L-lizintermelésre, mivel - bár specifikus aktivitása alacsonyabb, mint a vad típusú enzimé (körülbelül fele) gátlással szembeni deszenzitizáltsága nagymértékű. Az L-lizin-termelést illetően kimutattuk a dapA-géntermék gátlással szembeni deszenzitizáltságának szükségességét.
Azt a tényt, hogy a lysC*-gén hatást gyakorol az Llizin-termelésre, a következőképpen szemlélhetjük. Az első sebességmeghatározó lépés az, amelynél a homoszerin-dehidrogenáz (HD, a thrA- vagy metLM-gén terméke) - az aszpartát-P-szemialdehid (ASA) szubsztrátként történő megszerzésében - kompetícióba lép a DDPS-sel (amely a dapA-gén terméke), hogy elágazódási pontot képezzen a bioszintézis-rendszerben. Amennyiben a dapA-gént a fentebb leírtak szerint erősítjük, a reakció az L-lizin-bioszintézis irányába folytatódik. Másrészről, úgy gondoljuk, hogy ha a dapA-t megelőző reakcióban részt vevő lysC-gén erősítésével növeljük az ASA hozzáférhető mennyiségét, elősegítjük a HD-t és a DDPS-t érintő valamennyi reakciót is, s ezáltal fokozódik az L-lizin előállított mennyisége is. Ezt a hatást kizárólag a vad típusú lysC-gén erősítésével aligha érhetnénk el, ami feltehetően annak köszönhető, hogy a vad típusú AKIII (a lysC-gén terméke) Llizin által bekövetkező gátlása szigorúbb, mint a vad típusú DDPS-é (az AKIII és a DDPS 5 mM L-lizin jelenlétében mért gátlása 100%-os, illetve 80%-os).
A fentiekben leírt tények értelmében úgy ítéltük meg, hogy az első sebességmeghatározó lépést a DDPS által katalizált, nagyobb lizintermelékenységű reakció képezi, s feltételeztük, hogy a második sebességmeghatározó lépés az AKIII által katalizált reakció.
HU 219 608 Β <2> A második sebességmeghatározó lépés azonosítása
A második sebességmeghatározó lépés azonosítása érdekében - bevitt dapA*-gén tartalmazó törzsekben az L-lizin-bioszintézis-rendszer különböző génjeit erősítettük. Annak érdekében, hogy az egyéb plazmidok - a dapA*-gént hordozó plazmidot tartalmazó E. coli sejtekbe történő bevitelük után - stabilan helyezkedjenek el a sejtekben, a dapA*-gént a pdapA-plazmidból az RSFlOlO-plazmidba vittük át, miáltal az RSF24P-plazmidot kaptuk (7. ábra), mellyel E. coli W3110(tyrA) törzset transzformáltunk.
Az L-lizin-bioszintézis-rendszer génjeit tartalmazó plazmidokat E. coli W3110(tyrA)/RSF24P törzsbe vittük be. A kapott transzformánsok mindegyikében kétféle plazmid, nevezetesen az RSF24P-plazmid és - az L-lizin-bioszintézis-rendszer egy másik génjét tartalmazó - plazmid van együtt jelen. E törzsek Llizin-termelékenységét a (6-1-2) pontban leírtak szerint vizsgáltuk. Az eredményeket a 10. táblázatban mutatjuk be.
10. táblázat
Baktériumtörzs A termelt L-lizin-hidroklorid mennyisége (g/D Cukorra vonat- koztatott hozam (%)
W3110(tyrA)/RSF24P 3,63 8,9
W3110(tyrA)/RSF24P+pppc 3,67 9,0
W3110(tyrA)/RSF24P+paspC 3,59 8,8
W3110(tyrA)/RSF24P+plysC 3,42 8,4
W3110(tyrA)/RSF24P+plysC* 9,17 22,5
W3110(tyrA)/RSF24P+pasd 3,75 9,2
W3110(tyrA)/RSF24P+pdapA 3,55 8,7
W3110(tyrA)/RSF24P+pdapA* 3,46 8,5
W3110(tyrA)/RSF24P+pdapB 4,08 10,0
W3110(tyrA)/RSF24P+pDDH 3,67 9,0
W3110(tyrA)/RSF24P+plysA 3,55 8,7
A vizsgálat eredményeként L-lizin-termelékenységet jelentősen növelő hatást csak a lysC*-gén esetében tapasztaltunk. A vad típusú lysC-génnek egyáltalán nem volt hatása. Ez feltehetően az L-lizin erős gátlóhatása miatt van (amint azt fentebb leírtuk). Ilyenformán bebizonyítottuk, hogy az a reakció képezi a második sebességmeghatározó lépést, amelyben a lysC*-géntermék szerepel.
A lysC*-gént RSF24P-plazmidba foglaltuk, miáltal az RSFD80-plazmidot kaptuk (9. ábra). Hasonló módon a lysC-gént is RSF24P-plazmidba foglaltuk, s az így kapott plazmidot RSFD 1-nek neveztük el. Ezeket a plazmidokat E. coli W3110(tyrA) törzsbe vittük be, nyersenzimoldatokat készítettünk, s a (6-1-2) pontban leírtak szerint vizsgáltuk az AK-aktivitást és az AK-aktivitás L-lizin által bekövetkező gátlását. Az eredményeket all. táblázatban mutatjuk be.
11. táblázat
Az AK-aktivitás vizsgálatához alkalmazott baktériumtörzs Specifikus aktivitás1 A gátlás deszcnzitizáltságának mértéke2
W3110(tyrA)/RSF24P 0,94 42,9
W3110(tyrA)/RSFDl 18,55 7,2
W3110(tyrA)/RSFD80 33,36 98,8
1 nmol/pcrc/mg protein;
2 az aktivitás megmaradásának százalékos aránya 5 mM L-lizin jelenlétében.
A plazmidokat tartalmazó törzsekben az AK specifikus aktivitása - a lysC- és lysC*-gén RSF24P-plazmidba történő foglalásának hatására - 20-30-szorosára emelkedett. Az E. coliban háromféle AK-enzim létezik, és a lysC-gén ezek közül az AKIII-at kódolja. Ennek ellenére a fenti kísérletben a háromféle AK-enzim összes aktivitását mértük. Úgy véljük, hogy az L-lizin által kiváltott gátlás az inszertált, vad típusú lysC-gént tartalmazó RSFD 1-plazmidot hordozó törzsben szintén erőteljessé válik, mivel az AKIII aránya nagyobb, mint az AKI- és az AKIII-enzim aránya a kontroll W3110(tyrA)/RSF24P törzshöz viszonyítva, ami az L-lizin termelékenységének javítására irányuló hatás hiányát eredményezi. Kimutattuk továbbá, hogy az RSFD80-plazmidot tartalmazó törzsben az AKIII gátlása körülbelül 100%-os, és ez a tény hozzájárul az Llizin-termelés javításához.
< 3 > A harmadik sebességmeghatározó lépés azonosítása
A következő kísérletben az L-lizin-bioszintézisrendszer különböző plazmidjait E. coli W3110(tyrA)/ /RSFD80 törzsbe vittük, s a sejteket az L-lizin-termelés érdekében tenyésztettük. A tenyésztés eredményeit a 12. táblázatban mutatjuk be.
12. táblázat
Baktériumtörzs A termelődött L-lizinhidroklorid mennyisége (g/1) Cukorra vonat- koztatott hozam (%)
W3110(tyrA)/RSFD80 9,17 22,5
W3110(tyrA)/RSFD80+pppc 8,97 22,0
W3110(tyrA)/RSFD80+paspC 9,05 22,2
W3110(tyrA)/RSD80+plysC 8,56 21,0
W3110(tyrA)/RSFD80+plysC* 8,15 20,0
W3110(tyrA)/RSFD80+pasd 8,35 20,5
W3110(tyrA)/RSFD80+pdapA 8,56 21,0
W3110(tyrA)/RSFD80+pdapA* 8,15 20,0
W3110(tyrA)/RSFD80+pdapB 10,80 26,5
W3110(tyrA)/RSFD80+pDDH 8,56 21,0
W3110(tyrA)/RSFD80+plysA 8,48 20,8
Az L-lizin-termelékenységre gyakorolt fokozóhatást csak a dapB-gén esetében tapasztaltunk, s azt találtuk,
HU 219 608 Β hogy az a dapB-géntermék által katalizált reakció képezi a harmadik sebességmeghatározó lépést Ennek megfelelően a dapB-gént RSFD80-plazmidba inszertáltuk, és a kapott pCABl-plazmidot (18. ábra) E. coli W3310(tyrA) törzsbe vittük be, melyből nyersenzimoldatot készítettünk, és a dihidrodipikolinát-reduktáz (DDPR) aktivitását Tamir és Gilvarg által leírt eljárással [Tamir, H. és Gilvarg, C.: J. Bioi. Chem. 249, 3034 (1974)] mértük. Hasonló módon, a csak RSFB80-enzimet tartalmazó törzsből, valamint RSFD80-plazmidot és pdapB-plazmidot egyaránt tartalmazó törzsből is készítettünk nyersenzimoldatot, s ezekben is mértük a DDPR-aktivitást. Az eredményeket a 13. táblázatban mutatjuk be.
13. táblázat
Baktériumtörzs Specifikus aktivitás (pmol/pcrc/mg protein)
W3110(tyrA)/RSFD80 0,027
W3110(tyrA)/RSFD80+pdapB 0,092
W3310(tyrA)/pCABl 0,178
A csak RSFD80-plazmidot tartalmazó kontrolltörzshöz képest az RSFD80- és pdapB-plazmidot együttesen tartalmazó törzsben a DDPR-aktivitás körülbelül háromszorosára emelkedett, míg a pCABl-plazmidot (amelyet a dapB-gén RSFD80-plazmidba történő inszertálásával hoztunk létre) tartalmazó törzsben az emelkedés mértéke 6,5-szeres volt. Annak alapján, hogy a W3310(tyrA)/ /RSFD80+pdapB törzs és a W3310(tyrA)/pCABl törzs egyforma L-lizin-felhalmozást mutatott (10,8 g/1), úgy ítéltük, hogy a dapB az L-lizin-termeléshez elégséges mennyiségben állt rendelkezésre, és a sebességmeghatározó lépés a következő lépésre tolódott.
<4> A negyedik sebességmeghatározó lépés azonosítása
A következő lépésben a negyedik sebességmeghatározó lépést lysC*-, dapA*- és dapB-gént tartalmazó pCABl-plazmid alkalmazásával azonosítottuk. Az Llizin-bioszintézis-rendszer különböző génjeit hordozó plazmidokat E. coli W3110(tyrA)/pCABl törzsbe vittük be, és a sejteket az L-lizin-termelés érdekében tenyésztettük. A tenyésztési eredményeket a 14. táblázatban mutatjuk be.
14. táblázat
Baktériumtörzs A termelődött L-lizin-hidrokloríd mennyisége (g/i) Cukorra vonat- koztatott hozam (%)
W3110(tyrA)/pCABl 10,80 26,5
W3110(tyrA)/pCABl +pppc 11,00 27,0
W3110(tyrA)/pCABÍ +paspC 10,88 26,7
W3110(tyrA)/pCABl +plysC 10,60 26,0
W3110(tyrA)/pCABl +plysC* 10,39 25,5
W3110(tyrA)/pCABl +pasd 10,19 25,0
Baktériumtörzs A termelődött L-lizin-hidro- klorid mennyisége (g/1) Cukorra vonat- koztatott hozam (%)
W3110(tyrA)/pC AB 1+pdap A 10,72 26,3
W3110(tyrA)/pCABl +pdapA* 10,80 26,5
W3110(tyrA)/pCABl +pdapB 10,92 26,8
W3110(tyrA)/pCABl +pDDH 12,23 30,0
W3110(tyrA)/pCABl +plysA 10,60 26,0
Az L-lizin termelékenységét fokozó hatást csak a DDH esetében tapasztaltunk, s azt találtuk, hogy a DDH által katalizált reakció képezte a negyedik sebességmeghatározó lépést. Ezenkívül a bevitt DDHgént nem tartalmazó törzs tenyésztő tápközegében kimutatott N-szukcinil-L,L-a,e-diamino-pimelinsavat (SDAP) a bevitt DDH-gént tartalmazó törzs tenyésztő tápközegében nem detektáltunk. Az SDAP kimutatását vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) végeztük (az előhívó folyadék összetétele: metanol:víz: 10 N HCLpiridin = 80:17,5:2,5:10) [Bouvier, J. Richaud, C., Higgins, W., Bogler, O. és Stragier, P.: J. Bacteriol. 174, 5265 (1992)]. A bevitt DDH-gént nem tartalmazó törzs esetében a tápközeg színe barna volt, míg a bevitt DDH-gént tartalmazó törzs esetében sárgára változott. Ilyenformán a DDH-gént pCABl-plazmidba foglaltuk, miáltal a pCABD2-plazmidot (19. ábra) kaptuk, majd ismert eljárással [Azizono, Haruo: Fermentation and Industry 45, 964 (1987)] mértük az e plazmiddal transzformált E. coli W3110(tyrA) törzs DDH-aktivitását. Az eredményeket a 15. táblázatban mutatjuk be.
15. táblázat
Baktériumtörzs Specifikus aktivitás (pmol/perc/mg protein)
W3110(tyrA)/pCABl 0,000
W3110(tyrA)/pCABl +pDDH 0,799
W3310(tyrA)/pCABD2 2,214
A kontroll W3110(tyrA)/pCABl törzs esetében nem detektáltunk DDH-aktivitást, mivel a DDH eredetileg nincs jelen az E. coliban. A pCABD2-plazmidot tartalmazó W3310(tyrA)/pCABD2 törzs specifikus DDHaktivitása a pDDH-plazmidot tartalmazó W3110(tyrA)/ /pCABl +pDDH törzs specifikus aktivitásának körülbelül 2,5-szerese volt, azonban a két törzs azonos mértékű L-lizin-felhalmozást mutatott (12,23 g/1). Ilyenformán úgy ítéltük meg, hogy a pCABD2-plazmid DDH-expressziós szintje kielégítő volt.
<5> A dapC-, dapD-, dapE- és dapF-gének közötti sebességmeghatározó lépések vizsgálata
A fentebb leírt vizsgálatban DDH-val helyettesített dapC-, dapD-, dapE- és dapF-gének sebességkorlátozó sorrendjének vizsgálata érdekében először klónoztuk ezeket a géneket. A dapC-gént nem klónoztuk, mivel bázisszekvenciájának leírása nem áll rendelkezésre. A három másik gént PCR-eljárással klónoztuk.
HU 219 608 Β
A dapD-gént úgy kaptuk, hogy egy E. coli W3310 törzs kromoszomális DNS-éből - PCR-eljárással dapD-gént amplifikáltunk, amihez egy ismert dapD-gén nukleotidszekvenciája [Richaud, C. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 259, 14 824 (1984)] alapján előállított kétféle láncindító oligonukleotidot (15. és 16. azonosító számú szekvenciák) alkalmaztunk. Egy kapott, amplifikált fragmenst Eco0109I-gyel és Sacl-gyel hasítottunk, terminálisait tompa végűvé alakítottuk, majd a pMW118-vektor Smal-helyére inszertáltuk, miáltal egy pdapD-plazmidot kaptunk (20. ábra).
A dapE-gént úgy kaptuk, hogy egy E. coli W3310 törzs kromoszomális DNS-éből - PCR-eljárással dapE-gént amplifikáltunk, amihez egy ismert dapE-gén nukleotidszekvenciája [Bouvier, J. és munkatársai: J. Bacteriol. 174, 5265 (1992)] alapján előállított kétféle láncindító oligonukleotidot (17. és 18. azonosító számú szekvenciák) alkalmaztunk. Egy kapott, amplifikált DNS-fragmenst Munl-gyel és BglII-vel hasítottunk, terminálisait tompa végűvé alakítottuk, majd a pMW118vektor Smal-helyére inszertáltuk, miáltal egy pdapEplazmidot kaptunk (21. ábra).
A dapF-gént úgy kaptuk, hogy egy E. coli W3310 törzs kromoszomális DNS-éből - PCR-eljárással dapF-gént amplifikáltunk, amihez egy ismert dapF-gén nukleotidszekvenciája [Richaud, C. és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 16, 10 367 (1988)] alapján előállított kétféle láncindító oligonukleotidot (19. és 20. azonosító számú szekvenciák) alkalmaztunk. Egy kapott, amplifikált DNS-ffagmenst Pstl-gyel hasítottunk, terminálisait tompa végűvé alakítottuk, majd a pMW118vektor Smal helyére inszertáltuk, miáltal egy pdapFplazmidot kaptunk (22. ábra).
A fentiek szerint előállított plazmidok mindegyikét W3110(tyrA)/pCABl törzsbe vittük be, és a sejteket Llizin-termelés érdekében tenyésztettük. Az előző kísérletben a változásokat - a termelődött L-lizin mennyisége mellett - a tápközeg színe alapján, valamint az SDAP intermedier felhalmozódásának megléte vagy hiánya alapján észleltük (ezeket a jellemzőket a DDHgén bevitele előtti és utáni állapotban figyeljük meg). Következésképpen a sebességmeghatározó lépés vizsgálatát szintén e jellemzők alapján végeztük. Az eredményeket a 16. táblázatban mutatjuk be.
16. táblázat
Baktériumtörzs L-lizin-hidroklorid mennyisége (g/1) Cukorra vonatkoztatott hozam (%) Tápleves színe SDAP-felhalmozódás
W3110(tyrA)/pCABl 10,80 26,5 barna +
W3110(tyrA)/pCABl +pdapD 11,08 27,2 sárga +
W3110(tyrA)/pCABl +pdapE 11,12 27,3 barna +
W3110 (tyrA)/pC AB 1 +pdapF 10,96 26,9 bama -
W3110(tyrA)/pCABD2 12,23 30,0 sárga -
A termelődött L-lizin mennyisége a dapD- vagy 35 dapE-gén erősítése eredményeként kismértékben fokozódott, de a DDH esetében kapott eredményt nem múlta felül. Azt találtuk továbbá, hogy a tápközeg színének változása és a DDH-gén bevitele után megfigyelt intermedier, az SDAP felhalmozódása két, egymástól füg- 40 getlen jelenség: a tápközeg színváltozása a dapD-gén eredménye, az SDAP eltűnése pedig a dapE-gén eredménye volt. A dapE és az SDAP közötti összefüggés az L-lizin-bioszintézis reakcióútja alapján feltételezhető.
A dapF-gén-erősítés nem javította az L-lizin-termelé- 45 kenységet.
A pdapE-plazmidból kivágtuk a dapE-gént, és pdapD-plazmidba inszertáltuk, miáltal dapE- és dapDgént egyaránt tartalmazó pMWdapDEl-plazmidot kaptunk (23. ábra). Ezután a pMWdapDEl-plazmidból kivágtunk egy - dapE- és dapD-gént tartalmazó - fragmenst, melyet pCABl-plazmidba inszeitálva a pCABDElplazmidot hoztuk létre (24. ábra). Következő lépésként pCABl-, pCABDEl- vagy pCABDE2-plazmidot tartalmazó törzseket, valamint pCABDEl- és pdapF-plazmidot együttesen tartalmazó törzset hoztunk létre, és ezeket a törzseket L-lizin-termelés érdekében tenyésztettük. Az eredményeket a 17. táblázatban mutatjuk be.
17. táblázat
Baktériumtörzs L-lizin-hidroklorid mennyisége (g/1) Cukorra vonatkoztatott hozam Tápleves színe SDAP-felhalmozódás
W3110(tyrA)/pCABl 10,80 26,5 bama +
W3110(tyrA)/pCABDEl 12,23 30,0 sárga -
W3110(tyrA)/pCABDEl+ pdapF 11,82 29,0 bama -
W3110(tyrA)/pCABD2 12,23 30,0 sárga -
Azt találtuk, hogy a termelődött L-lizin mennyisége, a tápközeg színe és az SDAP-felhalmozódás megléte vagy hiánya azonos eredményt mutatott, mint a dapDés dapE-gén együttes erősítésével előidézett DDH-termelés esetében. Ezenkívül azt találtuk, hogy a dapF-gén további erősítése nincs hatással az L-lizin-termelékeny24
HU 219 608 Β ség javítására, és az a reakció, amelyben a dapF közreműködik, nem képez sebességkorlátozó lépést. A fentiekben leírt eredményeket a következők szerint értelmezhetjük.
A pCABl-plazmid bevitelének hatására az intermedierek két lépésben, N-szukcinil-e-keto-L-a-amino-pimelinsav (SKAP) és SDAP alakjában halmozódnak fel. Ezen intermedierek közül az SDAP-t extracelluláris táplevesben detektáltuk. Bár az SKAP-t nem detektáltuk, úgy véljük, hogy a baktériumsejtekben halmozódik fel. E véleményünk a tápleves színén alapul. A vad típusú törzs [W3110(tyrA)j vagy hasonló, L-lizint nem termelő törzsek esetében a tápleves színe sárga. A tápleves színe feltehetően a növekedésre gyakorolt nyomás hatására bekövetkező bakteriolízis vagy hasonló esemény eredménye. Úgy véljük, hogy az SDAP csak kis nyomást gyakorol a növekedésre, mivel a sejteken kívül halmozódik fel, miáltal a tápközeg színe sárgára változik, bár az SDAP felhalmozódó mennyisége növekszik, ha az SKAP a dapD-gén egyedüli erősítésének hatására metabolizálódik. Az Llizin felhalmozódó mennyisége azonban még a dapDgén erősítésének hatására sem növekszik, hacsak nem deszenzitizált a reakcióút következő, dapE-gén-termék által katalizált sebességkorlátozó lépése.
<6> Következtetés
A fentebb leírt eredmények alapján megállapítottuk, hogy az L-lizin termelékenysége Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumokban, lépcsőzetes módon, (1) dapA*-gén bevitelével; (2) lysC*-gén bevitelével; (3) dapB-gén erősítésével; és (4) DDH-gén vagy a dapD- és dapE-gén erősítésével javítható. A találmány szerinti eljárás eredményeként olyan E. colit kaptunk, amelyben az L-lizin termelékenysége lépcsőzetes módon javított.
< 7> Az L-lizin-bioszintézis-rendszer sebességmeghatározó lépésének vizsgálata E. coli C törzsben
Annak megállapítása érdekében, hogy az előző pontban levont következtetések az E. coli Κ-12-sorozatba tartozó törzseken kívül alkalmazhatók-e más törzsekre is, a fentebb leírt módon egy E. coli C törzs (IFO 13891) L-lizin-bioszintézis-rendszerének sebességmeghatározó lépéseit vizsgáltuk. A tenyésztést azonos feltételekkel végeztük, mint a W3310(tyrA) törzs esetében, azonban L-lizint nem adtunk a tápközeghez.
(1) Az első sebességmeghatározó lépés azonosítása
Az E. coli C törzset (IFO 13891) az L-lizin-bioszintézis-rendszer génjeit tartalmazó plazmidokkal transzformáltuk, és az L-lizin-termelés érdekében a tápközegben tenyésztettük. A tenyészetben mértük a termelődött L-lizin mennyiségét. Az eredményeket a 18. táblázatban mutatjuk be.
18. táblázat
Baktériumtörzs A termelődött L-lizin-hidroklorid mennyisége (g/1) Cukorra vonatkoztatott hozam (%)
c 0,08 0,2
C/pppc 0,08 0,2
Baktériumtörzs A termelődött L-lizin-hidroklorid mennyisége (g/1) Cukorra vonatkoztatott hozam (%)
C/paspC 0,12 0,2
C/plysC 0,08 0,2
C/plysC* 0,12 0,3
C/pasd 0,08 0,2
C/pdapA 0,32 0,8
C/pdapA* 0,71 L75
C/pdapB 0,12 0,3
C/pDDH 0,08 0,2
C/plysA 0,08 0,2
A W3110(tyrA) törzshöz hasonlóan az L-lizin a vad típusú dapA-gén bevitelének hatására, és még inkább a gátlással szemben deszenzitizált típusú dapA*-gén bevitelének hatására a C törzs tápközegében is felhalmozódott. A lysC*-gén az L-lizin-termelékenységre nem gyakorolt hatást.
(2) A második sebességmeghatározó lépés azonosítása
A dapA*-gént tartalmazó RSF24P-plazmidot bevittük az E. coli C törzsbe, és az így transzformált törzsbe az L-lizin-bioszintézis-rendszer további génjeit tartalmazó plazmidokat vittünk be. A kapott transzformánsokat L-lizin-termeléshez alkalmas tápközegben tenyésztettük, és mértük a termelődött L-lizin-hidroklorid mennyiségét. Az eredményeket a 19. táblázatban mutatjuk be.
19. táblázat
Baktériumtörzs A termelődött L-lizin-hidroklorid mennyisége (g/1) Cukorra vonatkoztatott hozam (%)
C/RSF24P 0,71 1,75
C/RSF24P+pppc 0,71 1,74
C/RSF24P+paspC 0,69 1,70
C/RSF24P+plysC 0,65 1,60
C/RSF24P+plysC* 1,82 4,50
C/RSF24P+pasd 0,70 1,73
C/RSF24P+pdapA 0,71 1,75
C/RSF24P+pdapA* 0,69 1,70
C/RSF24P+pdapB 0,99 2,45
C/RSF24P+pDDH 0,73 1,80
C/RSF24P+plysA 0,69 1,70
Megállapítottuk, hogy a dapA*-gént tartalmazó plazmiddal transzformált C törzs esetében a lysC*-gén javítja az L-lizin-termelékenységet, és az a reakció képezi a második sebességmeghatározó lépést, amelyben a lysC* közreműködik.
(3) A harmadik sebességmeghatározó lépés azonosítása
A dapA*- és lysC*-gént tartalmazó RSFD80-plazmidot E. coli C törzsbe vittük be, és az így transzformáit törzsbe bevittük az L-lizin-bioszintézis-rendszer további génjeit tartalmazó plazmidokat is. A kapott transz25
HU 219 608 Β formánsokat L-lizin-termeléshez alkalmas tápközegben tenyésztettük, és mértük a termelődött L-lizin-hidroklorid mennyiségét. Az eredményeket a 20. táblázatban mutatjuk be.
20. táblázat
Baktériumtörzs A termelődött L-lizin-hidroklorid mennyisége (g/1) Cukorra vonatkoztatott hozam (%)
C/RSFD80 1,82 4,5
C/RSFD80+pppc 1,74 4,3
C/RSFD80+paspC 1,82 4,5
C/RSFD80+plysC 1,91 4,7
C/RSFD80+plysC* 1,74 4,3
C/RSFD80+pasd 1,82 4,5
C/RSFD80+pdapA 1,95 4,8
C/RSFD80+pdapA* 1,91 4,7
C/RSFD80+pdapB 2,31 5,7
C/RSFD80+pDDH 2,15 5,3
C/RSFD80+plysA 1,95 4,8
A W3110 törzshöz hasonló módon, csak a dapB- 25 gén fejtett ki javítóhatást az L-lizin-termelékenységre, s megállapítottuk, hogy ez képezi a harmadik sebességmeghatározó lépést.
(4) A negyedik sebességmeghatározó lépés azonosítása
A dapA*-, lysC*- és dapB-gént tartalmazó pCABl- 30 plazmidot E. coli C törzsbe vittük be, és az így transzformáit törzsbe bevittük az L-lizin-bioszintézis-rendszer további génjeit tartalmazó plazmidokat is. A kapott transzformánsokat L-lizin-termeléshez alkalmas tápközegben tenyésztettük, és mértük a termelődött Llizin-hidroklorid mennyiségét. Az eredményeket a 21. táblázatban mutatjuk be.
21. táblázat
Baktériumtörzs A termelődött L-lizin-hidroklorid mennyisége (g/1) Cukorra vonatkoztatott hozam (%)
C/pCABl 2,31 5,7
C/pCABl+pppc 2,23 5,5
C/pC AB 1 + paspC 2,35 5,8
C/pCABl +plysC 2,27 5,6
C/pCABl+plysC* 2,19 5,4
C/pCABl +pasd 2,23 5,5
C/pCABl + pdapA 2,31 5,7
C/pC AB 1 + pdapA * 2,27 5,6
C/pCABl + pdapB 2,23 5,5
C/pCABl+pDDH 2,59 6,4
C/pC AB 1+plysA 2,19 5,4
A W3110 törzshöz hasonló módon, ebben az esetben is csak a DDH-gén fejtett ki javítóhatást az L-lizintermelékenységre, s megállapítottuk, hogy ez képezi a negyedik sebességmeghatározó lépést.
(5) A dapC-, dapD-, dapE- és dapF-gének közötti sebességmeghatározó lépések vizsgálata
A pCABl-plazmidot tartalmazó E. coli C törzsbe a DDH-gén helyett - dapD-, dapE- vagy dapF-gént tartalmazó plazmidot vittünk be, és a kapott transzformánsokat az L-lizin-termelés érdekében tenyésztettük. Az eredményeket a 22. táblázatban mutatjuk be.
22. táblázat
Baktériumtörzs L-lizin-hidroklorid mennyisége (g/1) Cukorra vonatkoztatott hozam (%) Tápleves színe SDAP-felhalmozódás
C/pCABl 2,31 5,7 barna +
C/pCABl +pdapD 2,43 6,0 sárga +
C/pCABl +pdapE 2,35 5,8 barna -
C/pC AB 1 + pdapF 2,23 5,5 barna +
C/pCABDEl 2,59 6,4 sárga -
C/pCABDEl+pdapF 2,43 6,0 sárga -
C/pCABD2 2,59 6,4 sárga -
Megállapítottuk, hogy a dapD- és dapE-gén-termé- 50 kék által katalizált lépések a C törzsben is ugyanolyan hatást gyakorolnak a sebességmeghatározásra, mint a W3110 törzs esetében.
Az eddig leírtak alapján megállapíthatjuk, hogy a különböző sorozatba tartozó E. coli K-12 és C törzsek- 55 ben a sebességmeghatározó sorrend azonos. Ennek megfelelően úgy véljük, hogy a teljes E. colit alkalmazhatjuk azt az elképzelésünket, miszerint az L-lizin-termelékenység lépcsőzetes módon, dapA*-gén és lysC*gén bevitelével, majd a dapB-gén és a DDH-gén (vagy dapD- és dapE-gén) erősítésével (a megadott sorrendben) javítható.
Nagyüzemi alkalmazhatóság
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításával olyan - Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó - mutáns DDPS-gént hoztunk létre, amelyben az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlás megfelelő mértékben deszenzitizált. Az általunk kialakított gén - Escherichia nemzetségbe tartozó, az Llizin által kiváltott „feedback” gátlással szemben de60 szenzitizált aszpartát-kinázt tartalmazó - baktériumba
HU 219 608 Β történő bevitelével az eddig leírtaknál tökéletesebb Llizin-termelő baktériumot sikerült létrehoznunk.
Az L-lizin-termelékenység lépcsőzetes módon, dapA*-gén és lysC*-gén bevitelével, majd a dapB-gén és a DDH-gén (vagy dapD- és dapE-gén) erősítésével (a megadott sorrendben) javítható.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCGCAACTAC TGACATGACG 20
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AGTAAGCCAT CAAATCTCCC 20
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1197
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomiDNS EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: Escherichia coli
TÖRZS: MC1061
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: prím trascript ELHELYEZKEDÉS: 248 AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: E SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS
ELHELYEZKEDÉS: 272-1150 AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: E SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: primerbind ELHELYEZKEDÉS: 27-46
AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: E SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: primer bind ELHELYEZKEDÉS: 1156-1175 AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: E
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: RBS ELHELYEZKEDÉS: 261-265 AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: S A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
CCAGGCGACT GTCTTCAATA TTACAGCCGC AACTACTGAC ATGACGGGTG ATGGTGTTCA 60 CAATTCCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG TGATCACCAG ATAATGTGTT GCGATGACAG 120 TGTCAAACTG GTTATTCCTT TAAGGGGTGA GTTGTTCTTA AGGAAAGCAT AAAAAAAACA 180 TGCATACAAC AATCAGAACG GTTCTGTCTG CTTGCTTTTA ATGCCATACC AAACGTACCA 240 TTGAGACACT TGTTTGCACA GAGGATGGCC C ATG TTC ACG GGA AGT ATT GTC 292
Met Phe Thr Gly Ser Ile Val 1 5
GCG ATT GTT ACT CCG ATG GAT GAA AAA GGT AAT GTC TGT CGG GCT AGC 340
Alá Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Alá Ser
10 15 20
TTG AAA AAA CTG ATT GAT TAT CAT GTC GCC AGC GGT ACT TCG GCG ATC 388
Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val Alá Ser Gly Thr Ser Alá Ile
25 30 35
GTT TCT GTT GGC ACC ACT GGC GAG TCC GCT ACC TTA AAT CAT GAC GAA 436
Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Alá Thr Leu Asn His Asp Glu
40 45 50 55
CAT GCT GAT GTG GTG ATG ATG ACG CTG GAT CTG GCT GAT GGG CGC ATT 484
His Alá Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Alá Asp Gly Arg Ile
60 65 70
CCG GTA ATT GCC GGG ACC GGC GCT AAC GCT ACT GCG GAA GCC ATT AGC 532
Pro Val Ile Alá Gly Thr Gly Alá Asn Alá Thr Alá Glu Alá Ile Ser
80 85
CTG ACG CAG CGC TTC AAT GAC AGT GGT ATC GTC GGC TGC CTG ACG GTA 580
Leu Thr Gin Arg Phe Asn Asp Ser Gly Ile Val Gly Cys Leu Thr Val
90 95 100
ACC CCT TAC TAC AAT CGT CCG TCG CAA GAA GGT TTG TAT CAG CAT TTC 628
Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gin Glu Gly Leu Tyr Gin His Phe
105 110 115
AAA GCC ATC GCT GAG CAT ACT GAC CTG CCG CAA ATT CTG TAT AAT GTG 676
Lys Alá Ile Alá Glu His Thr Asp Leu Pro Gin Ile Leu Tyr Asn Val
120 125 130 135
HU 219 608 Β
CCG TCC CGT ACT GGC TGC GAT CTG CTC CCG GAA ACG GTG GGC CGT CTG 724
Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu
140 145 150 772
GCG AAA GTA AAA AAT ATT ATC GGA ATC AAA GAG GCA ACA GGG AAC TTA
Alá Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile Lys Glu Alá Thr Gly Asn Leu
155 160 165
ACG CGT GTA AAC CAG ATC AAA GAG CTG GTT TCA GAT GAT TTT GTT CTG 820
Thr Arg Val Asn Gin Ile Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu
170 175 180
CTG AGC GGC GAT GAT GCG AGC GCG CTG GAC TTC ATG CAA TTG GGC GGT 868
Leu Ser Gly Asp Asp Alá Ser Alá Leu Asp Phe Met Gin Leu Gly Gly
185 190 195
CAT GGG GTT ATT TCC GTT ACG ACT AAC GTC GCA GCG CGT GAT ATG GCC 916
His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn Val Alá Alá Arg Asp Met Alá
200 205 210 215
CAG ATG TGC AAA CTG GCA GCA GAA GAA CAT TTT GCC GAG GCA CGC GTT 964
Gin Met Cys Lys Leu Alá Alá Glu Glu His Phe Alá Glu Alá Arg Val
220 225 230
ATT AAT CAG CGT CTG ATG CCA TTA CAC AAC AAA CTA TTT GTC GAA CCC 1012
Ile Asn Gin Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro
235 240 245
AAT CCA ATC CCG GTG AAA TGG GCA TGT AAG GAA CTG GGT CTT GTG GCG 1060
Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Alá Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Alá
250 255 260
ACC GAT ACG CTG CGC CTG CCA ATG ACA CCA ATC ACC GAC AGT GGT CGT 1108
Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg
265 270 275
GAG ACG GTC AGA GCG GCG CTT AAG CAT GCC GGT TTG CTG T AAAGTTTAGG 1158
Glu Thr Val Arg Alá Alá Leu Lys His Alá Gly Leu Leu
280 285 290
GAGATTTGAT GGCTTACTCT GTTCAAAAGT CGCGCCTGG 1197
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: MOLEKULATÍPUS: peptid
HOSSZA: 292 35 A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ
TÍPUSA: ami inosav s. A:
Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Alá Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys
1 5 10 15 Val
Gly Asn Val Cys Arg Alá Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His
20 25 30 Glu
Alá Ser Glv Thr Ser Alá Ile Val Ser Val Glv Thr Thr Gly Ser
35 40 45
Alá Thr Leu Asn His Asp Glu His Alá Asp Val Val Met Met Thr Leu
50 55 60
Asp Leu Alá Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Alá Gly Thr Gly Alá Asn
65 70 75 80
Alá Thr Alá Glu Alá Ile Ser Leu Thr Gin Arg Phe Asn Asp Ser Gly
85 90 95
Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gin
100 105 110
Glu Gly Leu Tyr Gin His Phe Lys Alá Ile Alá Glu His Thr Asp Leu
115 120 125
Pro Gin Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu
130 135 140
Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Alá Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile
145 150 155 160
Lys Glu Alá Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gin Ile Lys Glu Leu
165 170 175
HU 219 608 Β
Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Alá Ser Alá Leu
180 185 190
Asp Phe Met Gin Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn
195 200 205
Val Alá Alá Arg Asp Met Alá Gin Met Cys Lys Leu Alá Alá Glu Glu
210 215 220
His Phe Alá Glu Alá Arg Val Ile Asn Gin Arg Leu Met Pro Leu His
225 230 235 240
Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Alá Cys
245 250 255
Lys Glu Leu Gly Leu Val Alá Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr
260 265 270
Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Alá Alá Leu Lys His
Gly 275 280 285
Alá Leu Leu
290
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPU S A: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GAATTCCTTT GCGAGCAG 1 8
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 2147
TÍPU S A: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomiDNS
EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: Escherichia coli
TÖRZS: MC1061
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: -35 signal
ELHELYEZKEDÉS: 242-249 AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: S SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: -10 signal ELHELYEZKEDÉS: 265-273
AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: S SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: primerbind ELHELYEZKEDÉS: 536-555 AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: E
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: primer bind ELHELYEZKEDÉS: 2128-2147 AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: E SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: RBS ELHELYEZKEDÉS: 575-578 AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: S SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS
ELHELYEZKEDÉS: 584-1933 AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: S SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: terminator ELHELYEZKEDÉS: 1941-1968
AZONOSÍTÁSI ELJÁRÁS: S
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ SA:
TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT 60 AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA 120 AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGnGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA 180 AGCATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT 240 CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC 300 CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG 360 AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC 420 TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC 480 ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC 540 CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595
Met Ser Glu Ile l
HU 219 608 Β
gtt GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT tct GAC GCC ATG 643
Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Alá Asp Phe Asp Alá Met
5 10 15 20
AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT CTA GTT 691
Asn Arg Ser Alá Asp Ile Val Leu Ser Asp Alá Asn Val Arg Leu Val
25 30 35
GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CTG CTG GTC GCT TTA GCT 739
Val Leu Ser Alá Ser Alá Gly Ile Thr Asn Leu Leu Val Alá Leu Alá
40 45 50
GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA CTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787
Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Alá Ile Arg
55 60 65
AAC ATC CAG TCT GCC ATT CTG GAA CGT CTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835
Asn Ile Gin Phe Alá Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val Ile
70 75 80
CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GCT CTG GCA GAA 883
Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr Val Leu Alá Glu
85 90 95 100
GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG ACA GAT GAG CTG GTC AGC 931
Alá Alá Alá Leu Alá Thr Ser Pro Alá Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser
105 110 115
CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979
His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu Ile Leu Arg Glu
120 125 130
CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027
Arg Asp Val Gin Alá Gin Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr
135 140 145
AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1075
Asn Asp Arg Phe Gly Arg Alá Glu Pro Asp Ile Alá Alá Leu Alá Glu
150 155 160
CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTC AAT GAA GGC CTA GTG ATC 1123
Leu Alá Alá Leu Gin Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val Ile
165 170 175 180
ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171
Thr Gin Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu
185 190 195
GGC CGT GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA GCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219
Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Alá Alá Leu Leu Alá Glu Alá Leu
200 205 210
CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CCG GGC ATC TAC ACC 1267
His Alá Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro Gly Ile Tyr Thr
215 220 225
ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315
Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Alá Alá Lys Arg Ile Asp Glu Ile Alá
230 235 240
CTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363
Phe Alá Glu Alá Alá Glu Met Alá Thr Phe Gly Alá Lys Val Leu His
245 250 255 260
CCG GCA ACG CTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411
Pro Alá Thr Leu Leu Pro Alá Val Arg Ser Asp Ile Pro Val Phe Val
265 270 275
GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459
Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Alá Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys
280 285 290
ACT GAA AAT CCG CCG CTG ne CGC GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG 1507
Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Alá Leu Alá Leu Arg Arg Asn Gin
295 300 305
HU 219 608 Β
ACT CTG CTC ACT TTG CAC AGC CTG AAT ATG CTG CAT TCT CGC GGT TTC 1555
Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe
310 315 320
CTC GCG GAA GTT TTC GGC ATC CTC GCG CGG CAT AAT ATT TCG GTA GAC 1603
Leu Alá Glu Val Phe Gly Ile Leu Alá Arg His Asn Ile Ser Val Asp
325 330 335 340
TTA ATC ACC ACG TCA GAA GTG AGC GTG GCA TTA ACC CTT GAT ACC ACC 1651
Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Alá Leu Thr Leu Asp Thr Thr
345 350 355
GGT TCA ACC TCC ACT GGC GAT ACG TTG CTG ACG CAA TCT CTG CTG ATG 1699
Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gin Ser Leu Leu Met
360 365 370
GAG CTT TCC GCA CTG TGT CGG GTG GAG GTG GAA GAA GGT CTG GCG CTG 1747
Glu Leu Ser Alá Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly. Leu Alá Leu
375 380 385
GTC GCG TTG ATT GGC AAT GAC CTG TCA AAA GCC TGC GGC GTT GGC AAA 1795
Val Alá Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Alá Cys Gly Val Gly Lys
390 395 400
GAG GTA TTC GGC GTA CTG GAA CCG HC AAC ATT CGC ATG ATT TGT TAT 1843
Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg Met Ile Cys Tyr
405 410 415 420
GGC GCA TCC AGC CAT AAC CTG TGC ne CTG GTG CCC GGC GAA GAT GCC 1891
Gly Alá Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Alá
425 430 435
GAG CAG GTG GTG CAA AAA CTG CAT AGT AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT 1940
Glu Gin Val Val Gin Lys Leu His Ser Asn Leu Phe Glu
440 445
ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA 2000 ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT ΤΑΑΤΤΤΤΤΓΤ 2060 ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA 2120 TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC 2147
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 35 MOLEKULATÍPUS: peptid
HOSSZA: 449 A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ
TÍPUSA: aminosav SA:
Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Alá Asp
1 5 10 15
Phe Asp Alá Met Asn Arg Ser Alá Asp Ile Val Leu Ser Asp Alá Asn
20 25 30
Val Arg Leu Val Val Leu Ser Alá Ser Alá Gly Ile Thr Asn Leu Leu
35 40 45
Val Alá Leu Alá Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu
50 55 60
Asp Alá Ile Arg Asn Ile Gin Phe Alá Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Val Leu Alá Glu Alá Alá Alá Leu Alá Thr Ser Pro Alá Leu Thr Asp
100 105 Leu 110
Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Phe Val Glu
115 120 125
Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gin Alá Gin Trp Phe Asp Val Arg Lys
130 135 140
Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Alá Glu Pro Asp Ile Alá
145 150 155 160
HU 219 608 Β
Alá Leu Alá Glu Leu Alá 165 Alá Leu Gin Leu 170 Leu Pro Arg Leu Asn 175 Glu
Gly Leu Val Ile Thr Gin Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg
180 185 190
Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Alá Alá Leu Leu
195 200 205
Alá Glu Alá Leu His Alá Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro
210 215 220
Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Alá Alá Lys Arg Ile
225 230 235 240
Asp Glu Ile Alá Phe Alá Glu Alá Alá Glu Met Alá Thr Phe Gly Alá
245 250 255
Lys Val Leu His Pro Alá Thr Leu Leu Pro Alá Val Arg Ser Asp Ile
260 265 270
Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Alá Gly Gly Thr Leu
275 280 285
Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Alá Leu Alá Leu
290 295 300
Arg Arg Asn Gin Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His
305 310 315 320
Ser Arg Gly Phe Leu Alá Glu Val Phe Gly Ile Leu Alá Arg His Asn
325 330 335
Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Alá Leu Thr
340 345 350
Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gin
355 360 365
Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Alá Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu
370 375 380
Gly Leu Alá Leu Val Alá Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Alá Cys
385 390 395 400
Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg
405 410 415
Met Ile Cys Tyr Gly Alá Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro
420 425 430
Gly Glu Asp Alá Glu Gin Val Val Gin Lys Leu His Ser Asn Leu Phe
435 440 445
Glu
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav 45
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CTTTCACTGA TATCCCTCCC 20 50
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav 55
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 60
AAAAAGTGGA CCAAATGGTC 20
All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍ PU S A: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS
All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ
SA:
CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADA TAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS
HU 219 608 Β
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGCACGGTAG GATGTAATCG 20
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTAATGAAAC AAATGCCCGG 20
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTTATTCATA ATTGCCACCG 20
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CACGGTAATA CATATAACCG 20
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCTGCAATTG TCAAACGTCC 20
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTCGACGCGC TTGAGATCTT 20
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCATAAAGAG TCGCTAAACG 20
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: más - szintetikus DNS A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAACCGCCCG GTCATCAAGC 20

Claims (14)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. DNS, amely egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó dihidrodipikolinát-szintetázt kódol, és amely az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutációt tartalmaz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS, amely az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutációként - a dihidrodipikolinát-szintetáz (szekvencialista 4. azonosító számú szekvenciájában bemutatott) aminosavszekvenciájának N-terminálisától számított - 81. alanint valinnal helyettesítő mutációt vagy a 118. hisztidint tirozinnal helyettesítő mutációt vagy a 81. alanint valinnal és a 118. hisztidint tirozinnal helyettesítő mutációt tartalmaz.
  3. 3. Baktérium, amely az Escherichia nemzetségbe tartozik, és amely egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó dihidrodipikolinát-szintetázt kódoló, az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutációt tartalmazó DNS-nek a baktériumsejtekbe történő bevitelével lett transzformálva.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, amely az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutációként - a dihidrodipikolinát-szintetáz 4. azonosító számú aminosavszekvenciájának N-terminálisától számított - 81.
    HU 219 608 Β alanint valinnal helyettesítő mutációt, vagy a 118. hisztidint tirozinnal helyettesítő mutációt vagy a 81. alanint valinnal és a 118. hisztidint tirozinnal helyettesítő mutációt tartalmaz.
  5. 5. A 3. igénypont szerinti, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, amely tartalmaz továbbá egy aszpartát-kinázt is, amelyben az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlás deszenzitizált.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti, Escherichia nemzetségbe tartozó, az L-lizin által kiváltott gátlással szemben deszenzitizált aszpartát-kinázt tartalmazó baktérium, amely egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból származó aszpartát-kináz-III-at kódoló, az L-lizin által kiváltott „feedback” gátlást deszenzitizáló hatású mutációt tartalmazó DNS-nek a baktériumsejtekbe történő bevitelével lett transzformálva.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, amely az aszpartát-kináz-III Llizin által kiváltott „feedback” gátlását deszenzitizáló hatású mutációként - az aszpartát-kináz-III 8. azonosító számú aminosavszekvenciájának N-terminálisától számított - 323. glicint aszparaginsavval helyettesítő mutációt; vagy a 323. glicint aszparaginsavval és a 408. glicint aszparaginsavval helyettesítő mutációt; vagy a 34. arginint ciszteinnel és a 323. glicint aszparaginsavval helyettesítő mutációt; vagy a 325. leucint fenil-alaninnal helyettesítő mutációt; vagy a 318. metionint izoleucinnal helyettesítő mutációt; vagy a 318. metionint izoleucinnal és a 349. valint metioninnal helyettesítő mutációt; vagy a 345. szerint leucinnal helyettesítő mutációt; vagy a 347. valint metioninnal helyettesítő mutációt; vagy a 352. treonint izoleucinnal helyettesítő mutációt; vagy a 352. treonint izoleucinnal és a 369. szerint fenil-alaninnal helyettesítő mutációt; vagy a 164. glutaminsavat lizinnel helyettesítő mutációt; vagy a 417. metionint izoleucinnal és a 419. ciszteint tirozinnal helyettesítő mutációt tartalmaz.
  8. 8. Az 5. igénypont szerinti, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, amely erősített dihidrodipikolinát-reduktáz-gént tartalmaz.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, amely a dihidrodipikolinát-reduktáz-gén - Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjeiben önálló replikációra képes - vektorral történő ligálásával kialakított rekombináns DNS-sel lett transzformálva.
  10. 10. A 8. igénypont szerinti, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, melynek sejtjeibe coryneform baktériumból származó, erősített diamino-pimelátdehidrogenáz-gén lett bejuttatva.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, amely egy coryneform baktériumból származó diamino-pimelát-dehidrogenáz-gén - Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjeiben önálló replikációra képes - vektorral történő ligálásával kialakított rekombináns DNS-sel lett transzformálva.
  12. 12. A 8. igénypont szerinti, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, amely erősített tetrahidrodipikolinát-szukciniláz- és szukcinil-diamino-pimelát-deaciláz-gént tartalmaz.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti, Escherichia nemzetségbe tartozó baktérium, azzal jellemezve, hogy a tetrahidrodipikolinát-szukciniláz-gén és a szukcinil-diamino-pimelát-deaciláz-gén - Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok sejtjeiben önálló replikációra képes - azonos vagy különböző vektorral történő ligálásával kialakított egy, illetve két rekombináns DNS-sel lett transzformálva.
  14. 14. Eljárás L-lizin előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3-13. igénypontok bármelyike szerinti, Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumot megfelelő tápközegben tenyésztjük, a tenyészetben L-lizint termeltetünk és halmoztatunk fel, majd a tenyészetből az Llizint kinyerjük.
HU9601535A 1993-12-08 1994-11-28 Eljárás L-lizin fermentációval történő előállítására HU219608B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP5308397A JPH07155184A (ja) 1993-12-08 1993-12-08 発酵法によるｌ−リジンの製造法
PCT/JP1994/001994 WO1995016042A1 (fr) 1993-12-08 1994-11-28 Procede de production de l-lysine par fermentation

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9601535D0 HU9601535D0 (en) 1996-07-29
HUT74961A HUT74961A (en) 1997-03-28
HU219608B true HU219608B (hu) 2001-05-28

Family

ID=17980578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9601535A HU219608B (hu) 1993-12-08 1994-11-28 Eljárás L-lizin fermentációval történő előállítására

Country Status (20)

Country Link
US (1) US6040160A (hu)
EP (3) EP1477565B1 (hu)
JP (4) JPH07155184A (hu)
KR (1) KR100345592B1 (hu)
CN (2) CN100384984C (hu)
AT (2) ATE423206T1 (hu)
AU (1) AU690168B2 (hu)
BR (1) BR9408288A (hu)
CA (1) CA2178589C (hu)
CZ (1) CZ291730B6 (hu)
DE (2) DE69435191D1 (hu)
DK (1) DK1477565T3 (hu)
ES (2) ES2322350T3 (hu)
HU (1) HU219608B (hu)
MY (1) MY133278A (hu)
PE (1) PE10496A1 (hu)
PL (1) PL181614B1 (hu)
RU (2) RU2202614C2 (hu)
SK (1) SK280629B6 (hu)
WO (1) WO1995016042A1 (hu)

Families Citing this family (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9606379A (pt) * 1995-06-07 1997-08-12 Ajinomoto Kk Dna recombinante replicavel em células de bactérias corinformes bactérias corineformes processo para produzir l-lisina
JP4004065B2 (ja) * 1995-06-13 2007-11-07 味の素株式会社 発酵法によるｌ−リジンの製造法
EP0770676A3 (en) 1995-10-23 1999-05-19 Ajinomoto Co., Ltd. Method for treating fermentation broth
JP4035855B2 (ja) * 1996-06-05 2008-01-23 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
JP4088982B2 (ja) * 1996-10-15 2008-05-21 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
JP4075087B2 (ja) * 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
SK285201B6 (sk) * 1996-12-05 2006-08-03 Ajinomoto Co., Inc. Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7
RU2175351C2 (ru) * 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
JP2003135066A (ja) * 1999-03-19 2003-05-13 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
RU2250266C2 (ru) * 1999-04-09 2005-04-20 Адзиномото Ко., Инк. Способ получения l-аминокислоты
JP2001120292A (ja) * 1999-08-17 2001-05-08 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
DE19943587A1 (de) * 1999-09-11 2001-03-15 Degussa Neue für das dapF-Gen codierende Nukleotidsequenzen
JP2001120269A (ja) * 1999-10-22 2001-05-08 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
US6927046B1 (en) 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
CN101824392B (zh) * 2000-01-21 2014-09-24 味之素株式会社 生产l-赖氨酸的方法
ATE411378T1 (de) 2000-01-21 2008-10-15 Ajinomoto Kk Verfahren zur herstellung von l-lysin
DE10014546A1 (de) * 2000-03-23 2001-09-27 Degussa Für das dapC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
EP1174520A3 (en) * 2000-07-18 2004-02-18 Degussa AG Method for monitoring a fermentation process using an expression array
MXPA03007089A (es) * 2001-02-08 2004-10-15 Archer Daniels Midland Co Construccion de polinucleotidos para produccion incrementada de lisina.
CN100529057C (zh) * 2001-02-13 2009-08-19 味之素株式会社 通过埃希氏菌属细菌生产l-氨基酸的方法
EP1266966B1 (en) 2001-06-12 2009-04-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-lysine or L-arginine by using methanol assimilating bacterium
BRPI0214330B1 (pt) 2001-11-23 2015-06-16 Ajinomoto Kk Bactéria produtora de l-aminoácido, e, métodos para a produção de um l-aminoácido e de alquil éster inferior de alfa-l-aspartil-l-fenilalanina
JP3932945B2 (ja) * 2002-03-27 2007-06-20 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2216405A1 (en) 2002-05-03 2010-08-11 Monsanto Technology LLC Speed specific USP promoters for expressing genes in plants
AU2003205041A1 (en) 2002-07-12 2004-01-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by fermentation
BR0304860A (pt) * 2002-11-11 2004-08-31 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
DE102004001674B4 (de) 2003-01-29 2019-01-24 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Einsatz von Methanol verwertenden Bakterien
CA2519912A1 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Monsanto Technology Llc Regulatory regions that promote early plant seed enhanced transcription
JP2005021154A (ja) * 2003-06-11 2005-01-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
US8338141B2 (en) * 2003-07-08 2012-12-25 Novus International, Inc. Methionine recovery processes
RU2276687C2 (ru) 2003-07-16 2006-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-гистидина и способ получения l-гистидина
JP4923573B2 (ja) * 2003-07-16 2012-04-25 味の素株式会社 変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ及びｌ−システインの製造法
RU2276688C2 (ru) * 2003-08-29 2006-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia,- ПРОДУЦЕНТ L-ГИСТИДИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГИСТИДИНА
RU2275425C2 (ru) * 2003-11-03 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина
US20050176033A1 (en) * 2003-11-10 2005-08-11 Klyachko Elena V. Mutant phosphoribosylpyrophosphate synthetase and method for producing L-histidine
RU2275424C2 (ru) * 2003-12-05 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia
US20050181488A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 Akhverdian Valery Z. Method for producing L-threonine using bacteria belonging to the genus Escherichia
CN101111602B (zh) 2004-10-07 2012-07-04 味之素株式会社 生产碱性物质的方法
US7915018B2 (en) * 2004-10-22 2011-03-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family
KR100768748B1 (ko) 2004-12-30 2007-10-19 씨제이 주식회사 외래의 ｎａｄｐ 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나제 유전자를 포함하는 에세리키아 종 또는코리네박리움 종 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을생산하는 방법
US20070212764A1 (en) * 2005-01-19 2007-09-13 Ptitsyn Leonid R Method for producing l-amino acids using bacterium of the enterobacteriaceae family
WO2006089950A2 (en) 2005-02-26 2006-08-31 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
US7326546B2 (en) * 2005-03-10 2008-02-05 Ajinomoto Co., Inc. Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance
JP5583311B2 (ja) * 2005-03-10 2014-09-03 味の素株式会社 プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法
DE102005017508A1 (de) * 2005-04-15 2006-10-19 Basf Ag Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus einer Fermentationsbrühe II
ATE552343T1 (de) 2005-04-19 2012-04-15 Basf Plant Science Gmbh Endosperm-spezifische expression und/oder expression in keimenden embryos monokotyledoner pflanzen
AU2006237346B2 (en) 2005-04-20 2011-04-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
US7790873B2 (en) 2005-05-10 2010-09-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
JP2007185184A (ja) * 2005-12-16 2007-07-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
EP1976994A1 (en) * 2006-01-26 2008-10-08 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of enterobacteriaceae family with attenuated expression of the aldh gene
EP1979486B1 (en) 2006-01-30 2013-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009089603A (ja) 2006-02-02 2009-04-30 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性細菌を用いたｌ−リジンの製造法
JP2009095237A (ja) * 2006-02-02 2009-05-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2186881B1 (en) 2006-03-23 2014-04-23 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA
JP2009153382A (ja) 2006-03-30 2009-07-16 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法
JP2009060791A (ja) 2006-03-30 2009-03-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
AU2007238228A1 (en) * 2006-04-13 2007-10-25 Ambrozea, Inc. Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
US7309602B2 (en) * 2006-04-13 2007-12-18 Ambrozea, Inc. Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
US20070243235A1 (en) * 2006-04-13 2007-10-18 David Peter R Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
US20070244719A1 (en) * 2006-04-13 2007-10-18 David Peter R Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
EP2007873B1 (en) 2006-04-18 2015-11-18 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2021458A1 (en) 2006-05-23 2009-02-11 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
RU2337961C2 (ru) * 2006-07-04 2008-11-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН rspAB
JP5407858B2 (ja) * 2006-07-19 2014-02-05 味の素株式会社 腸内細菌科の細菌を用いたｌ−アミノ酸の製造方法
JP5315600B2 (ja) * 2006-09-05 2013-10-16 味の素株式会社 γ−グルタミルシステイン生産酵母とその利用
RU2355763C2 (ru) 2006-09-13 2009-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная ацетолактатсинтаза и способ продукции разветвленных l-аминокислот
JP5756259B2 (ja) * 2006-09-15 2015-07-29 シージェイ チェイルジェダン コーポレイション Ｌ−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたｌ−リジン生産方法
JP2010017081A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2008072761A2 (en) * 2006-12-11 2008-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an l-amino acid
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
RU2006145712A (ru) * 2006-12-22 2008-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина
CN101627110B (zh) 2007-01-22 2014-08-13 味之素株式会社 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法
KR100830826B1 (ko) 2007-01-24 2008-05-19 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
BRPI0808008B1 (pt) 2007-02-16 2016-08-09 Basf Plant Science Gmbh molécula de ácido nucleico isolada, cassete de expressão, vetor de expressão, métodos para excisão de sequências alvo de uma planta, para produzir uma planta com rendimento aumentado, e/ou tolerância a estresse aumentada, e/ou qualidade nutritional aumentada, e/ou teor de óleo aumentado ou modificado de uma semente ou broto para a planta, e, uso da molécula de ácido nucleico
JP2010110217A (ja) * 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010226956A (ja) * 2007-07-23 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
JP2010263790A (ja) * 2007-09-04 2010-11-25 Ajinomoto Co Inc アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
CN101939412B (zh) 2007-09-04 2016-01-20 味之素株式会社 生产氨基酸的微生物以及氨基酸的生产方法
RU2395579C2 (ru) * 2007-12-21 2010-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
RU2396336C2 (ru) 2007-09-27 2010-08-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
KR20100120663A (ko) 2008-01-23 2010-11-16 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-아미노산의 제조법
KR100987281B1 (ko) 2008-01-31 2010-10-12 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
US8268597B2 (en) 2008-03-03 2012-09-18 Global Bio-Chem Technology Group Company Limited Recombinant microorganism and method for producing L-lysine
KR101126041B1 (ko) 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
JP4963488B2 (ja) * 2008-04-23 2012-06-27 トヨタ自動車株式会社 変異体酵母及びこれを用いた物質生産方法
CN102177246B (zh) 2008-09-08 2015-02-11 味之素株式会社 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法
JP5504608B2 (ja) * 2008-10-23 2014-05-28 東レ株式会社 １，５−ペンタンジアミンの製造方法
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2008148283A (ru) 2008-12-09 2010-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА artI
KR20110104492A (ko) 2008-12-12 2011-09-22 메타볼릭스 인코포레이티드 폴리（5ｈｖ）및 5 탄소 화학물질의 생산을 위한 녹색 공정 및 조성물
JP2010142200A (ja) 2008-12-22 2010-07-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
WO2010084995A2 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid
JP5521347B2 (ja) 2009-02-16 2014-06-11 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
US20120036593A1 (en) 2009-04-17 2012-02-09 Basf Plant Science Company Gmbh Plant Promoter Operable in Endosperm and Uses Thereof
WO2011003901A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants
WO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 味の素株式会社 Ｌ-アミノ酸の製造法
JP2012196144A (ja) 2009-08-03 2012-10-18 Ajinomoto Co Inc ビブリオ属細菌を用いたｌ−リジンの製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2009136544A (ru) 2009-10-05 2011-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-цистеина с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae
JP2013013329A (ja) * 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
AU2010325720A1 (en) 2009-12-03 2012-07-19 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for embryo-specific expression in plants
RU2010101135A (ru) 2010-01-15 2011-07-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Бактерия семейства enterobacteriaceae - продуцент l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
EP2363489A1 (en) * 2010-03-03 2011-09-07 Technische Universität Hamburg-Harburg Enzyme Aspartokinase III having a reduced L-lysine feedback inhibition
CN102191227B (zh) * 2010-03-04 2013-10-09 中国科学院上海生命科学研究院 一种二氢吡啶二羧酸合成酶
US8839078B2 (en) * 2010-03-05 2014-09-16 Samsung Electronics Co., Ltd. Application layer FEC framework for WiGig
RU2010122646A (ru) 2010-06-03 2011-12-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия генов, кодирующих транспортер лизина/аргинина/орнитина
RU2471870C2 (ru) 2010-06-03 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
RU2626531C2 (ru) 2010-10-28 2017-07-28 Адиссео Франс С.А.С. Способ получения 2,4-дигидроксимасляной кислоты
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CN102191289B (zh) * 2011-03-18 2012-08-15 宁夏伊品生物科技股份有限公司 赖氨酸的发酵制备
RU2496867C2 (ru) 2011-04-25 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии
CN102286505B (zh) * 2011-05-26 2013-04-03 江南大学 用于发酵生产l-缬氨酸的重组dna、菌株及方法
CN102234667B (zh) * 2011-06-08 2012-08-15 宁夏伊品生物科技股份有限公司 赖氨酸的三级发酵制备
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
JP2015013812A (ja) 2011-11-01 2015-01-22 味の素株式会社 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法
RU2012112651A (ru) 2012-04-02 2013-10-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") САМОИНДУЦИРУЕМАЯ ЭКСПРЕССИОННАЯ СИСТЕМА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛЕЗНЫХ МЕТАБОЛИТОВ С ПОМОЩЬЮ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
RU2550269C2 (ru) 2012-08-17 2015-05-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, СОДЕРЖАЩЕЙ N-АЦЕТИЛОРНИТИНДЕАЦЕТИЛАЗУ С НАРУШЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ
CN104884462A (zh) 2012-10-29 2015-09-02 共晶制药股份有限公司 用于治疗病毒感染和癌症的嘧啶核苷及其单磷酸酯前药
CN103805626B (zh) * 2012-11-07 2017-07-18 宁夏伊品生物科技股份有限公司 发酵制备赖氨酸盐的方法及其产品
CN102911976B (zh) * 2012-11-07 2013-10-16 宁夏伊品生物科技股份有限公司 发酵制备中纯度赖氨酸硫酸盐的方法
CN103215286B (zh) * 2012-11-12 2015-11-25 江南大学 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
EP2868745B1 (en) 2013-05-13 2017-06-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for manufacturing an L-amino acid
US20150079650A1 (en) * 2013-06-05 2015-03-19 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms exhibiting increased flux through a fermentation pathway
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
ES2761596T3 (es) 2013-10-02 2020-05-20 Ajinomoto Kk Aparato de control de amoniaco y método de control de amoniaco
WO2015060314A1 (ja) 2013-10-21 2015-04-30 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
BR112016008830B1 (pt) 2013-10-23 2023-02-23 Ajinomoto Co., Inc Método para produzir uma substância alvo
RU2013147882A (ru) 2013-10-28 2015-05-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕН ПУТЬ ДЕГРАДАЦИИ ПУТРЕСЦИНА
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2015114955A (ru) 2015-04-22 2016-11-10 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-изолейцина с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой сверхэкспрессирован ген cycA
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
EP3420096A1 (en) 2016-02-25 2019-01-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
BR112019007806B1 (pt) 2016-10-26 2022-08-16 The Procter & Gamble Company Composição bucal de múltiplas fases para a liberação de agentes ativos para tratamento bucal
KR101863456B1 (ko) * 2016-11-15 2018-06-01 씨제이제일제당 (주) L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 생산방법
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
KR102011994B1 (ko) * 2017-06-30 2019-08-20 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법
WO2019130723A1 (en) 2017-12-26 2019-07-04 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing glycine by fermentation
JP2021521897A (ja) 2018-05-04 2021-08-30 味の素株式会社 パントエア属細菌を用いたｌ−メチオニンの製造方法
EP3856918A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-methionine using a bacterium
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
WO2020138178A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing basic l-amino acids or salts thereof by fermentation of an enterobacteriaceae bacterium
BR112021014194A2 (pt) 2019-02-22 2021-12-28 Ajinomoto Kk Método para a produção de um l-aminoácido
JP2020162549A (ja) 2019-03-29 2020-10-08 味の素株式会社 制御装置、制御方法およびプログラムならびに有機化合物の製造方法
BR112021017870A2 (pt) 2019-04-05 2021-12-07 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
CA3136733A1 (en) 2019-04-25 2020-10-29 The Procter & Gamble Company Oral care compositions for active agent delivery
US11096874B2 (en) 2019-04-25 2021-08-24 The Procter & Gamble Company Rinseable multi-phase compositions
WO2021060438A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation
CN114134095B (zh) * 2022-01-28 2022-06-17 清华大学 一种利用嗜盐细菌生产l-赖氨酸和/或1,5-戊二胺的方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU875663A1 (ru) 1978-06-30 1982-09-15 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени
JPS5618596A (en) 1979-07-23 1981-02-21 Ajinomoto Co Inc Production of l-lysine through fermentation process
JPH0746994B2 (ja) * 1984-10-04 1995-05-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
FR2627508B1 (fr) 1988-02-22 1990-10-05 Eurolysine Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede
US5258300A (en) * 1988-06-09 1993-11-02 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Method of inducing lysine overproduction in plants
US5175107A (en) 1988-10-25 1992-12-29 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of escherichia coli bkiim b-3996 as the producer of l-threonine
DE3943117A1 (de) * 1989-12-27 1991-07-04 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna
EP0485970A3 (en) * 1990-11-13 1992-07-01 Yeda Research And Development Company Limited Transgenic plants overproducing threonine and lysine
EP0488424B1 (en) 1990-11-30 1997-03-05 Ajinomoto Co., Inc. Recombinant DNA sequences encoding feedback inhibition released enzymes, plasmids comprising the recombinant DNA sequences, transformed microorganisms useful in the production of aromatic amino acids, and a process for preparing aromatic amino acids by fermentation
KR920008382B1 (ko) 1990-12-31 1992-09-26 제일제당 주식회사 재조합 대장균에 의한 라이신 제조방법
DK1394257T3 (da) * 1992-03-19 2007-12-10 Du Pont Nukleinsyrefragmenter og fremgangsmåder til forögelse af lysin- og threonin-indholdet i fröene fra planter
US5661012A (en) * 1992-11-10 1997-08-26 Ajinomoto Co., Inc. Method for the production of L-threonine by fermentation, using mutated DNA encoding aspartokinase III
US5545545A (en) * 1993-04-27 1996-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Lysine-insensitive maize dihydrodipicolinic acid synthase

Also Published As

Publication number Publication date
PL181614B1 (en) 2001-08-31
HU9601535D0 (en) 1996-07-29
AU690168B2 (en) 1998-04-23
KR100345592B1 (ko) 2002-11-29
CA2178589C (en) 2005-08-23
ES2322350T3 (es) 2009-06-19
CN100384984C (zh) 2008-04-30
JPH07155184A (ja) 1995-06-20
CN1142856A (zh) 1997-02-12
JP3132497B2 (ja) 2001-02-05
SK71396A3 (en) 1997-01-08
DE69434245D1 (de) 2005-03-03
CZ166796A3 (en) 1997-01-15
JP2926990B2 (ja) 1999-07-28
EP1477565B1 (en) 2009-02-18
EP0733710A1 (en) 1996-09-25
DE69435191D1 (de) 2009-04-02
PE10496A1 (es) 1996-04-16
US6040160A (en) 2000-03-21
EP0733710B1 (en) 2005-01-26
HUT74961A (en) 1997-03-28
RU2204605C2 (ru) 2003-05-20
JPH11285381A (ja) 1999-10-19
ATE423206T1 (de) 2009-03-15
JP3132487B2 (ja) 2001-02-05
RU2202614C2 (ru) 2003-04-20
ES2235169T3 (es) 2005-07-01
CN1125176C (zh) 2003-10-22
DE69434245T2 (de) 2005-10-13
EP2017348A1 (en) 2009-01-21
AU1077095A (en) 1995-06-27
ATE287961T1 (de) 2005-02-15
CA2178589A1 (en) 1995-06-15
MY133278A (en) 2007-10-31
EP1477565A1 (en) 2004-11-17
AU690168C (en) 1995-06-27
CN1475561A (zh) 2004-02-18
JPH11192088A (ja) 1999-07-21
WO1995016042A1 (fr) 1995-06-15
EP0733710A4 (en) 1999-09-08
DK1477565T3 (da) 2009-03-30
PL314852A1 (en) 1996-09-30
SK280629B6 (sk) 2000-05-16
CZ291730B6 (cs) 2003-05-14
KR960706562A (ko) 1996-12-09
BR9408288A (pt) 1997-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU219608B (hu) Eljárás L-lizin fermentációval történő előállítására
RU2351653C2 (ru) Бактерия, продуцирующая l-аминокислоту, и способ получения l-аминокислоты
AU725935B2 (en) A method of producing L-amino acid
US5661012A (en) Method for the production of L-threonine by fermentation, using mutated DNA encoding aspartokinase III
US7723081B1 (en) Bacteria containing aspartate-semialdehyde dehydrogenase, phosphoenolpyruvate carboxylase, and transhydrogenase to produce L-lysine in escherichia, and methods of using same
US5989875A (en) Method of process for producing L-lysine by fermentation
EP1020526A2 (en) Process for producing L-Threonine by fermentation
MXPA97010044A (en) Method to produce l-lysine by means of fermentation