JPS61122560A - Ａｔｐセンサ− - Google Patents
Ａｔｐセンサ−Info
- Publication number
- JPS61122560A JPS61122560A JP59246813A JP24681384A JPS61122560A JP S61122560 A JPS61122560 A JP S61122560A JP 59246813 A JP59246813 A JP 59246813A JP 24681384 A JP24681384 A JP 24681384A JP S61122560 A JPS61122560 A JP S61122560A
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- atp
- hydrogen ion
- hydrolase
- sensor
- sensitive electrode
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Immunology (AREA)
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- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
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- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
（産業上の利用分野］
本発明は、生体エネルギー源として最も重要なアゾ／シ
ン３リンＲ（ＡＴＰ）を検出するＡＴＰセンサーに関す
る。
ン３リンＲ（ＡＴＰ）を検出するＡＴＰセンサーに関す
る。
ＡＴＰは、生体反応、とくにエネルギーを必要とする酵
素反応に必要であり、有用物質生産のバイオリアクター
には必須である。 従来からのＡＴＰの測定法としては、■イオン交換カラ
ムでＡＴＰを分離し、紫外線吸収量により検出する方法
と、■生物発光反応を利用する方法の２つの代表的な方
法がある。これらの２つの方法について説明す為。 ■イオン交換カラムでＡＴＰを分離し、紫外線吸収量に
より検出する方法 ＡＴＰは中性付近でリン酸が解離するため、陰イオン交
換カラムで分離することができる。また、ＡＴＰは２５
０〜２６０ｎｚに核酸に特有な吸収を示すので、紫外分
光計と組み合わせて検出することができる。 ＃Ｉ４図はイオン交換カラムを眉いた高速液体りａマト
グフフイーにより、ＡＴＰを含む核酸試料からＡＴＰを
分離検出したぽあいの高速液体クロマトグラフィーの具
体例である（ＢＩＧ−ＲＡＤ社資料）、なお前記＾速液
体りａマトグ？フィーにおける測定条件は、ＢＩＧ−Ｒ
＾０社製のＣｏｌｕｍｎ＾−１ｎｅｘ＾−２５をｌｌイ
、６５℃で、ホウ酸ナトリウムと塩化７ンモニフムのグ
ラジェントで核酸を溶出したものを２５４ｎｘで検出し
たものである。 ■生物発光反応を利用する方法 ＡＴＰがルシフェリンとホタルの尾から抽出されたルシ
フェリン・ルシフェラーゼ酵素に上って反応を起こし、
５６０〜５８０ｕ＊の光を発することを利用した方法で
ある。この１ｆあいの反応式を下に示す。 ルシフェリン（酸化型）Ｐｆ’ｉ＋八ＭＰ＋へ（１＋ｂ
ｙこの発光はＡＴＰ １分子あたり１個の７オトンが故
へ 出さｔｔｉ″）で・発光０時間１対す
６値を積分ｔにとによってＡＴＰ量を検量することがで
さる。操作は試料からＡＴＰを抽出し、酵素Ｓａと反１
Ｂさせたのちフォトメーターによって測定する。 〔発明が解決しようとする問題息Ｊ 従来の＾ＴＦ検出演出法るイオン交換カラムでＡＴＰを
分離し、紫外線吸収量により検出する方法は、カラムを
用いる方式のため！ｉｌｉ！が大掛かりで、分離時開と
して数時間必要であり、条件出し操作を常に必要とする
。また他の核酸などが混在するばあいには分離が困難に
なり、また高速液体クロマトグラブイ−などの高価な装
置を必要とする、などの問題がある。 一方、生物発光反応を利用する方法は、酵素系が不安定
かつ高価であり、かつＡＴＩ’の試料からの抽出などが
必要であること、また７ｔ）メーターが高価であるなど
の問題があろ１本発明は上記のごとき問題を解消するた
めになされたもので、ＡＴＰに対する高い選択性を有し
、安定で迅速な測定ができ、小型化が可能で、操作が簡
単で安価なＡＴＰセンサーをうることを目的とするもの
である。 Ｅ問題点を解決するための手段］ 本発明は、ＡＴＰを選択的に認識して加水分解する酵素
であるＡＴＰ加水分解酵素および水素イオン感応電極を
岨み合わせたことを特徴とするＡＴＰセンサーにＩする
。 ［作用］ 本発明の基本原理をつぎに説明する。 ＡＴＰが７デノシントリホス７アターゼ（ＡＴＰ亀ｓｅ
）で代表されるＡＴＰ加水分解酵素によってｄａ付近で
分解される際、ＡＴＰ１ｍｏｌに対しで１−０１のＨ”
が生成することが知られている。 その結果上じたＨゝは測定液中の水素イオン濃度を上昇
させる。従ってＡＴＰ加水分解酵素濃度を一゛ 定に
してＡＴＰを分解させ、一定時間後の水素イオン濃度を
測定すれば、存在したＡＴＰ量を知ることができる。 ［ｙｌ施例］ 本発明に用いるＡＴＰ加水分解酵素は、サーマスサーモ
フイ２ス（Ｔｈｅｒｗｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
８Ｂ−８などの好熱性細菌、他のバクテリア、ミトコ
ンドリア、クロロプラストなどからえられる、たとえば
ＡＴＰａｓｅ、 ミオシンＡＴＰ’ａｓｅ％Ｈａ◆−
に◆ＡＴＰａｓｅ。 Ｃｍ”＋ＡＴＰａｇｅ％Ｈ÷ＡＴＰａｓｅなどで代表さ
れるものである。この上うなＡＴＰ加水分解酵素は細胞
膜に結合したままのものでもよく、精製した状態のもの
でもよい、一般にａ酵素は、膜に結合した状態の方が安
定であるぽあいが多い。 前記ＡＴＰ加水分解酵素の代表的な具体例であるＡＴＰ
ａｇｅのなかでも、好熱性Ｍ薗からＩｆ！Ｉ！したＡＴ
Ｐａｓｅは耐熱性に優れており、温度や変性剤などの影
響も受けにくく、固定化酵素として用いるばあいには最
適である。 ＡＴＰａｇｅで代表されるＡＴＰ加水分解酵素は、たと
えば好熱性細菌す−マスサーモフイラスＨＢ−８を栄’
ｌ培地で培養したのち、討致増殖期後牛で集菌し、超音
波またはフレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ −ｐｒｅｓｓ
）などで菌体を破壊し、遠心分離に上って細胞膜を集
めることに上り、ＡＴＰ加水分解酵素である膜結合型Ａ
ＴＰａｓｅが窮ｇ１される。この細胞膜には高い活性を
有するＡＴＰａｓｅが結合している。精製＾Ｔｌ’ａｓ
ｅは、この細胞膜を低イオン強度のバッフ７−や界面活
性剤をもちいて洗浄してＡＴＰａｇｅを可溶化したのち
、カラムクロマトグチフィーなどにより精製して調製さ
れる。 本発明に用いる水素イオン感応電極としては、通常使用
されている感応電極であれば使用しうるが、小型化や集
積化が容暴であるなどの点から水素イオン感応性電界効
果型シランノスター（ｐトｌ５ＦＥＴ）を眉いることが
好ましい。 本発明ではＡＴＰ加水分解酵素と水素イオン感応電極と
を組み合せてＡＴＰセンサーが製造される。 ＾ＴＦ加水分解酵素と水素イオン感応電極とを岨み合せ
る方法として、たとえば ■ＡＴＰ加水分解酵素を、たとえば感光性樹脂を用いて
水素イオン感応電極に固定化する方法■ＡＴＰａｇｅを
、寒天（八ｇａｒｏｓｅ）にまぜて水素イオン感応電極
上で固化させ、固定化させる方法へ ■Ａ
ＴＰａｇｅをアクリルアミトモ／マーとａ＋し、水素イ
オン感応電極上で重合させて固定化する方法などの方法
があげられるが、これらに限定されるものではない、必
要なのはＡＴＰ加水分解酵素を眉いてＡＴＰを＾ＯＰに
加水分解し、その際に生じる水素イオン濃度変化を再現
性よく測定することができ、ＡＴＰｔｆｉを測定するこ
とができればよいのである。 なお、たとえば感光性樹脂を用いてＡＴＰａｇｅ固定化
膜をｐＨ−［５ＦＥＴ上に形成するばあいには、イオン
感応面との接着性がよく、薄膜化が可能で、リングラフ
イー技術によって容易にパターニングすることもでき、
マルチセンサーにすることも可能である。 前記ＡＴＰ加水分解酵素を固定化するのに用いる感光性
樹脂の具体例としでは、たとえばトメチル−ｐ−ホルミ
ルスチリルピリジニフムメトサル７エー） をべ＞ｒン
トニ有するポリビニルアルコール、増感剤としてたとえ
ばベンゾインエチルエーテルを加えたポリエチレングリ
コールジメタクリレート、架橋剤としてノアシト化合物
を混合したポリビニルアルコールなどが用いられうるが
、これらに限定されるものではなく、ＡＴＰ加水分解酵
素な失活させずに固定化できるものであれば使用しうる
。 感光性樹脂を眉いて固定化するのが９トｔｓＦＥＴ電極
面との接着性、薄膜化、パターニングの容易さなどの点
から好ましいが、ＡＴＰ加水分解酵素を失活させずに固
定化できるかぎり、アクリルアミドなどを用いて固定化
してもよい。 本発明のＡＴＰセンサーの製法に用いる水素イオン感応
電極と、ＡＴＰ加水分解酵素との組み合わせとして種々
の組み合わせが考えられるが、その一実施態様として感
光性樹脂を用いてＡＴＰａｓｅをｐトＩＳＦＥＴのイオ
ン感応面に直接塗布硬化させ、ＡＴＰａｇｅ固定化膜に
したＡＴＰセンサーについて、図面にもとづき説明する
。 第２図は、本発明のＡＴＰセンサーのＵ？Ｌに用いうる
９トｌ５ＦＥＴ素子（下地電極）の一実施態様の斜視図
である。下地電極であるｐＨ−ｌ５ＦＥＴ素子（１）に
は、ソース（２）、（４）、ドレイン（３）、（５）、
疑似参照電極（８）、およびリード＃ｉ （７）が設け
られている。このｐＨ−ＩＳＦＥＴ素子はソース（２）
およびドレイン（３）からなる１個のｐＨ−ｌ５ＦＥＴ
（＾）、ソース（４）およびドレイン（５）からなるも
う１個の、ｌｌ−ｌ５ＦＥＴ（Ｂ）ならびに疑似参照電
極（６）から構成される複合型、トｌ５ＦＥＴ素子であ
る。この素子は通常の金属酸化物型電界効果トランジス
ターの製法に準拠して作製される。 ここで疑似参照電極（６）は金の蒸着膜であるａｐＨ−
ＩＳＦＥＴ（＾）およびｐｌＩ−ｒＳＦＥＴ（Ｂ）はそ
れぞれ単独で水素イオンに感応するもので、ソース・ド
レイン間に一定電圧をかけて両者の間を流れる電流を測
定するか、シース・ドレイン間に一定電流を流すために
必要なソース電圧を測定することによって、溶液中のｐ
Ｈ（水素イオン濃度）を測定しうる。 １図に示ｉ−ｐトｌ５ＦＥＴ（＾）の（８）の部分に固
定化膜を装着し、もう一方の、１Ｉ−ＩＳＦＥＴ（Ｂ）
にはそれを装着しないことにより本発明のＡＴＰセンサ
ーが作製されろ。 試料溶液中にＡＴＰがあれば前記の式（ｒ）に従ってＡ
ＴＰが分解され、ＡＴＰａｇｅ固定化膜内のｐＨは、Ａ
ＴＰａｇｅ固定化膜のなイｐＨ−１）ＦＥＴ（Ｂ）でモ
ニターされる試料溶液自体のＯｉｌと差を生じることに
なる。 従って、二のＡＴＰセンサーは、２個のｐトｌ５ＦＥＴ
（＾）おより（Ｂ）それぞれのソース・ドレイン間に一
定電流を流すために必要なソース電圧を測定し、両ｐト
ｌ５ＦＥＴのソース電圧の差動出力を増幅することによ
って、試料Ｓ液中のＡＴＰ濃度を測定することができる
。 以下、本発明のＡＴＰセンサーを実施例に、もとづき説
明する。 実施例１ ポリビニルアルコールの水酸基にＮ−メチル一一−ホル
ミルスチリルビリノニウムメトサル７エー）を付加（付
加率はポリビニルアルコールの水酸基に対して０．８毫
ル％）させた感光性ｍ脂（布材、特開昭５６−５７６１
号公報に記載）の５重量％水溶液を調製した。この水溶
９０．２ｍ＆に＾Ｔｆ’ａａｅ ２０ｔｇと牛血清アル
ブミン２０Ｈｇとを溶解し、均一な溶液とした。 この酵素・感光性樹脂混合水溶液を第１図に示す（８）
の部分に、第１１！Ｉに示すようにソース（２）とドへ
、イア（３）＆、、、６□、１ｌ−
ＩＳＦＥＴ、）やや、や１部分、すなわちイオン感応面
をおおうように広く塗布し、スピナーを用いて均一な膜
にするとともに乾燥せしめた。そののち、３４０ｎｗ以
下の波長の光をカットした３５０Ｗの水銀灯を眉い、５
分ｌｌｌ１！！素・感光性樹脂混合物に光照射しでＡＴ
Ｐａｓｅｆｉ定化膜を形成した。 つぎにこの固定化膜の機械的強度を増大させる推作を行
なった。すなわち、２５％のグルグルアルデヒド水ＷＩ
液中にＡＴＰａｇｅ固定化膜を１５分間浸漬し、たん白
質分子間を共有結合により相互架ｇ４させた。 二のＡＴＰａｇｅ固定化膜を充分水洗し、さらに残存す
るグルタルアルデヒドを除くために０．１モル％のグリ
シン水溶液に１５分間浸漬した。ついでこのＡＴＰセン
サーを水洗した。 以上のようにして作製したＡＴＰセンサーの応答特性を
２０ｇＮ ）リス（ヒドロキシメチル７ミノメタン）−
ＨＣＺ緩衝［（ｐ１１８．ｏ）を用いでＡＴＰ濃度１０
μＭ〜１０ｘＭ（５ｍｇ〜５ｇ＃）の範囲で検討した。 結果（検Ｉｌ線）を第３図に示す、なお該ＡＴＰセンサ
ーの応答は迅速でありた。またこのセンサーの寿命を評
価したところ、１力月後の出力低下は、はとんどなかつ
た。 １）図から本発明のＡＴＰセンサーは１ｘＨ程度の範囲
のＡＴＰａ１度に対して、直ＭＥ！；答すること力ずわ
かる。 前記実施例においてはデート電圧を与えるものとしてｔ
金属を用いたが、銀・塩化銀電極などの安定な参照電極
を用いでも良い。 〔発明の効果１ 以上のように本発明のＡＴＰセンサーでは、ＡＴＰ加水
分解酵素を水素イオン感応電極と岨み合わせているので
、ＡＴＰ濃度を簡単かつ迅速に、高選択性を持って測定
することができゐ、またＡＴＰ加水加水分解色素て耐熱
性ＡＴＰａｇｅを使用し、それをｐＨ−ｌ５ＦＥＴ上に
感光性樹脂を用いて固定化膜として形成するばあいには
、小型化、マルチセンサー化が容易で、長寿命を有する
ＡＴＰセンサーかえられる。
素反応に必要であり、有用物質生産のバイオリアクター
には必須である。 従来からのＡＴＰの測定法としては、■イオン交換カラ
ムでＡＴＰを分離し、紫外線吸収量により検出する方法
と、■生物発光反応を利用する方法の２つの代表的な方
法がある。これらの２つの方法について説明す為。 ■イオン交換カラムでＡＴＰを分離し、紫外線吸収量に
より検出する方法 ＡＴＰは中性付近でリン酸が解離するため、陰イオン交
換カラムで分離することができる。また、ＡＴＰは２５
０〜２６０ｎｚに核酸に特有な吸収を示すので、紫外分
光計と組み合わせて検出することができる。 ＃Ｉ４図はイオン交換カラムを眉いた高速液体りａマト
グフフイーにより、ＡＴＰを含む核酸試料からＡＴＰを
分離検出したぽあいの高速液体クロマトグラフィーの具
体例である（ＢＩＧ−ＲＡＤ社資料）、なお前記＾速液
体りａマトグ？フィーにおける測定条件は、ＢＩＧ−Ｒ
＾０社製のＣｏｌｕｍｎ＾−１ｎｅｘ＾−２５をｌｌイ
、６５℃で、ホウ酸ナトリウムと塩化７ンモニフムのグ
ラジェントで核酸を溶出したものを２５４ｎｘで検出し
たものである。 ■生物発光反応を利用する方法 ＡＴＰがルシフェリンとホタルの尾から抽出されたルシ
フェリン・ルシフェラーゼ酵素に上って反応を起こし、
５６０〜５８０ｕ＊の光を発することを利用した方法で
ある。この１ｆあいの反応式を下に示す。 ルシフェリン（酸化型）Ｐｆ’ｉ＋八ＭＰ＋へ（１＋ｂ
ｙこの発光はＡＴＰ １分子あたり１個の７オトンが故
へ 出さｔｔｉ″）で・発光０時間１対す
６値を積分ｔにとによってＡＴＰ量を検量することがで
さる。操作は試料からＡＴＰを抽出し、酵素Ｓａと反１
Ｂさせたのちフォトメーターによって測定する。 〔発明が解決しようとする問題息Ｊ 従来の＾ＴＦ検出演出法るイオン交換カラムでＡＴＰを
分離し、紫外線吸収量により検出する方法は、カラムを
用いる方式のため！ｉｌｉ！が大掛かりで、分離時開と
して数時間必要であり、条件出し操作を常に必要とする
。また他の核酸などが混在するばあいには分離が困難に
なり、また高速液体クロマトグラブイ−などの高価な装
置を必要とする、などの問題がある。 一方、生物発光反応を利用する方法は、酵素系が不安定
かつ高価であり、かつＡＴＩ’の試料からの抽出などが
必要であること、また７ｔ）メーターが高価であるなど
の問題があろ１本発明は上記のごとき問題を解消するた
めになされたもので、ＡＴＰに対する高い選択性を有し
、安定で迅速な測定ができ、小型化が可能で、操作が簡
単で安価なＡＴＰセンサーをうることを目的とするもの
である。 Ｅ問題点を解決するための手段］ 本発明は、ＡＴＰを選択的に認識して加水分解する酵素
であるＡＴＰ加水分解酵素および水素イオン感応電極を
岨み合わせたことを特徴とするＡＴＰセンサーにＩする
。 ［作用］ 本発明の基本原理をつぎに説明する。 ＡＴＰが７デノシントリホス７アターゼ（ＡＴＰ亀ｓｅ
）で代表されるＡＴＰ加水分解酵素によってｄａ付近で
分解される際、ＡＴＰ１ｍｏｌに対しで１−０１のＨ”
が生成することが知られている。 その結果上じたＨゝは測定液中の水素イオン濃度を上昇
させる。従ってＡＴＰ加水分解酵素濃度を一゛ 定に
してＡＴＰを分解させ、一定時間後の水素イオン濃度を
測定すれば、存在したＡＴＰ量を知ることができる。 ［ｙｌ施例］ 本発明に用いるＡＴＰ加水分解酵素は、サーマスサーモ
フイ２ス（Ｔｈｅｒｗｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
８Ｂ−８などの好熱性細菌、他のバクテリア、ミトコ
ンドリア、クロロプラストなどからえられる、たとえば
ＡＴＰａｓｅ、 ミオシンＡＴＰ’ａｓｅ％Ｈａ◆−
に◆ＡＴＰａｓｅ。 Ｃｍ”＋ＡＴＰａｇｅ％Ｈ÷ＡＴＰａｓｅなどで代表さ
れるものである。この上うなＡＴＰ加水分解酵素は細胞
膜に結合したままのものでもよく、精製した状態のもの
でもよい、一般にａ酵素は、膜に結合した状態の方が安
定であるぽあいが多い。 前記ＡＴＰ加水分解酵素の代表的な具体例であるＡＴＰ
ａｇｅのなかでも、好熱性Ｍ薗からＩｆ！Ｉ！したＡＴ
Ｐａｓｅは耐熱性に優れており、温度や変性剤などの影
響も受けにくく、固定化酵素として用いるばあいには最
適である。 ＡＴＰａｇｅで代表されるＡＴＰ加水分解酵素は、たと
えば好熱性細菌す−マスサーモフイラスＨＢ−８を栄’
ｌ培地で培養したのち、討致増殖期後牛で集菌し、超音
波またはフレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ −ｐｒｅｓｓ
）などで菌体を破壊し、遠心分離に上って細胞膜を集
めることに上り、ＡＴＰ加水分解酵素である膜結合型Ａ
ＴＰａｓｅが窮ｇ１される。この細胞膜には高い活性を
有するＡＴＰａｓｅが結合している。精製＾Ｔｌ’ａｓ
ｅは、この細胞膜を低イオン強度のバッフ７−や界面活
性剤をもちいて洗浄してＡＴＰａｇｅを可溶化したのち
、カラムクロマトグチフィーなどにより精製して調製さ
れる。 本発明に用いる水素イオン感応電極としては、通常使用
されている感応電極であれば使用しうるが、小型化や集
積化が容暴であるなどの点から水素イオン感応性電界効
果型シランノスター（ｐトｌ５ＦＥＴ）を眉いることが
好ましい。 本発明ではＡＴＰ加水分解酵素と水素イオン感応電極と
を組み合せてＡＴＰセンサーが製造される。 ＾ＴＦ加水分解酵素と水素イオン感応電極とを岨み合せ
る方法として、たとえば ■ＡＴＰ加水分解酵素を、たとえば感光性樹脂を用いて
水素イオン感応電極に固定化する方法■ＡＴＰａｇｅを
、寒天（八ｇａｒｏｓｅ）にまぜて水素イオン感応電極
上で固化させ、固定化させる方法へ ■Ａ
ＴＰａｇｅをアクリルアミトモ／マーとａ＋し、水素イ
オン感応電極上で重合させて固定化する方法などの方法
があげられるが、これらに限定されるものではない、必
要なのはＡＴＰ加水分解酵素を眉いてＡＴＰを＾ＯＰに
加水分解し、その際に生じる水素イオン濃度変化を再現
性よく測定することができ、ＡＴＰｔｆｉを測定するこ
とができればよいのである。 なお、たとえば感光性樹脂を用いてＡＴＰａｇｅ固定化
膜をｐＨ−［５ＦＥＴ上に形成するばあいには、イオン
感応面との接着性がよく、薄膜化が可能で、リングラフ
イー技術によって容易にパターニングすることもでき、
マルチセンサーにすることも可能である。 前記ＡＴＰ加水分解酵素を固定化するのに用いる感光性
樹脂の具体例としでは、たとえばトメチル−ｐ−ホルミ
ルスチリルピリジニフムメトサル７エー） をべ＞ｒン
トニ有するポリビニルアルコール、増感剤としてたとえ
ばベンゾインエチルエーテルを加えたポリエチレングリ
コールジメタクリレート、架橋剤としてノアシト化合物
を混合したポリビニルアルコールなどが用いられうるが
、これらに限定されるものではなく、ＡＴＰ加水分解酵
素な失活させずに固定化できるものであれば使用しうる
。 感光性樹脂を眉いて固定化するのが９トｔｓＦＥＴ電極
面との接着性、薄膜化、パターニングの容易さなどの点
から好ましいが、ＡＴＰ加水分解酵素を失活させずに固
定化できるかぎり、アクリルアミドなどを用いて固定化
してもよい。 本発明のＡＴＰセンサーの製法に用いる水素イオン感応
電極と、ＡＴＰ加水分解酵素との組み合わせとして種々
の組み合わせが考えられるが、その一実施態様として感
光性樹脂を用いてＡＴＰａｓｅをｐトＩＳＦＥＴのイオ
ン感応面に直接塗布硬化させ、ＡＴＰａｇｅ固定化膜に
したＡＴＰセンサーについて、図面にもとづき説明する
。 第２図は、本発明のＡＴＰセンサーのＵ？Ｌに用いうる
９トｌ５ＦＥＴ素子（下地電極）の一実施態様の斜視図
である。下地電極であるｐＨ−ｌ５ＦＥＴ素子（１）に
は、ソース（２）、（４）、ドレイン（３）、（５）、
疑似参照電極（８）、およびリード＃ｉ （７）が設け
られている。このｐＨ−ＩＳＦＥＴ素子はソース（２）
およびドレイン（３）からなる１個のｐＨ−ｌ５ＦＥＴ
（＾）、ソース（４）およびドレイン（５）からなるも
う１個の、ｌｌ−ｌ５ＦＥＴ（Ｂ）ならびに疑似参照電
極（６）から構成される複合型、トｌ５ＦＥＴ素子であ
る。この素子は通常の金属酸化物型電界効果トランジス
ターの製法に準拠して作製される。 ここで疑似参照電極（６）は金の蒸着膜であるａｐＨ−
ＩＳＦＥＴ（＾）およびｐｌＩ−ｒＳＦＥＴ（Ｂ）はそ
れぞれ単独で水素イオンに感応するもので、ソース・ド
レイン間に一定電圧をかけて両者の間を流れる電流を測
定するか、シース・ドレイン間に一定電流を流すために
必要なソース電圧を測定することによって、溶液中のｐ
Ｈ（水素イオン濃度）を測定しうる。 １図に示ｉ−ｐトｌ５ＦＥＴ（＾）の（８）の部分に固
定化膜を装着し、もう一方の、１Ｉ−ＩＳＦＥＴ（Ｂ）
にはそれを装着しないことにより本発明のＡＴＰセンサ
ーが作製されろ。 試料溶液中にＡＴＰがあれば前記の式（ｒ）に従ってＡ
ＴＰが分解され、ＡＴＰａｇｅ固定化膜内のｐＨは、Ａ
ＴＰａｇｅ固定化膜のなイｐＨ−１）ＦＥＴ（Ｂ）でモ
ニターされる試料溶液自体のＯｉｌと差を生じることに
なる。 従って、二のＡＴＰセンサーは、２個のｐトｌ５ＦＥＴ
（＾）おより（Ｂ）それぞれのソース・ドレイン間に一
定電流を流すために必要なソース電圧を測定し、両ｐト
ｌ５ＦＥＴのソース電圧の差動出力を増幅することによ
って、試料Ｓ液中のＡＴＰ濃度を測定することができる
。 以下、本発明のＡＴＰセンサーを実施例に、もとづき説
明する。 実施例１ ポリビニルアルコールの水酸基にＮ−メチル一一−ホル
ミルスチリルビリノニウムメトサル７エー）を付加（付
加率はポリビニルアルコールの水酸基に対して０．８毫
ル％）させた感光性ｍ脂（布材、特開昭５６−５７６１
号公報に記載）の５重量％水溶液を調製した。この水溶
９０．２ｍ＆に＾Ｔｆ’ａａｅ ２０ｔｇと牛血清アル
ブミン２０Ｈｇとを溶解し、均一な溶液とした。 この酵素・感光性樹脂混合水溶液を第１図に示す（８）
の部分に、第１１！Ｉに示すようにソース（２）とドへ
、イア（３）＆、、、６□、１ｌ−
ＩＳＦＥＴ、）やや、や１部分、すなわちイオン感応面
をおおうように広く塗布し、スピナーを用いて均一な膜
にするとともに乾燥せしめた。そののち、３４０ｎｗ以
下の波長の光をカットした３５０Ｗの水銀灯を眉い、５
分ｌｌｌ１！！素・感光性樹脂混合物に光照射しでＡＴ
Ｐａｓｅｆｉ定化膜を形成した。 つぎにこの固定化膜の機械的強度を増大させる推作を行
なった。すなわち、２５％のグルグルアルデヒド水ＷＩ
液中にＡＴＰａｇｅ固定化膜を１５分間浸漬し、たん白
質分子間を共有結合により相互架ｇ４させた。 二のＡＴＰａｇｅ固定化膜を充分水洗し、さらに残存す
るグルタルアルデヒドを除くために０．１モル％のグリ
シン水溶液に１５分間浸漬した。ついでこのＡＴＰセン
サーを水洗した。 以上のようにして作製したＡＴＰセンサーの応答特性を
２０ｇＮ ）リス（ヒドロキシメチル７ミノメタン）−
ＨＣＺ緩衝［（ｐ１１８．ｏ）を用いでＡＴＰ濃度１０
μＭ〜１０ｘＭ（５ｍｇ〜５ｇ＃）の範囲で検討した。 結果（検Ｉｌ線）を第３図に示す、なお該ＡＴＰセンサ
ーの応答は迅速でありた。またこのセンサーの寿命を評
価したところ、１力月後の出力低下は、はとんどなかつ
た。 １）図から本発明のＡＴＰセンサーは１ｘＨ程度の範囲
のＡＴＰａ１度に対して、直ＭＥ！；答すること力ずわ
かる。 前記実施例においてはデート電圧を与えるものとしてｔ
金属を用いたが、銀・塩化銀電極などの安定な参照電極
を用いでも良い。 〔発明の効果１ 以上のように本発明のＡＴＰセンサーでは、ＡＴＰ加水
分解酵素を水素イオン感応電極と岨み合わせているので
、ＡＴＰ濃度を簡単かつ迅速に、高選択性を持って測定
することができゐ、またＡＴＰ加水加水分解色素て耐熱
性ＡＴＰａｇｅを使用し、それをｐＨ−ｌ５ＦＥＴ上に
感光性樹脂を用いて固定化膜として形成するばあいには
、小型化、マルチセンサー化が容易で、長寿命を有する
ＡＴＰセンサーかえられる。
第１図は本発明のＡＴＰセンサーの一実施態様に関する
説明図、第２図は本発明のＡＴＦセンサーに用いる下地
電極の一実施態様であるＤＩｌ−ＩＳＦＥＴ素子に関す
る説明図、第３図は実施例１でえちれたＡＴＰセンサー
のＡＴＰ１１度と出力との関係を示すグラフ、１４図は
高速液体クロマトグラフィにょるＡＴＰの分離例を示す
グラフ′Ｃ″ある。 図中、（１）はｐＨ−ｌ５ＦＥＴ素子、（８）はＡＴＰ
加水分解酵素固定化膜である。なお、各図中の同一符号
は同一または相当部分を示す。 代理人 大 岩 ｔｌ！ 雄 １ ： ｖＨ−ＩＳＦＥＴ素子 へ ２．４・ソース ３．５： ドレイン ８：固定比獲 手続補正書（自発） １．事件の表示 特願昭 ５９−２４６８１）号２
、発明の名称 ＡＴＰセンサー ３、補正をする者 ４、代理人 ５、補正の対象 （１）明細書の「発明の詳細な説明」の欄■図面 ６、補正の内容 （１）明細書４頁１）〜１４行の「ＡＴＰの一一−−−
−また」を削除する。 ■同６頁２行の「クロロプラスト」を「クロロプラスト
、筋肉組織」と補正する。 の）同７頁１７〜１８行の「寒天−一一一一一方法」を
［ウシ血清アルブミンなどのマトリックスと混合してグ
ルタルアルデヒドなどで化学架橋する方法」と補正する
。 （４）同１）頁２行の「ＩＩＮ」をｒｌｏ＊ＭＪと補正
する。 Ｇ）図面（第３図）を別紙補正図面（第３図）のとおり
の補正する。 ７、添付書類の目録
説明図、第２図は本発明のＡＴＦセンサーに用いる下地
電極の一実施態様であるＤＩｌ−ＩＳＦＥＴ素子に関す
る説明図、第３図は実施例１でえちれたＡＴＰセンサー
のＡＴＰ１１度と出力との関係を示すグラフ、１４図は
高速液体クロマトグラフィにょるＡＴＰの分離例を示す
グラフ′Ｃ″ある。 図中、（１）はｐＨ−ｌ５ＦＥＴ素子、（８）はＡＴＰ
加水分解酵素固定化膜である。なお、各図中の同一符号
は同一または相当部分を示す。 代理人 大 岩 ｔｌ！ 雄 １ ： ｖＨ−ＩＳＦＥＴ素子 へ ２．４・ソース ３．５： ドレイン ８：固定比獲 手続補正書（自発） １．事件の表示 特願昭 ５９−２４６８１）号２
、発明の名称 ＡＴＰセンサー ３、補正をする者 ４、代理人 ５、補正の対象 （１）明細書の「発明の詳細な説明」の欄■図面 ６、補正の内容 （１）明細書４頁１）〜１４行の「ＡＴＰの一一−−−
−また」を削除する。 ■同６頁２行の「クロロプラスト」を「クロロプラスト
、筋肉組織」と補正する。 の）同７頁１７〜１８行の「寒天−一一一一一方法」を
［ウシ血清アルブミンなどのマトリックスと混合してグ
ルタルアルデヒドなどで化学架橋する方法」と補正する
。 （４）同１）頁２行の「ＩＩＮ」をｒｌｏ＊ＭＪと補正
する。 Ｇ）図面（第３図）を別紙補正図面（第３図）のとおり
の補正する。 ７、添付書類の目録
Claims (6)
- （１）ＡＴＰ加水分解酵素および水素イオン感応電極を
組み合わせたことを特徴とするＡＴＰセンサー。 - （２）ＡＴＰ加水分解酵素がアデノシントリホスファタ
ーゼ（ＡＴＰａｓｅ）である特許請求の範囲第（１）項
記載のＡＴＰセンサー。 - （３）ＡＴＰａｓｅが水素イオン感応電極に固定化され
ている特許請求の範囲第（２）項記載のＡＴＰセンサー
。 - （４）ＡＴＰａｓｅが耐熱性ＡＴＰａｓｅである特許請
求の範囲第（２）項または第（３）項記載のＡＴＰセン
サー。 - （５）水素イオン感応電極が水素イオン感応性電界効果
型トランジスター（ｐＨ−ＩＳＦＥＴ）である特許請求
の範囲第（１）項記載のＡＴＰセンサー。 - （６）ＡＴＰ加水分解酵素および水素イオン感応電極が
それぞれＡＴＰａｓｅおよびｐＨ−ＩＳＦＥＴであり、
感光性樹脂を用いてＡＴＰａｓｅをｐＨ−ＩＳＦＥＴ上
に固定化されている特許請求の範囲第（１）項記載のＡ
ＴＰセンサー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59246813A JPS61122560A (ja) | 1984-11-19 | 1984-11-19 | Ａｔｐセンサ− |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59246813A JPS61122560A (ja) | 1984-11-19 | 1984-11-19 | Ａｔｐセンサ− |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61122560A true JPS61122560A (ja) | 1986-06-10 |
Family
ID=17154066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59246813A Pending JPS61122560A (ja) | 1984-11-19 | 1984-11-19 | Ａｔｐセンサ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61122560A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02195241A (ja) * | 1989-01-25 | 1990-08-01 | Nok Corp | Ａｔｐセンサ |
| WO2002025262A1 (fr) * | 2000-09-25 | 2002-03-28 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Electrode a enzyme |
| JP2009229379A (ja) * | 2008-03-25 | 2009-10-08 | Bio X:Kk | Ｉｓｆｅｔを用いるａｔｐアーゼ活性の計測方法並びに計測システム |
| JP2013235014A (ja) * | 2009-04-21 | 2013-11-21 | Univ Of Tokyo | 微生物の数または量を測定する方法および装置 |
| WO2017073783A1 (ja) * | 2015-10-30 | 2017-05-04 | 国立大学法人豊橋技術科学大学 | センサ |
-
1984
- 1984-11-19 JP JP59246813A patent/JPS61122560A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02195241A (ja) * | 1989-01-25 | 1990-08-01 | Nok Corp | Ａｔｐセンサ |
| WO2002025262A1 (fr) * | 2000-09-25 | 2002-03-28 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Electrode a enzyme |
| JPWO2002025262A1 (ja) * | 2000-09-25 | 2004-01-29 | 旭化成株式会社 | 酵素電極 |
| US7169273B2 (en) | 2000-09-25 | 2007-01-30 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Enzyme electrode |
| JP4721618B2 (ja) * | 2000-09-25 | 2011-07-13 | 旭化成株式会社 | 酵素電極 |
| JP2009229379A (ja) * | 2008-03-25 | 2009-10-08 | Bio X:Kk | Ｉｓｆｅｔを用いるａｔｐアーゼ活性の計測方法並びに計測システム |
| JP2013235014A (ja) * | 2009-04-21 | 2013-11-21 | Univ Of Tokyo | 微生物の数または量を測定する方法および装置 |
| WO2017073783A1 (ja) * | 2015-10-30 | 2017-05-04 | 国立大学法人豊橋技術科学大学 | センサ |
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