WO2017073783A1 - センサ - Google Patents

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ion
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澤田　和明
弘一 奥村
宥奈 李
Original Assignee
国立大学法人豊橋技術科学大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS

Definitions

  • the present invention relates to an improvement in a sensor including an array of pixels that detect ions to be observed including an object to be measured.
  • adenosine triphosphate which may be abbreviated as “ATP” in this specification
  • ATP adenosine triphosphate
  • apyrase which is an ATP degrading enzyme, was immobilized on a pH image sensor. When ATP is expressed on the surface of the sample cell, this apyrase hydrolyzes ATP and generates hydrogen ions.
  • FIG. 1 shows the result of observing slices of rat hippocampal cells given ionomycin stimulation with a Sawada chip (fixed with apyrase) as a pH image sensor. From the results in FIG. 1, an increase in the hydrogen ion concentration was confirmed.
  • FIG. 2 shows changes in the hydrogen ion concentration when glutamate stimulation was applied.
  • a decrease in the hydrogen ion concentration is observed after 60 seconds.
  • This decrease in the hydrogen ion concentration is considered to be influenced by the glutamate transporter described above. Incidentally, when there is no stimulation, no change is observed in the hydrogen ion concentration as shown in FIG.
  • a sensor comprising an array of pixels for detecting ions to be observed including an object to be measured
  • the first pixel of the pixels constituting the array is covered with a first film that detects the first ions and transmits the first ions
  • the second pixel of the pixels constituting the array is covered with a second film that detects the first ions and transmits the first ions, or the second pixels are exposed.
  • the first detection time required for the first pixel to be detected by the first pixel on the surface of the first film is the surface of the second film or the exposed second Unlike the second detection time required for the first pixel existing on the surface of the pixel to be detected by the second pixel, A sensor in which a first ion control substance that acts on the object to be measured and changes the amount of the first ions to be observed is held on the first film.
  • the second pixel when the first ion appears in the observation target, when the second pixel is exposed, the second pixel is the first ion first. Detect presence. Next, the first pixel detects the presence of the first ion. This time difference is equal to the first detection time.
  • the second pixel is covered with the second film, the pixel covered with the film having a short detection time is detected first due to the difference between the first detection time and the second detection time.
  • the concentration of the first ions obtained from the outputs of the first pixel and the second pixel is the same regardless of the presence or absence of the coating and the thickness. As described above, there is a difference in detection time between the first pixel and the second pixel with respect to the same ion species (first ions).
  • the first ion controlling substance (for example, apyrase) of the first film reacts with the ATP. Therefore, the first ions are first detected by the first pixel. Since the first ions generated in this manner are diffused, they are subsequently detected in the second pixel. That is, in the first pixel, hydrogen ions generated by the decomposition of ATP are first detected, and then the hydrogen ions directly present in the observation target that has diffused through the first film are observed. These time differences are equal to the first detection time.
  • the second pixel is calculated based on the time difference between the first detection time and the second detection time from the hydrogen ion concentration obtained from the output of the first pixel.
  • the hydrogen ion concentration (hydrogen ion concentration directly present in the observation target) obtained from the output of the pixel 2 is subtracted.
  • the second detection time is sufficiently shorter than the time required for hydrogen ions generated by the decomposition of ATP in the first film to diffuse into the second pixel.
  • the second film is thinner than the first film or is not present.
  • the output of the second pixel is the hydrogen ion concentration directly present in the observation object before the diffusion time, and the second pixel after the diffusion time.
  • the first ion generated by the action of the first ion controlling substance held in the first film is obtained. Changes in the amount (concentration changes) can be observed.
  • the first ion controlling substance is not limited to the substance that acts on the object to be measured and generates the first ions (that is, increases the amount thereof), but the substance that decreases the amount of the first ions. But you can. That is, if the hydrogen ion concentration changes in proportion to the amount of the object to be measured or in other relations, the amount of the object to be measured can be specified from the change in the hydrogen ion concentration.
  • the first ion controlling substance is a proteolytic enzyme, and decomposes a predetermined protein as the object to be measured to generate the first ion.
  • the proteolytic enzyme is held in the first film, plants, animals and even human cells can be observed.
  • the protein is a biological protein.
  • the fourth aspect of the present invention is defined as follows. That is, In the sensor defined in any one of the first to third aspects, the second pixel is disposed close to the first pixel and at a predetermined interval. According to the sensor of the third aspect defined in this way, since the first pixel and the second pixel are close to each other, substantially the same region to be observed is defined as the first pixel and the second pixel. It can be observed with pixels. In addition, when an array is configured by two-dimensionally arranging the first pixel and the second pixel, the first pixel and the second pixel are made constant by keeping the interval between the first pixel and the second pixel constant.
  • the influence of the change in the first ion amount applied by the ion control substance of the pixel on the output of the second pixel can be made constant, that is, the diffusion time from the first pixel to the second pixel is arrayed. Since it can be made uniform throughout, the calculation of the first ion amount is facilitated.
  • the fifth aspect of the present invention is defined as follows. That is, In the sensor defined in any one of the first to fourth aspects, a third pixel of the pixels constituting the array detects a first ion and transmits a third ion that transmits the first ion.
  • the third detection time required for the first pixel to be detected by the third pixel is different from the second detection time, which is covered with a film and is present on the surface of the third film.
  • the third film holds a second ion control substance that acts on another object to be measured included in the observation target and changes the amount of the first ions.
  • the first object to be measured in which the first ion controlling substance (for example, apyrase) generates the first ion (hydrogen ion).
  • a second pixel control substance acetylcholinesterase (AChE)) that generates a first ion (hydrogen ion) for a second object to be measured (for example: acetylcholine (ACh)) different from the third pixel
  • the film (the third film) is held.
  • the time required for detecting the first ion on the surface of the third film by the third pixel is different from the second detection time of the second pixel.
  • the second ion controlling substance acts on the third film covering the third pixel and the first ions are released, the first ions are first detected by the third pixel. Then, the second pixel is observed.
  • the timing at which the first ion is observed by the third pixel depends on the third detection time of the third film. In other words, only the first ions resulting from the action of the second ion control substance are detected from the start of detection (the sensor is brought into contact with the observation target) to the third detection time. After the third detection time has elapsed, the amount of the first ions obtained from the output of the second pixel may be subtracted.
  • Both the first ion control substance held in the first film of the first pixel and the second ion control substance held in the third film of the third pixel change the amount of the first ions. Therefore, the influence extends to the second pixel.
  • the effect of the first ions between the first pixel and the third and second pixels is exclusively due to diffusion. Therefore, in order to specify the amount of the first ions that are directly included in the observation target in the second pixel, it is preferable that the influence from the first pixel can be distinguished from the influence from the third pixel.
  • a segment of the first pixel and the second pixel and a segment of the third pixel and the second pixel may be formed to substantially prevent the diffusion of the first ions between the segments. It can. Examples of the prevention method include disposing an ion adsorbent between the segments and taking a distance between the segments.
  • FIG. 1 shows the results of observing slices of rat hippocampal cells stimulated with ionomycin using a pH image sensor immobilized with apyrase.
  • the central part (white part) of the upper right photograph shows hippocampal cells, and the lower left chart shows that the hydrogen ion concentration increases with the increase in the concentration of ATP expressed on the hippocampal cells.
  • FIG. 2 also shows the observation results of hippocampal cells stimulated with glutamic acid.
  • the white part at the center of the lower left photograph is the hippocampal cell, and the lower right chart shows that the hydrogen ion concentration on the hippocampal cell surface is once lowered after stimulation.
  • FIG. 3 shows the observation results of hippocampal cells when no stimulation is performed.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a method for manufacturing a sensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a plan view of the sensor obtained by the manufacturing method shown in FIG.
  • FIG. 6 shows the relationship between the thickness of the first film and the output of the first pixel in the sensor of the embodiment.
  • FIG. 7 shows the relationship between the power of ultraviolet rays and the output of the first pixel during ultraviolet curing.
  • FIG. 9 shows the change over time of diffusion of hydrogen ions from the first pixel to the second pixel.
  • FIG. 10 is a schematic view showing a sensor manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing the configuration of one pixel of the Sawada chip, and the sensor has pixels of such a structure arranged two-dimensionally.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing the operation of the pixel of FIG.
  • the Sawada chip 1 is used as a pH image sensor 1 having an array of pixels for detecting hydrogen ions.
  • the structure of this Sawada chip 1 will be described later (see Patent Document 1 and Patent Document 2).
  • the Sawada chip 1 that is the basis of the sensor according to the embodiment of the present invention includes an array of 128 ⁇ 128 pixels.
  • a general-purpose silicon nitride film is laminated as a hydrogen ion sensitive film in the sensing area of each pixel.
  • This hydrogen ion sensitive membrane changes the potential of the sensing area according to the hydrogen ion concentration. It goes without saying that the sensitive film stacked in the sensing area of each pixel can be appropriately selected according to the ion species to be detected.
  • a first film 7 is formed on the surface of the Sawada chip, that is, on the hydrogen-sensitive film as shown in FIGS. 4B and 4C (see FIG. 4D).
  • the material for forming the first film 7 is a composition in which a first ion generating substance (first ion controlling substance) that generates first ions is dispersed and held in a resin matrix.
  • the resin matrix can be arbitrarily selected as long as it does not deactivate the first ion generating substance and can transmit the first ions generated by the first ion generating substance.
  • the first ion generating substance acts on a measurement object generated in an observation target (for example, a biological tissue) and generates first ions from the measurement object.
  • Degrading enzyme that hydrolyzes these substances to generate hydrogen when the object to be measured is a neurotransmitter such as adenosine triphosphate (ATP), acetylcholine (ACh), or ⁇ -aminobutyric acid (GABA).
  • ATP adenosine triphosphate
  • ACh acetylcholine
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • the blending ratio of the resin matrix and the first ion generating substance can be arbitrarily set according to the observation object, the observation conditions, and the like.
  • PVA-AWP that can be highly cross-linked is adopted for the resin matrix, and apyrase is adopted as the first ion generating substance, and ATP expressed in the cells is observed.
  • the compounding ratio of the resin matrix and the apyrase was 4: 1 (volume ratio).
  • FIG. 4C shows a plane photograph (including a partially enlarged view and a sectional view) of the obtained pH image sensor.
  • the area and shape of the first film 7 (that is, the shape of the opening of the photomask 3) can be arbitrarily designed according to the observation object, the observation conditions, and the like.
  • the thickness of the first coating 7 is preferably 0.05 ⁇ m to 2.5 ⁇ m. If this film thickness is less than 0.05 ⁇ m, hydrogen ions in the external environment (that is, hydrogen ions present on the surface of the first coating 7) are immediately detected by the first pixel, and the exposed first It becomes difficult to obtain a significant time difference from the detection time of the hydrogen ions by the two pixels. On the other hand, when the film thickness exceeds 2.5 ⁇ m, the response time to ATP expressed in the external environment may be delayed.
  • the film thickness is preferably 0.2 ⁇ m to 0.6 ⁇ m (see FIG. 6).
  • the power of ultraviolet light for curing the spin coat film 5 is preferably 1000 mJ / cm 2 or more. This is because if the power is less than 1000 mJ / cm 2 , sufficient output cannot be obtained for the first pixel (see FIG. 7).
  • the output of the first pixel covered with the first film 7 does not change.
  • second detection time 0 second).
  • FIG. 9 shows how hydrogen ions diffuse between the first pixel and the second pixel.
  • the portion described as “No membrane” indicates the second pixel, and the first pixel is arranged on both sides thereof.
  • a high output is obtained from the first pixel after one second.
  • the output of the second pixel increases with time. This is because the apyrase of the first film covering the first pixel hydrolyzes ATP to generate hydrogen ions, and the hydrogen ions diffuse.
  • the concentration can be specified. From the result of FIG. 9, it is preferable that the distance between the first pixel and the second pixel is 100 ⁇ m or more.
  • the distance between the two is less than 100 ⁇ m, the time for hydrogen ions on the first pixel to diffuse to the second pixel becomes too early, and it becomes difficult to compare the outputs of the two pixels.
  • the distance between the two is preferably 150 ⁇ m or less. This is because the detection time between the first pixel and the second pixel hardly changes even when the thickness exceeds 150 ⁇ m.
  • the second pixel since the second pixel is exposed, the observation of hydrogen ions by the second pixel is executed in real time. From the point of view of the present invention, in which the observation target hydrogen ion is observed with a difference in detection time between the first pixel and the second pixel, the second pixel is obtained after ensuring the detection time difference.
  • the third film 9 is formed by performing spin coating and photolithography under the same conditions as in the example shown in FIG.
  • PCh-AWP is used as a resin matrix
  • AChE as a second ion generating material is dispersed and held.
  • This AChE is a degrading enzyme that degrades acetylcholine.
  • ATP and ACh as neurotransmitters can be observed simultaneously.
  • the second pixel can be covered with the second film.
  • FIG. 11 shows the basic configuration of each pixel of this pH image sensor.
  • Each pixel 10 of the pH image sensor includes a silicon substrate 11 and a structure layered thereon.
  • a charge supply adjustment (ICG) region 13 In the silicon substrate 11, a charge supply adjustment (ICG) region 13, a diffusion layer 14, a sensing region 15, and a charge transfer control (TG) region 16 are sequentially arranged from the charge supply (ID) region 12 into which charges are injected.
  • the charge storage (FD) region 17 is partitioned. The division of each region is defined by the difference in semiconductor type on the surface of the silicon substrate 11.
  • the charge supply (ID) region 12 the diffusion layer 14 and the charge storage (FD) region 17 are n + -type regions, and the charge supply adjustment (ICG) region 13 and the sensing region 15. Is a p-type region.
  • the charge accumulation region 17 is connected to a reset unit 18 that discharges the accumulated charge and a charge amount detection unit 19 that detects the accumulated charge amount.
  • a general-purpose circuit is employed for the reset unit 18 and the charge detection unit 19.
  • a silicon oxide insulating film 21 is laminated on the surface of the substrate 11, and an ICG electrode 25 for controlling the electric potential of the charge supply adjustment region 13 is laminated on the opposite surface of the charge supply adjustment region 13.
  • a TG electrode 26 for controlling the potential is laminated at a position opposite to the control region 16.
  • a silicon nitride film 23 is laminated as a hydrogen ion sensitive film in a portion corresponding to the sensing region 15. Since the silicon nitride film 23 is formed after the ICG electrode 25 and the TG electrode 26, these electrodes are also covered.
  • the area and planar shape of each region, the amount of dopant introduced, and the material of the sensitive film can be arbitrarily designed in consideration of the measurement object of the sensor, measurement conditions, required sensitivity, and the like.
  • FIG. 12A shows a reset state.
  • the reset gate RG of the reset unit 18 is at a high potential, and charges in the charge accumulation (FD) region (hereinafter sometimes simply referred to as “FD region”) 17 are discharged to the outside.
  • FIG. 12B shows a standby state. In this standby state, the reset gate RG of the reset unit 18 becomes a low potential, and the FD region 17 enters a state where charges can be accumulated.
  • FIGS. 12C and 12D show the measurement state. As a premise of this state, the potential of the sensing region 15 changes depending on the external environment (pH of the measurement target). First, as shown in FIG.
  • ICG region when charges (in this case, electrons) are injected from a charge supply (ID) region (hereinafter, sometimes simply referred to as “ID region”) 12, the charge is adjusted to charge supply (ICG ) When the region 13 (hereinafter sometimes simply referred to as “ICG region”) 13 is reached to the sensing region 15 and then the charge supply from the ID region 12 is stopped as shown in FIG. The charge on the top is worn out to the ICG region 13. At this time, the potential difference between the ICG region 13 and the sensing region 15 depends on the pH of the measurement target, and an amount of charge corresponding to the potential difference remains on the sensing region 15.
  • the potential of the diffusion layer 14 is set sufficiently higher than the potential of the sensing region 15, no potential barrier is formed between the ICG region 13 and the sensing region 15.
  • charges are also present in the diffusion layer 14 and the injected charges remain on the diffusion layer 14, but this is also due to the potential difference between the ICG region 13 and the sensing region 15.
  • the amount of charge defines the pH value of the detection target. In other words, the charge existing in the charge well formed by the diffusion layer 14 does not affect the charge amount that defines the pH value.
  • FIGS. 12E and 12F show the charge transfer state.
  • the potential of the charge transfer control (TG) region (hereinafter sometimes simply referred to as “TG” region) 16 is increased, and the remaining charge in the state of FIG. It may be simply referred to as “FD area”) 17.
  • TG charge transfer control
  • FD area the remaining charge in the state of FIG. It may be simply referred to as “FD area”.

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Abstract

サンプル細胞における細胞伝達物質の変化をイメージングすることに適したセンサを提供する。　被測定物を含む観察対象のイオンを検出する画素のアレイを備えるセンサであって、アレイを構成する画素のうちの第１の画素は第１のイオンを検出し、該第１のイオンを透過させる第１の被膜で被覆されており、アレイを構成する画素のうちの第２の画素は前記第１のイオンを検出し、第１のイオンを透過させる第２の被膜で被覆されているか、若しくは第２の画素は表出しており、第１の被膜の表面に存在する第１のイオンが第１の画素に検出されるのに要する第１の検出時間は、第２の被膜の表面または表出した第２の画素の表面に存在する第１のイオンが第２の画素に検出されるのに要する第２の検出時間と異なり、第１の被膜には、被測定物に作用して観察対象の前記第１のイオンの量を変化させる第１のイオン制御物質が保持される、センサ。

Description

センサ
　本発明は、被測定物を含む観察対象のイオンを検出する画素のアレイを備えるセンサの改良に関する。
　神経伝達物質の細胞間での挙動を解明することは創薬や脳科学の分野で強く求められている。かかる挙動の研究手法として、本発明者らは神経伝達物質の挙動をイメージングすることについて提案してきた。
　神経伝達物質の一例としてアデノシン三リン酸（この明細書で「ＡＴＰ」と略することがある）を採り上げ、スライスしたラットの海馬細胞へ刺激を与えたときにこのサンプル細胞から放出されるＡＴＰの分布を把握する。そのため、ＡＴＰの分解酵素であるアピラーゼをｐＨイメージセンサ上に固定した。サンプル細胞の表面にＡＴＰが発現すると、このアピラーゼがＡＴＰを加水分解して水素イオンを発生させる。
　この水素イオンの濃度分布がｐＨイメージセンサで観察される。即ち、水素イオンはＡＴＰに起因しているので、観察された水素イオン濃度の分布がＡＴＰの濃度分布を示していると考えられた（非特許文献１及び２参照）。
　この観察に使用されるｐＨイメージセンサには、微量なＡＴＰの濃度変化（即ち、水素イオンの濃度変化）を観察できる高感度性、更には、そのＡＴＰの濃度変化をリアルタイムで観察するための高い応答性、並びに微小領域での変化を観察するための高い分解能が要求される。かかる要求を満足するｐＨイメージセンサとして、いわゆる澤田チップが提案されている（特許文献１）。
　その他、本願発明に関連する文献として、特許文献２－４を参照されたい。
特許第４１７１８２０号公報 特開２０１０－２４３２９９号公報 特開平８－３２７５８７号公報 特開平９－１５１９１号公報
Shoko TAKENAGA et al., LABEL-FREE REAL TIME IMAGING OF NEURAL COMMUNICATION USING ACETYLCHOLINE IMAGE SENSOR, Proc. of Transducer’s11, pp. 954-957, Beijing, Chine, June 5-9, 2011 Kazuhiro TAKAHASHI, Shoko TAKENAGA et al., Label-Free Acetylcholine Image Sensor Based on Charge Transfer Technology for Biological Phenomenon Tracking, Japanese Journal of Applied Physics 51, 027001 1-5, (2012), DOI:10.1143/JJPAP.51.027001
　上記の観察では、サンプル細胞に刺激を加えたとき、サンプル細胞表面にはＡＴＰのみが発現し、もって、ｐＨイメージセンサが観察した水素イオン濃度の変化はこのＡＴＰの濃度変化に対応していることを前提とした。
（勿論、刺激により他の神経伝達物質や他のタンパク質もサンプル細胞の表面に発現すると考えられるが、これらはｐＨイメージセンサで観察される水素イオン濃度に何ら関与しないので、その説明は省略する、以下同様）
　しかしながら、刺激を与えられたサンプル細胞が水素イオン自体を放出若しくは吸収する可能性があることがわかった。例えば、グルタミン酸により細胞を刺激したとき、細胞が備えるグルタミン酸トランスポータが刺激されてこれが細胞外からグルタミン酸やナトリウムイオンとともに水素イオンを細胞内へ取り込むと予想される。
　図１は、イオノマイシンの刺激が与えられたラットの海馬細胞のスライスをｐＨイメージセンサとしての澤田チップ（アピラーゼを固定している）で観測した結果を示す。図１の結果から、水素イオン濃度の上昇が確認できた。これは、イオノマイシンの刺激を受けたサンプル細胞の表面にＡＴＰが出現し、このＡＴＰが澤田チップのアピラーゼで加水分解されて、水素イオン濃度が上昇し、その上昇がｐＨイメージセンサで観察されたものである。
　他方、図２に、グルタミン酸の刺激を与えたときの水素イオン濃度変化を示す。図２の結果では、６０秒後に水素イオン濃度の低下がみられる。この水素イオン濃度の低下は既述したグルタミン酸トランスポータが影響しているものと考えられる。
　ちなみに、何ら刺激がないときは、図３に示す通り、水素イオン濃度に変化は見られない。
　以上の結果から、細胞表面の神経伝達物質の濃度変化を分解酵素により水素イオン濃度の変化に変換してこれをｐＨイメージセンサにより観察する手法では、細胞自体に起因する水素イオンがその観察結果に影響しているおそれがあることがわかった。
　換言すれば、分解酵素の作用に起因する水素イオンの濃度と、細胞自体に起因する水素イオン濃度とを峻別して観察することが望まれる。他方、前者のイオン濃度の観察時に後者のイオン濃度の影響をキャンセルできれば、前者の水素イオン濃度の変化を正確に観察できることとなる。
　この発明は、上記目的を達成すべくなされたものであり、その第１の局面は次のように規定される。即ち、
　被測定物を含む観察対象のイオンを検出する画素のアレイを備えるセンサであって、
　前記アレイを構成する画素のうちの第１の画素は前記第１のイオンを検出し、該第１のイオンを透過させる第１の被膜で被覆されており、
　前記アレイを構成する画素のうちの第２の画素は前記第１のイオンを検出し、該第１のイオンを透過させる第２の被膜で被覆されているか、若しくは該第２の画素は表出しており、
　前記第１の被膜の表面に存在する前記第１のイオンが前記第１の画素に検出されるのに要する第１の検出時間は、前記第２の被膜の表面または表出した前記第２の画素の表面に存在する前記第１のイオンが第２の画素に検出されるのに要する第２の検出時間と異なり、
　前記第１の被膜には、前記被測定物に作用して前記観察対象の前記第１のイオンの量を変化させる第１のイオン制御物質が保持される、センサ。
　このように規定される第１の局面のセンサによれば、観察対象に第１のイオンが出現すると、第２の画素が表出しているときは最初に第２の画素が第１のイオンの存在を検出する。次に、第１の画素が第１のイオンの存在を検出する。この時間差は、第１の検出時間に等しい。第２の画素が第２の被膜で被覆されているときは第１の検出時間と第２の検出時間の差分により、検出時間の短い被膜で被覆された画素が最初に検出する。第１の画素と第２の画素の出力から得られる第１のイオンの濃度は、被膜の有無や厚さに関係なく等しい。
　このように同じイオン種（第１のイオン）に対して第１の画素と第２の画素とで検出時間に差が生じている。
　これに対し、観察対象において他の変化、例えば被測定物としての生体タンパク質としてＡＴＰの出現があったときは、第１の被膜の第１のイオン制御物質（例えばアピラーゼ）が当該ＡＴＰと反応して第１のイオン（水素イオン）を発生させるので、最初に第１の画素により第１のイオンが検出される。このように発生した第１のイオンは拡散するので、その後に第２の画素において検出されることとなる。即ち、第１の画素では最初にＡＴＰの分解により発生した水素イオンが検出され、その後、第１の被膜を拡散してきた観察対象に直接存在する水素イオンが観察される。これらの時間差は第１の検出時間に等しい。このセンサを観察対象に接触させた時より第１の検出時間の間は、ＡＴＰの分解により発生した水素イオンのみが観察されている。
　第１の検出時間経過後においては、第１の被膜を拡散してきた観察対象に直接存在する水素イオンの影響が現れる。ここに、表出した第２の画素は観察対象に直接存在する水素イオンをリアルタイム（第２の検出時間＝０）で観察しているので、第２の画素の出力から得られた水素イオン濃度を、第１の画素の出力から得られた水素イオン濃度から減算すれば、第１の画素においてＡＴＰの分解のみにより発生した水素イオン濃度が得られることとなる。
　第２の画素が第２の被膜で被覆されているときにも、第１の検出時間と第２の検出時間の時間差に基づいて、第１の画素の出力から得られた水素イオン濃度より第２の画素の出力から得られた水素イオン濃度（観察対象に直接存在する水素イオン濃度）を減算する。
　なお、第２の検出時間は、第１の被膜においてＡＴＰの分解により発生した水素イオンが第２の画素に拡散してくるまでの時間よりも充分短いものとする。そのためには、第２の被膜は第１の被膜より薄いか、若しくは当該被膜は無いことが好ましい。
　他方、ＡＴＰの分解により第１の被膜において発生した水素イオンが拡散するので、その影響が第２の画素にも現れる。この場合、当該拡散に要する時間が予め特定できれば、当該拡散時間前においては、第２の画素の出力は観察対象に直接存在する水素イオン濃度であり、当該拡散時間後においては、第２の画素の出力から得られた水素イオン濃度より、既述のようにして第１の画素において特定されたＡＴＰの分解のみにより発生した水素イオン濃度を減算することにより、水素イオン濃度の変化を特定可能となる。
　以上より、第１の画素の検出結果と第２の画素の検出結果とを比較することにより、第１の被膜に保持された第１のイオン制御物質が作用して生じた第１のイオンの量の変化（濃度変化）を、観察可能となる。
　上記において、第１のイオン制御物質は、被測定物に作用して第１のイオンを発生させる（即ち、その量を増大させる）ものに限定されず、当該第１のイオン量を減少させるものでもよい。即ち、被測定物の量に比例して、若しくはその他の関係をもって水素イオン濃度が変化すれば、この水素イオン濃度の変化より被測定物の量を特定できるからである。
　この発明の第２の局面のセンサは次のように規定される。即ち。
　第１の局面で規定のセンサにおいて、前記第１のイオン制御物質はタンパク質分解酵素であり、前記被測定物としての所定のタンパク質を分解して前記第１のイオンを生じさせる。
　このように規定される第２の局面の発明によれば、第１の被膜にタンパク質分解酵素を保持させたので、植物、動物更にはヒトの細胞を観察対象とすることができる。
　第３の局面では、タンパク質が生体タンパク質であることを規定した。
　この発明の第４の局面は次のように規定される。即ち、
　第１～３の何れかの局面で規定のセンサにおいて、前記第２の画素は前記第１の画素に近接して、かつ所定の間隔に配置される。
　このように規定される第３の局面のセンサによれば、第１の画素と第２の画素とが近接しているので、実質的に同じ観察対象の領域を第１の画素と第２の画素とで観察できる。また、第１の画素と第２の画素と二次元的に配置してアレイを構成するとき、対応する第１の画素と第２の画素との間隔を一定にしておくことにより、第１の画素のイオン制御物質が作用した第１のイオン量の変化が第２の画素に出力に与える影響を一定にすることができるので、即ち第１の画素から第２の画素への拡散時間をアレイ全体において均一化できるので、第１のイオン量の算出が容易になる。
　この発明の第５の局面は次のように規定される。即ち、
　第１～第４の何れかの局面に規定のセンサにおいて、前記アレイを構成する画素のうちの第３の画素は前記第１のイオンを検出し、該第１のイオンを透過させる第３の被膜で被覆されており、該第３の被膜の表面に存在する前記第１のイオンが前記第３の画素に検出されるのに要する第３の検出時間は前記第２の検出時間と異なり、　前記第３の被膜には前記観察対象に含まれる他の被測定物に作用して前記第１のイオンの量を変化させる第２のイオン制御物質が保持されている。
　このように規定される第５の局面に規定のセンサによれば、第１のイオン制御物質（例えば、アピラーゼ）が第１のイオン（水素イオン）を発生させる第１の被測定物（ＡＴＰ）とは異なる第２の被測定物（例えば：アセチルコリン（ＡＣｈ））に対して、第１のイオン（水素イオン）を発生させる第２のイオン制御物質（アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ））を第３の画素の被膜（第３の被膜）に保持させる。
　第３の被膜において、その表面の第１のイオンが第３の画素に検出されるのに要する時間（第３の検出時間）は、第２の画素の第２の検出時間と異なる。これにより、第３の画素を被覆する第３の被膜において第２のイオン制御物質が作用して第１のイオンが放出されたとき、この第１のイオンは最初に第３の画素に検出され、その後第２の画素で観察される。他方、観察対象に直接第１のイオンが存在していると、その第１のイオンが第３の画素に観察されるタイミングは、第３の被膜の第３の検出時間に依存する。換言すれば、検出開始（センサを観察対象に接触させて）から第３の検出時間までは、第２のイオン制御物質の作用に起因する第１のイオンのみが検出される。第３の検出時間経過後は、第２の画素の出力から得られた第１のイオンの量を減算すればよい。
　第１の画素の第１の被膜に保持される第１のイオン制御物質と第３の画素の第３の被膜に保持される第２のイオン制御物質とはともに第１のイオンの量を変化させるので、その影響は第２の画素にも及ぶ。第１の画素及び第３の画素と第２の画素との間の第１のイオンの影響は専ら拡散による。従って、第２の画素において観察対象に直接含まれる第１のイオンの量を特定するには、第１の画素からの影響と第３の画素からの影響を峻別できるようにすることが好ましい。例えば、第１の画素と第２の画素の距離と第３の画素と第２の画素との距離に差を設けることで、第１の画素から第２の画素までの拡散時間と第３の画素から第２の画素までの拡散時間とに有意な差がでるようにすることができる。また、第１の画素及び第２の画素のセグメントと第３の画素及び第２の画素のセグメントとを形成して、両セグメント間での第１のイオンの拡散を実質的に防止することもできる。防止の方法として、各セグメントの間にイオン吸着剤を配置することや各セグメント間に距離をとることが挙げられる。
図１はアピラーゼを固定したｐＨイメージセンサを用い、イオノマイシンで刺激したラットの海馬細胞のスライスを観察したときの結果を示す。上段右端写真の中央部分（白い部分）が海馬細胞であり、左下のチャートは海馬細胞上に発現したＡＴＰの濃度の上昇に伴い水素イオン濃度も上昇していることを示す。 図２は同じくグルタミン酸で刺激した海馬細胞の観察結果を示す。左下の写真の中央部分の白い部分が海馬細胞であり、右下のチャートは、刺激後に、海馬細胞表面の水素イオン濃度が一旦低下していることを示す。 図３は何ら刺激をしないときの海馬細胞の観察結果を示す。左下の写真の中央部分の白い部分が海馬細胞であり、右下のチャートは、刺激のないときは水素イオン濃度が変化しないことを示す。 図４はこの発明の実施形態のセンサの製造方法を示す模式図である。 図５は図４に示された製造方法で得られたセンサの平面図である。 図６は実施形態のセンサにおいて第１の被膜の厚さと第１の画素の出力の関係を示す。 図７は紫外線硬化時の紫外線のパワーと第１の画素の出力の関係を示す。 図８は実施形態のセンサでバッファ溶液（ｐＨ＝８．０）のｐＨ変化を観察したときの結果であり、図８（ａ）は酸性バッファ溶液（ｐＨ＝４．２）を滴下したときの出力を示し、図８（ｂ）は同じく１ｍＭのＡＴＰ溶液を滴下したときの観察結果を示す。 図９は第１の画素から第２の画素への水素イオンの拡散の時間変化を示す。 図１０はこの発明の実施形態のセンサの製造方法を示す模式図である。 図１１は澤田チップの１つの画素の構成を示す模式図であり、センサはかかる構造の画素が二次元的に配置されている。 図１２は図１１の画素の動作を示す模式図である。
　以下、この発明の実施の形態を、図面を参照しながら、説明する。
　この実施形態では、水素イオンを検出する画素のアレイを備えるｐＨイメージセンサ１として澤田チップ１を用いている。この澤田チップ１の構造については後述する（特許文献１及び特許文献２参照）。
　図４（Ａ）に示すように、この発明の実施形態のセンサの基礎となる澤田チップ１は１２８×１２８の画素のアレイを備える。各画素のセンシングエリアには水素イオン感応膜として汎用的な窒化シリコン膜が積層されている。この水素イオン感応膜が水素イオン濃度に応じてセンシングエリアの電位を変化させる。各画素のセンシングエリアに積層される感応膜は検出対象となるイオン種に応じて適宜選択可能なことは言うまでもない。
　澤田チップの表面、すなわち水素感応膜の上に、図４（Ｂ），（Ｃ）のようにして第１の被膜７を形成する（図４（Ｄ）参照）。第１の被膜７の形成材料は樹脂マトリックスに第１のイオンを発生させる第１のイオン発生物質（第１のイオン制御物質）を分散保持させた組成物である。この組成物において、樹脂マトリックスは第１のイオン発生物質を失活させず、かつこの第１のイオン発生物質により発生された第１のイオンを透過できるものであれば任意に選択できる。
　第１のイオン発生物質は観察対象（例えば生体組織）に生じた被測定物に作用してこの被測定物から第１のイオンを発生させる。観察対象に生じた被測定物がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アセチルコリン（ＡＣｈ）、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）等の神経伝達物質であるとき、これらを加水分解して水素を発生させる分解酵素としてそれぞれＡＴＰａｓｅ、ＡＣｈＥ、ＧＡＢＡｏｘｉｄａｓｅ等を挙げられる。
　樹脂マトリックスと第１のイオン発生物質との配合割合は、観察対象や観察条件等に応じて任意に設定できる。
　実施の形態では、樹脂マトリックスに高架橋可能なＰＶＡ－ＡＷＰを採用し、第１のイオン発生物質としてアピラーゼを採用して、細胞に発現するＡＴＰを観察する。樹脂マトリックスとアピラーゼの配合比は４：１（体積比）とした。
　架橋前の樹脂マトリックスにアピラーゼを分散し、図４（Ｂ）に示すように、澤田チップ１の表面にスピンコートする。
　その後、図４（Ｃ）に示すように、フォトマスク３を介して、スピンコート膜５を部分的にＵＶ硬化し、第１の被膜７を形成する。未硬化部分は除去する。マスクアライナイーにはウシオ電機株式会社製のＵＳＨ－５００ＢＹ１を用いた。紫外線の強さは１０００ｍＪ／ｃｍ２とした。
　実施の形態において第１の被膜７は２５０μｍ×２５０μｍの面積で、厚さは０．３μｍであった。得られたｐＨイメージセンサの平面写真（一部拡大図、断面図を含む）を図５に示す。
　第１の被膜７の面積、形状（即ち、フォトマスク３の開口部の形状）は観察対象や観察条件等に応じて任意に設計可能である。
　第１の被膜７の厚さは０．０５μｍ～２．５μｍとすることが好ましい。この膜厚が０．０５μｍ未満であると、外部環境の水素イオン（即ち、第１の被膜７の表面に存在する水素イオン）が即座に第１の画素で検出されてしまい、露出状態の第２の画素による当該水素イオンの検出時間との間に有意な時間差を得難くなる。他方、その膜厚が２．５μｍを超えると、外部環境に発現したＡＴＰに対する応答時間が遅くなるおそれがある。
　ＰＶＡ－ＡＷＰにアピラーゼを４：１（体積比）で分散して得られる実施形態の第１の被膜７ではその膜厚は０．２μｍ～０．６μｍとすることが好ましい（図６参照）。
　なお、スピンコート膜５を硬化するための紫外線のパワーは１０００ｍＪ／ｃｍ２以上とすることが好ましい。そのパワーが１０００ｍＪ／ｃｍ２未満であると、第１の画素に十分な出力が得られないためである（図７参照）。
　このようにして得られたセンサを用い、観察対象をｐＨ＝８．０のバッファ溶液としたときの出力（観察結果）を図８に示す。図８（ａ）では、観察対象に数滴の酸性（ｐＨ＝４．２）バッファ溶液を滴下した。１秒後において、第１の被膜７で被覆されている第１の画素はその出力に変化がない。これに対し、露出状態の第２の画素においてｐＨ変化が出力されている（第２の検出時間＝０秒）。３０秒経過すると第１の画素にも、滴下した酸性バッファ溶液の影響が現れる。これは、酸性バッファ溶液の滴下により増加した水素イオンが第１の被膜７内を拡散透過して第１の画素で検出されたためである（第１の検出時間＝３０秒）。
　図８（ｂ）の出力は、観察対象に１ｍＭのＡＴＰ溶液を滴下したときの出力である。ＡＴＰ溶液を滴下したときは、１秒後に第１の画素のｐＨが変化した。これは、第１の被膜７に保持されたアピラーゼがＡＴＰに作用して水素イオンが発生したことに起因する。
　以上より、測定開始から第１の検出時間の間はＡＴＰに起因する水素イオンのみが観察されることがわかる。
　図９は第１の画素と第２の画素との間の水素イオンの拡散の様子を示している。図中、No membraneと記載されている部分が第２の画素を示し、その両脇に第１の画素が配置されている。図８の試験と同様に、観察対象をｐＨ＝８．０のバッファ溶液として、そこへ１ｍＭのＡＴＰ溶液を数滴滴下した後、１０秒経過毎の各画素の出力を示す。図８（ｂ）の結果と同様に、１秒後において第１の画素から高い出力が得られている。
　第２の画素の出力は時間の経過とともに高くなっている。これは、第１の画素を被覆する第１の被膜のアピラーゼがＡＴＰを加水分解して水素イオンを発生させ、その水素イオンが拡散してきたものである。第２の画素の出力が第１の画素の出力と同程度になるのに１６０秒を要している。
　以上より、第１の画素の第１の被膜においてＡＴＰに起因する水素イオンが生成されても、それが第２の画素の出力に影響を及ぼすまでには所定のタイムラグがあることがわかる。即ち、そのタイムラグ（この例では１０秒）の間は、観察対象に直接存在する水素イオン（観察対象が生体組織のときは当該組織から直接放出された水素イオン）のみが第２の画素で観察される。
　また、拡散時間経過後（この例では１６０秒後）は、ＡＴＰに起因する水素イオンが第２の画素でも観察されるので、第１の画素において特定されたＡＴＰのみに起因する水素イオンの量を第２の画素の出力から特定された水素イオン濃度の量（観察対象に直接存在する水素イオンの量+ＡＴＰに起因する水素イオンの量）より減算すれば、観察対象に直接存在する水素イオン濃度を特定できることがわかる。
　また、図９の結果から、第１の画素と第２の画素の間隔は１００μｍ以上とすることが好ましい。両者の間隔が１００μｍ未満であると、第１の画素上の水素イオンが第２の画素まで拡散する時間が早くなりすぎて、２つの画素の出力を比較することが困難になる。また、分解能を向上する見地から、両者の間隔は１５０μｍ以下とすることが好ましい。１５０μｍを超えても第１の画素と第２の画素の間の検出時間は殆ど変わらないからである。
　以上の例では、第２の画素が露出していたので、当該第２の画素による水素イオンの観察は実時間で実行される。
　観察対象の水素イオンを第１の画素と第２の画素とで検出時間差を設けて観察することを要点とするこの発明の観点からすれば、当該検出時間差を確保したうえで、第２の画素を何らかの被膜（第２の被膜）で被覆することができる。
　第２の被膜は、第１の被膜と同様に、スピンコート及びホトリソグラフィの技術により個別に形成することができる。澤田チップの全画素の光感応層の上に樹脂層（第１のイオン発生物質を含まない）を積層し、この樹脂層の上に第１の画素を覆うようにして、第１の被膜７を形成することもできる。
　更には、第１及び第２の被膜をインクジェットで形成することもできる。
　図１０に示す例では、図４に示す例と同じ条件で、スピンコート及びホトリソグラフィを行い、第３の被膜９を形成する。第３の被膜はＰＶＡ－ＡＷＰを樹脂マトリックスとして第２のイオン発生物質としてのＡＣｈＥが分散保持されている。このＡＣｈＥはアセチルコリンを分解する分解酵素である。
　このようにして得られた図１０（ｃ）に示すｐＨイメージセンサによれば、神経伝達物質としてのＡＴＰとＡＣｈとを同時に観察可能となる。
　この１０図の例においても、第２の画素を第２の被膜で被覆できる。
　最後に、この実施形態のイメージセンサのベースとなるｐＨイメージセンサ（澤田チップ）の説明をする。
　このｐＨイメージセンサの各画素の原理的な構成を図１１に示す。
　このｐＨイメージセンサの各画素１０はシリコン基板１１とその上に積層される構造体とから構成される。
　シリコン基板１１には、電荷が注入される電荷供給（ID）領域１２から電荷移送方向へ順に、電荷供給調節（ICG）領域１３、拡散層１４、センシング領域１５、電荷移送制御（TG）領域１６、電荷蓄積（FD）領域１７が区画される。
　各領域の区画はシリコン基板１１の表面における半導体型の違いにより規定される。例えば、電荷として電子を用いた場合、電荷供給（ID）領域１２、拡散層１４及び電荷蓄積（FD）領域１７はｎ+型の領域であり、電荷供給調節（ICG）領域１３及びセンシング領域１５はｐ型の領域である。
　電荷蓄積領域１７にはこれに蓄積された電荷を排出するリセット部１８と蓄積された電荷量を検出する電荷量検出部１９と接続される。これらリセット部１８及び電荷検出部１９には汎用的な回路が採用される。
　基板１１の表面には酸化シリコン絶縁膜２１が積層され、その上に、電荷供給調節領域１３の対向位置に該電荷供給調節領域１３の電位を制御するICG電極２５が積層され、同様に電荷移送制御領域１６の対向位置にその電位を制御するTG電極２６が積層される。センシング領域１５に対応する部分には水素イオン感応膜として窒化シリコン膜２３が積層される。この窒化シリコン膜２３は、ICG電極２５やTG電極２６よりも後に形成されるため、これらの電極も被覆している。
　各領域の面積や平面形状、ドーパントの導入量、更には感応膜の材質はセンサの測定対象、測定条件及び要求される感度等を考慮して任意に設計できる。
　次に、図１２を参照しながら、画素１０の動作を説明する。
　図１２(a)はリセット状態を示す。このリセット状態においてリセット部１８のリセットゲートＲＧが高電位となり、電荷蓄積（ＦＤ）領域（以下、単に「ＦＤ領域」ということがある）１７の電荷が外部へ排出されている。
　図１２(b)はスタンバイ状態を示す。このスタンバイ状態においてリセット部１８のリセットゲートＲＧが低電位となり、ＦＤ領域１７によって電荷が蓄積され得る状態となる。
　図１２(c)、(d)は測定状態を示す。この状態の前提として、センシング領域１５の電位は外部環境（測定対象のｐＨ）に依存して変化している。まず、図１２(c)に示すように電荷供給（ＩＤ）領域（以下、単に「ＩＤ領域」ということがある）１２から電荷（この場合、電子）を注入すると、電荷は電荷供給調節（ＩＣＧ）領域（以下、単に「ＩＣＧ領域」ということがある）１３を超えてセンシング領域１５に至り、その後、図１２(d)に示すようにＩＤ領域１２からの電荷供給を止めると、センシング領域１５上の電荷はＩＣＧ領域１３にすり切られる。このとき、ＩＣＧ領域１３の電位とセンシング領域１５の電位差は、測定対象のｐＨに依存しており、当該電位差に対応した量の電荷がセンシング領域１５の上に残存する。
　拡散層１４の電位はセンシング領域１５の電位より充分に高く設定されているので、ＩＣＧ領域１３とセンシング領域１５との間に電位障壁が形成されることはない。
　図１２(d)に示す測定状態において、拡散層１４にも電荷が存在し、そのうえに注入された電荷が残存するが、この残存した電荷も含め、ＩＣＧ領域１３とセンシング領域１５の電位差に起因する電荷量が検出対象のｐＨ値を規定する。換言すれば、拡散層１４の形成する電荷井戸内に存在する電荷はｐＨ値を規定する電荷量に何ら影響を与えない。
　図１２(e)、(f)は電荷移送状態を示す。電荷移送制御（ＴＧ）領域（以下、単に「ＴＧ」領域ということがある）１６の電位を上げて、図１２(d)の状態で残存している電荷を電荷蓄積（ＦＤ）領域（以下、単に「ＦＤ領域」ということがある）１７へ移送する。
　なお、図１２(c)～図１２(f)の操作を繰り返すことにより、小さなｐＨ変化を大きな電荷量変化に変換可能となる。
　図１２(g)において、電荷検出部１９によりＦＤ領域１７に蓄積された電荷量を電気信号に変換する。これにより、ｐＨ値の特定が可能となる。
　以下、図１２(a)～図１２(g)のステップが繰り返される。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求に範囲の記載の趣旨を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
１　１０　澤田チップ（ｐＨイメージセンサ）
３　フォトマスク
５　スピンコート膜
７　第１の被膜
９　第３の被膜

Claims (6)

  1. 　被測定物を含む観察対象のイオンを検出する画素のアレイを備えるセンサであって、
    　前記アレイを構成する画素のうちの第１の画素は第１のイオンを検出し、該第１のイオンを透過させる第１の被膜で被覆されており、
    　前記アレイを構成する画素のうちの第２の画素は前記第１のイオンを検出し、該第１のイオンを透過させる第２の被膜で被覆されているか、若しくは該第２の画素は表出しており、
    　前記第１の被膜の表面に存在する前記第１のイオンが前記第１の画素に検出されるのに要する第１の検出時間は、前記第２の被膜の表面または表出した前記第２の画素の表面に存在する前記第１のイオンが第２の画素に検出されるのに要する第２の検出時間と異なり、
    　前記第１の被膜には、前記被測定物に作用して前記観察対象の前記第１のイオンの量を変化させる第１のイオン制御物質が保持される、センサ。
  2. 　前記第１のイオン制御物質はタンパク質分解酵素であり、前記被測定物としての所定のタンパク質を分解して前記第１のイオンを生じさせる、請求項１に記載のセンサ。
  3. 　前記測定物は生体タンパク質である、請求項２に記載のセンサ。
  4. 　前記第２の画素は前記第１の画素に近接して、かつ所定の間隔で配置される、請求項１～３のいずれかに記載のセンサ。
  5. 　前記アレイを構成する画素のうちの第３の画素は前記第１のイオンを検出し、該第第１のイオンを透過させる第３の被膜で被覆されており、該第３の被膜の表面に存在する前記第１のイオンが前記第３の画素に検出されるのに要する第３の検出時間は前記第２の検出時間と異なり、
    　前記第３の被膜には前記観察対象に含まれる他の被測定物に作用して前記第１のイオンの量を変化させる第２のイオン制御物質が保持されている、請求項１～４の何れかに記載のセンサ。
  6. 　前記第１のイオンは水素イオンである、請求項１～５のいずれかに記載のセンサ。
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