ES2235169T3 - Procedimiento para la produccion de -lisina mediante fermentacion. - Google Patents

Abstract

UNA BACTERIA QUE PERTENECE A LA ESPECIE ESCHERICHIA, QUE ES TRANSFORMADA MEDIANTE LA INTRODUCCION, EN SUS CELULAS, DE UN ADN DE CODIFICACION DE UNA SINTASA DE DIHIDRODIPICOLINATO QUE SE ORIGINA A PARTIR DE UNA BACTERIA QUE PERTENECE A LA ESPECIE ESCHERICHIA QUE TIENE MUTACION PARA DESENSIBILIZAR LA INHIBICION DE ALIMENTACION POR L-LISINA Y UN ADN QUE CODIFICA UNA ASPARTOCINASA III QUE SE ORIGINA A PARTIR DE UNA BACTERIA QUE PERTENECE A LA ESPECIE ESCHERICHIA QUE TIENE MUTACION PARA DESENSIBILIZAR LA INHIBICION DE REALIMENTACION POR L-LISINA; PREFERIBLEMENTE UNA BACTERIA QUE PERTENECE A LA ESPECIE ESCHERICHIA EN LA QUE UN GEN DE REDUCTASA DE DIHIDRODIPICOLINATO Y UN GEN DE DEHIDROGENASA DE DIAMINOPIMELATO QUE SE ORIGINA A PARTIR DE BREVIBACTERIUM LACTOFERMENTUM (O UN GEN DE TRANSAMINASA SUCCINILDIAMINOPIMELATO Y UN GEN DE DEACILASA DE SUCCINILDIAMINOPIMELATO) SON TAMBIEN MEJORADOS, SE CULTIVA EN UN MEDIO APROPIADO, SE PRODUCE L-LISINA Y SE ACUMULA EN UN CULTIVO DE LA MISMA, Y LA L-LISINA SERECOGE DEL CULTIVO.

Description

Procedimiento para la producción de L-lisina mediante fermentación.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la industria microbiana, y en particular a un procedimiento para producir L-lisina mediante fermentación, al ADN así como a los microorganismos a utilizar para dicho procedimiento de producción.

Antecedentes de la técnica

En la técnica anterior, cuando la L-lisina es producida mediante un procedimiento de fermentación, una cepa microbiana que se separa del entorno natural o una cepa mutante artificial obtenida de dicha cepa microbiana se utiliza para mejorar la productividad. Se conocen un gran número de cepas mutantes artificiales que producen L-lisina. La mayoría de ellas son cepas mutantes resistentes a la S-2-aminoetilcisteína (AEC) y pertenecen a los géneros Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus o Escherichia. Además, se han dado a conocer varias técnicas para aumentar la producción de aminoácidos, por ejemplo, empleando un transformante utilizando ADN recombinante (patente US nº 4.278.765).

Respecto a aquéllos que pertenecen al género Escherichia, por ejemplo la Solicitud abierta a la inspección pública de la patente japonesa nº 56-18596, patente US nº 4.346.170, y Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227-231, (1982), describe los procedimientos de producción de L-lisina utilizando una cepa bacteriana en los que se potencia la dihidrodipicolinato sintasa (abreviada a veces en lo sucesivo como "DDPS"). Sin embargo, la DDPS utilizada en estos casos es de un tipo salvaje, que sufre inhibición retroactiva por la L-lisina. Así, no se ha obtenido una producción de L-lisina suficientemente satisfactoria. A propósito, Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227-231 (1982) mencionado anteriormente, describe una producción de L-lisina de 3 g/l de clorhidrato de L-lisina a partir de 75 g/l de glucosa, en la que un coeficiente de consumo (número de g de L-lisina producidos a partir de 1 g de azúcar, o su porcentaje), se calcula que es de 0,04, o del 4%.

Por otra parte, la publicación de la patente coreana nº 92-8382 describe un procedimiento para producir L-lisina utilizando una bacteria que pertenece a Escherichia en la que se introduce la DDPS que proviene de una bacteria que pertenece al género Corynebacterium, de la que se sabe que no está sometida a retroacción inhibitoria por la L-lisina (coeficiente de consumo: 17%). Sin embargo, la temperatura límite superior para el crecimiento de las bacterias que pertenecen al género Corynebacterium es más baja que la temperatura límite superior para el crecimiento de bacterias que pertenecen al género Escherichia en unos 10 grados aproximadamente. Así, parece que el cultivo debe realizarse a una temperatura de cultivo que haya disminuido si el ADN que codifica a DDPS que proviene de una bacteria que pertenece al género Corynebacterium, se introduce en una bacteria que pertenece al género Escherichia, con objeto de utilizarlo para la producción de L-lisina. Por tanto, se anticipa que es difícil exhibir ventajas de la bacteria que pertenece al género Escherichia, es decir, que la temperatura de crecimiento es alta, la velocidad de crecimiento es rápida, y la velocidad de producción de la L-lisina también es rápida. Generalmente, cuando un gen que proviene de un organismo heterólogo se expresa, se produce ocasionalmente la descomposición de un producto de expresión por la proteasa y la formación de un cuerpo de inclusión insoluble, anticipándose más dificultades cuando se compara con el caso de expresión de un gen homólogo. Además, cuando el ADN que codifica la DDPS que proviene de una bacteria que pertenece al género Corynebacterium, se introduce en una bacteria que pertenece al género Escherichia para producir industrialmente L-lisina, es obligatoria una regulación más estricta que cuando se compara con la utilización de un recombinante en el que se introduce un gen homólogo, de acuerdo con las directrices del ADN recombinante.

En este sentido, la dihidrodipicolinato sintasa (DDPS) es una enzima para deshidratar y condensar el aspartosemialdehído y el ácido pirúvico para sintetizar el ácido dihidrodipicolínico. Esta reacción se localiza al ingresar en una ramificación para continuar a un sistema biosintético de la L-lisina en la biosíntesis de los aminoácidos de la familia del ácido aspártico. Se sabe que este enzima se ocupa de un sitio regulatorio importante como es la aspartoquinasa en las bacterias que pertenecen al género Escherichia.

DDPS es codificado por un gen denominado dapA en E. coli (Escherichia coli). El dapA se ha clonado, y su secuencia nucleótida también se ha determinado (Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)).

Por otra parte, la aspartoquinasa (que en lo sucesivo, en esta memoria, se abrevia a veces como "AK"), es una enzima que cataliza una reacción para convertir el ácido aspártico en el ácido \beta-fosfoaspártico, que sirve como una enzima regulatoria principal en un sistema biosintético de aminoácidos de la familia del ácido aspártico. AK de E. coli posee tres tipos (AKI, AKII, AKIII), dos de los cuales son enzimas complejas con homoserina deshidrogenasa (que en lo sucesivo, se abrevia a veces como "HD"). Una de las enzimas complejas es AKI-HDI, codificada por un gen thrA, y la otra es AKII-HDII, codificada por un gen metLM. AKI está sometida a supresión concertada por la treonina y la isoleucina, y está inhibido por la treonina, mientras que AKII está sometida a supresión por la metionina.

Por el contrario, se sabe que sólo AKIII es una enzima funcional simple, que es un producto de un gen denominado como lysC, y que está sometido a supresión y retroinhibición por la L-lisina. La proporción de sus actividades intracelulares es AKI:AKII:AKIII=alrededor de 5:1:4.

Tal como se ha descrito anteriormente, el DDPS que proviene de las bacterias que pertenecen al género Corynebacterium, no está sujeto a retroinhibición por la L-lisina. Sin embargo, cuando se introduce en una bacteria que pertenece al género Escherichia, para utilizarlo para la producción de la L-lisina, surge un problema en la temperatura del cultivo. Se espera que la L-lisina pueda ser producida eficientemente por fermentación, utilizando una bacteria que pertenezca al género Escherichia, si una enzima mutante de DDPS o AKIII que proviene de una bacteria que pertenece al género Escherichia, que no está sometido a la retroinhibición por la L-lisina, puede ser obtenido. Sin embargo, no existe literatura precedente que describa dicho enzima mutante de DDPS, y aunque existe un informe sobre una enzima mutante de AKIII (Boy, E., et al., J.Bacteriol., 112, 84 (1972)), no se ha sabido de ningún ejemplo que sugiera que dicho enzima mutante pueda mejorar la productividad de la L-lisina.

Exposición de la invención

La presente invención se ha llevado a cabo tomando en consideración los puntos de vista anteriormente mencionados, un objeto de la cual es la obtención de DDPS y AKIII que se originen de bacterias que pertenezcan al género Escherichia con una retroinhibición suficientemente desensibilizada por la L-lisina, y proporcionar un procedimiento para la producción de L-lisina mediante fermentación, que mejore el de la técnica anterior.

Como resultado de diligentes y repetidas investigaciones, con vistas a alcanzar el objetivo anteriormente descrito, los presentes inventores han tenido éxito en la obtención de un ADN que codifica una dihidrodipicolinato sintasa que proviene de una bacteria que pertenece al género Escherichia que presenta una mutación seleccionada del grupo, que consiste en una mutación para reemplazar un residuo de alanina en el lugar 81 con un residuo de valina, en una mutación para reemplazar un residuo de histidina en el lugar 118 con un residuo de tirosina, y una mutación para reemplazar el residuo de alanina en el lugar 81 con el residuo de valina y el residuo de histidina en el lugar 118 con el residuo de tirosina, que se cuentan a partir del N-terminal en una secuencia aminoácida de la dihidrodipicolinato sintasa definida en SEC. ID. nº:3 en el Listado de Secuencias. Al ADN que codifica DDPS que proviene de E. coli y que presenta tal mutación se hace referencia a veces en la presente memoria como mutante dapA o dapA*.

Los inventores han creado además una bacteria que pertenece al género Escherichia que alberga al dapA mutante y la aspartoquinasa, en la que la retroinhibición por la L-lisina está desensibilizada. Al ADN que codifica la aspartoquinasa que proviene de E. coli en el que la retroinhibición por la L-lisina está suficientemente desensibilizada, se hace referencia a veces en la presente memoria como mutante lysC o lysC*.

Los inventores han creado además una bacteria que pertenece al género Escherichia que alberga el mutante dapA y el mutante lysC. Y se ha encontrado que una cantidad considerable de la L-lisina puede producirse y acumularse en un cultivo, en un medio preferido, de las bacterias anteriormente mencionadas que pertenecen al género Escherichia.

Los inventores han encontrado además que la productividad de la L-lisina puede mejorarse posteriormente potenciando otros genes en el sistema biosintético de la L-lisina de una bacteria que pertenezca al género Escherichia que alberga el mutante dapA y el mutante lysC.

Es decir, la presente invención se basa en un ADN que codifica una dihidrodipicolinato sintasa que se origina a partir de una bacteria que pertenece al género Escherichia que presenta mutación para desensibilizar la retroinhibición por la L-lisina. La mutación es seleccionada del grupo formado por una mutación para reemplazar un residuo de alanina en el puesto 81 con un residuo de valina, una mutación para reemplazar un residuo de histidina en el puesto 118 con un residuo de tirosina y una mutación para reemplazar el residuo de alanina en el lugar 81 con el residuo de valina y el residuo de histidina en el lugar 118 con el residuo de tirosina, que se cuentan a partir del N-terminal en una secuencia aminoácida de la dihidrodipicolinato sintasa definida en SEC. ID. nº:4 en el Listado de Secuencias.

La presente invención se basa además en una bacteria que pertenece al género Escherichia, transformada mediante la introducción en sus células, de un ADN que codifica una dihidrodipicolinato sintasa que proviene de una bacteria que pertenece al género Escherichia que presenta una mutación seleccionada del grupo formado por una mutación para reemplazar un residuo de alanina en el puesto 81 con un residuo de valina, una mutación para reemplazar un residuo de histidina en el puesto 118 con un residuo de tirosina y una mutación para reemplazar el residuo de alanina en el lugar 81 con el residuo de valina y el residuo de histidina en el lugar 118 con el residuo de tirosina, que se cuentan a partir del N-terminal en una secuencia aminoácida de la dihidrodipicolinato sintasa definida en SEC. ID. nº:4 en el Listado de Secuencias.

La presente invención se basa además en una bacteria que pertenece al género Escherichia, que alberga una dihidrodipicolinato sintasa y una aspartoquinasa que son desensibilizadas respecto a la retroacción inhibitoria mediante la L-lisina. Un procedimiento que permita que las bacterias que pertenecen al género Escherichia alberguen una aspartoquinasa que presente una retroinhibición desensibilizada por la L-lisina, se pone como ejemplo mediante un procedimiento para introducir, en sus células, un ADN que codifique una aspartoquinasa III que se origina a partir de una bacteria que pertenece al género Escherichia y en el cual la retroinhibición mediante L-lisina se desensibiliza.

La mutación de la aspartoquinasa III para desensibilizar la retroinhibición por la L-Lisina se ejemplifica por una mutación para reemplazar a un residuo de glicina en posición 323 con un residuo de ácido aspártico, una mutación para reemplazar el residuo de glicina en posición 323 con el residuo de ácido aspártico y reemplazar un residuo de glicina en posición 408 con un residuo de ácido aspártico, una mutación para reemplazar un residuo de arginina en el lugar 34, con un residuo de cisteína y reemplazar el residuo de glicina en posición 323 con el residuo de ácido aspártico, una mutación para reemplazar un residuo de leucina en el lugar 325, con un residuo fenilalanina y una mutación para reemplazar un residuo de metionina en posición 318 con un residuo de isoleucina, una mutación para reemplazar un residuo de metionina en el lugar 318, con el residuo de isoleucina y reemplazar un residuo de valina en posición 349 con un residuo de metionina, una mutación para reemplazar a un residuo de serina en posición 345 con un residuo de leucina, una mutación para reemplazar un residuo de valina en posición 347 con un residuo de metionina, una mutación para reemplazar un residuo de treonina en el lugar 352, con un residuo de isoleucina, una mutación para reemplazar el residuo de treonina en posición 352 con un residuo de isoleucina y reemplazar un residuo de serina en el lugar 369, con un residuo de fenilalanina, una mutación para reemplazar un residuo de ácido glutámico en posición 164 con un residuo de lisina, y una mutación para reemplazar un residuo de metionina en el lugar 417, con un residuo de isoleucina y reemplazar un residuo de cisteína en posición 419 con un residuo de tirosina, que se cuentan a partir del N-terminal en una secuencia aminoácida de la aspartoquinasa III definida en SEC. ID. nº:8 en el Listado de Secuencias.

El ADN que codifica una dihidrodipicolinato sintasa que se origina a partir de una bacteria que pertenece al género Escherichia que posee una mutación para desensibilizar la retroinhibición mediante la L-lisina, y el ADN que codifica una aspartoquinasa III que posee una mutación para desensibilizar la retroinhibición mediante la L-lisina, puede albergarse, respectivamente, en un cromosoma de una bacteria que pertenece al género Escherichia, o en células en un plásmido idéntico o en plásmidos separados. Además, también es aceptable que uno de los ADN respectivos se alberga en un cromosoma, y el otro ADN se alberga en un plásmido.

La presente invención se basa, además, en la bacteria anteriormente mencionada que pertenece al género Escherichia, en la que se potencia un gen de la dihidrodipicolinato reductasa. Esta potenciación del gen de la dihidrodipicolinato reductasa puede obtenerse mediante transformación con un ADN recombinante, construido uniendo el gen de la dihidrodipicolinato reductasa con un vector capaz de replicarse autónomamente en células de bacterias que pertenecen al género Escherichia.

La presente invención se basa además en la bacteria anteriormente mencionada que pertenece al género Escherichia en la que se introduce un gen potenciado de la diaminopimelato deshidrogenasa que se origina a partir de bacterias corineformes tales como Brevibacterium lactofermentum. La introducción del gen potenciado de la diaminopimelato deshidrogenasa que se origina a partir de las bacterias corineformes, puede alcanzarse mediante transformación con un ADN recombinante construido uniendo el gen con un vector capaz de replicarse autónomamente en células de bacterias que pertenecen al género Escherichia. Como en las bacterias corineformes, pueden ponerse como ejemplo cepas de tipo salvaje que producen ácido glutámico, y sus cepas mutantes que producen otros aminoácidos, que pertenecen al género Corynebacterium o al género Brevibacterium. Más concretamente, Brevibacterium flavum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium glutamicum y Corynebacterium lilium, así como Brevibacterium lactofermentum pueden ponerse como ejemplos de las bacterias corineformes utilizadas para la presente invención.

La presente invención se basa además en la bacteria que pertenece al género Escherichia, en la que la actividad de una enzima codificada por dapD y la actividad de una enzima codoficada por dapE están potenciadas, en vez del gen diaminodipimelato deshidrogenasa anteriormente mencionado. La potenciación de estos genes puede alcanzarse mediante transformación con un único ADN recombinante o dos ADN recombinantes construidos uniendo estos genes con un vector idéntico o vectores diferentes capaces de replicarse autónomamente en células de bacterias que pertenezcan al género Escherichia.

La presente invención proporciona además un procedimiento para producir L-lisina, que comprende las etapas de cultivo de cualquiera de las bacterias que pertenecen al género Escherichia descrito anteriormente, en un medio apropiado, la producción y acumulación de la L-lisina en su cultivo, y la recuperación de la L-lisina a partir de éste.

En esta memoria, al ADN que codifica DDPS o AKIII, ó al ADN que contiene un promotor añadido, se hace referencia como "gen DDPS" ó "gen AKIII". Además, al enzima mutante en el que es desensibilizada la retroinhibición mediante la L-lisina y al ADN que lo codifica ó al ADN que contiene además un promotor, se les hace referencia simplemente como "enzima mutante" y "gen mutante", respectivamente. Además, la frase "la retroinhibición mediante la L-lisina es desensibilizada" significa que la desensibilización sustancial de la inhibición es suficiente, no siendo necesaria la desensibilización completa.

La presente invención se explicará detalladamente a continuación.

<1> ADN que codifica la dihidrodipicolinato sintasa mutante (DDPS) de la presente invención

El ADN que codifica el DDPS mutante de la presente invención es desensibilizado en inhibición retroactiva mediante la L-lisina de la DDPS codificada en el ADN que codifica la DDPS de tipo salvaje. Son ejemplo de DDPS las que provienen de las bacterias que pertenecen al género Escherichia, especialmente las DDPS que provienen de E. coli. La mutación de DDPS para desensibilizar la retroinhibición (o inhibición retroactiva) mediante la L-lisina, se selecciona a partir de:

(1)

mutación para reemplazar un residuo de alanina en el lugar 81 con un residuo de valina;

(2)

mutación para reemplazar un residuo de histidina en el lugar 118 con un residuo de tirosina; y

(3)

mutación para reemplazar el residuo de alanina del lugar 81 con el residuo de valina y reemplazo del residuo de histidina del lugar 118 con el residuo de tirosina; las cuales mutaciones se cuentan a partir del N-terminal de DDPS en una secuencia aminoácida de la DDPP definida en SEC. ID. nº:4 en el Listado de Secuencias.

El ADN que codifica la DDPS de tipo salvaje no está especialmente limitado, con tal que codifique la DDPS que se origina a partir de una bacteria que pertenece al género Escherichia, que está ejemplificada concretamente por el ADN que codifica una secuencia aminoácida definida en SEC ID nº:4, y es ejemplificada concretamente además por una secuencia representada por las bases 272-1147 en la secuencia de bases definida en la SEC ID nº:3. En estas secuencias, las que presentan la mutación en la secuencia nucleótida para provocar el reemplazamiento de los residuos aminoácidos descritos anteriormente, son el ADN que codifica el mutante DDPS de la presente invención. Cualquier codon que corresponda al residuo aminoácido reemplazado es apropiado, con tal que codifique el residuo aminoácido idéntico. Además, se postula que el DDPS poseído es ligeramente diferente en la secuencia, dependiendo de la diferencias en la especie y cepa bacterianas; sin embargo, (las secuencias) que presentan reemplazamiento, deleción o inserción del residuo o residuos aminoácidos en la posición o posiciones irrelevantes para la actividad enzimática, se incluyen también en el gen mutante DDPS de la presente invención.

Un procedimiento para la obtención de dicho gen mutante es el siguiente: En primer lugar, un ADN que contiene un gen DDPS de tipo salvaje o un gen DDPS que presenta otra mutación, se somete a un tratamiento mutacional in vitro, y un ADN después de este tratamiento mutacional se une a un ADN vectorial adaptado a un huésped, para obtener un ADN recombinante. El ADN recombinante se introduce en un microorganismo huésped para obtener transformantes. Cuando uno que expresa un DDPS mutante se selecciona de entre los transformantes anteriormente mencionados, dicho transformante alberga un gen mutante. Alternativamente, un ADN que contiene un gen DDPS de tipo salvaje o un gen DDPS que tiene otra mutación, puede unirse a un ADN vectorial adaptado a un huésped para obtener un ADN recombinante. El ADN recombinante se somete entonces a un tratamiento mutante in vitro, y un ADN recombinante después del tratamiento mutacional, se introduce en un microorganismo huésped para obtener transformantes. Cuando uno que expresa un DDPS mutante se selecciona de entre los transformantes anteriormente mencionados, dicho transformante alberga un gen mutante.

También es aceptable que un microorganismo que produce una enzima de tipo salvaje se someta a un tratamiento mutacional para crear una cepa mutante que produzca una enzima mutante, obteniéndose entonces un gen mutante a partir de la cepa mutante. Alternativamente, un transformante en el cual se introduce un ADN recombinante unido a un gen de tipo salvaje, puede someterse a un tratamiento mutacional para crear una cepa mutante que produzca una enzima mutante. Cuando un ADN recombinante se recupera entonces a partir de la cepa mutante, se crea un gen mutante en el ADN anteriormente mencionado.

Ejemplo de un agente para llevar a cabo el tratamiento mutacional in vitro del ADN, es la hidroxilamina. Ésta constituye un agente químico de tratamiento mutacional que provoca la mutación de citosina a timina cambiando la citosina a la N^{4}-hidroxicitosina. Alternativamente, cuando un mismo microorganismo es sometido a un tratamiento mutacional, el tratamiento se lleva a cabo utilizando la irradiación de luz intravioleta, o un agente mutante utilizado habitualmente para la mutación artificial, tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) o ácido nitroso.

No se producen problemas respecto al microorganismo donador para el ADN que contiene el gen DDPS de tipo salvaje o el gen DDPS que posea otra mutación descrita anteriormente, con tal que sea un microorganismo que pertenezca al género Escherichia. Concretamente, es posible utilizar aquellos descritos en un libro escrito por Neidhardt et al. (Neidhart, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, tabla 1), por ejemplo, una cepa JM109 y una cepa MC1061 de E. coli. Cuando se utiliza una cepa salvaje como microorganismo donante para ADN que contiene un gen DDPS, puede obtenerse un ADN que contenga un gen DDPS de tipo salvaje.

(1) Preparación del gen DDPS de tipo salvaje

Se describirá a continuación un ejemplo de preparación de ADN que contiene un gen DDPS. En primer lugar, se cultiva E. coli que posea dapA de tipo salvaje, por ejemplo, la cepa MC1061, para obtener un cultivo. Cuando el microorganismo descrito anteriormente se cultiva, el cultivo debe realizase según un procedimiento ordinario de cultivo sólido, llevándose a cabo, sin embargo, preferentemente, adoptando un procedimiento de cultivo líquido, considerando la eficacia durante la recuperación de la bacteria. Puede utilizarse un medio en el que una o más fuentes de nitrógeno tales como extracto de levadura, peptona, extracto de carne, maíz empapado de licor y exudado de soja o de trigo se añadan con una o más sales inorgánicas tales como dihidrogenfosfato potásico, hidrogenfosfato dipotásico, sulfato de magnesio, cloruro sódico, cloruro magnésico, cloruro férrico, sulfato férrico o sulfato de manganeso, y a los que se añaden opcional y adecuadamente además, por ejemplo, materiales azucarados y vitaminas. Es apropiado que el pH inicial del medio se ajuste a 6 a 8. El cultivo se lleva a cabo durante 4 a 24 horas a 30 a 42ºC, preferentemente a 37ºC aproximadamente, mediante cultivo profundo con aireación y agitación, agitando el cultivo o el cultivo estacionario.

El cultivo obtenido de este modo se centrifuga, por ejemplo, a 3000 r.p.m. durante 5 minutos para obtener un sedimento celular de la cepa MC1061 de E. coli. El ADN cromosómico puede obtenerse a partir del sedimento celular mediante, por ejemplo, del procedimiento de Saito y Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)), o un procedimiento de K.S. Kirby (Biochem. J. 64, 405 (1956)).

Con objeto de aislar el gen DDPS a partir del ADN cromosómico así obtenido, se prepara una genoteca de ADN cromosómico. En primer lugar, el ADN cromosómico se digiere parcialmente con una enzima de restricción apropiada para obtener una mezcla de varios fragmentos. Puede utilizarse una amplia variedad de enzimas de restricción, si el grado de fragmentación se controla mediante el tiempo de reacción de fragmentación. Por ejemplo, se permite que Sau3AI reaccione sobre el ADN cromosómico a una temperatura no menor de 30ºC, preferentemente a 37ºC con una concentración enzimática de 1 a 10 unidades/ml para varios períodos de tiempo (1 minuto a 2 horas), para digerirlo.

En la próxima etapa, los fragmentos de ADN obtenidos se unen con un ADN vectorial capaz de replicarse autónomamente en las células bacterianas que pertenecen al género Escherichia para preparar el ADN recombinante. Concretamente, una enzima de restricción, que genera la secuencia nucleótida terminal complementaria a la generada por la enzima de restricción Sau3AI utilizado para cortar el ADN cromosómico, por ejemplo, BamHI, se deja que actúe sobre el ADN vectorial bajo una temperatura no menor de 30ºC y con una concentración enzimática de 1 a 100 unidades/ml durante no menos de 1 hora, preferentemente durante 1 a 3 horas para digerirlo completamente, y cortarlo y fragmentarlo. En la próxima etapa, la mezcla de fragmentos del ADN cromosómico obtenida, tal como se describe anteriormente, se mezcla con el ADN vectorial cortado y fragmentado, sobre el que la ADN ligasa, preferentemente la T4 ADN ligasa se deja que actúe a una temperatura de 4 a 16ºC y con una concentración enzimática de 1 a 100 unidades/ml durante no menos de 1 hora, preferentemente durante 6 a 24 horas para obtener el ADN recombinante.

El ADN recombinante obtenido se utiliza para transformar un microorganismo que pertenece al género Escherichia, por ejemplo, una cepa mutante deficiente en DDPS tal como una cepa K-12 de Escherichia coli, preferentemente una cepa JE7627 (ponB704, dacB12, pfv^{+}, tonA2, dapA, lysA; str, malA38, metB1, ilvH611, leuA371, proA3, lac-e, tsx-76) para preparar una genoteca de ADN cromosómico. La transformación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un procedimiento de D.M. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) o un procedimiento en el que las células bacterianas receptoras se tratan con cloruro cálcico para aumentar la permeabilidad del ADN (Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol, 53, 159 (1970)). La cepa JE7627 está disponible en el Instituto Nacional de Genética (Mishima-shi, Shizouka-ken, Japón).

Una cepa bacteriana que posee el ADN recombinante del gen DDPS se obtiene a partir de las cepas con actividad DDPS aumentada o de las cepas en las que la auxotrofía resultante de la deficiencia en el gen DDPS es complementada, entre la genoteca obtenida del ADN cromosómico. Por ejemplo, una cepa mutante deficiente en DDPS requiere ácido diaminopimélico. Así, cuando la cepa mutante deficiente en DDPS se utiliza como huésped, un fragmento del ADN que contiene el gen DDPS puede obtenerse aislando una cepa bacteriana que llegue a ser capaz de crecer en un medio que no contenga ácido diaminopimélico, y recuperando ADN recombinante de la cepa bacteriana.

La confirmación del hecho de que una cepa candidata que posea ADN recombinante que contenga un gen DDPS alberga o no actualmente ADN recombinante en el que el gen DDPS sea clonado, puede obtenerse preparando un extracto celular de la cepa candidata, y preparando una solución enzimática en bruto a partir de este extracto, para confirmar si la actividad DDPS ha aumentado o no. Un procedimiento para medir la actividad enzimática de DDPS puede llevarse a cabo mediante el método de Yugari et al (Yugari, Y. y Gilvarg, C., J. Biol. Chem., 240, 4710 (1962)).

El ADN recombinante en el que el ADN que contiene el gen DDPS se inserta en el ADN vectorial, puede aislarse a partir de la cepa bacteriana descrita anteriormente mediante, por ejemplo, un procedimiento de P.Guerry et al (J.Bacteriol.,116, 1064 (1973)) o un procedimiento de D.B. Clewell (J. Bacteriol., 110, 667 (1972)).

La preparación del gen DDPS de tipo salvaje puede llevarse también a cabo preparando ADN cromosómico a partir de una cepa que tenga un gen DDPS en el cromosoma, mediante un método de Saito y Miura o similar, y simplificando el gen DDPS mediante un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véase White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)). Los iniciadores de ADN que van a utilizarse para la reacción de amplificación son los complementarios a los dos extremos 3' de un ADN bicatenario que contiene una región entera o una región parcial del gen DDPS. Cuando sólo una región parcial del gen DDPS es amplificada, es necesario utilizar dichos fragmentos de ADN como iniciadores para realizar el rastreo de un fragmento de ADN que contenga la región completa de una genoteca de ADN cromosómico. Cuando la región entera del gen DDPS es amplificada, una solución de la reacción PCR que incluya fragmentos de ADN que contengan el gen DDPS amplificado, se somete a electroforesis en gel de agarosa, y entonces se extrae un fragmento deseado del ADN. Así, puede recuperarse un fragmento del ADN que contiene el gen DDPS.

Los iniciadores del ADN pueden prepararse adecuadamente basándose, por ejemplo, en una secuencia conocida en E. coli (Richaud, F. et al., J.Bacteriol., 297 (1986)).

Concretamente, los iniciadores que puedan amplificar una región que comprenda 1150 bases que codifiquen el gen DDPS son preferibles, y son apropiados dos tipos de iniciadores definidos en SEC ID nº:1 y SEC ID nº:2. La síntesis de los iniciadores puede realizarse mediante un procedimiento ordinario tal como el de la fosfoamidita (véase Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)) utilizando un sintetizador de ADN que está disponible comercialmente (por ejemplo, el sintetizador de ADN modelo 380B producido por Applied Biosystems Inc.). Además, la PCR puede llevarse a cabo utilizando un aparato PCR comercialmente disponible (por ejemplo, el Ciclador Térmico de ADN, modelo PJ2000 producido por Takara Shuzo, Co., Ltd), que utiliza ADN polimerasa Taq (suministrado por Takara Shuzo Co., Ltd.) según un procedimiento designado por el proveedor.

Con respecto al gen DDPS amplificado mediante el procedimiento PCR, las operaciones tales como la introducción de la mutación en el gen DDPS resultan fáciles, cuando se une con un ADN vectorial capaz de replicarse autónomamente en células bacterianas que pertenecen al género Escherichia, y se introduce en células bacterianas que pertenecen al género Escherichia. El ADN vectorial que va a utilizarse, el procedimiento de transformación, y el de confirmación respecto a la presencia del gen DDPS, son los mismos que los del procedimiento anteriormente mencionado.

(2) Introducción de la mutación en el gen DDPS

El procedimiento para llevar a cabo una mutación tal como el reemplazamiento, la inserción y la deleción de residuos aminoácidos, se ejemplifica mediante un procedimiento PCR recombinante (Higuchi, R., 61, en PCR Technology
(Erlich, H.A. Eds., Stockton Press (1989))), y un procedimiento de mutagénesis sitio-específica (Kramer, W. y Frits, H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)). La mutación deseada puede provocarse en un sitio deseado mediante estos procedimientos.

Además, según la síntesis química de un gen deseado, es posible introducir la mutación o la mutación al azar en un sitio determinado.

Además, está disponible un procedimiento en el que el gen DDPS en el cromosoma o plásmido se trata directamente con hidroxilamina (Hashimoto, T. y Sekiguchi, M. J. Bacteriol., 159, 1039 (1984)). Alternativamente, es aceptable utilizar un procedimiento en el que una bacteria que pertenece al género Escherichia, que posee el gen DDPS, es irradiada mediante luz ultravioleta, o un procedimiento basado en un tratamiento con un agente químico tal como N-metil-N'-nitrosoguanidina o ácido nitroso. Según estos procedimientos, las mutaciones pueden introducirse al azar.

Respecto a un procedimiento de selección para el gen mutante, el ADN recombinante que comprende un fragmento de ADN que contiene el gen DDPS y el ADN vectorial, se somete directamente en primer lugar a un tratamiento de mutación con hidroxilamina o similar, que se utiliza para transformar, por ejemplo, una cepa W3110 de E. coli. A continuación, las cepas transformadas se cultivan en un medio mínimo tal como M9, que contiene S-2-aminoetilcisteína (AEC) como un análogo de la L-lisina. Cepas que albergan ADN recombinante que contiene el gen DDPS de tipo salvaje, no pueden sintetizar L-lisina y ácido diaminopimélico (DAP) y no crecen, a causa de que el DDPS expresado del ADN recombinante, es inhibido por AEC. Por el contrario, una cepa que alberga ADN recombinante que contiene el gen DDPS en el que la inhibición por la L-lisina es desensibilizada, posee una enzima mutante codificada por el gen DDPS en el ADN recombinante anteriormente mencionado, que no es inhibido por AEC. Así, será capaz de crecer sobre el medio mínimo en el que AEC se añade. Este fenómeno puede utilizarse para seleccionar una cepa que sea resistente en el crecimiento a AEC como un análogo de L-lisina, que es una cepa que alberga ADN recombinante que contiene un gen DDPS mutante en el que la inhibición es desensibilizada.

El gen mutante así obtenido puede introducirse como un ADN recombinante en un microorganismo huésped apropiado, y expresarse. Así, puede obtenerse un microorganismo que alberga DDPS, siendo la retroinhibición desensibilizada. El huésped es preferentemente un microorganismo que pertenece al género Escherichia, para el cual se pone como ejemplo E. coli.

Alternativamente, un fragmento del gen DDPS mutante puede sacarse del ADN recombinante, e insertarse en otro vector para utilizarlo. El ADN vectorial que puede utilizarse en la presente invención es preferentemente un ADN vectorial plasmídico, por ejemplo pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 y pMW218. Además, pueden también utilizarse vectores de ADN fágico.

Además, con objeto de expresar eficientemente el gen DDPS m mutante, otros promotores que actúan en microorganismos tales como lac, trp y PL pueden unirse por encima de una secuencia de ADN que codifica el DDPS mutante, o un promotor contenido en el gen DDPS puede utilizarse como es, o después de amplificar el promotor.

Además, tal como se ha descrito anteriormente, el gen mutante puede insertarse en un ADN vectorial capaz de replicarse autónomamente, que se inserta en un huésped, y al que se le permite ser acogido por éste como ADN extracromosómico, tal como un plásmido. Alternativamente, el gen mutante puede integrarse en el cromosoma de un microorganismo huésped mediante un procedimiento que utiliza la transducción, el transposón (Berg, D.E. y Berg, C.M., Bio/Tecnol., 1, 417 (1983), fago Mu (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública nº 2-109985) o la recombinación homóloga (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)).

<2> ADN que codifica la aspartoquinasa III mutante (AKIII) utilizada para la presente invención

El ADN que codifica la AKIII mutante utilizada para la presente invención posee una mutación para desensibilizar la retroinhibición de la AKIII codificada por la L-lisina en el ADN que codifica la AKIII de tipo salvaje. La mutación para desensibilizar la retroinhibición de la AKIII por la L- lisina tiene como ejemplo:

(a)

mutación para reemplazar un residuo de glicina en el lugar 323 con un residuo de ácido aspártico;

(b)

mutación para reemplazar un residuo de glicina en el lugar 323 con el residuo de ácido aspártico y reemplazar un residuo de glicina en el lugar 408 con un residuo de ácido aspártico;

(c)

mutación para reemplazar un residuo de arginina en el lugar 34 con un residuo de cisteína y reemplazar un residuo de glicina en el lugar 323 con un residuo de ácido aspártico;

(d)

mutación para reemplazar un residuo de leucina en el lugar 325 con un residuo de fenilalamina;

(e)

mutación para reemplazar un residuo de metionina en el lugar 318 con un residuo de isoleucina;

(f)

mutación para reemplazar un residuo de metionina en el lugar 318 con el residuo de isoleucina y reemplazar un residuo de valina en el lugar 349 con un residuo de metionina;

(g)

mutación para reemplazar un residuo de serina en el lugar 345 con un residuo de leucina;

(h)

mutación para reemplazar un residuo de valina en el lugar 347 con un residuo de metionina;

(i)

mutación para reemplazar un residuo de treonina en el lugar 352 con un residuo de isoleucina.

(j)

mutación para reemplazar un residuo de treonina en el lugar 352 con el residuo de isoleucina y reemplazar un residuo de serina en el lugar 369 con un residuo de fenilalanina;

(k)

mutación para reemplazar un residuo de ácido glutámico en el lugar 164 con un residuo de lisina; y

(l)

mutación para reemplazar un residuo de metionina en el lugar 417 con un residuo de isoleucina y reemplazar un residuo de cisteína en el lugar 419 con un residuo de tirosina; las cuales mutaciones se cuentan a partir del N-terminal de AKIII en una secuencia aminoácida de la AKIII definida en SEC. ID. nº:8 en el Listado de Secuencias.

El ADN que codifica la AKIII de tipo salvaje no está especialmente limitado, es, por ejemplo, un ADN que codifica la AKIII que proviene de una bacteria que pertenece al género Escherichia, tal como E. coli. Concretamente, existe un ADN que sirve como ejemplo que codifica una secuencia aminoácida definida en SEC. ID. nº:8, y una secuencia representada por los números de base 584-1930 en una secuencia de bases definida en SEC. ID. nº:7. A propósito, AKIII de E. coli es codificada por un gen lysC.

En estas secuencias, las que presentan mutación en la secuencia de bases para provocar el reemplazamiento de los residuos de aminoácidos descrito anteriormente, son secuencias que codifican un AKIII mutante. Cualquier codón que corresponda al residuo aminoácido reemplazado está disponible, especialmente sin tener en cuenta su clase, a condición de que codifique el residuo aminoácido idéntico. Además, están aquellos en los que las secuencias aminoácidas del AKIII de tipo salvaje son ligeramente diferentes, dependiendo de las diferencias en las especies y cepas bacterianas. Las que muestran reemplazamiento, deleción o inserción del residuo o residuos aminoácidos en posición o posiciones irrelevantes para la actividad enzimática, se incluyen también en el gen mutante AKIII de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia de bases de un gen lysC de tipo salvaje obtenida en el Ejemplo 2 que se describe a continuación (SEC. ID. nº:7) es distinta de una secuencia ya publicada de lysC de una cepa JC411 K-12 de E. coli en 6 sitios (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. y Patte, J.C., J.Biol.Chem., 261 1052 (1986)). Las secuencias aminoácidas codificadas difieren en 2 sitios (en lysC de la cepa JC411, un residuo de glicina en posición 58 es reemplazado con un residuo de cisteína, y un residuo de glicina en el lugar 401, es reemplazado con un residuo de alanina, contadas a partir del N-terminal en una secuencia aminoácida de lysC definida en SEC. ID. nº:8). Se espera incluso para la lysC que tiene la misma secuencia que la de lysC de la cepa JC411 K-12 de E. coli, que la lysC con mutación en la cual la retroinhibición mediante la L-lisina es desensibilizada se obtiene, si se introduce cualquiera de las mutaciones de (a) a (l) anteriormente mencionadas.

Un procedimiento para obtener ADN que codifique el AKIII mutante en el que la retroinhibición por la L-lisina esté desensibilizada, se lleva a cabo de la siguiente manera. En primer lugar, un ADN que contiene un gen AKIII de tipo salvaje o un gen AKIII que posee otra mutación, se somete a un tratamiento mutacional in vitro, y el ADN después de éste se une a un ADN vectorial adaptado a un huésped, para obtener un ADN recombinante. El ADN recombinante se introduce en un microorganismo huésped para obtener transformantes. Cuando uno que expresa un AKIII mutante es seleccionado entre los transformantes anteriormente mencionados, dicho transformante alberga un gen mutante. Alternativamente, un ADN que contiene un gen AKIII de tipo salvaje o un gen AKIII que posee otra mutación, puede unirse con un ADN vectorial adaptado a un huésped para obtener un ADN recombinante. El ADN recombinante se somete entonces a un tratamiento mutacional in vitro y después de éste, un ADN recombinante se introduce en un microorganismo huésped para obtener transformantes. Cuando uno que expresa un AKIII mutante se selecciona entre los transformantes anteriormente mencionados, tal transformante también alberga un gen mutante.

Alternativamente, también es aceptable que un microorganismo que produce una enzima de tipo salvaje se someta a un tratamiento mutacional para crear una cepa mutante que produzca una enzima mutante, obteniéndose entonces un gen a partir de la cepa mutante. El agente para llevar a cabo un tratamiento mutacional directo del ADN tiene como ejemplo la hidroxilamina. Éste es un agente químico de tratamiento mutacional que provoca la mutación de citosina a timina cambiando la citosina a N^{4}-hidroxicitosina. Alternativamente, cuando un microorganismo mismo se somete a un tratamiento de mutación, éste se realiza mediante irradiación de luz ultravioleta, o utilizando un agente mutante que se emplea habitualmente para la mutación artificial, tal como el N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG).

Cualquiera puede utilizarse como un microorganismo donador para el ADN que contenga el gen AKIII de tipo salvaje o el gen AKIII con otra mutación descrita anteriormente, siempre que sea un microorganismo que pertenezca al género Escherichia. Concretamente, es posible utilizar aquellos descritos en un libro escrito por Neidhardt et al. (Neidhart, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, tabla 1). Se toman como ejemplos una cepa JM109 y una cepa MC1061 de E. coli. Cuando el gen AKIII se obtiene de estas cepas, la preparación del ADN cromosómico, la preparación de una genoteca de ADN cromosómico y similares pueden llevarse a cabo de la misma forma que la preparación del gen DDPS descrito anteriormente. Como el huésped que va a utilizarse para la preparación de la genoteca, es preferible utilizar una cepa enteramente deficiente en AKI II y III, tal como una cepa GT3 de E. coli (disponible en el E. coli Genetic Stock Center (Connecticut, Estados Unidos).

A partir de la genoteca de ADN cromosómico obtenida, se consigue una cepa bacteriana que posee un ADN recombinante del gen AKIII como una cepa en la que la actividad AKIII aumenta, o una cepa en la que la auxotrofía se complementa. Se preparan extractos celulares de cepas candidatas, y a partir de éstas, se preparan soluciones enzimáticas en bruto para confirmar la actividad AKIII. El procedimiento de medida para la actividad enzimática de AKIII puede llevarse a cabo según un procedimiento de Stadtman et al. (Stadtman, E.R., Cohen, G.N., LeBras, G., y Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033 (1961)).

Por ejemplo, cuando una cepa mutante completamente deficiente en AK se utiliza como huésped, puede obtenerse un fragmento de ADN que contenga un gen AKI-II aislando una cepa transformada que llegue a ser capaz de crecer en un medio que no contenga L-lisina, L-treonina, L-metionina y ácido diaminopimélico, o en un medio que no contenga homoserina y ácido diaminopimélico, y recuperando al ADN recombinante a partir de la cepa bacteriana.

Cuando el gen AKIII se amplifica a partir del ADN cromosómico mediante el procedimiento PCR, los iniciadores de ADN que vayan a utilizarse para la reacción PCR, pueden prepararse apropiadamente basándose en, por ejemplo, una secuencia conocida en E. coli (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N., y Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)). Sin embargo, los iniciadores que pueden amplificar una región que comprende 1347 bases que codifica el gen lysC son apropiados, y por ejemplo, son apropiados, dos iniciadores que tienen secuencias definidas en SEC.ID. nº: 5 y nº:6. son apropiados.

El procedimiento para llevar a cabo una mutación como el reemplazamiento, inserción y deleción del residuo o residuos en el gen AKIII, obtenido tal como se ha descrito anteriormente, se ejemplifica mediante el procedimiento de PCR recombinante, el procedimiento de mutagénesis sitio-específico y similares, de la misma forma que el tratamiento de mutación del gen DDPS descrito anteriormente.

Además, según la síntesis química de un gen que se pretenda, es posible introducir la mutación o la mutación al azar en el sitio pretendido.

Además, está disponible un procedimiento en el que el ADN del gen AKIII en el ADN recombinante extracromosómico o cromosómico es tratado directamente con hidroxilamina (Hashimoto, T. y Sekiguchi, M. J. Bacteriol., 159, 1039, (1984)). Alternativamente, es aceptable utilizar un procedimiento en el que una bacteria que pertenezca al género Escherichia con un gen AKIII en el ADN recombinante extracromosómico o cromosómico, se irradia con luz ultravioleta, o un procedimiento para llevar a cabo un tratamiento con un agente químico tal como la N-metil-N'-nitrosoguanidina o ácido nitroso.

Respecto a un procedimiento de selección para el gen mutante AKIII, una cepa completamente deficiente en AK, por ejemplo, una cepa GT3 de E. coli se transforma en primer lugar con un ADN recombinante que contiene un gen AKIII que se ha sometido al tratamiento mutacional. A continuación, las cepas transformadas se cultivan sobre un medio mínimo tal como M9 que contiene una cantidad considerable de L-lisina. Las cepas que albergan el ADN recombinante que contiene un gen AKIII de tipo salvaje, no pueden sintetizar L-treonina, L-isoleucina, L-metionina y ácido diaminopimélico (DAP) y no se desarrollan, a causa de que sólo un AK es inhibido por la L-lisina. Por el contrario, la cepa que alberga al ADN recombinante que contiene el gen AKIII mutante, en la que la inhibición por la L-lisina es desensibilizada, podrá desarrollarse sobre el medio mínimo al que se añade la cantidad considerable de L-lisina. Este fenómeno puede utilizarse para seleccionar una cepa que sea resistente en el crecimiento a la L-lisina o al AEC como análogo de la L-lisina, que es una cepa que alberga ADN recombinante que contiene un gen mutante AKIII en el que la inhibición está desensibilizada.

El gen mutante así obtenido puede introducirse como un ADN recombinante en un microorganismo apropiado (huésped) y expresarse. De este modo, puede obtenerse un microorganismo que albergue AKIII, desensibilizándose la retroinhibición.

El huésped es preferentemente un microorganismo que pertenece al género Escherichia, para el cual se toma como ejemplo E. coli.

Alternativamente, un fragmento del gen mutante AKIII puede sacarse del ADN recombinante, e insertarse en otro vector para utilizarlo. El ADN vectorial que puede utilizarse en la presente invención es preferentemente un ADN vectorial plasmídico, por ejemplo pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 y pMW218. Además, pueden también utilizarse vectores de ADN fágico.

Además, con objeto de expresar eficientemente el gen mutante AKIII, otros promotores que actúan en microorganismos tales como lac, trp y PL pueden unirse por encima de una secuencia de ADN que codifica el AKIII mutante, o un promotor contenido en el gen AKIII puede utilizarse como es, o después de amplificar el promotor.

Además, tal como se ha descrito anteriormente, el gen mutante puede insertarse en un ADN vectorial capaz de replicarse autónomamente, que se inserta en un huésped, y al que se le permite ser acogido por éste como ADN extracromosómico, tal como un plásmido. Alternativamente, el gen mutante puede integrarse en el cromosoma de un microorganismo huésped mediante un procedimiento que utiliza la transducción, el transposón (Berg, D.E. y Berg, C.M., Bio/Technol., 1. 417 (1983), fago Mu (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública nº 2-109985) o la recombinación homóloga (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)).

<3> Producción de L-lisina según la presente invención

La L-lisina puede producirse eficientemente mediante cultivo en un medio preferido de la bacteria que se ha transformado introduciendo el gen DDPS mutante obtenido tal como se describe anteriormente, y dejando que dicha bacteria albergue AK, en la cual bacteria es desensibilizada mediante la retroinhibición por L-lisina, y se produce y se acumula L-lisina en un cultivo del mismo, y se recupera L-lisina a partir del cultivo. Es decir, la L-lisina puede ser producida eficientemente dejando que la bacteria que pertenece al género Escherichia albergue tanto al mutante DDPS como al mutante AKIII.

La bacteria que pertenece al género Escherichia que alberga AK y en la cual es desensibilizada la inhibición retroactiva mediante la L-lisina, tiene como ejemplo las bacterias que pertenecen al género Escherichia transformado mediante la integración, en ADN recombinante, de un ADN que codifica AKIII que presenta una mutación para desensibilizar la retroinhibición por la L-lisina, o bacterias que pertenecen al género Escherichia transformado mediante la introducción en las células de un ADN recombinante construido uniendo el ADN con un ADN vectorial capaz de replicarse autónomamente en las células de bacterias que pertenezcan al género Escherichia. Además, el AK en el que la retroinhibición por la L-lisina es desensibilizada, puede consistir en un tipo salvaje de AK, que no experimente la retroinhibición por la L-lisina, y una bacteria que pertenezca al género Escherichia en la que dicho gen AK de tipo salvaje se introduzca de la misma forma, siendo esto aceptable. Además, una cepa mutante de una bacteria que pertenezca al género Escherichia, la cual ha llegado a producir un mutante AKIII mediante un tratamiento mutacional de células de una bacteria que pertenece al género Escherichia, también es aceptable.

Por otra parte, con objeto de obtener la transformación introduciendo el gen mutante DDPS en una bacteria que pertenece al género Escherichia, el gen mutante DDPS puede integrarse en el ADN cromosómico para alcanzar la transformación, o ésta puede alcanzarse introduciendo, en las células, un ADN recombinante construido uniendo el gen DDPS mutante con un ADN vectorial capaz de replicarse autónomamente en las células de bacterias que pertenezcan al género Escherichia.

Cuando los dos, el gen mutante DDPS y el gen mutante AKIII se introducen en una bacteria que pertenece al género Escherichia, ambos genes mutantes pueden integrarse en y albergarse en el ADN cromosómico de las bacterias que pertenecen al género Escherichia, o pueden albergarse en un plásmido idéntico o en plásmidos separados en las células como ADN extracromosómico. Cuando se utilicen plásmidos separados, es preferible utilizar plásmidos que tengan un mecanismo estable de distribución para permitir que cada uno de ellos se albergue compatiblemente en la célula. Además, uno de los genes mutantes puede ser integrado en y albergarse en el ADN cromosómico, y el otro gen mutante puede albergarse en un plásmido en las células como ADN extracromosómico, respectivamente. Cuando el gen mutante DDPS y el gen mutante AKIII se introducen en una bacteria que pertenece al género Escherichia, cualquier orden de introducción de ambos genes es aceptable.

La productividad de la L-lisina puede mejorarse además potenciando un gen de la dihidrodipicolinato reductasa de la bacteria que pertenece al género Escherichia en la cual se han introducido el gen mutante DDPS y el gen mutante AKIII. La bacteria puede transformarse con un ADN recombinante construido uniendo un gen de la dihidrodipicolinato reductasa con un vector capaz de replicarse autónomamente en la bacteria. La productividad de la L-lisina puede mejorarse todavía además potenciando un gen de la diaminopimelato deshidroganasa, es decir, introduciendo dicho gen, que se origina a partir de una bacteria corineforme, en la bacteria que pertenece al género Escherichia, en la que el gen de la dihidrodipicolinato reductasa se ha potenciado. Este gen de la diaminopimelato deshidrogenasa deberá potenciarse. Alternativamente, la productividad de la L-lisina puede también mejorarse en un grado similar potenciando el gen dapD y un gen dapE en vez de introducir la diaminopimelato deshidrogenasa.

La potenciación de un gen en la presente memoria se refiere a la potenciación en la actividad de una enzima como un producto de expresión del gen por célula. Concretamente, puede ponerse como ejemplo la potenciación en el número de copias del gen en una célula, la potenciación en la intensidad de la expresión por gen, utilizando un promotor que posea una alta eficacia de expresión, y la introducción de la mutación para potenciar la actividad enzimática en el gen. Con objeto de potenciar el número de copias de un gen en una célula, el gen se inserta en un vector capaz de replicarse autónomamente en la bacteria que pertenece al género Escherichia, y una bacteria que pertenece al género Escherichia puede ser transformada con este vector. Los genes dapD y dapE pueden unirse con distintos vectores capaces de replicarse autónomamente en E. coli. Este vector es preferiblemente un plásmido de tipo multi-copia. Alternativamente, el número de copias puede aumentarse amplificando el ADN integrado en el ADN cromosómico utilizando, por ejemplo, el fago Mu. Respecto a la utilización del plásmido, cuando los plásmidos se utilizan para la introducción del gen mutante DDPS y del gen mutante AKIII, dichos plásmidos, con un mecanismo de distribución estable, se utilizan preferentemente, en la cual distribución estos plásmidos se albergan establemente juntos en una célula. Cualquier orden de introducción de los genes es aceptable.

A continuación se explicará en qué puede mejorarse la productividad de la L-lisina paso a paso potenciando sucesivamente genes del sistema de biosíntesis de la L-lisina, tal como se ha descrito anteriormente. Un sistema biosintetico que incluye una pluralidad de reacciones puede compararse con un líquido que fluye a través de múltiples conductos que poseen diferentes grosores conectados en serie. En la presente memoria cada conducto corresponde a una enzima individual, y el grosor del conducto corresponde a una velocidad de reacción enzimática. Con objeto de aumentar la cantidad del líquido que fluye a través de los conductos, es efectivo espesar el conducto más fino. No puede esperarse ningún efecto incluso si un conducto grueso, se engrosa más. Desde dicho punto de vista, los presentes inventores han probado potenciar el sistema de biosíntesis de la L-lisina. Con este propósito, tal como se muestra en el Ejemplo 6 que se describe a continuación, el orden de las etapas determinantes de la tasa del sistema de biosíntesis de la L-lisina, se ha dilucidado introduciendo paso a paso en E. coli, genes del sistema biosintético de la L-lisina, que provienen de E. coli. En esta dilucidación, cuatro genes de dapC (gen de la tetrahidrodipicolinato succinilasa), dapD, dapE (gen de la succinildiaminopimelato deaciclasa), y dapF (gen de la diaminoepimelato epimerasa), localizados por debajo en la vía biosintética, fueron reemplazados con un gen DDH que codifica la DDH (diaminoepimelato deshidrogenasa) de Brevibacterium lactofermentum capaz de catalizar reacciones en las que estos productos génicos toman parte por sí mismos. Es decir, los genes introducidos para las enzimas del sistema biosintético de la L-lisina y las enzimas por ellos codificadas son las siguientes:

ppc: fosfoenolpiruvato carboxilasa

aspC: aspartato aminotransferasa

lysC: aspartoquinasa III

lysC*: aspartoquinasa III que desensibiliza la inhibición.

asd: aspartato semialdehído deshidrogenasa

dapA: dihidrodipicolinato sintasa

dapA*: dihidrodipicolinato sintasa que desensibiliza la inhibición.

dapB: dihidrodipicolinato reductasa

DDH: diaminopimelato deshidrogenasa (que proviene de Brevibacterium lactofermentum)

lysA: diaminopimelato decarboxilasa

Como resultado de la introducción individual de cada uno de los genes en E. coli, se encontró producción de L-lisina en las cepas en las que lysC*, dapA o dapA* se introdujeron, mostrando la máxima productividad de L-lisina la cepa en la que se había introducido dapA*. Según el resultado, se encontró que una reacción catalizada por dapA fue el primer paso determinante de la velocidad. A continuación, cuando cada uno de los genes del sistema biosintético de la L-lisina se introdujo en la cepa en la que se había introducido dapA*, lysC* presentó el efecto más importante en la mejoría de la productividad de la L-lisina. Así, se encontró que una reacción catalizada por lysC constituía el segundo paso determinante de la velocidad. De la misma forma, se encontró que una reacción catalizada por dapB constituía el tercer paso determinante de la velocidad, y el cuarto paso lo constituyó una reacción catalizada por DDH. Además, como resultado de la investigación sobre los pasos que determinaban la velocidad entre las reacciones catalizadas por dapC, dapD, dapE y dapF reemplazadas con DDH, se encontró que dapD y dapE afectaban a los pasos que determinaban la velocidad.

Un procedimiento para la obtención de los genes del sistema biosintético de la L-lisina de E. coli y del gen DDH de Brevibacterium lactofermentum se pondrá como ejemplo a continuación.

El gen ppc puede obtenerse a partir de un plásmido pS2 (Sabe, H. et al., Gene, 31, 279 (1984)) o de pT2 que contenga este gen. Un fragmento de ADN que contenga el gen ppc se obtiene fragmentando pS2 con AatII y AflII. Un fragmento de ADN que contenga el gen ppc también se obtiene fragmentando pT2 con SmaI y ScaI. Una cepa F15 de E. coli (AJ12873)que alberga pT2 está depositada internacionalmente en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (código postal 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) bajo un número de depósito de FERM BP-4732 basado en el Tratado de Budapest.

El gen aspC se obtiene a partir de un plásmido pLF4 (Inokuchi, K. et al., Nucleic Acids Res., 10, 6957 (1982)) que tenga este gen. Un fragmento de ADN que tiene el gen aspC se obtiene fragmentando pLF4 con PvuII y StuI.

El gen asd se obtiene a partir de un plásmido pAD20 (Haziza, C. et al., EMBO, 1, 379 (1982)) que contenga este gen. Un fragmento de ADN que tenga el gen asd se obtiene fragmentando pAD20 con AseI y ClaI.

El gen dapB se obtiene amplificando el ADN cromosómico de E. coli mediante el procedimiento PCR utilizando dos tipos de iniciadores oligonucleótidos (por ejemplo, SEC. ID. nº:9, nº:10) preparados basándose en una secuencia nucleótida de un gen dapB conocido (Bouvier, J. et al., J.Biol. Chem., 259, 14829 (1984)).

El gen DDH se obtiene amplificando el ADN cromosómico de Brevibacterium lactofermentum mediante el procedimiento PCR utilizando dos tipos de iniciadores oligonucleótidos (por ejemplo, SEC. ID. nº:11, nº:12) preparados basándose en una secuencia nucleótida conocida de un gen DDH de Corynebacterium glutamicum (Ishino, Ss et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)).

El gen lysA se obtiene amplificando el ADN cromosómico de E. coli mediante el procedimiento PCR utilizando dos tipos de iniciadores oligonucleótidos (por ejemplo, SEC. ID. nº:13, nº:14) preparados basándose en una secuencia nucleótida de un gen lysA conocido (Stragier, P. et al., J. Mol. Biol., 168, 321 (1983))

El gen dapD se obtiene amplificando el ADN cromosómico de la cepa W3110 de E. coli mediante el procedimiento PCR utilizando dos tipos de iniciadores oligonucleótidos (por ejemplo, SEC. ID. nº:15, nº:16) preparados basándose en una secuencia nucleótida de un conocido gen dapD (Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)).

El gen dapE se obtiene amplificando el ADN de E. coli mediante el procedimiento PCR utilizando dos tipos de iniciadores oligonucleótidos (por ejemplo, SEC. ID. nº:17, nº:18) preparados basándose en una secuencia nucleótida de un conocido gen dapE (Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174, 5265 (1992)).

El gen dapF se obtiene amplificando el ADN cromosómico de E. coli mediante el procedimiento PCR utilizando dos tipos de iniciadores oligonucleótidos (por ejemplo, SEC. ID. nº:19, nº:20) preparados basándose en una secuencia nucleótida de un conocido gen dapF (Richaud, C. et al., Nucleic Acids Res., 16, 10367 (1988)).

En la presente invención, cualquier bacteria que pertenezca al género Escherichia está disponible para su utilización como un huésped, con tal de que un promotor del gen mutante DDPS, del gen mutante AKIII u de otro gen del sistema biosintético de la L-lisina, u otro promotor para expresar estos genes, funcione en sus células, y un origen de replicación de un ADN vectorial que va a utilizarse para la introducción de las funciones en sus células, sea capaz de replicarse cuando el gen mutante DDPS, el gen mutante AKIII u otro gen del sistema biosintético de la L-lisina, se introduzcan en un plásmido como ADN extracromosómico.

A este respecto, puede ponerse como ejemplo E. coli que produzca L-lisina, concretamente una cepa mutante que presente resistencia a análogos de la L-lisina. El análogo de la L-lisina es aquél que inhibe la proliferación de las bacterias que pertenecen al género Escherichia, pero la supresión está desensibilizada parcial o enteramente si la L-lisina co-existe en un medio. Por ejemplo, están la oxalisina, la lisina hidroxamato, AEC\gamma-metillisina, y el \alpha-clorocaprolactam. Las cepas mutantes con resistencia a estos análogos de la lisina se obtienen aplicando una operación mutacional artificial ordinaria a microorganismos que pertenezcan al género Escherichia. La cepa bacteriana que vaya a utilizarse para la producción de la L-lisina está concretamente ejemplificada por Escherichia coli AJ11442 (depositada como FERM BP-1543 y NRRL B-12185; véase la Solicitud de Patente Japonesa abierta a la inspección pública nº 56-18596 o la patente US nº 4.346.170). En la aspartoquinasa de los microorganismos descritos anteriormente, la retroinhibición por la L-lisina, está desensibilizada.

Además, por ejemplo, los microorganismos que producen L-treonina están ejemplificados, porque la inhibición de su aspartoquinasa por la L-lisina está generalmente desensibilizada también en los microorganismos que producen L-treonina. Como en la bacteria productora de L-treonina que pertenece a E. coli, una cepa B-3996 presenta la capacidad más alta de producción que se conoce hasta ahora. La cepa B-3996 está depositada en el Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding, con el número de registro RIA 1867.

El medio que va a utilizarse para el cultivo del transformante que alberga el gen mutante, según la presente invención, es un medio ordinario que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones orgánicos y opcionalmente, otros componentes orgánicos.

Como fuente de carbono, es posible utilizar azúcares tales como glucosa, lactosa, galactosa, fructosa, o hidrolisado de almidón; alcoholes tales como glicerol o sorbitol; o ácidos orgánicos tales como ácido fumárico, ácido cítrico o ácido succínico.

Como fuente de nitrógeno, es posible utilizar sales de amonio inorgánicas, tales como sulfato amónico, cloruro amónico o fosfato amónico, nitrógeno orgánico tal como hidrolizado de soja; gas amoníaco, o amoníaco acuoso.

Es deseable permitir que sustancias necesarias como la vitamina B_{1} y la L-isoleucina o el extracto de levadura estén contenidos en cantidades apropiadas como nutrientes orgánicos traza. Además de los anteriormente mencionados, se añaden en pequeñas cantidades, si es necesario, el fosfato potásico, sulfato magnésico, iones de hierro, iones de manganeso y similares.

El cultivo se lleva a cabo preferentemente bajo condiciones aeróbicas durante 16 a 72 horas. La temperatura del cultivo se controla entre 25ºC y 45ºC, y el pH, entre 5 y 8 durante el cultivo. Para el ajuste del pH, pueden utilizarse sustancias inorgánicas u orgánicas, ácidas o alcalinas, así como gas amoníaco o similares.

La recuperación de la L-lisina del licor de fermentación se lleva a cabo habitualmente combinando un procedimiento de resina de intercambio iónico, un procedimiento de precipitación y otros procedimientos conocidos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra las etapas de preparación para pdapA1 y pdapA2.

La Fig. 2 muestra la inhibición por la L-lisina de los DDPS de tipo salvaje y mutante.

La Figura 3 muestra las etapas de preparación para un plásmido pdapAS824 que posee una mutación doble del tipo del gen dapA*.

La Figura 4 muestra las etapas de preparación de pLYSC1 y pLYSC2.

La Figura 5 muestra una proporción de la aparición y de mutación de transformantes después de un tratamiento con hidroxilamina.

La Figura 6 muestra la inhibición por la L-lisina del AKIII de tipo salvaje y mutante.

La Figura 7 muestra las etapas de preparación de un plásmido RSF24P que se origina a partir de RSF1010 que posee dapA*4.

La Figura 8 muestra las etapas de preparación de un plásmido pLLC*0.

La Figura 9 muestra las etapas de preparación de un plásmido RSFD80 que se origina a partir de RSF1010 que posee dapA*4 y lysC*0.

La Figura 10 muestra estructuras de los plásmidos pdapA y pdapA* que tienen dapA o dapA*.

La Figura 11 muestra estructuras de los plásmidos plysC y plysC* que tienen lysC o lysC*80.

La Figura 12 muestra una estructura de un plásmido pppc que tiene ppc.

La Figura 13 muestra una estructura de un plásmido paspC que posee aspC.

La Figura 14 muestra una estructura de un plásmido pasd que posee asd.

La Figura 15 muestra una estructura de un plásmdo pdapB que tiene dapB.

La Figura 16 muestra una estructura de un plásmido pDDH que posee DDH.

La Figura 17 muestra una estructura de un plásmido plysA que presenta lysA.

La Figura 18 muestra las etapas de preparación de un plásmido pCAB1 que se origina a partir de RSF1010 que posee dapA*24, LysC*80 y dapB.

La Figura 19 muestra las etapas de preparación de un plásmido pCABD2 que se origina a partir de RSF1010 que posee dapA*24, lysC*80, dapB y DDH.

La Figura 20 muestra una estructura de un plásmido pdapD que posee dapD.

La figura 21 muestra una estructura de un plásmido pdapE que posee dapE.

La Figura 22 muestra una estructura de un plásmido pdapF que posee dapF.

La Figura 23 muestra las etapas de preparación de un plásmido pMWdapDE1 que posee dapD y dapE.

La Figura 24 muestra las etapas de preparación de un plásmido pCABDE1 que posee dapD, dapE, dapB, dapA*24 y lysC*80.

Mejor modo de poner en práctica la invención

La presente invención se explicará con mayor detalle a continuación con referencia a los Ejemplos.

Ejemplo 1 Preparación del gen DDPS mutante <1> Clonación del gen dapA de tipo salvaje

Ya se ha informado (Richaud, F. et al., J.Bacteriol., 297 (1986)) de una secuencia nucleótida de un gen dapA de E. coli, y se sabe que su marco de lectura abierto (ORF) comprende 876 pares de bases, y que codifica una proteína que comprende 292 residuos de aminoácidos. Ya que no se sabe como este gen dapA se regula, una región que sólo contenía una secuencia SD y ORF excepto una región promotora, se amplificó utilizando el procedimiento PCR, clonándose.

El ADN genómico total de una cepa K-12 MC1061 de E. coli se sometió a extracción, según un procedimiento de Saito y Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)). Se prepararon dos tipos de iniciadores, con secuencias que se muestran en SEC ID nº:1 y nº:2, los cuales se utilizaron para llevar a cabo la reacción PCR según un procedimiento de Erlich et al (PCR Technology, Stockton Press (1989)), amplificándose el ADN diana. E El ADN obtenido se insertó en un vector pCR1000 de clonación comercialmente disponible para fragmentos PCR (obtenido de Invitrogen, Ltd., (California, Estados Unidos). pCR1000 contiene un promotor lacZ (Placz), y se vende fragmentado en un sitio por debajo del promotor lacZ. Cuando un ADN recombinante obtenido uniendo un fragmento PCR entre dos extremos cortados de pCR1000 se introduce en E. coli, el fragmento PCR se transcribe bajo control del promotor lacZ. Después de la unión del fragmento PCR con pCR1000, se obtuvieron dos tipos de plásmidos, que fueron pdapA1 como un plásmido unido con una orientación normal, y pdapA2 como un plásmido unido con una orientación inversa, aludiendo a la dirección de transcripción de dapA respecto a la dirección de transcripción del promotor lacZ (Fig 1).

Cuando estos plásmidos se introdujeron en E. coli JE7627 que es una cepa deficiente en DDPS, la cepa con los plásmidos introducidos fue complementada auxotróficamente respecto al ácido aminopimélico del huésped JE7627. De este modo, se confirmó que los fragmentos de ADN insertados en ambos plásmidos, contienen el gen dapA que codifica el DDPS activo.

Una cepa transformada obtenida introduciendo pdapA1 en una cepa W3110 de E. coli de tipo salvaje (disponible en el National Institute of Genetics (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japón) se designó como W3110/pdapA1, y una cepa transformada obtenida introduciendo pdapA2 en la cepa W3110 de E. coli se denominó W3110/pdapA2, respectivamente. Estas dos cepas transformadas se cultivaron respectivamente en un medio mínimo M9 que tenía la composición siguiente, a la que se añadió AEC como un análogo de la lisina. La cepa W3110 en la que no se había introducido el plásmido, también se cultivó en el mismo medio como control. Estas dos cepas transformadas y la cepa W3110 sin plásmido suprimieron su crecimiento debido al AEC, recuperándose, sin embargo, la inhibición de su desarrollo añadiendo L-lisina.

Medio mínimo M9

A:	(20 x M9)
	Na_{2}HPO_{4} . 12H_{2}O	303 g/l
	KH_{2}PO_{4}	60 g/l
	NaCl	10 g/l
	NH_{4}Cl	20 g/l
B:	1 M MgSO^{4}
C:	50% Glucosa
D:	1 g/l Tiamina

A, B, C y D anteriormente descritos se esterilizaron separadamente, y se mezclaron en una proporción de A:B:C:D: agua= 5:0,1:1:0,1:95.

<2> Preparación del gen mutante DDPS (dapA*)

Se asumió que una cepa que alberga un plásmido que contiene dapA* que codifica DDPS con una inhibición desensibilizada mediante la L-lisina, podría crecer en un medio mínimo M9 al que se añadió una cantidad considerable de AEC. Una cepa que alberga un plásmido que contiene dapA* se seleccionó por su resistencia al crecimiento para AEC.

Con objeto de obtener eficientemente dapA*, dapA sobre pdapA1 y pdapA2 que se prepararon en <1>, se sometieron a un tratamiento mutacional.

(1-2-1) Investigación sobre las condiciones de selección para la cepa que alberga el plásmido que contiene dapA*

La cepa W3110/pdapA1 y la cepa W3110/pdapA2 obtenidas tal como se describe anteriormente, se cultivaron sobre medio M9 en placas de agar que contenía varias concentraciones de AEC, respectivamente. Se examinaron las concentraciones inhibitorias del crecimiento por AEC, y se investigaron las condiciones de selección para una cepa que albergara un plásmido que contenía dapA*.

El crecimiento de los transformantes sobre el medio M9 conteniendo AEC a varias concentraciones, se muestra en la Tabla 1. En ella, + indica crecimiento del transformante, y - indica que no existe crecimiento.

TABLA 1

1

La dirección de la transcripción del gen dapA respecto a pdapA1 coincide con la dirección de transcripción por el promotor lacZ (Figura 1). Así, se encontró que el gen dapA respecto a pdapA1 proporcionó resistencia a AEC a concentraciones considerablemente altas incluso cuando dapA permaneció como un tipo salvaje debido a que la cuantía de su expresión fue amplificada por el promotor lacZ, mientras que el gen dapA respecto a pdapA2 mostró una cuantía de expresión más pequeña y proporcionó inhibición en el crecimiento por AEC a concentraciones más bajas, debido a que la dirección de transcripción era la inversa respecto al promotor lacZ, y un promotor del propio dapA fue también deficiente (el crecimiento se suprimió con un reparto de la adición de 30 mM en el caso de la cepa W3110/pdapA1, y de 15 mM en el caso de la cepa W3110/pdapA2). Se confirmó que la inhibición del crecimiento se eliminó por la adición simultánea de L-lisina.

Por tanto, pdapA2 se utilizó como un objetivo para la introducción de la mutación. Un medio que se preparó añadiendo 60 mM de AEC al medio mínimo M9 se utilizó para la selección de una cepa que albergara a un plásmido que contuviera dapA*. A este medio se alude como "medio de selección" en el Ejemplo 1 que sigue a continuación.

(1-2-2) Tratamiento de la mutación in vitro para pdapA2 con hidroxilamina

Un procedimiento de tratamiento mutacional in vitro en el cual los plásmidos se trataron directamente con hidroxilamina, se utilizó para la introducción de la mutación en el plásmido pdapA2.

2 \mug del ADN se trataron a 75ºC durante 1 a 4 horas en 0,4 M hidroxilamina (0,1 M KH_{2}PO_{4}-1 mM EDTA (pH 6,0): 100 \mul, 1 M hidroxilamina-1 mM EDTA (pH 6,0): 80 \mul, ADN: 2 \mug, total: 200 \mul llenando con agua). El ADN después del tratamiento se purificó con polvo de vidrio, se introdujo en E. coli W3110, y se extendió sobre un medio completo (L-caldo de cultivo: Bacto trypton al 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 0,5%, agar al 1,5%), formándose las colonias. Se duplicaron sobre el medio de selección descrito en (1-2-1), y las que formaron colonias sobre el medio de selección, se escogieron. Las candidatas de los plásmidos mutantes en un total de 36 cepas se obtuvieron después de dos tiempos de experimentos.

Las cepas candidatas de 36 cepas en total así obtenidas, se salpicaron sobre el medio de selección otra vez, confirmándose la resistencia a AEC.

(1-2-3) Aislamiento del gen dapA* e investigación sobre el producto de dapA*

Los mutantes pdapA2 se recuperaron de las 36 cepas descritas anteriormente. Una cepa deficiente en dapA, JE7627 se transformó con ellos y el tipo salvaje pdapA2, respectivamente. Se preparó un extracto libre de células a partir de cada una de las cepas transformadas, midiéndose la actividad enzimática de DDPS.

El extracto libre de células (solución enzimática en bruto) se preparó de la siguiente manera. Una cepa transformada se cultivó en un medio 2 x TY (Bacto trypton al 1,6%, extracto de levadura al 1%, NaCl al 0,5%), y se recuperó con una densidad óptica a 660 nm (OD_{660}) de 0,8 aproximadamente. Se lavó el sedimento celular con NaCl al 0,85% bajo una temperatura de 0ºC, y se suspendió en un tampón de 20 mM fosfato potásico (pH 7,5) que contenía 400 mM KCl. Las células se fragmentaron mediante ultrasonidos (0ºC, 200 W, 10 minutos). Una solución de células fragmentadas se centrifugó a 33 k.r.p.m. durante 1 hora bajo unas condiciones de temperatura de 0ºC para obtener un sobrenadante al cual se añadió sulfato amónico para dar lugar a una saturación del 80%, para conservarse a 0ºC durante la noche, seguido por centrifugación. Un sedimento se disolvió en un tampón de 20 mM difosfato potásico (pH 7,5)-400 mM KCl.

La actividad enzimática de DDPS se midió según un procedimiento de Yugari et al (Yugari, Y. y Gilvarg, C., J. Biol. Chem., 240, 4710 (1962)). Es decir, la absorbancia de una solución reactiva que tenía la composición siguiente, se midió a 37ºC con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 270 nm, de forma dependiente del tiempo, y generándose dihidrodipicolinato, que se midió. El piruvato sódico se eliminó del sistema reactivo para utilizarse como un blanco.

Composición de la solución reactiva

50 mM imidazol-HCl pH 7,4

20 mM L-aspartato semialdehído

20 mM piruvato sódico

solución de la enzima

agua (equilibrio)

total 1,0 ml

Se añadieron varias concentraciones de L-lisina a la solución reactiva enzimática durante la medición de la actividad enzimática de DDPS, examinándose el grado de inhibición por la L-lisina. Tal como se muestra en la Fig 2, el DDPS de tipo salvaje sufrió inhibición por la L-lisina. Al comparar plásmidos mutantes que se originaron de las cepas transformadas en las que era difícil que DDPS sufriera la inhibición por la L-lisina, con los de tipo salvaje, se encontraron tres especies entre las 36 de los plásmidos candidatos. Se denominaron como pdapAS8, pdapAS9 y pdapAS24, respectivamente. Según la siguiente determinación de secuencias nucleótidas, se reveló que pdapAS8 y pdapAS9 tenían la misma mutación.

El grado de desensibilización de la inhibición por la L-lisina varió en las tres especies del DDPS mutante codificado por pdapAS8, pdapAS9 y pdapAS24; sin embargo, la inhibición por la L-lisina fue desensibilizada en las tres especies. Aunque la actividad específica de la enzima podría verse afectada por situaciones de crecimiento de las células y de la preparación de las muestras, se encontró que disminuía un poco en cualquier caso, cuando se comparó con el tipo salvaje. Sin embargo, se concluyó que no se causaría ningún problema por ellas como material para
cría.

(1-2-4) Determinación de la secuencia nucleótida del gen mutante dapA

Las secuencias nucleótidas de los genes mutantes dapA se determinaron según cualquier procedimiento ordinario, utilizando un secuenciador de ADN, modelo ABI 373A (producido por Applied Biosystems Inc.). Como resultado, se reveló que la C en posición 513 cambió a T en pdapAS8 y pdapAS9, y que la C en posición 623 cambió a T en pdapAS24, en una secuencia del gen dapA de tipo salvaje que se muestra en SEC. ID. nº:3. Por tanto, se reveló que un residuo de alanina en la posición 81 cambió a un residuo de valina en DDPS codificado por pdapAS8 y pdapAS9, y un residuo de histidina en posición 118 cambió a un residuo de tirosina en DDPS c codificado por pdapAS24, en una secuencia aminoácida de DDPS que se muestra en SEC. ID. nº:4.

(1-2-5) Preparación de dapA con doble mutación

Dos especies de los genes mutante dapA se obtuvieron tal como se ha descrito anteriormente. Con objeto de comprobar si la desensibilización de la inhibición actúa aditivamente o no para estas mutaciones, se preparó un plásmido que contenía el dapA mutante con ambas mutaciones. En la Figura 3 se muestra un procedimiento de preparación. Un plásmido, obtenido con mutación doble se denominó pdapAS824.

Ejemplo 2 Preparación del gen mutante AKIII <1> Clonación del gen lysC de tipo salvaje

Ya se ha informado de una secuencia nucleótida de un gen AKIII (lysC) de E. coli (Cassan, M., Parsot, C., Cohen G.N., y Patte, J.C. J. Biol. Chem, 261, 1052 (1986)), y se sabe que su marco de lectura abierto (ORF) comprende 1347 pares de bases, y codifica 449 residuos de aminoácidos. En este gen se encuentra un operador, y está sometido a la supresión por la L-lisina. Así, con objeto de eliminar la región operadora, se amplificó una región que contenía sólo una secuencia SD y ORF, utilizando el procedimiento PCR, y clonándose.

Se preparó el ADN genómico total de una cepa K-12 MC1061 de E. coli, según un procedimiento de Saito y Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963). Se prepararon dos tipos de iniciadores con secuencias que se muestran en SEC ID nº:5 y nº:6, que se utilizaron para llevar a cabo la reacción PCR según un procedimiento de Erlich et al (PCR Technology, Stockton Press (1989)), y el gen lysC se amplificó. El ADN obtenido se digirió con BamHI y AseI, se redondearon sus extremos, y se insertó en un sitio SmaI de un vector multi-copia. pUC18. Este sitio SmaI está localizado en el lado por debajo de un promotor lacZ que existe en el vector, y cuando el ADN recombinante obtenido insertando un fragmento de ADN en el sitio SmaI de pUC18, se introduce en E. coli, el fragmento de ADN insertado es transcrito mediante una transcripción a través de lectura bajo el control del promotor lacZ. Después de la inserción del fragmento PCR en el sitio SmaI de pUC18, se obtuvieron dos tipos de plásmidos, que fueron pLYSC1 como un plásmido insertado en una orientación inversa y pLYSC2 como un plásmido insertado en una orientación normal, por la dirección de transcripción de lysC con respecto a la dirección de transcripción por el promotor lacZ (Fig 4).

Cuando estos plásmidos se utilizaron para transformar E. coli GT3 (thrA1016b, metLM1005, lysC1004) como una cepa completamente eficiente para AKI, II, III, la auxotrofía de GT3 para la homoserina y el ácido diaminopimélico se complementó. Así pues, se confirmó que los fragmentos de ADN insertos en los dos plásmidos contienen el gen lysC que codifica la AKIII activa.

Una cepa transformada obtenida introduciendo pLYSC1 en la cepa completamente deficiente para AK, E. coli GT3, se denominó como GT3/pLYSC1, y una cepa transformada obtenida introduciendo pLYSC2 en E. coli GT3, se denominó como GT3/pLYSC2. Se añadió una cantidad considerable de L-lisina al medio mínimo M9, y la cepa GT3/pLYSC1 y la cepa GT3/pLYSC2 se cultivaron, respectivamente. Ambas cepas GT3/pLYSC1 y GT3/pLYSC2 albergaban plásmidos que contenían el lysC tipo salvaje, en el que AKIII codificado por lysC en los plásmidos, es un único AK. El AKIII de tipo salvaje como el único AK es inhibido por la L-lisina en presencia de una cantidad considerable de L-lisina. Así, ambas cepas no podrían sintetizar L-treonina, L-isoleucina, L-metionina y ácido diaminopimélico (DAP), y no crecieron.

<2> Preparación del gen mutante AKIII (lysC*)

Se asumió que una cepa que albergaba un plásmido que contenía lysC* que codificaba AK con la inhibición desensibilizada por la L-lisina, podría crecer en un medio mínimo M9 al que se hubiera añadido una considerable cantidad de L-lisina. Una cepa que albergaba un plásmido conteniendo lysC* se seleccionó eligiendo cepas en las que su crecimiento era resistente a la L-lisina o AEC como un análogo de la L-lisina.

Con objeto de obtener lysC* eficientemente, lysC en los pLYSC1 y pLYSC2 preparados en <1>, se sometieron a un tratamiento mutacional.

(2-2-1) Investigación sobre las condiciones de selección para la cepa que alberga el plásmido que contiene lysC*

La cepa GT3/pLYSC1 y la cepa GT3/pLYSC2 se cultivaron sobre medio M9 en placas de agar que contenían varias concentraciones de L-lisina o AEC, respectivamente. Se examinaron las concentraciones inhibitorias del crecimiento por la L-lisina o el AEC, y se investigó una condición de selección para una cepa que albergara un plásmido que contenía lysC*.

El crecimiento de los transformantes sobre el medio M9 que c contiene L-lisina o AEC, a diversas concentraciones, se muestra en la tabla 2. En ésta, + indica crecimiento del transformante, \pm indica un leve crecimiento, y - indica que no existe crecimiento.

TABLA 2 Crecimiento y concentración de L-lisina

2

Crecimiento y concentración de AEC

3

La dirección de la transcripción del gen lysC en pLYSC2 coincide con la dirección de transcripción por el promotor lacZ (Fig 4). Así, se encontró que el gen lysC en pLYSC2 proporcionó resistencia a la L-lisina y AEC a concentraciones considerablemente altas incluso cuando lysC permanecía como un tipo salvaje debido a que la cuantía de su expresión fue amplificada por el promotor lacZ, mientras que el ben lysC en pLYSC1, mostraba una cuantía más pequeña de su expresión y proporcionaba inhibición del crecimiento por la L-lisina y AEC a concentraciones más inferiores, debido a la dirección de la transcripción que era inversa con respecto al promotor lacZ, siendo también deficiente un promotor de si mismo (el crecimiento no fue suprimido hasta un reparto de adición de 100 mM para la L-lisina y hasta un reparto de adición de 3 mM para AEC en el caso de la cepa GT3/pLYSC2, mientras que el crecimiento fue suprimido completamente en un reparto de adición de 0,2 mM para tanto la L-lisina como el AEC en el caso de la cepa GT3/pLYSC1). Se confirmó que la inhibición del crecimiento se eliminó mediante la adición simultánea de homoserina y ácido diaminopimélico.

Por tanto, el pLYSC1 se utilizó para experimentos de introducción de la mutación. Un medio preparado añadiendo 10 mM de L-lisina o 0,2 mM de AEC al medio mínimo M9 fue utilizado para la selección de cepas que albergaban plásmidos que contenían lysC*. A este medio, en el Ejemplo 2 que sigue, se alude como "medio de selección".

(2-2-2) Tratamiento mutacional in vitro para pLYSC1 con hidroxilamina

Se utilizaron dos tipos de procedimientos para la introducción de la mutación en el plásmido pLYSC1, que fueron un tratamiento mutacional in vitro en el cual los plásmidos se trataron directamente con hidroxilamina, y un procedimiento de tratamiento mutacional in vivo en el que una célula que alberga un plásmido se trata con nitrosoguanidina (NTG), seguido por la extracción del plásmido, con objeto de proporcionar diversidad mutacional, esperando principalmente una mutación distinta que la de citosina a timina con la hidroxilamina.

Tratamiento mutacional in vitro con hidroxilamina

2 \mug de ADN se trataron bajo condiciones de 75ºC durante 1 a 4 horas en 0,4 M hidroxilamina (0,1 M KH_{2}PO_{4} - 1 mM EDTA (pH 6,0): 100 \mul, 1 M hidroxilamina - 1 mm EDTA (pH 6,0): 80 \mul, ADN: 2 \mug, total: 200 \mul rellenando con agua). El ADN después del tratamiento se purificó con polvo de vidrio, se introdujo en una cepa completamente deficiente en AK, una cepa GT3 de E. coli, y se extendió sobre un medio completo (L-caldo de cultivo: Bacto trypton al 1%, extracto de levadura 0,5%, NaCl al 0,5%, agar al 1,5%), formándose las colonias. Se replicaron sobre el medio de selección descrito en (2-2-1), y las cepas capaces de crecer sobre el medio de selección, se escogieron como cepas candidatas. Se encontró que el ritmo de aparición de los transformantes y la velocidad mutacional actuaron tal como se muestra en la Fig 5. Se obtuvieron cepas mutantes mediante un tratamiento durante 4 horas a una ritmo considerablemente alta de 0,5-0,8%.

Tratamiento mutacional in vivo con NTG

pLYSC1 se introdujo en E. coli MC1061, y se llevó a cabo un tratamiento NTG con una célula entera. La célula, después del tratamiento, se cultivó durante la noche para fijar la mutación y entonces se extrajo el plásmido y se introdujo en E. coli GT3. E Es decir, la cepa transformada se cultivó en un medio 2 x TY (Bacto trypton al 1,6%, extracto de levadura al 1%, NaCl al 0,5%,), se recuperó a una OD_{660} de 0,3 aproximadamente, se lavó con un tampón TM que se describe seguidamente, se suspendió entonces en una solución NTG (preparada disolviendo NTG a una concentración de 0,2 mg/ml en tampón TM), y se trató a 37ºC durante 0 a 90 minutos. La célula se lavó con tampón TM y medio 2xTY, y entonces se fijó la mutación mediante cultivo en medio 2 x TY durante la noche. A continuación, el ADN plasmídico se extrajo de la célula, y se introdujo en una cepa E. coli GT3. El rastreo de las cepas candidatas se llevó a cabo de la misma forma que en la mutación in vitro, y se obtuvieron los mutantes de la resistencia a la lisina (Lys^{R}) y la resistencia AEC (AEC^{R}).

Tampón TM

	Tris	50 mM
	Ácido maleico	50 mM
	(NH_{4})SO_{4}	1 g/l
	MgSO_{4}\cdot7H_{2}O	0,1 g/l
	Ca(NO_{3})_{2}	5 mg/l
	FeSO_{4}\cdot7H_{2}O	0,25 mg/l

El pH se ajustó a 6,0 con NAOH.

Las 180 cepas en total de las cepas candidatas obtenidas tal como se ha descrito anteriormente (tratamiento con hidroxilamina; 48 cepas, tratamiento con NTG; 132 cepas), se rociaron otra vez sobre el medio selectivo, y las resistencias de AEC y de L-lisina se confirmaron para obtener 153 cepas. Prestando atención a la diferencia en el patrón de acumulación de aminoácidos en el medio, estas 153 cepas se dividieron en 14 grupos, y la actividad AK se midió después de seleccionar cepas representativas de cada uno de los grupos. No hubo una gran diferencia en la actividad AK entre las cepas mutantes obtenidas mediante el tratamiento con hidroxilamina y las cepas mutantes obtenidas mediante el tratamiento NTG. Así, los experimentos siguientes se llevaron a cabo sin distinguir entre ellos.

(2-2-3) Aislamiento del gen lysC* e investigación sobre el producto lysC*

Los n^{os} 24, 43, 48, 60, 80, 117, 126, 149, 150, 156, 158, 167, 169 y 172 se seleccionaron como cepas representativas de los 14 grupos anteriormente mencionados. Los plásmidos mutantes derivados de pLYSC1 se recuperaron a partir de cada uno de ellos y se denominaron pLYSC1*4, pLYSC1*3, pLYSC1*8, pLYSC1*0, pLYSC1*0, pLYSC1*17, pLYSC1*26, pLYSC1*49, pLYSC1*50, pLYSC1*56, pLYSC1*58, pLYSC1*67, pLYSC1*69, pLYSC1*72, respectivamente. Una cepa GT3 completamente deficiente en AK se transformó con ellos y el tipo salvaje pLYSC1. Un extracto acelular se preparó a partir de cada uno de las cepas transformadas, midiéndose la actividad enzimática de AKIII.

El extracto acelular (solución enzimática en bruto) se preparó de la forma siguiente. Una cepa transformada se cultivó en un medio 2 x TY, y se recuperó con una densidad (OD_{660}) óptica de 0,8 aproximadamente. Las células se lavaron con 0,02 M KH_{2}PO_{4} (pH 6,75) - 0,03 M \beta-mercaptoetanol bajo condiciones de 0ºC, y las células se fragmentaron mediante ultrasonidos (0ºC, 100 W, 30 minutos X 4). Una solución de células fragmentadas se centrifugó a 33 k.r.p.m. durante 1 hora bajo condiciones de 0ºC para obtener un sobrenadante, al cual se añadió sulfato amónico para dar lugar a una saturación del 80%. Después de centrifugación, se disolvió el sedimento en 0,02 M KH_{2}PO_{4} (pH 6,75)-0,03 M \beta-mercaptoetanol, y se guardó a 0ºC por la noche.

La actividad enzimática de AKIII se midió según un procedimiento de Stadtman et al. (Stadtman, E. R., Cohen, G.N., LeBras, G., y Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033 (1961)). A saber, una solución reactiva con la composición siguiente, se incubó a 27ºC durante 45 minutos, y una solución de FeCl_{3} (2,8 N HCl 0,4 ml + 12% TCA 0,4 ml+5% FeCl_{3}.6 H_{2}O/0,1 N HCl 0,7 ml) se añadió para desarrollar un color, que se centrifugó seguido por medición de la absorbancia de un sobrenadante a 540 nm. La actividad se indicó por una cantidad de ácido hidroxámico generado por minuto (1 U=1 \mumol/min). El coeficiente de absorción molar fue 600. El aspartato potásico se eliminó de la solución reactiva para utilizarse como un blanco.

Composición de la solución reactiva

	Mezcla reactiva *	0,3 ml
	Solución de hidroxilamina *	0,2 ml
	0,1 Aspartato potásico (pH 7,0)	0,1 ml
	Solución enzimática
	Agua	(equilibrio)
		total 1,0 ml

*1: 1 M Tris-HCl (pH 8,1) 9 ml + 0,3 M MgSO_{4} 0,5 ml + 0,2 M ATP (pH 7,0) 5 ml

*2: La solución de 8 M hidroxilamina se neutralizó justamente antes de su utilización con KOH.

Se añadieron varias concentraciones de L-lisina a la solución reactiva enzimática para la medición de la actividad enzimática de AK, y se examinó el grado de inhibición de la L-lisina. Los resultados se muestran en la Fig 6 y en la Tabla 3. El tipo salvaje y los n^{os} 24, 43, 48, 60, 80, 117 y 126, se muestran en la Fig 6A. Los n^{os} 149, 150, 156, 158, 167, 169 y 172 se muestran en la Fig 6B.

Tal como se muestra en estos resultados, la AKIII de tipo salvaje sufrió intensamente la inhibición por la L-lisina, la cual fue inhibida en un 50% por 0,45 mM de L-lisina aproximadamente, y en un 100% con 5 mM. Por el contrario, el mutante AKIII obtenido mostró varios grados de desensibilización, pero sin embargo, la inhibición por la L-lisina fue desensibilizada en la totalidad de las 14 especies. Especialmente en el caso de los n^{os} 24, 80, 117, 169 y 172, la inhibición se observó apenas, incluso con 100 mM de L-lisina, y tuvieron concentraciones inhibitorias del 50% no menores que 200 veces cuando se compararon con las del tipo salvaje. La actividad específica por proteínas totales, que podría estar afectada por las situaciones de crecimiento de las células y la preparación de las muestras, fue igual a o superior que la del tipo salvaje en casi todos los casos, en los que hubo un pequeño problema de disminución de la actividad debido a la introducción de la mutación (Tabla 3). Según este hecho, se postuló que un centro activo de AKIII era independiente de un sitio regulatorio por la L-lisina con cada uno de los otros. En la tabla 3, el grado de desensibilización de la inhibición (%) se refiere a una actividad de AK en presencia de 100 mM de L-lisina con respecto a una actividad de AK en ausencia de L-lisina en la solución de reacción. La estabilidad térmica (%) se refiere a una proporción de mantenimiento de actividad después de un tratamiento a 55ºC durante 1,5
horas.

TABLA 3

4

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 *1: \+  \begin{minipage}[t]{135mm} Actividad de AK (%) en
presencia de 100 mM de L-lisina con respecto a la
actividad de AK en ausencia de L-lisina.
\end{minipage} \cr  *2: \+  \begin{minipage}[t]{135mm}
Proporción de mantenimiento de actividad (%) después del tratamiento
a 55ºC durante 1,5 horas.
\end{minipage} \cr}

\vskip1.000000\baselineskip

A continuación, se examinó la estabilidad térmica de las enzimas mutantes, Cuando se tiene el propósito de que una enzima mejore para aumentar su actividad, es importante que una enzima creada se mantenga establemente en las células. La medición in vitro tiene algunos problemas, debido a la diferencia en las actividades proteásicas intra y extracelulares y a la influencia de los tampones para el almacenamiento in vitro de las enzimas. Sin embargo, por conveniencia, la estabilidad térmica de los mutantes AKIII se investigó in vitro como un parámetro.

Juzgando los resultados de la investigación respecto a la temperatura de inactivación de AKIII bajo varias condiciones, se midió la proporción de mantenimiento de la actividad después de un tratamiento a 55ºC durante 90 minutos. Tal como se muestra en la Tabla 3, la mitad de las enzimas eran bastante más buenos que el tipo salvaje. Generalmente, una enzima mutante es a menudo inestable cuando se compara con un tipo salvaje. Sin embargo, alguno de los mutantes AKIII obtenidos ahora fueron superiores al tipo salvaje en estabilidad, y pareció que muchos de ellos eran realmente útiles en la utilización práctica para la producción de la L-lisina.

(2-2-4). Determinación de la secuencia de bases del lysC de tipo salvaje y del lysC mutante

Una secuencia nucleótida del gen lysC de tipo salvaje obtenido, se determinó según un procedimiento habitual utilizando un secuenciador de ADN modelo ABI 373A (producido por Applied Biosystems Inc,) (SEC ID nº:7). Como resultado, se encontraron diferencias en seis sitios (dos lugares al nivel aminoácido) a partir de una secuencia ya publicada de lysC de una cepa E. coli K-12 JC411 (Cassan, M., Rarsot, C., Cohen, G.N., y Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)). Se especula que la diferencia en seis sitios es debida a la diferencia en la cepa bacteriana utilizada.

De la misma forma, las secuencias de las bases se determinaron para cada uno de los lysC* existentes en las 14 especies de los pLYSC1 mutantes, clarificándose los puntos mutacionales. Los resultados se muestran en la Tabla 4. En esta tabla, las indicaciones entre paréntesis muestran mutaciones de residuos de aminoácidos basadas en mutaciones de nucleótidos. Los tipos de mutaciones fueron de 12 tipos, porque dos conjuntos (nº 4 y nº 167, nº 24 y nº 80) tenían exactamente los mismos tipos de mutación entre las 14 especies. Con respecto a los tipos de mutación, los n^{os} 149, 150, 156, 158, 167, 169 y 172 se obtuvieron mediante el tratamiento con hidroxilamina, y los n^{os} 24, 43, 48, 60, 80, 117 y 126 se obtuvieron mediante el tratamiento NTG. Sin embargo, como para el patrón mutacional, cualquiera de ellos radicaba en la mutación de citosina a timina, o de guanina a adenina sobre una cadena codificante, debido a la mutación de citosina a timina sobre una cadena no codificante.

TABLA 4 Determinación de puntos de mutación de lysC*

5

Ejemplo 3 Producción de L-lisina mediante fermentación, con una cepa en la que se ha introducido dapA*

Con objeto de producir L-lisina utilizando E. coli, tal como se indica en la Solicitud de patente japonesa abierta a la inspección pública nº 56-18596, patente US nº 4.346.170 y Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227-231 (1982), se considera que es esencial que, para potenciar a DDPS, un huésped tenga una aspartoquinasa que cambia, con objeto de no sufrir la inhibición por la L-lisina. Como tal cepa, puede ponerse como ejemplo bacterias que producen L-treonina. Como para la E. coli que produce L-treonina, una cepa B-3996 posee la máxima productividad entre las que se conocen actualmente. Así, la cepa B-3996 se utilizó como un huésped para evaluar dapA*. La cepa B-3996 alberga pVIC40 extracromosómicamente como un único plásmido. Los detalles se describen en la Patente Japonesa abierta a inspección pública nº 3-501682 (PCT). Este microorganismo está depositado en el Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding, con el número de registro RIA 1867.

Por otra parte, el dapA* contenido en pdapAS24 (en el que el residuo de histidina del sitio 118 se reemplazó con un residuo de tirosina), se seleccionó como dapA* para ser introducido en E. coli, juzgando del grado de desensibilización de la inhibición y de la actividad específica de la enzima. En primer lugar, con objeto de aumentar la cuantía de la expresión de dapA* y el aumento de la estabilidad del plásmido, el dapA* que estaba contenido en pdapAS24 (al que en lo sucesivo se aludirá como "dapA*4"), se unió por debajo de un promotor de un gen de resistencia a la tetraciclina de pV1C40, y se obtuvo RSF24P tal como se muestra en la Fig 7.

Una cepa obtenida introduciendo el plásmido RSF24P en la cepa E. coli JM109, se denominó AJ12395, que está depositada en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology el 28 de octubre de 1993, como número de entrada FERM P-13935, transfiriéndose desde el depósito original al depósito internacional basado en el Tratado de Budapest del 1 de noviembre de 1994, con el número de entrada FERM BP-4858. Las cepas que albergan pdapAS8 y pdapAS9 no se depositaron. Sin embargo, todos los puntos mutacionales de dapA* en cada uno de los plásmidos se han aclarado, tal como se describió anteriormente. Así, es fácil para los expertos en la materia recuperar el plásmido a partir de la bacteria que se depositó, a la anteriormente se ha aludido, utilizando un procedimiento de Maniatis et al. (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989)), y se obtuvo un gen diana utilizando un procedimiento de mutagénesis sitio-dirigida (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15.63 (1989)).

pVIC40 se suprimió de la cepa B-3996 según un procedimiento habitual, y se obtuvo una cepa B-399 que no contenía el plásmido. El plásmido RSF24P se introdujo en la cepa B-399 según un procedimiento habitual, obteniéndose B-399/RSF24P. Se evaluó la productividad de la L-lisina de B-399/RSF24P.

Por otra parte, se construyó RSFP como un plásmido control. Es decir, se seleccionó un fragmento voluminoso a partir del digesto del pVIC40 doblemente digerido con BamHI y DraI tal como se muestra en la Fig 7, redondeándose los extremos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa. El fragmento voluminoso con los extremos redondeados se auto-unió para obtener el plásmido RSFP. RSFP se introdujo en la cepa B-399 según un procedimiento habitual, obteniéndose B-399/RSFP. La productividad de la L-lisina también se evaluó para B-399/RSFP.

El cultivo se llevó a cabo con una agitación de 114 a 116 r.p.m. durante 48 horas y a una temperatura de 37ºC utilizando el medio que se expresa a continuación. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Medio para la producción de L-lisina

A:	(NH_{4})_{2} SO_{4}		16 g/l
	KH_{2}PO_{4}		1 g/l
	MgSO_{4}\cdot7H_{2}O		1 g/l
	FeSO_{4}\cdot7H_{2}O		0,01 g/l
	MnSO_{4}\cdot5H_{2}O		0,01 g/l
	KH_{2} PO_{4}		1 g/l
	extracto de levadura (Difco)		2 g/l
	L-metionina		0,5 g/L
	L-treonina		0,1 g/l
	L-isoleucina		0,05 g/l
	\begin{minipage}[b]{95mm} El pH se ajustó a 7,0 con KOH, y el medio se sometió al autoclave a 115^{o}C durante 10 minutos \end{minipage}		(16/20 volumen)
\begin{minipage}[b]{103mm} B: \hskip0,19cm Glucosa al 20% (sometida al autoclave a 115^{o}C durante 10 minutos) \end{minipage}		(4/20 volumen)
\begin{minipage}[b]{103mm} C: \hskip0,22cm CaCO_{3} de la Farmacopea (esterilizado mediante calor seco a 180^{o}C {}\hskip0,7cm durante 2 días) \end{minipage}		(30 g/l)

A y B se mezclaron en la proporción de A:B=4:1, añadiendo 30 gramos de C a 1 l de la mezcla, disolviéndose, y añadiendo ahora antibióticos (estreptomicina: 100 \mug/ml, kanamicina: 5 \mug/ml).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5

6

Ejemplo 4 Producción de L-lisina mediante fermentación, con una cepa en la que se ha introducido dapA* y lysC*(I)

El efecto del mutante DDPS sobre la producción de L-lisina se ha mostrado en el Ejemplo 3. Con objeto de obtener más mejoría, se permitió que el gen mutante AKIII obtenido en el Ejemplo 2 coexistiera con el gen mutante DDPS. Para coexistir con el gen mutante DDPS, se seleccionó el gen mutante AKIII que se originó de la cepa nº 80 (lysC*0), juzgando de la actividad enzimática, estabilidad térmica y similares.

lysC*0 se utilizó después de extraerlo de un plásmido pLLC*0 (Fig. 8) preparado uniendo alternativamente lysC* que había existido en pLYSC1*80 (al que en lo sucesivo se denominará como "lysC*0") por debajo del promotor lacZ del vector pHSG399 (producido por Takara Shuzo Co., Ltd), el cual posee un sitio de inserción direccional inverso con respecto a pUC18, con objeto de aumentar la cuantía de la expresión de lysC*. pLLC*0 es un plásmido preparado para que lysC*0 se adapte para permitir que la dirección de la transcripción tenga una orientación normal respecto al promotor lacZ, con objeto de mejorar la productividad de la L-lisina, ya que lysC*0 en pLYSC1*0 tiene su dirección de transcripción en una orientación inversa con respecto al promotor lacZ.

Un plásmido, RSFD80, conteniendo dapA* y lysC*, se preparó a partir de pLLC*80 y RSF24P obtenido en el Ejemplo 3, tal como se muestra en la Fig 9. RSFD80 incluye dapA*24 y lysC*80 dispuestos en este orden, para permitir que la dirección de transcripción tenga una orientación normal respecto a tetP por debajo de un promotor (tetP) de un gen de resistencia a la tetraciclina.

El plásmido RSFD80 se introdujo en la cepa E. coli JM109, que se denominó AJ12396. AJ12396 está depositada en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology el 28 de octubre de 1993, como número de entrada FERM P-13936, transfiriéndose desde el depósito original al depósito internacional basado en el Tratado de Budapest del 1 de noviembre de 1994, con el número de entrada FERM BP-4859. Las cepas que albergan pLYSC1*4, pLYSC1*3, pLYSC1*8, pLYSC1*0, pLYSC1*17, pLYSC1*26, pLYSC1*49, pLYSC1*50, pLYSC1*56, pLYSC1*58, pLYSC1*67, pLYSC1*69, pLYSC1*72, no se depositaron. Sin embargo, todos los puntos mutacionales de lysC* en cada uno de los plásmidos se han aclarado, tal como se describió anteriormente. Así, es fácil para los expertos en la materia recuperar el plásmido a partir de la bacteria en la que se depositó, a la anteriormente se ha aludido, utilizando un procedimiento de Maniatis et al. (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989)), y se obtuvo un gen diana utilizando un procedimiento de mutagénesis sitio-dirigida (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15.63 (1989)). RSFD80 se introdujo en la cepa B-399 según un procedimiento habitual, obteniéndose B-399/RSFD80. Se evaluó la productividad de la L-lisina de B-399/RSFD80. La productividad de la L-lisina se evaluó también para B-399/RSFP como un control.

El cultivo se llevó a cabo con una agitación de 114-116 r.p.m. durante 48 horas y a una temperatura de 37ºC utilizando el mismo medio para la producción de la L-lisina que en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

TABLA 6

7

Ejemplo 5 Producción de L-lisina mediante fermentación, con una cepa en la que se ha introducido dapA* y lysC*(II)

Se ha confirmado en el Ejemplo 4 que la productividad de la L-lisina puede mejorarse permitiendo que la bacteria que pertenece al género Escherichia albergue el gen mutante dapA y el gen mutante lysC. Se llevaron a cabo experimentos para confirmar si el efecto se mantenía o no cuando se cambiaba el huésped.

Se utilizó una cepa W3110(tyrA) de E. coli como huésped. La cepa W3110 (tyrA) es descrita en detalle en la publicación de patente europea nº 488424/92. Su procedimiento de preparación se describirá brevemente de la forma siguiente. La cepa W3110 de E. coli se obtuvo del National Institute of Genetics (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japón). Esta cepa se sembró sobre una placa LB que contenía estreptomicina, obteniéndose una cepa resistente a ésta seleccionando cepas que formaran colonias. La cepa resistente a la estreptomicina se mezcló con la cepa K-12 ME8424 de E. coli, y se cultivó estacionariamente en un medio completo (L-caldo de cultivo: Bacto trypton al 1,%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 0,5%,), a una temperatura de 37ºC durante 15 minutos para inducir la conjugación. La cepa K-12 ME8424 de E. coli posee caracteres genéticos de (HfrPO45, thi, relAl, tyrA::Tn10, ung-1, nadB), que está disponible en el National Institute of Genetics.

El cultivo se sembró entonces en un medio completo (L-caldo de cultivo: Bacto trypton al 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 0,5%, agar al 1,5%) que contenía estreptomicina, tetraciclina y L-tirosina, seleccionándose una cepa formadora de colonias. Esta cepa se denominó como E. coli W3110 (tyrA).

A propósito, la Publicación de Patente Europea nº 488424/92 describe muchas cepas formadas introduciendo plásmidos en la cepa W3110 (tyrA). Por ejemplo, una cepa obtenida introduciendo un plásmido pHATerm se denomina como cepa E. coli W3110 (tyrA)/pHATerm, depositada en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, a la cual se le asignó el número de entrada FERM BP-3653. La cepa W3110 (tyrA) puede también obtenerse eliminando el plásmido pHATerm de la cepa E. coli W3110 (tyrA)/pHATerm. Esta eliminación puede realizarse según cualquier procedimiento habitual.

El plásmido RSFD80 que contiene el dapA* y el lysC* obtenido en el Ejemplo 4 se introdujo en el W3110 (tyra) obtenido tal como se describió anteriormente, obteniéndose W3110 (tyra)/RSFD80. La productividad de la L-lisina se evaluó para W3110(tyra)/RSFD80. Como control, RSFP se introdujo en la cepa W3110(tyra) según un procedimiento habitual, obteniéndose W3110(tyra)/RSFP. La productividad de la L-lisina se evaluó también para W3110(tyra)/RSFP como control.

El cultivo se llevó a cabo con una agitación de 114 a 116 r.p.m. durante una duración del cultivo de 48 horas y a una temperatura de 37ºC utilizando el medio anteriormente mencionado para la producción de la L-lisina. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

TABLA 7

8

Ejemplo 6 Análisis de las pasos determinantes del ritmo (de producción) del sistema biosintético de la L-lisina y de la mejoría en la productividad de L-lisina en las bacterias que producen L-lisina y que pertenecen al género Escherichia

Se intentó mejorar la productividad de la L-lisina analizando las pasos que determinaban el ritmo (de producción) del sistema biosintético de la L-lisina de E. coli y de los genes potenciadores de las enzimas que catalizan las pasos.

<1> Identificación de las primeras pasos que determinan el ritmo (de producción) (6-1-1) Preparación de genes del sistema de biosíntesis de la L-lisina.

El paso en la determinación del ritmo (de producción) se identificó aislando varios genes del sistema biosintético de la L-lisina, introduciéndolos en E. coli y examinando los efectos de cada uno de los genes sobre la productividad de la L-lisina. Los genes introducidos para las enzimas del sistema biosintético de la L-lisina, y las enzimas codificadas por ellos, son las siguientes:

ppc: fosfoenolpiruvato carboxilasa

aspC: aspartato aminotransferasa

lysC: aspartoquinasa III

lysC*: 80 aspartoquinasa III que desensibiliza la inhibición.

asd: aspartato semialdehído deshidrogenasa

dapA: dihidropicolinato sintasa

dapA*4: dihidrodipicolinato sintasa que desensibiliza la inhibición.

dapB: dihidropicolinato reductasa

DDH: diaminopimelato deshidrogenasa (que proviene de Brevibacterium lactofermentum)

lysA: diaminopimelato descarboxilasa

El sistema biosintético de la L-lisina desde el ácido fosfoenolpirúvico a la L-lisina, puede cubrirse totalmente por los genes anteriormente descritos. Los genes dapC, dapD, dapE y d dapF, entre los genes del sistema biosintético de la L-lisina que E. coli poseyó originariamente, son reemplazados con el gen DDH que codifica la DDH (diaminopimelato deshidrogenasa) de Brevibacterium lactofermentum, la cual puede catalizar reacciones por sí misma que afectan a estos productos génicos. La cepa W3110 (tyrA) de la serie K12 de E. coli se utilizó como un huésped para introducir estos genes.

Los genes dapA y dapA*24 se obtuvieron respectivamente mediante escisión a partir de pdapA2 y pdapAS24 (véase el Ejemplo 1) con EcoRI y KpnI (Fig 10). Estos genes se unieron con pMW118 que se digerió con EcoRI y KpnI para obtener pdapA y pdapA*. Los genes lysC y lysC*80 se obtuvieron respectivamente mediante escisión a partir de pLYSC1 y pLLC*80 (véase Ejemplo 2) con EcoRI y SphI. Estos genes se unieron con pMW119 que fue digerido con EcoRI y SphI para obtener plysC y plysC* (Fig. 11).

El gen ppc se obtuvo a partir de un plásmido pT2 que contenía este gen. pT2 se fragmentó con SmaI y ScaI y los extremos se redondearon, seguido por la inserción en un sitio SmaI de pMW118 para obtener un plásmido pppc (Fig 12). E. coli F15 (AJ12873) que alberga pT2 está depositado en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, a la cual se le asignó el número de entrada FERM BP-4732.

El gen aspC se obtuvo a partir de un plásmido pLF4 (Inokuchi, K. et al., Nucleic Acids Res., 10, 6957 (1982) que posee este gen (Fig 13). pLF4 se fragmentó con PvuII y StuI, y los extremos se redondearon, seguido por la inserción en un sitio SmaI de pMW119 para obtener un plásmido paspC.

El gen asd se obtuvo a partir de un plásmido pAD20 (Haziza, C. et al., EMBO, 1, 379 (1982)) que contenía este gen. pAD20 se fragmentó con AseI y ClaI, y los extremos se redondearon, seguido por la inserción en un sitio SmaI de pMW118 para obtener un plásmido pasd. (Fig 14).

El gen dapB se obtuvo amplificando un gen dapB a partir del A ADN cromosómico de una cepa W3110 de E. coli, mediante el procedimiento PCR utilizando dos tipos de iniciadores oligonucleótidos (SEC. ID. nº:9, nº:10) preparados basándose en una secuencia nucleótida de un gen dapB conocido (Bouvier, J. et al., J.Biol.Chem, 259, 14829 (1984)) (Fig 15). Un fragmento amplificado de ADN que se obtuvo, se fragmentó con AseI y DraI, y los extremos se redondearon, seguido por la inserción en un sitio SmaI de pMW119 para obtener un plásmido pdapB.

El gen DDH se obtuvo amplificando un gen DDH a partir del ADN cromosómico de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 mediante el procedimiento PCR, utilizando dos tipos de iniciadores oligonucleótidos (SEC. ID. nº:11, nº:12) preparados basándose en una secuencia nucleótida conocida de un gen DDH de Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)). Un fragmento amplificado de ADN que se obtuvo, se fragmentó con EcoT22I y AvaI, y los extremos se redondearon, seguido por la inserción en un sitio SmaI de pMW119 para obtener un plásmido pDDH (Fig 16).

El gen lysA se obtuvo amplificando un gen lysA a partir del ADN cromosómico de una cepa W3110 de E. coli, mediante el procedimiento PCR utilizando dos tipos de iniciadores oligonucleótidos (SEC. ID. nº:13, nº:14) preparados basándose en una secuencia nucleótida de un gen lysA conocido (Stragier, P. et al., J. Mol. Biol., 168, 321 (1983)). Un fragmento amplificado de ADN que se obtuvo, se fragmentó con SplI y BclI, y los extremos se redondearon, seguido por la inserción en un sitio SmaI de pMW118 para obtener un plásmido plysA (Fig 17).

La confirmación del hecho de que cada uno de los genes anteriormente mencionados se clonó, se llevó a cabo fragmentándolos con las enzimas de restricción que se muestran en las figuras. Los vectores pMW118 y pMW119 (producidos por Nippon Gene) utilizados para la clonación de estos genes, se seleccionaron debido a que eran capaces de coexistir en células de E. coli conjuntamente con RSF1010 como un vector utilizado para la preparación de plásmidos para la producción de lisina que se describe a continuación, teniendo también un mecanismo de distribución estable.

(6-1-2) Productividad de la L-lisina de E. coli con los genes introducidos del sistema biosintético de la L-lisina

E. coli W3110 (tyrA) se transformó con cada uno de los plásmidos que contenían los genes del sistema biosintético de la L-lisina que se describió anteriormente, y los transformantes obtenidos se cultivaron para llevar a cabo la producción de la L-lisina. El cultivo se llevó a cabo durante 30 horas a una temperatura de 37ºC y con una agitación de 114-116 r.p.m. utilizando el medio siguiente. Los resultados se muestran en la Tabla 8.

Glucosa		40 g/l
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O		1 g/l
(NH_{4})_{2} SO_{4}		16 g/l
KH_{2} PO_{4}		1 g/l
FeSO_{4}\cdot7H^{2}O		0,01 g/l
MnSO_{4}\cdot5H_{2}O		0,01g/l
extracto de levadura (Difco)		2 g/l
L-tirosina		0,1 g/L
\begin{minipage}[t]{92mm} El pH se ajustó a 7,0 con KOH, y el medio se sometió al autoclave a 115^{o}C durante 10 minutos. (La glucosa y el MgSO_{4}.7H_{2} {}\hskip-2mm O se esterilizaron separadamente). \end{minipage}
CaCO_{3} de la Farmacopea
\hskip0.7cm (esterilizado mediante calor seco a 180^{o}C durante 2 días)		25 g/l
Antibióticos:
\hskip0.7cm (estreptomicina: 20 mg/l, o ampicilina 50 mg/l dependiendo
\hskip0.7cm de los tipos de plásmidos que vayan a introducirse).

TABLA 8

9

E. coli W3110 (tyrA) empezó a producir L-lisina cuando se introdujeron plysC*, pdapA o pdapA*. Ya que los productos de lysC y de dapA sufren retroinhibición por la L-lisina, puede postularse que estos enzimas constituyen puntos regulatorios importantes en la biosíntesis de la L-lisina. La reacción catalizada por el producto de dapA se encuentra en una posición ramificada respecto a un sistema biosintético para la L-treonina, L-metionina y L-isoleucina, y para un sistema de biosíntesis para la L-lisina, y constituye el primer paso del sistema biosintético inherente a L-lisina. Ya se informó de que E. coli también llega a producir L-lisina mediante la amplificación de un dapA de tipo salvaje (Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 15, 227 (1982)), que se ha confirmado también a partir del resultado descrito anteriormente. Por otra parte, el resultado del Ejemplo 3 se ha confirmado otra vez porque el rendimiento de la L-lisina aumenta además cuando dapA*, como un gen tipo que desensibiliza la inhibición, se introduce en
E. coli.

Se prepararon soluciones enzimáticas en bruto a partir de W3110 (tyrA), W3110 (tyrA)/pdapA y W3110(tyra) pdapA* de la misma forma que en el Ejemplo 1, midiéndose la actividad de la DDPS (dihidrodipicolinato sintasa) y examinándose el grado de inhibición de la actividad DDPS por la L-lisina. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

TABLA 9

10

*1: \mumoles/min/mg proteína

*2: proporción de mantenimiento de la actividad (%) en presencia de 5 mM de L-lisina.

El producto de dapA* que desensibiliza la inhibición tiene un efecto intenso, probablemente, sobre la producción de L-lisina, porque este grado de desensibilización de la inhibición es intenso, aunque posee una actividad específica más escasa que la enzima de tipo salvaje (alrededor de 1/2). La necesidad de la desensibilización de la inhibición del producto de dapA se ha mostrado para la producción de la L-lisina.

Además, el hecho de que lysC* posea un efecto sobre la producción de L-lisina puede considerarse de la siguiente forma. El primer paso que determina el ritmo (de producción) es un paso en el que HD (homoserina deshidrogenasa: producto de thrA o metLM) compite con DDPS (producto de dapA) para conseguir ASA (aspartato-\beta-semialdehído) como substrato para que sea de utilidad en un punto de ramificación del sistema biosintético, y cuando dapA es potenciado tal como se describe anteriormente, la reacción fluye en la dirección de la biosíntesis de la L-lisina. Por otra parte, se especula que cuando la cantidad suministrada de ASA aumenta potenciando lysC que participa en una reacción más allá de dapA y corriente arriba, cualquiera de las reacciones pertinentes para HD y DDPS son también facilitadas, y así, la cantidad producida de L-lisina ha aumentado también. Sin embargo, este efecto apenas se produce potenciando sólo al lysC de tipo salvaje. Esto es debido, probablemente, a que la inhibición del AKIII de tipo salvaje (producto de lysC) por la L-lisina es más estricta que la del DDPS tipo salvaje (AKIII y DDPS son inhibidos por alrededor de un 100% y un 80% respectivamente, en presencia de 5 nM de L-lisina).

Según los hechos anteriormente descritos, se juzgó que la reacción mediante DDPS que tenía un intenso efecto productor de lisina, constituyó el primer paso de determinación de (su) ritmo (de producción) y se postuló que la reacción por AKIII fue la segunda paso de determinación del ritmo.

<2> Identificación del segundo paso de determinación del ritmo (de producción)

El segundo paso de determinación del ritmo se identificó potenciando varios genes del sistema biosintético de la L-lisina en cepas en las que se había introducido el dapA*. Con objeto de que otros plásmidos estuvieran establemente albergados cuando se introdujeran en E. coli que alberga un plásmido que contiene dapA*, dapA* se transfirió desde pdapA a RSF1010, obteniéndose RSF24P (Fig 7). E. coli W3110 (tyrA) se transformó con el plásmido RSF24P que poseía dapA*.

Los plásmidos que tienen genes del sistema biosintético de la L-lisina, se introdujeron en E. coli W3110
(tyrA)/RSF24P. Dos tipos de plásmidos, a saber, RSF24P y un plásmido que contenía otro gen del sistema biosintético de la L-lisina, co-existieron en cada uno de los transformantes obtenidos. La productividad de la L-lisina se examinó para estas cepas de la misma forma que en (6-1-2) Los resultados se muestran en la Tabla 10.

TABLA 10

11

Como resultado, un notable efecto potenciador de la productividad de la L-lisina se encontró sólo en lysC*. El tipo salvaje de lysC no tenía efecto en absoluto. Esto se debe a que probablemente, la inhibición por la L-lisina es intensa, tal como se ha descrito anteriormente. De este modo, se confirmó que la reacción en la que intervenía lysC* constituía el segundo paso de determinación del ritmo (de la productividad).

lysC* se integró en RSF24P, y se obtuvo RSFD80 (Fig 9). De la misma manera, lysC se integró en RSF24P, y un plásmido que se obtuvo se denominó RSFD1. Estos plásmidos se introdujeron en E. coli W3110 (tyrA), se prepararon soluciones enzimáticas en bruto, y la actividad AK y el grado de inhibición de la actividad de AK por la L-lisina, se examinó de la misma forma que en (6-1-2). Los resultados se muestran en la Tabla 11.

TABLA 11

12

*1: nmoles/min/mg proteína

*: proporción de mantenimiento de la actividad (%) en presencia de 5 mM de L-lisina.

Las actividades específicas de AK de las cepas que albergan los plásmidos, aumentaron 20 a 30 veces mediante la integración de lysC y lysC* en RSF24P. E. coli tiene tres especies de AK, y lysC codifica AKIII entre ellas. Sin embargo, en el experimento descrito anteriormente, se midió una actividad total de las tres especies de AK. Se especula que la inhibición de la L-lisina también se convierte en intensa en la cepa que alberga RSFD1 con el lysC de tipo salvaje inserto, porque la proporción ocupada por AKIII es más alta que la ocupada por AKI y AKIII, cuando se compara con el control (W3110(tyrA)/RSF24P), lo que da lugar a que no se indique el efecto sobre la potenciación de la productividad de la L-lisina. Por otra parte, se reveló que la inhibición fue desensibilizada por aproximadamente el 100% de AKIII en la cepa que alberga RSFD80, y este hecho contribuyó a la mejoría en la producción de la L-lisina.

<3> Identificación de la tercera paso de determinación del ritmo (de producción)

El próximo paso fue la introducción de varios plásmidos del sistema biosintético de la L-lisina en E. coli W3110 (tyrA)/RSFD80, llevándose a cabo el cultivo para producir Lisina. Los resultados del cultivo se muestran en la Tabla 12.

TABLA 12

13

Un efecto potenciador sobre la productividad de la L-lisina se observó sólo en dapB, y se encontró que la reacción en la que intervenía dapB constituía el tercer paso en la determinación del ritmo (de la productividad). Así, dapB se insertó en RSFD80, obteniéndose pCAB1 (Fig 18). Este plásmido se introdujo en E. coli W3110 (tyrA), se preparó una solución enzimática en bruto, y la actividad DDPR (dihidrodipicolinato reductasa se midió según un procedimiento descrito por Tamir, H. y Gilvarg, C., J. Biol. Chem. 249, 3034 (1974). De la misma manera, se prepararon soluciones enzimáticas en bruto a partir de una cepa que albergaba sólo a RSFD80 y de una cepa que albergaba a RSFD80 y pdapB, midiéndose la actividad DDPR. Los resultados se muestran en la Tabla 13.

TABLA 13

14

La actividad DDPR aumentó alrededor de 3 veces en la cepa que albergaba RSFD80 y pdapB, y aumentó alrededor de 6,5 veces en la cepa que albergaba pCAB1 en el que dapB se insertó en RSFD80, cuando se comparó con la cepa control (cepa que albergaba sólo RSFD80). Según el hecho de que tanto W3110 (tyrA)/RSFD80 + pdapB como W3110(tyra)/pCAB1 presentaban una acumulación equivalente de L-lisina de 10,8 g/l, se consideró que d dapB había sido proporcionado en una cantidad suficiente para la producción de L-lisina, cambiándose, por tanto, el paso de determinación del ritmo (de producción) a la próxima.

<4> Identificación del cuarto paso en la determinación del ritmo (de producción)

A continuación, se identificó el cuarto paso en la determinación del ritmo (de producción). utilizando el plásmido pCAB1 que alberga lysC*, dapA* y dapB. Varios plásmidos del sistema biosintético de la L-lisina se introdujeron en E. coli W3110 (TyrA)/pCAB1, llevándose a cabo el cultivo para la producción de L-lisina. Los resultados del cultivo se muestran en la Tabla 14.

TABLA 14

15

\vskip1.000000\baselineskip

Un efecto potenciador sobre la productividad de la L-lisina se observó sólo en DDH, y se encontró que la reacción catalizada por DDH constituía el cuarto paso en la determinación del ritmo (de la productividad). Además, el SDAP (ácido N-succinil-L,L-\alpha, \varepsilon-diaminopimélico) detectado en un caldo de cultivo de la cepa en la que DDH no estaba introducido, no se detectó en un caldo de cultivo de la cepa en la que DDH se había introducido. La detección de SDAP se llevó a cabo mediante el desarrollo de TLC (composición del disolvente de desarrollo; metanol:agua:10N HCl: piridina=80:17,5:2,5:10) (Bouvier, J., Richaud, C., Higgins, W., Bogler, O. y Stragier, P., J.Bacteriol., 174, 5265 (1992)). Además, el color del caldo de cultivo era castaño en el caso de la cepa en la que no se había introducido DDH, pero cambió a amarillo en el caso de la cepa en la que DDH se había introducido. Así, DDH se integró en pCAB1 para preparar un plásmido pCABD2 (Fig 19), midiéndose la actividad DDH de E. coli W3110 (tyrA) transformada con este plásmido. La actividad enzimática DDH se midió según el procedimiento que se muestra en la literatura (Azizono, Haruo, Fermentation and Industry, 45, 964 (1987)). Los resultados se muestran en la Tabla 15.

TABLA 15

16

La actividad DDH no se detectó en el control (W3110(tyrA)/pCAB1) debido a que DDH no se encontraba originariamente en E. coli. La actividad específica de DDH de la cepa que albergaba pCABD2 (W3110(tyrA)/pCABD2) fue 2,5 veces más que la de la cepa que albergaba pDDH (W3110(tyrA)/pCAB1+ pDDH), pero sin embargo, ambas cepas contenían una cantidad equivalente de L-lisina acumulada (12,23 g/l).

Por esto, se consideró que la cuantía de expresión de DDH del pCABD2, fue suficiente.

<5> Análisis de los pasos que determinan el ritmo (de producción) entre dapC, dapD, dapE y dapF

A continuación, con objeto de examinar un orden limitante del ritmo (de producción) de dapC, dapD, dapE y dapF, reemplazados por DDH en el análisis anteriormente descrito, estos genes se clonaron, en primer lugar. dapC no se clonó a causa de la no existencia de informes sobre su secuencia de bases, aunque sin embargo, las tres especies restantes de genes se clonaron según al procedimiento PCR.

El gen dapD se obtuvo amplificando un gen dapD a partir del ADN cromosómico de una cepa E. coli W3110 mediante el procedimiento PCR utilizando dos tipos de iniciadores oligonucleótidos (SEC. ID. nº:15, nº:16) preparados basándose en una secuencia nucleótida de un gen dapD conocido (Richaud, C. et al., J.Biol.Chem., 259, 14824 (1984)). Un fragmento amplificado de ADN que se obtuvo, se fragmentó con Eco0109I y SacI, y los extremos se redondearon, seguido por la inserción en un sitio SmaI de pMW118 para obtener un plásmido pdapD (Fig 20).

El gen dapE se obtuvo amplificando un gen dapE a partir del ADN cromosómico de una cepa E. coli W3110 mediante el procedimiento PCR utilizando dos tipos de iniciadores oligonucleótidos (SEC. ID. nº:17, nº:18) preparados basándose en una secuencia nucleótida de un gen dapE conocido (Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174, 5265 (1992)). Un fragmento amplificado de ADN que se obtuvo, se fragmentó con MunI y BglII, y los extremos se redondearon, seguido por la inserción en un sitio SmaI de pMW118 para obtener un plásmido pdapE (Fig 21).

El gen dapF se obtuvo amplificando un gen dapF a partir del ADN cromosómico de una cepa E. coli W3110 mediante el procedimiento PCR utilizando dos tipos de iniciadores oligonucleótidos (SEC. ID. nº:19, nº:20) preparados basándose en una secuencia nucleótida de un gen dapF conocido (Richaud, C. et al., Nucleic Acids Res., 16, 10367 (1988)). Un fragmento amplificado de ADN que se obtuvo, se fragmentó con PstI y los extremos se redondearon, seguido por la inserción en un sitio SmaI de pMW118 para obtener un plásmido pdapF (Fig 22).

Cada uno de los plásmidos obtenidos tal como se ha descrito anteriormente, se introdujo en W3110 (tyrA)/pCAB1, llevándose a cabo el cultivo para la producción de L-lisina. En el experimento previo, los cambios se observaron en el color del caldo de cultivo y en la presencia o ausencia de la acumulación del intermediario (SDAP), además de la cuantía en la producción de L-lisina entre antes y después de la introducción de DDH. Así, el análisis de los pasos que determinan el ritmo (de producción) se llevó a cabo también utilizándolos como índices. Los resultados se muestran en la Tabla 16.

TABLA 16

17

La cantidad producida de L-lisina aumentó un poco por la potenciación de dapD o dapE, pero DDH no se excedió. Además, se encontró que el cambio en el color del caldo de cultivo y la acumulación de SDAP como un intermediario, observado después de la introducción de DDH, eran fenómenos independientes entre ellos, el cambio en el color del caldo de cultivo provenía de dapD, y la desaparición de SDAP provenía de dapE. La relación entre dapE y SDAP puede postularse considerando la vía biosintética de la L-lisina. La potenciación de dapF no afectó la mejoría en la productividad de la L-lisina.

dapE se extirpó de pdapE, y se insertó en pdapD para preparar un plásmido pMWdapDE1 que contenía tanto dapE como dapD (Fig 23). Además, un fragmento que contenía dapE y dapD se extirpó de pMWdapDE1, y se insertó en pCAB1 para preparar pCABDE1 (Fig 24). Se prepararon cepas que albergaban pCAB1, pCABDE1, o pCABD2, y una cepa que albergaba tanto pCABDE1 como pdapF, llevándose a cabo el cultivo para la producción de L-lisina utilizando estas cepas. Los resultados se muestran en la tabla 17.

TABLA 17

18

Se encontró que la cantidad producida de L-lisina, el color del caldo de cultivo, y la presencia o ausencia de la acumulación de SDAP llegaron a ser equivalentes a las características obtenidas en el caso de la producción de DDH potenciando dapD y dapE combinadamente. Además, se encontró que una posterior potenciación de dapF no tuvo efecto sobre la mejoría en la productividad de la L-lisina, y la reacción en la que dapF participó, no limitó el ritmo (de producción). Los resultados descritos anteriormente pueden interpretarse de la siguiente manera.

Después de la etapa de introducción de pCAB1, los intermediarios se acumulan en las dos etapas de SKAP (ácido N-succinil-\varepsilon-ceto-L-\alpha-aminopimélico) y SDAP. Entre estos intermediarios, SDAP se detectó en un caldo extracelular. Aunque SKAP no se detectó, se especuló que se acumulaba en las células bacterianas. La razón de dicha especulación reside en el color del caldo (de cultivo). Éste es amarillo en el caso de la cepa de tipo salvaje (W3110(tyrA)) o similar que no produce L-lisina. Sin embargo, el caldo de cultivo deviene de color castaño debido probablemente a bacteriolisis o similar cuando el crecimiento es influenciado. Se especula que SDAP ejerce una pequeña influencia sobre el crecimiento porque se descarga al exterior de las células, y por tanto, el caldo de cultivo mejora para tener un color amarillo, aunque la cantidad acumulada de SDAP aumenta cuando SKAP es metabolizado sólo mediante la potenciación de dapD. Sin embargo, incluso si dapD se potencia, la cantidad acumulada de L-lisina no aumenta a no ser que la limitación del ritmo de producción por el dapE situado por debajo, sea desensibilizada.

<6> Conclusión

Según los resultados descritos anteriormente, se ha encontrado que la productividad de la L-lisina mejora gradual llevando a cabo (1) la introducción de dapA*, (2) la introducción de lysC*, (3) potenciación de dapB, (4) potenciación de DDH ó dapD y dapEen las bacterias que pertenecen al género Escherichia. Además, se ha obtenido E. coli, en la que la productividad de la L-lisina ha mejorado de forma gradual.

<7> Análisis de las pasos determinantes del ritmo (de producción) del sistema biosintético de la L-lisina en la cepa C de E. coli

Con objeto de examinar si la conclusión obtenida en lo anteriormente mencionado puede aplicarse o no a cepas distintas que las de la serie de E. coli K-12, se analizaron los pasos determinantes del ritmo (de producción) de un sistema biosintético de L-lisina de una cepa E. coli C (IFO 13891), de la misma forma que la descrita anteriormente. Las condiciones del cultivo fueron las mismas que las de W3110 (tyrA), sin añadir al medio, sin embargo, la L-tirosina.

(1) Identificación del primer paso determinante del ritmo (de producción de L-lisina)

La cepa E. coli C (IFO 13891) transformada con plásmidos que contenían genes del sistema biosintético de la
L-lisina, se cultivó en el medio para la producción de L-lisina, midiéndose la cantidad producida de clorhidrato de
L-lisina. Los resultados se muestran en la tabla 18.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 18

19

De la misma forma que en W3110(tyrA), La L-lisina se acumuló también en el medio mediante la cepa C, introduciendo el dapA de tipo salvaje y después el dapA* de desensibilización de la inhibición. lysC* no tuvo efecto sobre la productividad de la L-lisina.

(2) Identificación del segundo paso determinante del ritmo

El plásmido RSF24P que contiene dapA* se introdujo en la cepa E. coli C, y los plásmidos que contenían genes del sistema biosintético de la L-lisina, se introdujeron posteriormente. Los transformantes obtenidos se cultivaron en el medio para la producción de la L-lisina, midiéndose la cantidad producida de clorhidrato de L-lisina. Los resultados se muestran en la tabla 19.

TABLA 19

20

Se encontró que lysC* tenía efecto sobre la mejoría en la producción de la L-lisina, incluso en el caso de la cepa C con dapA* transformado, constituyendo el segundo paso determinante del ritmo la reacción en la que participaba lysC*.

(3) Identificación del tercer paso determinante del ritmo

El plásmido RSFD80 que contiene dapA* y lysC* se introdujo en la cepa E. coli C, y los plásmidos que contenían genes del sistema biosintético de la L-lisina, se introdujeron posteriormente. Los transformantes obtenidos se cultivaron en el medio para la producción de la L-lisina, midiéndose la cantidad producida de clorhidrato de L-lisina. Los resultados se muestran en la tabla 20.

TABLA 20

21

De la misma forma que en la cepa W3110, sólo dapB tuvo un efecto sobre la mejoría en la productividad de la
L-lisina, y se encontró que constituía el tercer paso determinante del ritmo.

(4) Identificación del cuarto paso determinante del ritmo (de producción de la L-lisina)

El plásmido pCAB1 que contiene dapA*, lysC* y dapB se introdujo en la cepa E. coli C, y los plásmidos que contenían genes del sistema biosintético de la L-lisina, se introdujeron posteriormente. Los transformantes obtenidos se cultivaron en el medio productor de L-lisina, midiéndose la cantidad producida de clorhidrato de L-lisina. Los resultados se muestran en la tabla 21.

TABLA 21

22

De la misma forma que en la cepa W3110, sólo DDH tuvo un efecto sobre la mejoría en la productividad de la
L-lisina, y se encontró que constituía el cuarto paso determinante del ritmo.

(5) Análisis de los pasos determinantes del ritmo entre dapC, dapD, dapE y dapF

El plásmido que alberga los genes dapD, dapE ó dapF se introdujo, en vez de DDH, en la cepa E. coli C que alberga pCAB1, llevándose a cabo el cultivo para la producción de L-lisina. Los resultados se muestran en la tabla 22.

TABLA 22

23

Se encontró que los pasos de dapD y dapE afectaban también la determinación del ritmo en la cepa C, de la misma forma que en la cepa W3110.

Tal como se ha descrito anteriormente, las cepas K-12 y C que pertenecen a las distintas series tenían el mismo orden de determinación del ritmo. Así, se cree que la totalidad de las especies de E. coli pueden ser aplicadas con la idea de que la productividad de la L-lisina puede mejorarse gradualmente llevando a cabo la introducción de dapA* y lysC* y la potenciación de dapB y DDH (ó dapD y dapE) en este orden.

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, se ha obtenido un gen mutante DDPS que se origina a partir de una bacteria que pertenece al género Escherichia, en la cual la retroinhibición por la L-lisina está suficientemente desensibilizada. Una bacteria que produce L-lisina más mejorada que en la técnica anterior ha podido obtenerse introduciendo el gen en una bacteria que pertenece al género Escherichia que alberga una aspartoquinasa, en la cual bacteria la retroinhibición por la L-lisina está desensibilizada.

Además, la productividad de la L-lisina puede mejorarse gradualmente potenciando dapB y DDH (o dapD y dapE) de la bacteria productora de L-lisina anteriormente mencionada, en este orden.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: AJINOMOTO CO., INC.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento para la producción de L-lisina mediante fermentación

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 20

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CP:

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

DATOS DEL APODERADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE CONTACTO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGCAACTAC TGACATGACG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTAAGCCAT CAAATCTCCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1197

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Escherichia Coli

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: MC1061

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.800000\baselineskip

NOMBRE / CLAVE: unión de iniciador

\vskip0.800000\baselineskip

LOCALIZACIÓN: 248

\vskip0.800000\baselineskip

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.800000\baselineskip

NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.800000\baselineskip

LOCALIZACIÓN: 272...1150

\vskip0.800000\baselineskip

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.800000\baselineskip

NOMBRE / CLAVE: unión de iniciador

\vskip0.800000\baselineskip

LOCALIZACIÓN: 27...46

\vskip0.800000\baselineskip

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.800000\baselineskip

NOMBRE / CLAVE: unión de iniciador

\vskip0.800000\baselineskip

LOCALIZACIÓN: 1156...1175

\vskip0.800000\baselineskip

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.800000\baselineskip

NOMBRE / CLAVE: RBS

\vskip0.800000\baselineskip

LOCALIZACIÓN: 261...265

\vskip0.800000\baselineskip

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: S

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:3

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 292

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:4

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATTCCTTT GCGAGCAG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2147

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Escherichia Coli

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: MC1061

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.800000\baselineskip

NOMBRE / CLAVE: señal -35

\vskip0.800000\baselineskip

LOCALIZACIÓN: 242...249

\vskip0.800000\baselineskip

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: S

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.800000\baselineskip

NOMBRE / CLAVE: señal -10

\vskip0.800000\baselineskip

LOCALIZACIÓN: 265...273

\vskip0.800000\baselineskip

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: S

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.800000\baselineskip

NOMBRE / CLAVE: unión de iniciador

\vskip0.800000\baselineskip

LOCALIZACIÓN: 536...555

\vskip0.800000\baselineskip

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.800000\baselineskip

NOMBRE / CLAVE: unión de iniciador

\vskip0.800000\baselineskip

LOCALIZACIÓN: 2128...2147

\vskip0.800000\baselineskip

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.800000\baselineskip

NOMBRE / CLAVE: RBS

\vskip0.800000\baselineskip

LOCALIZACIÓN: 575...578

\vskip0.800000\baselineskip

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: S

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.800000\baselineskip

NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.800000\baselineskip

LOCALIZACIÓN: 584...1933

\vskip0.800000\baselineskip

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: S

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.800000\baselineskip

NOMBRE / CLAVE: finalizador

\vskip0.800000\baselineskip

LOCALIZACIÓN: 1941...1968

\vskip0.800000\baselineskip

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: S

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

\newpage

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 499

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:8

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTCACTGA TATCCCTCCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAAGTGGA CCAAATGGTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCTAAGTA TGCATCTCGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCCCCTCGA GCTAAATTAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCACGGTAG GATGTAATCG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAATGAAAC AAATGCCCGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTATTCATA ATTGCCACCG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACGGTAATA CATATAACCG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGCAATTG TCAAACGTCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCGACGCGC TTGAGATCTT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCATAAAGAG TCGCTAAACG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otros ... ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAACCGCCCG GTCATCAAGC

\hfill

20

Claims (13)

1. \global\parskip0.900000\baselineskip

   1. ADN que codifica una dihidrodipicolinato sintasa que se origina a partir de una bacteria que pertenece al género Escherichia que posee una mutación seleccionada de entre el grupo formado por una mutación para reemplazar un residuo de alanina en la posición 81 con un residuo de valina, una mutación para reemplazar un residuo de histidina en la posición 118 con un residuo de tirosina, y una mutación para reemplazar el residuo de alanina en la posición 81 con el residuo de valina y reemplazar el residuo de histidina en posición 118 con el residuo de tirosina, contados a partir del extremo N en una secuencia aminoácida de la dihidrodipicolinato sintasa definida en SEC. ID. nº: 3 del Listado de Secuencias.
2. 2. Bacteria que pertenece al género Escherichia, que se transforma introduciendo en sus células un ADN según la reivindicación 1, y que alberga una aspartoquinasa en la cual la retroinhibición por la L-lisina es desensibilizada.
3. 3. Bacteria que pertenece al género Escherichia según la reivindicación 2, que alberga la aspartoquinasa cuya retroinhibición por la L-lisina es desensibilizada, obtenida introduciendo, en sus células, un ADN que codifica una aspartoquinasa III que proviene de una bacteria que pertenece al género Escherichia y cuya retroinhibición por la
   L-lisina es desensibilizada.
4. 4. Bacteria que pertenece al género Escherichia según la reivindicación 3, en la que la retroinhibición de la aspartoquinasa III por la L-lisina es desensibilizada por una mutación seleccionada de entre el grupo formado por una mutación para reemplazar el residuo de glicina en la posición 323 con un residuo de ácido aspártico, una mutación para reemplazar el residuo de glicina en la posición 323 con un residuo de ácido aspártico y para reemplazar el residuo de glicina en la posición 408 con un residuo de ácido aspártico, una mutación para reemplazar el residuo de arginina en la posición 34 con un residuo de cisteína y para reemplazar el residuo de glicina en posición 323 con un residuo de ácido aspártico, una mutación para reemplazar el residuo de leucina en la posición 325 con un residuo de fenilalanina, una mutación para reemplazar el residuo de metionina en la posición 318 con un residuo de isoleucina, una mutación para reemplazar el residuo de metionina en la posición 318 con un residuo de isoleucina y para reemplazar el residuo de valina en posición 349 con un residuo de metionina, una mutación para reemplazar el residuo de serina en posición 345 con un residuo de leucina, una mutación para reemplazar el residuo de valina en la posición 347 con un residuo de metionina, una mutación para reemplazar un residuo de treonina en la posición 352 con un residuo de isoleucina, una mutación para reemplazar el residuo de treonina en la posición 352 con el residuo de isoleucina y para reemplazar el residuo de serina en posición 369 con un residuo de fenilalanina, una mutación para reemplazar el residuo de ácido glutámico en la posición 164 con un residuo de lisina, y una mutación para reemplazar el residuo de metionina en la posición 417 con un residuo de isoleucina, y para reemplazar el residuo de cisteína en la posición 419 con un residuo de tirosina contados a partir del extremo N en una secuencia aminoácida de la aspartoquinasa III definida en la SEC. ID. nº: 8, en el Listado de Secuencias.
5. 5. Bacteria que pertenece al género Escherichia según las reivindicaciones 2, 3 ó 4, en la que la actividad de la dihidrodipicolinato reductasa por célula es potenciada por el aumento del número de copias del gen en una célula, o por el aumento de la cantidad de expresión por gen, utilizando un promotor que tenga una alta eficacia de expresión.
6. 6. Bacteria que pertenece al género Escherichia según la reivindicación 5, que se transforma con un ADN recombinante construido uniendo un gen de la dihidrodipicolinato reductasa con un vector capaz de replicarse autónomamente en las células de bacterias que pertenecen al género Escherichia.
7. 7. Bacteria que pertenece al género Escherichia según la reivindicación 5, en la que la actividad de la diaminopimelato deshidrogenasa por célula es potenciada por el aumento del número de copias del gen en una célula, o por el aumento de la cantidad de expresión por gen, utilizando un promotor que tenga una alta eficacia de expresión.
8. 8. Bacteria que pertenece al género Escherichia según la reivindicación 7, que se transforma con un ADN recombinante construido uniendo un gen de la diaminopimelato deshidrogenasa que proviene de una bacteria corineforme con un vector capaz de replicarse autónomamente en las células de bacterias que pertenecen al género Escherichia.
9. 9. Bacteria que pertenece al género Escherichia según la reivindicación 5, en la que la actividad de una enzima codificada por dapD por célula y la actividad de una enzima codificada por dapE por célula, es potenciada por el aumento del número de copias del gen en una célula, o potenciada por el aumento de la cantidad de expresión por gen, utilizando un promotor que tenga una alta eficacia de expresión.
10. 10. Bacteria que pertenece al género Escherichia según la reivindicación 9, que se transforma con un ADN recombinante único o dos ADN recombinantes construidos uniendo dapD y dapE con un mismo vector o con distintos vectores, capaces de replicarse autónomamente en las células de bacterias que pertenecen al género Escherichia.
11. 11. Bacteria que pertenece al género Escherichia y que contiene el ADN según la reivindicación 1.
12. 12. Procedimiento para la producción de L-lisina, que comprende el cultivo de una bacteria que pertenece al género Escherichia según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en un medio apropiado.
13. 13. Proteína codificada por el ADN según la reivindicación 1.