ITTS20080011A1 - Striscia biosensoristica con strato reattivo ottimizzato - Google Patents
Striscia biosensoristica con strato reattivo ottimizzatoInfo
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Classifications
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Description
STATO della tecnica
La presente invenzione riguarda un biosensore biochimico e il suo uso per la quantificazione degli analiti nei fluidi. È stato finora messo a punto un biosensore elettrochimico mononuso a forma di striscia per misurare la quantità dell ’analita specifico presente nel campione liquido (EP 0851224 Al; EP 1203956 A2; EP 12113321 Al; EP 0964059 A2; US 5798031 ; US 6270637; US 5658444; US 5762770).
Una striscia biosensoristica a struttura sandwich tipicamente consiste in:
1 ) un supporto di plastica sul quale si depositano un elettrodo e dei circiuti conduttivi;
2) uno strato isolante che definisce la superfìcie dell’eletttrodo;
3) uno strato reattivo contenente dei reagenti per l’analisi;
4) uno spaziatore per definire l’area e l’altezza del canale capillare dove si svolge la reazione (bio)chimica;
5) uno strato coprente di un materiale flessibile e isolante;
Lo strato reattivo 3 si deposita diretamente sul sistema dell’elettrodo. Applicando il campione liquido, il canale capillare si riempie e i reagenti dello strato reattivo 3 si sciolgono velocemente reagendo con l’analita pesente nel campione. In seguito si misurano le proprietà elettriche (la corrente, il potenziale), proporzionali alla quantità dell’analita collegando l’unità elettronica con la striscia reattiva tramite i contatti. La scelta dei reagenti dipende da uno o più analiti specifici che si vogliono quantificare. In ogni caso la miscela dei reagenti contiene almeno un enzima della classe delle ossidoreduttasi specifico per l’analita e dei mediatorti elettrochimici e facoltativamente vari additivi complementari come cofattori degli enzimi, attivatori degli enzimi, agenti idratanti, stabilizzatori, surfattanti, sali tampone, agenti disperdenti, inibitori della cristallìnizzazione, spaziatori.
I tipici agenti idratanti sono: polietilene ossido (US 5798031, US 6270637), idrossipropilcellulosa, polivinilpirolidone (PVP), polivinilalcool, polivinilacetato (US 5658444, US 6241862). I tipici addensanti sono: idrossiletilcel luiosa, alginato, cellulosa microcristallina, metilcel lu Iosa (US 6241862, US 6270637, US 6287451).
Succinato, trealosio, polietilenglicolo (PEG), mannitolo, lattosio, raffmosio, flavina mononucleotide, adenosina difosfato, albumina di siero bovino, acido etilenediaminetetracetico (EDTA) sono stati usati come stabilizzatori (US 6270637, US 6455324, US 6541216, US 6723500, US 6837976).
Quando è stato impiegato il trealosio, la sua concentrazione non superava il 16% (p/p). Alcuni tra i sopramenzionati additivi si dissolvono o disperdono nell’acqua con difficoltà, il che protrae in maniera significativa il processo della reazione e il tempo dell’analisi. Qualche additivo addiritura esercita un effetto negativo sull’attività enzimatica. Perciò sarebbe molto oportuno minimizzare questi aspetti negativi.
II trealosio è un disaccaride non riducente presente in natura con un legame di a, a ( 1 > 1 ) tra due molecole di glucosio (D-glucopiranosi) che presenta le proprietà fisico-chimiche e biologiche particolarmente interessanti. È conosciuto come un agente proteina-stabilizzante (Schebor et al., Biotechnol. Prog., 13, p. 857-863, 1997; Esteves et al., Biotechnol. Lett., 22, p. 417-420, 2000; Lins et al. Proteins: Struture, Function, Bioinformatics, 55, p. 177-186, 2004). In più il trealosio mostra delle interessanti proprietà idratanti e viscose (Branca et al., J. Phys. Chem., 105, pp. 10140-10145, 2001 ).
E stato scoperto che il trealosio ad alta concentrazione può contemporaneamente fungere da agente idratante, da stabilizzatore e da addensante.
Sommario
La presente invenzione riguarda la striscia biosensoristica con uno strato reattivo di migliori proprietà. La composizione dello strato reattivo della striscia biosensoristica di questa invenzione fornisce una valida soluzione per i sopraindicati problemi riscontrati in precedenza. Lo strato reattivo del biosensore contiene specifici reagenti attivi come enzimi, cofattori, mediatori elettrochimici e alte dosi chimicamente inerti di trealosio. Il trealosio migliora la funzionalità del biosensore, la sua stabilità e nello stesso tempo semplifica anche il processo produttivo. 11 trealosio ad elevata concentrazione può svolgere piu ruoli come quello dell’addensante, stabilizzatore ed agente idratante.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
La striscia reattiva di questa invenzione è a struttura sandwich ed è composta da: un supporto di materiale isolante con sopra depositati dei circuiti conduttivi insieme a elettrodi, da uno strato reattivo, da uno spaziatore e infine da un altro foglio isolante. Per permettere una possibile reazione tra i reagenti specifici dello strato reattivo e Panai ita del campione liquido, lo strato è posizionato sopra il sistema dell’elettrodo e comunque dentro il canale capillare. Quest’ultimo è creato tra i due supporti, uno inferiore e uno superiore, collegati insieme dallo spaziatore. 1 reagenti sono applicati sotto forma liquida con la tecnica di dispensione oppure quella di stampa, e successivamente sono lasciati asciugare fino a formare un film con lo spessore e la struttura più o meno uniformi. Lo strato reattivo contiene sia reagenti attivi, sia quelli ausiliari. Ovviamente la scelta dei reagenti attivi dipende dall’analita che si vuole misurare e include dei mediatori elettrochimici, dei cofattori tipo coenzimi e naturalmente degli enzimi, tra i quali almeno uno è specifico per Panai ita di interesse.
Il numerosissimo gruppo degli enzimi da scegliere include glucosio ossidasi, ascorbato ossidasi, alcool ossidasi, sorbitolo ossidasi, polifenolo ossidasi, piruvato ossidasi, colesterolo ossidasi, L-lattato ossidasi, bilirubina ossidasi, xantina ossidasi, sarcosina ossidasi, galattosio ossidasi, glicerolo-3-fosfato ossidasi, piranosio ossidasi, L-lisina ossidasi, L-glutamato ossidasi, L-aminoacido ossidasi, D-aminoacido ossidasi, amino ossidasi, lipossidasi, citocromo-c ossidasi, sulfìto ossidasi, NADH ossidasi, uricasi, perossidasi, catalasi, diaforesi, glucosio deidrogenasi, fruttaSio deidrogenasi, glicerolo deidrogenasi, alcool deidrogenasi, colesterolo deidrogenasi, gluconato deidrogenasi, aldeide deidrogenasi, formaldeide deidrogenasi, L-lattato deidrogenasi, D-lattato deidrogenasi, L-malato deidrogenasi, D-malato deidrogenasi, isicitrato deidrogenasi, succinato deidrogenasi, L-glutamato deidrogenasi, L-alanina deidrogenasi, glucosio-6-fosfato deidrogenasi, piruvato deidrogenasi, βidrossibutirato deidrogenasi, acyl-CoA deidrogenasi, trimetilamina deidrogenasi, nitrato reduttasi, colesterolo esterasi, colina esterasi, lipasi, fosfolipasi, fosfatasi alcalina, fosfatasi acida, saccarosio fosforilasi, invertasi, β-galattossidasi, maltasi, amilasi, mutarorasi, ureasi, ossalacetato decarbossilasi, creatinasi, creatininasi, transferasi, aconitasi, citrato liasi, esochinasi, glucochinasi, glicerolo chinasi, acetato chinasi, piruvato chinasi, creatina chinasi, miochinasi, urea chinasi.
Come esempio del numeroso gruppo dei cofattori si può nominare NAD nella forma ridotta e ossidata, forma ridotta ed ossidata di NADP, PQQ, FAD, FMN, ATP, ADP, AMP, c-AMP, fosfoenolpiruvato, creatinfosfato, glicerolo-3-fosfato.
L’altro illimitato gruppo è quello dei mediatori elettrochimici ed è rappresentato da esacianoferrato (II), esacianoferrato (III), ferrocene e i suoi derivati, benzochinone e i suoi derivati, fenazine e i suoi derivati, blu di toluidina, Meldola blu, tionina, blu di metilene.
Finora sono stati descritti tanti dei cosiddetti reagenti ausiliari come gli agenti idratanti, surfattanti, stabilizzatori, addensanti, disperdenti, inibitori della cristallinizzazione, ecc. Inaspettatamente è stato scoperto che il trealosio presente nello strato reattivo del biosensore ad elevata concentrazione svolge piu funzioni come addensante, stabilizzatore, agente idratante. In effetti la idrofilicità del trealosio e le sue proprietà idratanti migliorano e accelerano l’entrata del campione liquido nel canale capillare e la dissoluzione dei reagenti.
Una elevala quantità di trealosio nello strato reattivo risulta in un aumento della viscosità dei reagenti sciolti nel campione liquido. Se la velocità della ossidazione (riduzione) del mediatore ridotto (ossidato) è in relazione con la velocità della sua difusione sulla superfìcie dell’elettrodo e se la difusione dipende dalla viscosità, la quantità di trealosio presente nello strato reattivo influenza direttamente lo svolgimento della misura. In altre parole, il trealosio ad alta concentrazione migliora la precisione e riproducibilità dell’analisi. In più, il trealosio significativamente migliora anche la stabilità della striscia biosensoristica. L’intervallo di concentrazione del trealosio (allo stato secco) nello strato reattivo è compreso tra il 20% e il 70%, preferibilmente tra il 25% e il 50%, meglio ancora tra il 30% e il 40%.
Possono essere aggiunti anche altri reagenti tipo surfattanti, polimeri solubili nell’acqua, sali tampone, attivatori degli enzimi in piccole quantità.
Tra i surfattanti preferibilmente utilizzati appartengono i detergenti biologicamente compatibili neutri (per esempio Triton® X-100, Tween®, Tergitol®, Brij®, Span®, polietilene glicolo, polietilene ossido, polipropilene ossido), i detergenti anionici (per esempio sodio dodecil solfato, colato, taurocolato, deossicolato, fosfolipid) e i detergenti cationici (per esempio cetil-trimetil-ammoniobromuro).
1 polimeri ampiamente usati sono destrano, amido modificato, cellulosa modificata, gomma arabica, gomma di guar, polivinilpirrolidone, polivinilacetato, polivinilalcool, xantano, chitosano, pectato, alginato.
Invece fosfato, citrato, Tris, borato, acetato, pirofosfato sono i migliori sali tampone.
acetato, tartarato, succinato, citrato, gliossalato, ditiotreitolo si usano come attivatori degli enzimi.
Il foglio inferiore potrebbe essere fatto da vari materiali isolanti simili alla plastica, vetro, ceramica, carta impregnata o meglio polimero flessibile, tipo poliimide oppure poliestere. Ugualmente anche il foglio superiore potrebbe essere fatto dagli stessi materiali, preferibilmente da polimeri flessibili. Lo spaziatore che divide i due fogli, quello inferiore da quello superiore, potrebbe essere legato a loro mediante qualche adesivo resistente all’acqua disponibile sul mercato. In più lo spaziatore definisce l’altezza e i bordi laterali del canale capillare. Potrebbe essere costruito da vari materiali, anche essi resistenti all’acqua, per esempio aplicando uno strato sottile di materiale adesivo ad alta temperatura di fusione depositato sul foglio inferiore. Lo spaziatore più adatto è un nastro biadesivo. Lo spessore di un spaziatore varia tra 0.05 mm a 0.5mm, preferibilmente tra 0.1 e 0.2 min.
La striscia reattiva viene usata insieme all’unità elettronica dotata di un fonte di elettricità, e un metro. Vengono misurate la corrente oppure il potenziale, le proprietà elettroniche proporzionali alla quantità dell’analita.
Si possono sottoporre ad un’analisi anche vari liquidi dal settore alimentare (vino, succhi di frutta e di verdura, spremute, latte, ecc), liquidi umani (sangue, plasma, siero, urina, saliva, ecc), anche quelli di origine animale, campioni provenienti dall’industria, dall’ambiente.
Esempio 1
Degli elettrodi d’oro con la superficie di 2.25 mm<2>e dei circuiti conduttivi d’oro si depositano tramite vaporizzazione chimica, una tecnica di deposizione, sopra un lato del foglio di polietilene tereftalate con lo spessore di 250 micron. Si prepara una soluzione fresca sciogliendo (p/p) 4% di trealosio, 1.5% di lattato ossidasi (Sigma, Cat.No.L0638), 4% di ferricianuro di potassio, 0,05% di Triton<®>X-100, 0.85% di potassio fosfato monobasico e 0.95% di potassio fosfato bibasico in acqua deionizzata. 2 μΐ della soluzione finale si depositano sulla superfìcie del sistema degli elettrodi e si lasciano asciugare a 35°C per 15 min. Successivamente si crea un canale dove prende luogo una reazione (bio)chimica applicando uno spaziatore biadesivo (Tesa, Germania, spessore di 150 micron) e uno strato di poliestere trasparente e flessibile (spessore di 175 micron). Da questo supporto si tagliano le singole strisce reattive che poi vengono sottoposte ad un’analisi con 3μΙ della 5 mM soluzione standard di lattato, vino, passata di pomodoro e sangue (dal dito). La corrente viene misurata in modo cronoamperometrico con applicato un potenziale costante di 300mV. Dopo 6 mesi di immagazzinamento a temperatura ambientale e a umidità relativa di 12%, le strisce biosensoristiche hanno conservato più del 92% della loro sensibilità iniziale. Le strisce reattive non contenenti il trealosio hanno invece perso circa l’85% della loro sensibilità iniziale. In più le strisce reattive contenenti il trealosio hanno dato la risposta più rapida (20s) rispetto alle strisce reattive senza il trealosio (45s).
Esempio 2
Degli elettrodi di carbonio la superfìcie di 2.25 mm<2>(usato a base di carbonio, Gwent Electronic erials, Ltd., UK, Cat. No. C2000802D2) e dei circuiti conduttivi d’argento (usato l’inchiostro da stampa a base d’argento, Gwent Electronic Materials, Ltd., UK, Cat. No. C51204D2), si depositano con la tecnica di screen-printing su un lato del foglio di poliestere con lo spessore di 250 micron. Si prepara una soluzione fresca sciogliendo (p/p) 5% di trealosio, 1 .2% di glucosio ossidasi (Sigma, Cat.No.G2133), 4% di ferricianuro di potassio, 0.05% di Triton<®>X-100, 0.8% di KH2P04, 1.1% di K2HPO4, 0.2% di destrano (M.W. 2 000 000) in acqua deionizzata. 2 μ! della soluzione finale si depositano sulla superfìcie dell’elettrodo e si lasciano asciugare a 50°C per 5 min. Successivamente si crea un canale dove prende luogo una reazione (bio)chimica applicando uno spaziatore biadesivo (Tesa, Germania, spessore di 150 micron) e uno strato (foglio) di poliestere trasparente e flessibile (spessore di 175 micron). Dal foglio si tagliano le singole strisce reattive che poi vengono sottoposte ad una analisi con 3μΙ della 10 mM soluzione standard di glucosio, vino, spremuta di arancia e sangue (dal dito). La corrente viene misurata in modo cronoamperometrieo con applicato un potenziale di 400mV. Dopo 6 mesi di immagazzinamento a temperatura ambientale e a umidità relativa di 12% le strisce reattive hanno conservato più del 98% della loro sensibilità iniziale. Le strisce reattive non contenenti il trealosio hanno invece perso circa il 29% delia loro sensibilità iniziale. In più le strisce reattive contenenti il trealosio hanno dato la risposta più rapida (15s) rispetto alle strisce reattive senza il trealosio (35s).
Esempio 3
Un elettrodo di carbonio da lavoro, degli elettrodi di riferimento ad argento/argento cloruro con la superfìcie di 2.25 mm<2>e dei circuiti conduttivi (usati Linchiostri da stampa a base di carbonio e di Ag/AgCl, Gwent Electronic Materials, Ltd., UK, Cat. No. C2000802D2 and C2000215D3), si depositano con la tecnica di screen-printing su un lato del foglio di polietilene tereftalate con lo spessore di 250 micron. 1 μΙ di 0.2% di “multiwal!” (a tante pareti) nanotubi di carbonio (Aldrich, USA, 95%, Cat.No.636495, 20-30 nm) si disperde in 0.8% di acetato di cellulosa e uniformemente applica sulla superfìcie dell’elettrodo da lavoro. Si prepara una soluzione fresca sciogliendo (p/p) 4% di trealosio, 0.6% di colesterolo esterasi (Sigma, Cat.No.C1403), 1% di colesterolo ossidasi (Sigma, Cat.No.C8649), 0.5% di Triton<®>X-100, 0.5% colato di sodio, 0.1% taurocolato di sodio, 0.1% di azide, 0.8% KII2PO4, 1.1% Κ2ΗΡ04, 0.5% di alcool polivinilico in acqua deionizzata. 2 μΙ della soluzione finale si depositano sulla superficie dell’elettrodo e si lasciano asciugare a 35°C per 15 min. Successivamente si crea un canale dove prende luogo una reazione (bio)chimica applicando uno spaziatore biadesivo (Tesa, Germania, spessore di 150 microns) e uno strato (foglio) di poliestere trasparente e flessibile (spessore di 175 micron). Dal foglio si tagliano le singole strisce reattive che poi vengono sottoposte ad una analisi con 3μ1 della 5 mM soluzione standard di colesterolo, 5mM soluzione standard di colesterolo-oleate, l’uovo omogeneizzato e sangue (dal dito). La corrente viene misurata in cronoamperometrico con applicato un potenziale di -50mV. Dopo 6\mesi di immagazzinamento a temperatura ambientale e a umidità relativa di 12% le strisce reattive hanno conservato più del 94% della loro sensibilità iniziale. Le strisce reattive non contenenti il trealosio hanno invece perso circa il 54% della loro sensibilità iniziale. In più le strisce reattive contenenti il trealosio hanno dato la risposta più rapida (35s) rispetto alle strisce reattive senza il trealosio (60s).
Esempio 4
Degli elettrodi d’oro con la superficie di 2.25 min<2>, dei circuiti cocnduttivi si depositano con un comune processo di rivestimento in oro su un substrato di resina con lo spessore di 600 micron coperto con lo strato sottile di rame. In seguito si applica uno strato isolante con la tecnica di screen printing usando l’inchiostro dielettrico (Gwent Electronic Materials, Ltd., UK (Cat. No. D2020823D2). Si prepara una soluzione fresca sciogliendo (p/p) 6.5% di trealosio, I% di lipoproteina lipasi (Sigma, Cat. No. L9656), 0.8% di glicerolo chinasi (Sigma, Cat. No. G6142), 0.8% gIicerolo-3-fosfato ossidasi (Sigma, Cat. No. G9888), 3% di fericianuro di potassio, 2.5% dipotassio di adenosine trifosfate, 0.5% di Tween® 20, 0.1% di Triton<®>X-100, 0.25% colato di sodio, l .4% K2HP04, 0.15% K.H2PO40.5% polietilene glicole (M.W. 20,000) in acqua deionizzata. 2 pi della soluzione finale si depositano sulla superficie dell’elettrodo e si lasciano asciugare a 40°C per 12 min. Successivamente si crea un canale dove prende luogo una reazione (bio)chimica applicando uno spaziatore biadesivo (Tesa, Germania, spessore di 150 microns) e uno strato (foglio) di poliestere trasparente e flessibile (spessore di 175 micron). Dal foglio si tagliano le singole strisce reattive che poi vengono sottoposte ad una analisi con 3μΙ della 2.5 mM e 5 mM soluzione standard di trioleina, e campione di latte. La corrente viene misurata in modo cronoamperometrico con applicato un potenciale di 300mV tra due elettrodi. Dopo 6 mesi di immagazzinamento a temperatura ambientale e a umidità relativa di 12% le strisce reattive hanno conservato più del 95% della loro sensibilità iniziale. Le strisce reattive non contenenti il trealosio hanno invece perso circa il 42% della loro sensibilità iniziale. In più le strisce reattive contenenti il trealosio hanno dato la risposta più rapida (50s) rispetto alle strisce reattive senza il trealosio (70s).
Claims (10)
17 La striscia biosensoristica per il rilevamento degli analiti presenti nel campione fluido consistente in:
a) un supporto isolante planare sul quale sono depositati elettrodi e dei circiuti conduttivi;
b) uno strato isolante che copre i circuiti conduttivi e definisce le superfici degli eletttrodi;
c) uno strato reattivo contenente dei reagenti appropriati per lo svolgimento dell’analisi, tra i quali trealosio con la sua concentrazione compresa tra il 20% e il 70% del suo standard secco;
d) uno spaziatore per definire l’area e l’altezza del canale capillare dove si svolge la reazione (bio)chimica;
e) uno strato coprente di un materiale flessibile e isolante;
2. La striscia biosensoristica secondo la rivendicazione 1. caratterizzata dal fatto che la concentrazione media di trealosio nello strato reattivo è compresa tra il 25% e il 50% del suo standard secco.
3. La striscia biosensoristica secondo le rivendicazioni 1. e 2. caratterizzata dal fatto che la concentrazione media di trealosio nello strato reattivo è compresa tra il 30% e il 40% del suo standard secco.
4. La striscia biosensoristica secondo le rivendicazioni 1, 2. e 3. caratterizzata dal fatto che lo strato reattivo contiene almeno un elemento del riconoscimento biologico, come biocatalizatore, strutture cellulari o subcellulari, anticorpo, antigen, acido nucleico, preferibilmente un enzima della classe delle ossidoreduttasi selezionato dal gruppo contenente colesterolo ossidasi, colesterolo deidrogenasi, diaforasi, perossidasi, glucosio ossidasi, glucosio deidrogenasi, glicerolo-3 -fosfato ossidasi, βìdrossibutirato deidrogenasi, alcool ossidasi, alcool deidrogenasi, lattato ossidasi, lattato deidrogenasi, sarcosina ossidasi, bilirubina ossidasi, malato deidrogenasi, fruttosio deidrogenasi, piruvato ossidasi.
5. La striscia biosensoristica secondo le rivendicazioni 1., 2. e 3. cratterizzata dal fatto che lo strato reattivo contiene almeno un mediatore elettrochimico preferibilmente selezionato dal gruppo contenente ferricianuri, ferrocianuri, ferracene e i suoi derivati, tionina, blu di toluidina, blu di metilene, fcnilenediamina, fenazina etosolfato, derivati di benzochinone.
6. La striscia reattiva secondo le rivendicazioni 1., 2. e 3. caratterizzata dal fatto che lo strato reattivo contiene almeno un cofattore degli enzimi preferibilmente selezionato dal gruppo di NAD, NADH, NADP, NADPH, PAD, PQQ, ATP, ADP, fosfoenolpiruvato, creatina fosfato, glicerolo-3-fosfato.
7. La striscia biosensoristica secondo le rivendicazioni 1., 2, e 3. caratterizzata dal fatto che lo strato reattivo contiene almeno un surfattante biologicamente compatibile preferibilmente selezionato dal gruppo contenente Triton® X-100, Tween®, Tergitol®, Brij®, Span®, poi ieti lenegl ìcolo, polietilene ossido, polipropilene ossido, sodio dodecil solfato, colato, taurocolato, deossicolato, fosfolipidi, cetiltrimetil-ammonio-bromuro.
8. La striscia biosensoristica secondo le rivendicazioni 1 ., 2. e 3. caratterizzata dal fatto che lo strato reattivo contiene almeno un polimero solubile nell’acqua preferibilmente selezionato dal gruppo cntenenti desstrano, atnido modificato, cellulosa modificata, gomma arabica, gomma di guar. polivini lpirrolidone, polivinilacetato, polivinilalcool, xantano, chitosano, pectato, alginato.
9. La striscia-reattiva secondo le rivendicazioni 1., 2. e 3. caratterizzata dal fatto che lo strato reattivo contiene almeno un sale tampone preferibilmente selezionato dal gruppo contenente fosfato, citrato, Tris, borato, acetato e pirofosfato.
10. La striscia reattiva secondo le rivendicazioni 1., 2. e 3. caratterizzata dal fatto che lo strato reattivo contiene almeno un attivatore degli enzimi preferibilmente selezionato dal gruppo contenente Mg<2>', Ca<2+>, K<+>, Mn<2->, Co<2'>, Cu<'>, Zn<2+>, acetato, tartrato, succinato, citrato, gliossalato, ditiotreitolo.
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Citations (5)
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2008
- 2008-11-19 IT IT000011A patent/ITTS20080011A1/it unknown
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