CN1575416A - 高敏感性电位传感器的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备用导电性聚合物薄膜作为敏感元件的高灵敏性电位传感器的方法。

Description

高敏感性电位传感器的制造方法
技术领域
本发明涉及高敏感性电位传感器的制备方法，该电位传感器具有导电聚合物薄膜作为敏感元件。本发明应用于医药、生物技术、农业、生态学领域以及环境监测和食品质量保证，特别是应用于为了临床诊断、proteomics、细胞分析、环境和制造检测与研究。
背景技术
用导电性聚合物薄膜作为敏感元件的传感器是定量电化学分析的最有前途和吸引力的方法之一[1]。到目前为止，已经描述了许多基于导电性聚合物的电化学传感器。它们通过测量原理(安培法、伏安法、化学电阻法、电位法)以及接受分析信号的方法(直接和间接的传感器)进行区分。
安培信号通过对传感器施加来自外电源的恒定电压并测量由传感器内发生的化学和/或生物反应确定的电流量来接收[2]。伏安法和化学电阻法传感器在工作原理上类似，但是不同之处在于施加的电压不是恒定的，而是根据对特定方法所确定的参数而变化[2，3]。
一般来说，安培法和伏安法需要昂贵的设备，包括安培计、外电压源或稳压器、反电极和参比电极[2]。
电位装置由于化学/或生物反应从导电性聚合物的氧化还原组成变化得出其响应，这伴随着电位传感器的稳态电位变化[2，4，5]。本发明的发明人观察到，电位传感器相对于安培法和伏安法传感器有许多优点。优点之一是电位法不需要复杂的设备。电位测定装置通常包含传感器自身、参比电极和高阻抗伏特计[2，6]。其次，信号不依赖于传感器的表面积和形状[2]。第三，用电位测量方法，与电化学电池内的扩散过程相关的问题和导致安培和伏安测量法的复杂电极结构(例如旋转圆盘电极)的问题不起明显作用[2，4]。
使用电位测量可以象pH测量一样简便，电位测定装置可以类似于商品pH或离子选择电极。
所有的电化学传感器可以分成两类，直接和间接传感器。
直接电化学传感器在分析物和与固定在传感器内的或吸附在传感器上的受体之间相互作用时立即产生信号。直接传感器的实例是酶安培传感器[2，7，8]、离子选择性电位传感器[9，10]和电位免疫传感器[11，12，13]。一般来说，与分析物接触和测量过程同时进行。
间接电化学传感器由于存在对携带电化学活性标记物的分析物特异性的附加试剂而产生信号。属于间接类型的传感器的实例是安培和电位酶传感器[2]、对表面电位变化敏感的电位传感器[14，15]以及伏安和化学电阻传感器[16，17，18]。在传感器与分析物之间的接触和测量过程在时间和空间上分开进行。
伏安传感器可以描述为直接和间接传感器之间的中间类型。在这种情况下，在系统中没有标记的试剂，但是培养和测量步骤在时间和空间上和/或溶质上是分开的。
制造用导电性聚合物层作为敏感元件的高敏感性电位传感器的最重要步骤是在导电载体上形成聚合物薄膜。载体本身通常是贵金属、碳或半导性材料[19]。电化学分析允许生产具有确定的化学、电化学和力学性能的导电性聚合物薄膜[19]。
聚合过程的成分包括单体、极性溶剂和至少两个电极(辅助电极和工作电极)[19]。支持电解质通常包含在聚合溶液中，以提高溶液的导电性和用于在聚合步骤中使聚合物掺杂[19]。有三种主要类型的电化学分析：恒电流的(galvanostatic)、恒电位的和动电位的[19]
在恒电流法中，在聚合溶液中浸渍的工作电极与辅助电极之间施加一段时间的来自外电源的恒定电流。参比电极可以用来控制工作电极的电化学电位[19，20，21]。
在恒电位法中，通常需要三个电极。在工作电极和辅助电极之间的电流通过安培计来控制，安培计设定在来自外电源的恒定电压下(其又由参比电极来控制)，外电源施加在工作电极与辅助电极之间一定的时间[19，20，21]。
电位酶-或免疫传感器的最重要性质使它们的氧化还原敏感性[4]，因为大多数酶反应是氧化还原过程，伴随着反应物氧化还原状态的变化。聚合物基传感器的氧化还原敏感性完全由聚合物薄膜的氧化还原性质决定[22]，而聚合物薄膜的氧化还原性质又由聚合过程的条件和参数决定。
大量出版物致力于导电性聚合物氧化还原性质的研究，例如聚吡咯[5，22-27]。在许多这类研究中[22-23，26]，已经表明在电位信号形成中采用两种主要机理。导电性聚合物的本征氧化还原状态的不可逆变化是聚合物层与电化学活性物质之间相互作用的结果，并被称为“腐蚀型”形成电位响应。该过程总是伴随聚合物与周围溶液的离子交换。另一个机理基于借助于聚合物薄膜在聚合物表面的氧化还原电对之间的电子交换。聚合物的本征氧化还原状态在该过程中不发生变化，并且不发生在聚合物与溶液之间的离子交换。在这种情况下，导电性聚合物起金属性电位电极的作用，其行为可以由电子平衡的Frumkin理论描述[22，28]。这是“金属型”电位响应，并且它是可逆的。实际上，这两种机理同时作用，但是其中之一为主[22-23，26，27]。“金属型”对于电位氧化还原传感器是有利的，因为它提供更迅速且更强的响应[26]。可以在聚合步骤中改变聚合物薄膜的性质，使得“金属型”机理为主[22-23，26]。
以前，支持电解质的性质，以及因此产生的掺杂剂离子的性质，被认为是聚合物薄膜金属型性质的唯一因素[22-27，29]。已经表明，包埋在聚合物薄膜内的固定阴离子不参与离子交换反应，提供本征氧化还原状态的稳定性[23，26]。这样的电解质的实例是十二烷基磺酸盐[23]，各种染料例如靛蓝胭脂红和亚甲蓝[30，31]。但是在所有引用的公开物中，不认为聚合溶液中掺杂剂离子的浓度是赋予聚合物金属型性能的因素。
本发明人认电化学聚合的溶液中单体浓度以及支持电解质的浓度是氧化还原性质的最重要因素，因此是聚合物氧化还原敏感性的最重要因素。已知单体浓度还可以影响聚合物的导电性[19]。根据本发明人的数据，使用具有远低于常用浓度(0.05-0.5M)的单体浓度(＜0.05M)的聚合溶液可以达到最佳的氧化还原敏感性。本发明人发现，在单体浓度与支持电解质之间的比例是对氧化还原性质和聚合物薄膜厚度特别重要的关键因素。在本发明人进行的研究之前，在单体和支持电解质之间的比例以及它们的浓度以前没有被认为是对聚合物薄膜氧化还原性质起作用的因素。
尽管在文献中有许多所述电化学聚合物的电化学合成的方法，但是它们没有一个提供了生产适合于电位检测低浓度生物分子的高敏感性传感器的条件和参数。
以下给出电化学合成的现有技术方法的某些实例。
用于在支持电解质存在下从水溶液中制备电化学聚吡咯基传感器的恒电位方法描述在[39，42，43，44和45中]。
Taniguchi等人[33]描述了使用恒电流方案在支持电解质存在下从有机溶剂中生长聚吡咯薄膜的方法。所产生的聚合物薄膜用于制备直接电位免疫传感器。这种方法的主要缺点是：由该方法生产的传感器的敏感性差(mg/ml的IgG)。另一个缺点是在这样的方法中所用的有机溶剂是高毒性的。
其它使用水作为溶剂的恒电流法描述在[13，16，17，34，35，36，37，38，39，40，41]中。
已经描述了在支持电解质存在下从水溶液中合成导电性聚合物来制备电化学传感器的电化学聚合的动电位法[9，10，27，46，47，48，49]。
由上述文献中所述的方法生产的大多数传感器不是准备用于电位测量的，而是用于其它类型的电化学测量或捕集。它们全都不适合于要求高分析敏感性、精度和稳定性的电位检测。这些方法不能直接发展成本发明中所述的方法，以提供所需的传感器性能。测量过程总是比本发明中所述的更复杂并花费更长的时间。
本发明人还已经描述了电位聚吡咯基传感器的动电位制备方法[50，51]。
尽管在动电位和恒电流方案中使用低浓度单体的聚合溶液是可能的[19]，但是所引用的公开物中大多数描述了使用0.05M和更高的浓度。由于本发明人已经强调，从单体浓溶液生长的聚合物薄膜不具有高氧化还原敏感性，所以不能用作聚合物基电位传感器的高敏感性元件。
只有一个研究中提到了低浓度单体[48]，但是该作者使用高浓度支持电解质(0.5M)和具有高迁移性阴离子的支持电解质(KCl、KNO3、NaClO4、Na2HPO4)，它们在聚合物与周围溶液之间的离子交换中活泼地相互作用。这样的传感器的电位响应主要属于腐蚀型机理。这类传感器对于测量生物氧化还原反应不是足够敏感的，其中分析物的临床或环境相关浓度通常在纳摩尔、飞摩尔或渺摩尔范围内。其它研究也使用高迁移性阴离子作为掺杂离子，产生具有低敏感性的传感器。可以给出Hulanicki等人的工作作为一个实例，其中该作者用Cl-掺杂聚合物。在这种情况下，传感器仅在非常高浓度的氧化还原电对(约0.5M)存在下具有氧化还原敏感性。
其它研究[9，49，51]使用合适的掺杂剂离子-十二烷基苯磺酸钠，但是使用高浓度聚合物(0.05-0.3M)，其仍然不适合于制备高敏感性电位氧化还原传感器。
本发明人已经确定了主要因素，这些主要因素组合起来是聚合物薄膜的氧化还原性能的主要原因，并且因此能够生产具有比现有技术中所述的更高敏感性的聚合物基电位传感器。这些因素是单体的浓度、支持电解质的性质和浓度、单体与支持电解质浓度的比例，以前的研究涉及唯一一个或两个参数或条件而不是它们的协同影响或干扰。本发明人已经发现，高敏感性聚合物薄膜可以通过组合上述全部因素来生产。
发明内容
本发明涉及生产高敏感性可重现且长期稳定的聚合物基电位传感器。
在第一方面，本发明涉及具有高氧化还原敏感性的聚合物薄膜的电化学合成方法，其可以用作高敏感性电位化学、酶-和免疫传感器的敏感元件。有三种主要类型的电化学合成方法：恒电流、恒电位和动电位[19]。所有这些可以单独使用或者组合使用，以便电化学生长聚吡咯层。
因此，本发明提供通过用导电性聚合物涂敷导电性电极来生产高敏感性电位传感器的方法，该方法包括以下步骤：
(a)制备用于电化学聚合的水溶液，其包含导电性聚合物的单体单元，浓度为0.002-0.05M；和支持电解质，支持电解质也用作掺杂剂，其浓度为0.0001-0.005M。
(b)组装包含用于电化学聚合的溶液、辅助电极、一个或多个将要用导电性聚合物涂敷的工作电极和任选的参比电极的电化学聚合池；和
(c)通过使用以下电化学方案的至少一种从电化学聚合溶液中电化学合成聚合物用聚合物薄膜涂敷工作电极：
(i)在待涂敷工作电极和辅助电极之间借助Ag/AgCl参比电极施加-0.2至+0.2V的周期电压；
(ii)在单个或多个电流步骤中在待涂敷工作电极和辅助电极之间施加恒定电流，给定电流密度为0.01-1mA/cm2，该电流施加一定时间，使得通过工作电极的最终电量为10-250mC/cm2；
(iii)在单个或多个电位步骤中在待涂敷工作电极与辅助电极之间施加恒定电位，该电位的施加一定的时间，使得通过共诶电极的最终电量为10-250mC/cm2；
(iv)任何其它电化学方案，其中固定上述的所有溶液浓度和电化学参数。
本发明的基础是由本发明人进行的研究，由该研究可以得出下列结论：
·当由低浓度单体(例如吡咯)(＜0.05M)的溶液进行电化学合成时，聚合物(例如聚吡咯)基电位传感器的氧化还原敏感性明显增大(急剧)。
·对于在支持电解质存在下在0.002-0.05M的一定范围的单体(例如吡咯)浓度，观察到氧化还原敏感性的增大，支持电解质用作掺杂剂，例如十二烷基磺酸钠。
·当单体(例如吡咯)和支持电解质的浓度之间的比例约为25∶1并且使用以下电化学聚合方法中的任一项或多项时，观察到氧化还原敏感性的最终增大(尽管在本发明范围内可以使用其它比例)：
i)动电位方案：在(待涂敷的)工作电极与参比电极之间施加-0.2至+0.2(相对于Ag/AgCl参比电极)的周期性电压。
ii)恒电流方案：施加一级或多级(串联的)电流步骤，其中在聚合过程中通过的总电荷为10-250mC/cm2。
iii)恒电位方案：在工作电极与参比电极之间施加一级或多级(串联)的电位步骤，其中在聚合过程中通过的总电荷为10-250mC/cm2。
·在恒电流方案中使用多于一级的电流和/或在恒电位方案中使用多于一级的外加电位可以严格控制传感器的性能，所以生产比在电聚合过程中使用一级电流或电位的方案具有更好性能特性的传感器，例如更敏感。
·单体和支持电解质的浓度、它们之间的比例以及所施加的聚合过程协同影响聚合物(例如吡咯)基传感器的氧化还原敏感性。
本发明人的观察结果是出乎意料的，因为，如上所述，在氧化还原敏感性与诸如单体浓度、支持电解质的性质和浓度以及它们之间的比例和聚合过程的参数等参数在以前的出版物中没有考虑。在聚合物薄膜的氧化还原敏感性与传感器的最终分析敏感性之间存在强烈的相关性。本发明非常重要的方面是：通过改变溶液的组成和聚合过程的参数可以调节氧化还原敏感性。可以生产出用于确定某些病毒感染(例如HIV、HbsAg)的传感器，其中要求处于飞摩尔水平的敏感性。有时分析物感兴趣的范围处于更高的浓度，例如地高新(0.5-5ng/ml)或IgE(20-1000ng/ml)。
通过改变电化学聚合过程的参数或/和用于进一步测量过程的基底系统的组成，测量范围可以移动到更高的浓度或者被扩大。
总之，对于特定分析物可以设计分析敏感性和测量范围。通过在聚合溶液中确定的单体浓度、支持电解质以及确定的聚合方案与传感器的以下处理相结合，实现了这一目的。
本发明提供通过单体(例如聚吡咯)的电化学聚合生产高敏感性聚合物涂敷的(例如聚吡咯涂敷的)电位传感器动电位、恒电流和恒电位方法。任一方法可以与其它方法组合使用。
恒电位方案的参数从静电位过程得出并在实验中测试。对于相同的生长溶液和传感器的设计，电压和电流相互依赖。在某一个外加电流下记录的电压可以应用于恒电位方案，这将给出与静电位过程大致相同的电流。
在每种聚合方法中的准确值可以随导电性或半导性层的性能而稍有变化，但是一般来说，所有的过程给出类似的结果并且可以成功应用于任何类型的导电性或半导电性载体。
聚合过程的参数可以使用其上沉积聚合物的传感器几何表面积或电化学表面积计算。
本发明已经测试了各种传感器设计。传感器的优选设计有丝网印刷的直径为1.5mm2的圆形电极组成，几何面积为1.77mm2。可以预计其它设计，并且本发明不能认为限于这种特定设计。用于计算电化学表面积的方法是：将电极放在具有氧化还原物质(例如5mM亚铁氰化物)和支持电解质(例如0.1M的NaNO3)的溶液中。电极的电位从没有电流流过的电位逐步提高到所有的还原物质被氧化的电位，随时间变化记录所得的电流(计时安培法)。电流响应随时间变化的形状由Cottrell方程给出：
i＝(nFACD0.5)/(π0.5t0.5)其中n＝转移的电子数＝1，F＝法拉第(96480 C mol)，A＝电极的表面积，D＝还原物质的扩散系数，i＝电流，t＝时间。如果电流相对于t-0.5作图，则数据应当是线性的，并且从斜率可以计算面积。还可以使用估算电化学表面积的其它方法。
优选的动电位方法包含以下步骤：
a)制备用于电化学聚合的水溶液，其包含浓度为0.002-0.05M的单体(例如吡咯)和浓度为0.0001-0.005M的还作为掺杂剂的支持电解质，
b)组装包含用于电化学聚合的溶液、辅助电极、参比电极和一个或多个将用聚合物薄膜涂敷的电极的电化学聚合池，其中待涂敷的电极包括导电或半导性层；
c)向待涂敷的电极与参比电极之间施加-0.2至+0.2V(对于Ag/AgCl参比电极)的周期性电压，以便通过从电化学聚合溶液电化学合成聚合物用聚合物薄膜涂敷电极。
一种优选的恒电位方法包括以下步骤：
a)制备用于电化学聚合的水溶液，其包含浓度为0.002-0.05M的单体(例如吡咯)和浓度为0.0001-0.005M的还作为掺杂剂的支持电解质，
b)组装包含用于电化学聚合的溶液、辅助电极、参比电极和一个或多个将用聚合物薄膜涂敷的电极的电化学聚合池，其中待涂敷的电极包括导电或半导性层；
c)向待涂敷的电极与参比电极之间以单个或多个电位步骤施加0-3V的恒定电位，施加电位一定的时间，使得通过工作电极的最终电量为10-250mC/cm2。
本发明还包括电化学合成的恒电流方案，作为动电位方案的一种替代方案。在这种情况下，通过待涂敷工作电极的电量处于10-250mC/cm2(优选10-60mC/cm2)范围内是在工作电极和辅助电极之间以给定电流密度施加恒定电流一定时间的结果。可以使用单个或多个电流步骤。电流密度可以在0.01-1mA/cm2范围内变化。
本发明提供一种通过电化学聚合生产高敏感性聚合物涂敷的电位传感器的恒电流法，其包括以下步骤：
a)制备用于电化学聚合的水溶液，其含有浓度为0.002-0.05M的单体(例如吡咯)；和浓度为0.0001-0.005M的还作为掺杂剂的支持电解质；
b)组装包含用于电化学聚合的溶液、辅助电极、和一个或多个将用聚合物薄膜涂敷的电极的电化学聚合池，其中待涂敷的电极包括导电或半导性层；
c)向待涂敷的工作电极与辅助电极之间以单个或多个电流步骤以给定电流密度为0.01-1mA/cm2施加恒定电流，施加电流一定的时间，使得通过工作电极的最终电量为10-250mC/cm2(优选10-90mC/cm2)。
可以使用参比电极监测恒电流法或者可以采用两电极系统，其中不使用单独的参比电极。此外，可以在一个聚合过程中使用不同方案的组合。例如，在一个实施方案中，首先用恒电流方案是工作电极涂敷聚合物薄膜，然后使用动电位或恒电位方案涂敷附加的聚合物层。相反顺序也是可能的。也可以组合两个或多个恒电流方案。这些组合在控制聚合物薄膜的氧化还原条件方面给出了更大的灵活性。
在恒电流方案中使用施加不同时间的多个电流可以设计聚合物薄膜的氧化还原性能。
动电位周期或恒电位步骤和恒电流步骤的组合可以用来设计聚合物薄膜的氧化还原性能。
通过在制备生物传感器的恒电流方案中组合一种以上聚合方案和使用多个相继的电流来设计氧化还原性能的可能性在以前没有描述过，是本发明的一个新的部分。
本发明的方法可以用于在一个步骤中向单个电极或多个电极(大于1)涂敷聚合物薄膜。在单个聚合反应中涂敷多个电极的能力提高了重现性并降低了制造过程的成本。与以前的工作相反，以前的工作中仅涂敷一个电极，本发明的发明人在一个电化学聚合池中将在一组中的多个待涂敷的导电性或半导性电极用一个电连接连接起来，电化学聚合池包括辅助电极和用于动电位和恒电位方案的参比电极以及用于电化学聚合的溶液。全部待涂敷的电极作为一个单一的工作电极。理论上，不限制待涂敷的电极数量，并且该数量可以达到一次数十个，甚至数百个。
本发明人还观察到：高敏感性聚合物涂敷传感器可以使用电化学聚合方案的组合和/或在聚合方案中使用多个电流或电位步骤来生产，而没有在电化学聚合溶液中使用低浓度(＜0.05M)单体的限制。
所以，本发明还涉及使用电化学方案的组合和/或具有多个电流或电位步骤的电化学方案的电化学聚合的多步法。
特别地，本发明涉及以下：
一种生产高敏感性电位传感器的方法，其通过用导电性聚合物涂敷导电性电极进行，其中在恒电流方案中使用两个或多个电流步骤。
一种生产高敏感性电位传感器的方法，其通过用导电性聚合物涂敷导电性电极进行，其中在恒电位方案中使用两个或多个电位步骤。
一种生产高敏感性电位传感器的方法，其通过用导电性聚合物涂敷导电性电极进行，其中采用两个或多个聚合方案，优选选自恒电流、动电位、恒电位或其它电化学方案。
优选的恒电流、动电位或恒电位方案是与本发明的第一个方面相关的上述那些。
如上所述，在这些方法中，对在电化学聚合溶液中所用的单体或背景电解质的浓度没有限制。因此，这些方法可以用于在WO 00/11473中所述的更高浓度的单体。
本发明的范围扩展到根据本发明的方法生产的聚合物涂敷的电位传感器，以及这些传感器的应用。特别地，电位传感器可以用在分析物的电化学检测方法中(例如在WO 00/11473、WO 96/02001等中所述的那些)，以及酶活性的电位检测方法中(例如测量位于传感器表面附近的酶活性)和整个细胞的电位分析方法中(例如使用在本申请人的共同未决申请GB 0207116.5中所述的技术)。
在另一个方面，本发明还提供在沉积聚合物薄膜后处理导电性聚合物涂敷的传感器表面以提高长期稳定性和传感器的分析敏感性的方法。该处理可以用应用于上述的根据本发明方法制备的传感器，但是也可以应用于根据现有技术的电化学聚合法制备的聚合物涂敷的电位传感器(见WO 96/02001、WO 0011473等)。
该处理方法包括两个阶段。第一个阶段是在电化学聚合后用去离子水彻底清洗聚合物涂敷的传感器。在该阶段，未包埋的掺杂剂阴离子和痕量单体被从聚合物薄膜中去除。单体的去除是必需的，因为单体在储存过程中可能被氧化，改变聚合物薄膜的本征氧化还原性能，未包埋掺杂剂离子的去除也是必需的，因为迁移性反离子可能损害聚合物的金属性能[22，23]，降低氧化还原敏感性。特别是过量十二烷基磺酸钠使蛋白质分子变性[16]并降低生物分子的吸附。对于在聚合物薄膜内或在其上固定生物分子，这可能是不利的一点。
第二个稳定化步骤是从聚合物薄膜中去除未结合的水。这是非常重要的，因为未结合的水与聚合物的相互作用在一定时间内改变聚合物薄膜的本征氧化还原性能。这是为什么关于聚合物(例如聚吡咯)薄膜在一定时间内的不稳定性有许多出版物的原因，因为最常见的储存方法(即以湿式方式)[13，16，32，35，41]导致电化学特性的不稳定性和电位(或其它电化学)测量结果的非重现性。
这两个测量步骤可以使传感器长时间储存而不改变其工作特性，这对传感器的商业制造是非常重要的。
根据本发明中所述的方法生产的聚合物基传感器长时间储存稳定的另一个原因是因为聚合物薄膜远比常用(“半透明”薄膜)的更薄。在这样的薄膜中，聚合后过程结束非常迅速并且不会进一步影响聚合物性能。
本发明的另一个方面涉及测试由上述方法生产的聚合物基传感器的敏感性的方法。该测试在传感器性能方面表现出非常小的差异，并且提高设计传感器性能的能力。这些差异不可能通过一般应用的电化学过程来区分，例如通过在电解质溶液中测量传感器开路电位来测量电位。
对于所获得的传感器的敏感性，拥有通用的、重现性和快速测试是必需的，以便可靠地评价传感器制备条件(聚合过程和后续的处理)与其分析敏感性之间的关系。该测试也可以用作所有类型传感器的质量控制和用于进一步的传感器制造方法。
本发明的发明人已经发现：在固定的抗生物素蛋白链菌素与生物素标记的辣根过氧化物酶(HRP)之间的反应是一种简单、快速且可靠的测试方法，适合于测试传感器的分析敏感性。对于该测试的所有组分都是可以购得的并且是被检定的。
所以，本发明提供一种测试聚合物基电位传感器的分析敏感性的方法，该方法包括以下连续步骤：
(a)通过被动吸附用抗生物素蛋白链菌素涂敷传感器；
(b)对抗生物素蛋白链菌素涂敷蔗糖保护膜；
(c)使步骤(b)中获得的传感器与含有已知浓度的生物素标记的辣根过氧化物酶的溶液接触一定时间；
(d)当都浸渍在基础电解质溶液中时，监测传感器与参比电极之间的电位差；
(e)用与基础电解质溶液具有相同组成的增强剂电解质溶液取代基础电解质溶液，但是它另外含有用于辣根过氧化物酶的酶底物，并在浸入增强剂电解质溶液中时监测在传感器与参比电极之间的电位差；
(f)计算在步骤(d)和(e)中获得的电位差测量结果之间的差异，并比较所获得的结果与同时评价的利用预先确定的标准传感器或其它传感器获得的参考结果。
步骤a)和b)可以在一个步骤中组合：可以把一滴在蔗糖溶液中的抗生物素蛋白链菌素放在传感器上并干燥。任何附加的成分，例如阻断成分或稳定剂可以添加到该溶液中。在进行检测之前可能需要洗涤步骤。
在优选的实施方案中，在步骤(d)中所用的基础电解质溶液可以包含H供体。
上述方法提供一种迅速、标准化的电位检测，其可以用来迅速评价给定电位传感器的分析敏感性和确定例如电化学聚合溶液的组成变化对传感器的最终分析敏感性的影响。优选的是相对于标准或参考传感器评价分析敏感性，所述标准或参考传感器由用户选择。选择标准或参考传感器仅仅是为了提供基线(或参考线)，针对它可以比较其它传感器。参考传感器的精确特性对本发明并不重要。
重要的是为了可以在用不同传感器获得的结果之间进行有意义的比较，使检测参数即反应物浓度、培养时间等标准化。但是，这些参数的精确值并不重要并且可以由用户选择。本领域技术人员将会理解，合适的检测参数可以通过常规实验确定。模型检测的一个实例在所附实施例中给出。
标准化的检测是在本申请人的国际申请WO 00/11473中描述的方法的发展，步骤(a)和(c)至(e)可以如WO 00/11473中所述进行，其内容并入本文作为参考。
步骤(b)产生具有蔗糖保护层的传感器的涂层。该步骤是重要的，因为蔗糖层防止所吸附的抗生物素蛋白链菌素活性的损失并且还有助于防止氧和水分进入到聚合物层中。如下所述，通过将传感器浸渍到蔗糖溶液中(通常为1-25％，最优选为10％的蔗糖)或施加一滴含有抗生物素蛋白链菌素的蔗糖溶液来方便地涂敷蔗糖涂层，如果步骤(a)和(b)组合，则干燥该传感器(优选在30-40℃干燥约8-12小时)。
向传感器上施加蔗糖涂层的实用性不限于标准模型监测系统。相反，包含涂敷一层导电聚合物特别是聚吡咯的导电性电极的任何电位传感器都可以涂敷蔗糖保护层。此外，可以使用其它保护物质代替具有相同效果的蔗糖。
所以，在另一个方面，本发明提供包含涂敷导电性聚合物的导电性电极的电位传感器，其特征在于将保护性物质的涂层涂敷在导电性聚合物上面。
合适的保护性物质是作为蛋白质稳定剂的那些物质。合适的实例尤其包括海藻糖、肌醇、纤维素二糖和乳糖醇以及蔗糖。还可以使用这些物质与聚合物如葡聚糖或聚二醇的混合物。一般通过将传感器浸渍在保护物质的溶液中或者通过任何其它合适的方法，例如放置一滴保护性溶液或丝网印刷(例如海藻糖、肌醇、纤维素二糖、乳糖醇或蔗糖的1-25％溶液)并且然后干燥该传感器来涂敷保护性涂层。任何其它涂敷到传感器上的物质，如生物受体，例如抗生物素蛋白链菌素、抗体、肽等，以及阻断剂、稳定剂等，可以添加到保护溶液中并在该步骤中涂敷。
在另一个方面，本发明提供包含导电性聚合物的电位传感器，特征在于它可以用在具有电位检测步骤的任何分析中，例如酶检测或细胞分析，其中由于酶活性或细胞新陈代谢而产生的氧化还原、pH或离子变化而发生聚合物电位的可测量的变化。例如，通过直接生长或通过亲合性相互作用，细胞可以附着到表面上，通过本发明中所描述的电位测量可以检测电位的变化。
附图说明
图1表示对于用从含有不同浓度吡咯的聚合溶液中生长的聚吡咯薄膜涂敷的电位传感器，来自涂敷抗生物素蛋白链菌素的聚吡咯电位传感器的电位响应与生物素化的辣根过氧化物酶(Bt-HRP)浓度之间的关系。
图2表示对于用从含有不同浓度SDS的聚合溶液中生长的聚吡咯薄膜涂敷的电位传感器，来自涂敷抗生物素蛋白链菌素的聚吡咯电位传感器的电位响应与辣根过氧化物酶(HRP)浓度之间的关系。
图3表示对于聚吡咯涂敷的电位传感器，上边界电位的变化对分析响应和曲线(信号对HRP浓度)形状的影响。
图4表示对于聚吡咯涂敷的电位传感器，通过工作电极的电量变化对分析响应和校准曲线形状的影响。
图5表示各种恒电流聚吡咯生长方案对于对生物素化HRP(Bt-HRP)的响应的影响。每个生长方案由一系列恒电流控制的电流步骤组成，其中每个步骤可以施加10-1000s的时间。
图6表示电极设计对于对生物素化HRP(Bt-HRP)的响应的影响。“线性”电极设计由电极宽度明显小于电极长度的电极设计组成。“圆形”设计由圆形或圆盘形电极组成。
具体实施方案
本发明的方法用于通过用导电性聚合物涂敷导电性电极来生产高敏感性电位传感器。
要用导电性聚合物的导电性电极可以基本是任何包含导电性或半导性的合适电极。合适的电极包括标准电位电极，其具有在水性介质中稳定的金属或准金属导电性。电极优选由具有结合层(碳或铜)的塑料载体组成，在塑料载体上电化学镀敷或直接丝网印刷导电基底(优选金)。电位检测步骤所需的参比电极例如Ag/AgCl参比电极，可以通过任何方法与检测电极放在相同的载体上，所述方法例如丝网印刷。也可以使用任何外来商品参考电极。
在最终传感器产品中的任何布置都是可能的，例如用于电化学分析方法中的包含整体电化学传感器的“浸渍-棒”、多孔板。
电聚合水溶液通常在蒸馏水(例如MilliQ)中包含导电性聚合物的单体单元，其浓度为0.002-0.05M，优选0.002-0.02M，更优选0.0025-0.15M，更优选0.005-0.01M，和支持电解质，其浓度为0.0001-0.05M，优选0.0001-0.002M，优选0.0001-0.0015M，更优选0.0001-0.001M。其它极性溶剂可以代替蒸馏水。
合适的单体包括吡咯、呋喃、噻吩或其它的，吡咯是最优选的。这些单体中的两种或多种的组合也可以使用，导致产生导电性共聚物。
优选的支持电解质是十二烷基磺酸钠，但是可以使用其阴离子固定在聚合物薄膜内的其它电解质。该电解质还用作掺杂剂。
最优选的是电化学聚合溶液由单体和支持电解质的水溶液组成。但是，应当理解的是可以向聚合溶液中加入其它成分，例如提供特异性官能团的成分，其可以用作生物受体的连接剂或者用于传感器表面的化学改性(见WO 00/11473)。
在单体与支持电解质的浓度之间的比例优选为2∶1-30∶1，更优选为5∶1-30∶1。约25∶1的比例是最优选的。
最优选的组合物，尽管不限于本发明的整个范围，是0.005-0.01M单体(吡咯是最优选的)与0.0002M电解质(SDS是最优选的)或0.0075-0.01M单体(吡咯是最优选的)与0.0017M电解质(SDS是最优选的)。
在由待涂敷的电极(在本文中还称为“工作电极”)、辅助电极和参比电极构成的两-或三-电极系统中进行电化学聚合。在两电极系统(恒电流方案)的情况下，不使用参比电极。合适的组件已经描述在现有技术中(参见WO 00/11473和其中所包含的参考文献)。多个工作电极可以用一个点接触组合成一组。
辅助电极优选用铂、其它贵金属或其它惰性导电材料如石墨或碳制成。辅助电极应当具有大于全部工作电极总面积的表面积[53]。为了减小聚合溶液中未补偿的溶液电阻，参比电极应当尽可能靠近工作电极[20，21，53]。在工作电极与参比电极之间的恒定距离是优选的。常规Ag/AgCl或甘汞电极可以用作参比电极。
稳压器可以用于进行电化学合成。在动电位方案中，在参比电极与待涂敷工作电极之间施加扫描速度优选为50-100mV/s、优选1-15个循环的-0.2至+0.2V(相对于参比电极)的循环电压。记录在辅助电极处的电流。
伏安曲线的形状和通过工作电极的总电量是聚合物形成的控制参数。在每次循环过程中通过的电量不许与第一次循环相差5％以上。
在恒电流方案的情况下，在待涂敷工作电极与辅助电极之间可以使用一个或多个恒流步骤，电流为0.01-1mA/cm2，时间为100-1000s。施加电流步骤数量不限制。本发明人到目前为止已经使用了1-5个步骤。优选的总聚合时间为150-600s。
恒电流方案是更优选的。它比其它方案更便宜、更容易，设备的复杂程度低。使用不同的外加电流允许以非常高的精度设计聚合物薄膜的氧化还原性能。使用恒电流方案还可以精确控制所得聚合物薄膜的氧化水平。
在某些特定情况下，在一个聚合过程中可以依次使用恒电流和动电位或恒电位(或者反过来进行)方案。例如，在恒电流方案中使用小的恒电流在低电位下形成主聚合物薄膜，然后用高的上(upper)电位用动电位方案生长附加量的聚合物。导电聚合物可以进一步利用低电位例如0V(相对于Ag/AgCl)或使用0A的电流步骤调节1-300s。
在电化学合成后，优选将聚合物涂敷的传感器用去离子水洗涤，直至单体和十二烷基磺酸钠不能检测到。
在洗涤步骤后，必须从聚合物薄膜中出去未结合的水。这可以用若干方法进行。最简单的方法是在恒温箱中将传感器加热8小时。根据薄膜厚度，温度可以在25-50℃，优选30-40℃范围内变化。这一范围非常重要，因为一方面未结合的水在低于25℃的温度下不能完全排出，另一方面高温(高于50℃)可能损坏聚合物薄膜。除去水的另一种可能性是冻干法。
上述洗涤和干燥步骤还可以用来处理用现有技术的电化学聚合方法制备的聚合物涂敷电极(见WO 96/02001，WO 00/11473和其中引用的参考文献)。这种处理在电极的长期储存方面提供特别的优点，如上所述。
通过上述方法获得的聚合物涂敷电极的主要用途是生产高敏感性电位生物传感器，例如化学-、酶-或免疫传感器。任何生物受体可以使用固相涂敷的公知技术固定到传感器上。任何形式的氧化还原、pH-变化或酸化检测可以使用这些传感器进行，包括细胞分析。
为了评价和控制传感器的氧化还原敏感性，本发明人提出使用了一种模拟检测，其基于使用用抗生物素蛋白链菌素涂敷的聚合物基传感器，抗生物素蛋白链菌素与生物素标记的辣根过氧化物酶反应。以上已经提及，使用常用的电化学过程不适合于测定传感器的性能，因为它不可能在希望的水平上分辨性能差异。免疫检测有助于评价氧化还原性能，因此有助于评价使用不同聚合方案制备的传感器的分析灵敏性。
用抗生物素蛋白链菌素涂敷聚吡咯层的技术详细描述在本发明人的国际专利申请WO 00/11473中。根据涂敷方法，涂敷溶液中的抗生物素蛋白链菌素浓度可以在2-100μg/ml范围内变化。此外，在本发明中，保护性蔗糖层涂敷在用抗生物素蛋白链菌素涂敷的传感器上，然后干燥传感器。
用生物素蛋白链菌素涂敷和施加保护层可以组合在一起。在后一种情况下，将一滴(0.1-10μl)含有抗生物素蛋白链菌素的保护溶液放在传感器上并干燥。可以使用其它方法，例如丝网印刷。
用分析物培养的方法描述在WO 00/11473中。可以使用许多种具有不同pH值的含水缓冲液，用于HRP溶液制备。生物素化的HRP在0-100ng/ml范围内变化。典型的一组浓度为：0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0ng/ml。培养时间可以为2-60分钟。
电位测量过程，以及分析结果的计算详细描述在WO 00/11473中。
公知的是HRP要求使用H-供体来加速酶的反应。但是，在WO00/11473中，仅提到了在用光学检测的常规免疫检测中常用的H供体。所有这些H-供体由于酶反应而改变其颜色。对于电位测量，不要求这种颜色变化。在后一种情况下，只有敏感元件例如聚合物薄膜由于与HRP反应而发生的氧化还原状态变化程度是重要的。本发明人已经发现，许多无色物质可以用作HRP的H-供体并且提供氧化还原状态的充分变化以进行电位测量。合适的H供体是由于与辣根过氧化物酶反应而产生氧化还原状态的高变化程度的那些。最优选的是H-供体将是由于在确定的模拟检测条件下与辣根过氧化物酶相互作用提供至少10mV的传感器电位响应的H供体。合适的无色H-供体的实例是松柏醇、愈创木酚、MBTH。取决于特定的H-供体，在电位测量中所用的H-供体浓度可以在0.1-100mM范围内变化。通过仅改变H-供体和/或其在酶底物系统中的浓度，对特定分析物可以扩展或移动测量范围。
在WO 00/11473中，使用过氧化氢作为HRP酶底物。作为强氧化剂，过氧化氢可能通过干扰聚合物层或下面的电极而影响测量结果。在本发明中，它可以用有机或无机过氧化物酶底物代替。合适的酶底物包括甲基氢过氧化物、乙基氢过氧化物或对硝基过氧苯甲酸和过硼酸钠。酶底物的浓度根据酶底物的性质而在0.0005-0.1％范围内变化，在过硼酸钠的情况下，优选的浓度为0.03％。
很明显，这些H-供体和过氧化物酶底物的实用性不限于本文所述的氧化还原灵敏性评价和质量控制的模拟检测系统。实际上，这些H-供体和酶底物还可以用于这种分析物的电位分析，例如使用与WO00/11473中所述的夹心和竞争电位分析方法类似的方法。
这些电位分析方法类似于模拟检测系统，但是传感器表面用对感兴趣的分析物具有特异性结合亲合性的生物分子修饰而不是使用抗生物素蛋白链菌素修饰(NB，分析物特异性结合分子可以用吸附到传感器上的抗生物素蛋白链菌素通过生物素/抗生物素蛋白链菌素相互作用附着到传感器上或者固定在聚合物涂层中，如WO 00/11473中所述)。参见WO 00/11473，将会理解基于使用酶标记物(例如过氧化物酶)的电位检测的特征。可以使用除了HRP酶以外的酶标记物(例如其它过氧化物酶、葡萄糖氧化酶或过氧化氢酶)，因为任何酶过程涉及电子转移，这又改变传感器的电位。
使用酶标记物的电化学检测的典型“夹心”电位法(如在WO00/11473中所述的方法)包括以下步骤：
(a)提供具有导电性聚合物涂层的电位传感器，该涂层中固定受体或者在其上吸附受体，所述受体能够结合到样品中希望的待检测分析物上；
(b)使传感器与包含样品的测试溶液接触，使得所述分析物结合到所述固定的或吸附的受体上；
(c)使传感器与包含次级受体的溶液接触，次级受体能够在与结合到固定的或吸附的受体空间上不同的位置结合到所述分析物上，所述次级受体与至少一种酶是共轭的。
(d)当传感器和参比电极都浸入在基础电解质溶液中时，检测传感器与参比电极之间的电位变化。
(e)将传感器和参比电极转移到与基础电解质溶液具有相同组成但是还含有酶的酶底物的增强剂电解质溶液中，并且当传感器和参比电极都浸渍在增强剂电解质溶液中时，监测传感器和参比电极之间的电位变化。
(f)计算在步骤(d)和(e)中获得的电位差测量之间的差值，并将所得的结果与样品中的分析物浓度相关联。
而使用酶标记物的电化学检测的典型“竞争”电位法(例如在W000/11473中所述的方法)包括以下步骤：
(a)提供具有导电性聚合物涂层的电位传感器，该涂层中固定受体或者在其上吸附受体，所述受体能够结合到样品中希望的待检测分析物上；
(b)使传感器与包含样品的测试溶液接触，使得所述希望的分析物结合到所述固定的或吸附的受体上；
(c)使传感器与包含竞争分子的溶液接触，竞争分子能够结合到所述固定的或吸附的受体上，所述竞争分子与至少一种酶是共轭的。
(d)当传感器和参比电极都浸入在基础电解质溶液中时，检测传感器与参比电极之间的电位变化。
(e)将传感器和参比电极转移到与基础电解质溶液具有相同组成但是还含有所述酶的酶底物的增强剂电解质溶液中，并且当传感器和参比电极都浸渍在增强剂电解质溶液中时，监测传感器和参比电极之间的电位变化。
(f)计算在步骤(d)和(e)中获得的电位差测量之间的差值，并将所得的结果与样品中的分析物浓度相关联。
本发明提供具有以上列出的典型检测的所有特征的方法，特征在于(i)使用过氧化物酶酶标记物，任选与选自过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的其它酶标记物结合，和(ii)基础和增强剂电解质溶液包含H-供体，所述H-供体由于与过氧化物酶相互作用而表现出其氧化还原状态的高变化量，从而提供高电位传感器响应。
优选的是H-供体由于与过氧化物酶的相互作用对感兴趣的分析物浓度提供至少10mV的传感器电位响应。
最优选的H-供体包括但不限于松柏醇、愈创木酚和MBTH。
使用葡萄糖氧化酶或过氧化氢酶作为酶标记物而不用过氧化物酶也可以进行检测，但是在这种情况下，不必向电解质中加入H-供体。
本发明还提供具有以上列出的典型检测的所有特征的方法，特征在于(i)所述酶是过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)和(ii)酶底物是过硼酸钠、过氧化氢或有机过氧化物。在这些方法中，基础和增强剂电解质溶液中包含H-供体，但是不限制H-供体的精确性质。
使用替代的H-供体(与过氧化物酶标记物)和不同的酶组合(过氧化物酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶等)的可能性为整个系统增加了额外的灵活性，扩大了本发明的可能应用范围。
参考以下非限制性的试验实施例，将会进一步理解本发明。
实施例
如果没有另外说明，所有的试剂购自Sigma。购自Merck的吡咯通过蒸馏提纯并在-20℃分小份储存。
实施例1
该第一个实施例证明在用于电化学聚合的溶液中吡咯浓度与聚吡咯基电位传感器的分析灵敏性之间的关系。
工作电极是常规制备的平面电极，其包含PET(聚对苯二甲酸乙二酯)载体(～125μm)与涂敷电化学镀金(～30μm)的电沉积铜(～17μm)。工作面积约1.0平方毫米。用于电化学聚合的水溶液包含0.0002 M SDS(十二烷基苯磺酸钠)作为支持电解质和下列吡咯浓度：0.5M、0.3M、0.15M、0.05M、0.01M、0.005M、0.0025M。将这些溶液之一放在包含辅助铂电极和参比电极(BAS)的用于电化学聚合的池中。将具有一个电触点的组成成一组的8个电极放在所述池中，工作面积浸渍在溶液中。为了提供均匀的电流密度，把全部电极按与辅助电极平行的关系放置。为了减小电阻电压降，参比电极位于距离工作电极可能的最近距离。使用μAutolab II恒电位-恒电流(EcoChemie)进行电化学聚合，施加-0.2至+1.7V的循环电压4次，扫描速度为0.05V/sec。
在聚合后，将传感器放在含有去离子水的储存器中，系统地用新水换水(3个小时，每15分钟一次)。在洗涤后，将传感器在37℃的恒温箱中放置24小时。
使用模拟检测测试氧化还原灵敏性(涂敷抗生物素蛋白链菌素的聚吡咯基传感器与生物素化的辣根过氧化物酶)。
将干燥后的传感器在+4℃的抗生物素蛋白链菌素溶液中(40μg/ml抗生物素蛋白链菌素在磷酸钾缓冲液(0.05M、pH为8.0))放置24小时。在吸附后，将传感器在10％的蔗糖水溶液中放1-2分钟，然后干燥。在该步骤之后，传感器可以贴箔并可以保持较长的时间。估计的时间为至少12个月。
在本实施例中，通过用反应缓冲液(0.1 M磷酸钾缓冲液，pH＝7.8)洗涤，除去保护性蔗糖薄膜，然后进行下一个分析阶段。但是，在该阶段不一定除去蔗糖层。可以使蔗糖涂敷的传感器与含有分析物(在这种情况下是生物素化的HRP)的溶液接触。蔗糖是高度水溶性的并且将非常迅速地溶解。而且，在反应容器中存在蔗糖不影响检测本身。在本实施例中，在洗出保护性蔗糖薄膜后，将抗生物素蛋白链菌素涂敷的传感器用在反应缓冲液中各种浓度的生物素化的HPR培养、洗涤并放置在其中直至电位测量。
在WO 00/11473中所述的电位测量方法组合两个步骤，通常在含有H-供体的第一种电解质溶液中(另外称为基础溶液)进行第一电位测量(相对于Ag/AgCl参比电极)。在第二电解质溶液(另外称为增强剂溶液)中进行第二电位测量，第二电解质溶液与基础溶液组成相同，但是加入酶底物。用毫伏测量与样品中分析物浓度相关的两种电位的差值。为了消除H-供体本身对最终结果的贡献，在基础溶液中存在H-供体是希望的。
使用包含测量池(在这些实验室中构造的)的测量装置进行测量。将传感器放在测量池中，将基础溶液泵入，然后根据设定参数用增强基溶液替换。用常规设计的软件计算结果。
在本实施例中，基础溶液为在0.05M柠檬酸钠缓冲液中的100mMOPD(邻苯二胺)，pH＝5.0。使用过硼酸钠(0.03％)在增强剂溶液中作为HRP的酶底物。第一电位测量在20秒进行；第二电位测量在60秒进行。
对于具有从不同浓度吡咯的溶液中生长的聚吡咯薄膜的传感器，电位响应与HRP浓度之间的关系表示在图1a中。
聚吡咯基传感器的响应强烈依赖于用于电化学聚合的溶液中单体的浓度。对于特定的HRP浓度，在信号与聚合溶液中吡咯浓度之间的关系表示在图1b上(0.1ng/ml HRP)、图1c(1.0ng/ml HRP)和图1d(10ng/ml HRP)中。
信号通常随着聚合溶液中吡咯浓度的减小而增大。对于用含有0.0025M-0.015M吡咯(对于10ng/ml为0.005M)的溶液生产的传感器，观察到信号的最大增大。
如上所述，在所述吡咯浓度范围内观察到这种效果，这还没有被生产高灵敏性聚合物基传感器的其它研究者认识到。
本实施例证明，电化学聚合溶液中的单体浓度是生产高灵敏性电位传感器的重要因素之一。
实施例2
本实施例证明用于电化学聚合的溶液中支持电解质浓度与聚吡咯基电位传感器的分析灵敏性之间的关系。
与实施例1中一样制备电位传感器，不同的是用于电化学聚合的水溶液中单体浓度固定(0.005M)。按下列浓度使用SDS(支持电解质)：0.0001M、0.00015M、0.0002M、0.0004M、0.001M、0.002M。在聚合后处理传感器，并使用浓度在0-10ng/ml范围内的生物素化HRP与实施例1一样测定分析灵敏性。
对于从具有不同浓度SDS的溶液中生长的聚吡咯薄膜的传感器，在电位响应与生物素化HRP浓度之间的关系表示在图2a中。聚吡咯基传感器的响应强烈依赖于用于电化学聚合的溶液中支持电解质的浓度。
对于特定的生物素化HRP浓度，在信号与聚合溶液中SDS浓度之间的关系表示在图2b(0.1ng/ml HRP)、图2c(1.0ng/ml生物素化HRP)和图2d(10ng/ml生物素化HRP)中。对于生物素化HRP浓度≤1.0ng/ml，传感器响应曲线在0.0002M SDS处有峰值，在0.00015M有下降，然后在0.0001M处急剧增大。
在聚合溶液中的SDS浓度与电位传感器的分析灵敏性之间的关系是复杂的。一方面，SDS用作掺杂剂离子，为聚合物薄膜提供某些电化学性能，SDS浓度的变化导致传感器的分析灵敏性变化(见图2a、b、c、d)。另一方面，SDS作为支持电解质，为聚合溶液提供一定导电性和一定的电流密度，这确定了聚合物薄膜的厚度。从具有更高SDS浓度的聚合溶液中生长的聚合物薄膜更厚。
用具有最低SDS浓度(0.0001M)的溶液形成的聚合物薄膜是不规则的。电位效应由于酶反应而部分来自聚合物并且由于酶底物存在而部分来自表面上出现的暴露的金。暴露的金的响应贡献在0ng/ml生物素化HRP处可以清楚看到。
这两个实施例证明了单体和支持电解质的浓度及它们的比例对于聚合物基电位传感器的灵敏度是重要的因素。这些实施例还证明通过改变电化学合成的参数来设计分析灵敏性和测量范围的可能性。
实施例3
本实施例证明在聚合过程的参数与聚合物基电位传感器之间的关系。
将40个电极组合在具有一个电触点的一组中。这些电极放在圆形池的周边上。将Ag/AgCl参比电极放在该池的中心。辅助电极是固定在池底部的铂网，其与所述40个工作电极的每一个距离相等。选择圆形布置是为了对所有的工作电极提供均匀的电流密度。使用吡咯浓度为0.005M和SDS为0.0002M的聚合溶液，该浓度在以前的实验中(见实施例1和2)发现是最佳的。
通过施加循环电压4次，扫描速度为0.05V/sec，使用μAutolabII恒电位-恒电流(EcoChemie)进行电化学聚合。下限电位为-0.2V(与实施例1相同)，上限电位在1.4-2.0V之间变化。如前面的实施例中所述，在聚合后处理传感器，使用在0-10ng/ml范围内的生物素化HRP浓度，按实施例1中所述测试分析灵敏度。
根据这些结果，传感器的分析响应和曲线形状(信号-HRP浓度)受上限电位影响(图3)。
上限电位对电位传感器的电位灵敏性是另一个关键因素。这是聚合物薄膜的氧化还原状态及其厚度的原因，这取决于单位表面积通过的电量。
该实施例证明本发明的主要声明之一，即单体和支持电解质的浓度、它们之间的比例、外加循环电压的范围协同影响聚吡咯基传感器的分析敏感性。
应该记载，通过上述方法生产的传感器比已知的电位传感器有更高的灵敏性，并且可以用于多种分析物的电位分析。
实施例4
本实施例证明在电化学分析的恒电流方案中通过工作电极的电量对其分析灵敏性的影响。
将40个电极组合在具有一个电触点的一组中。这些电极放在圆形池的周边上。将Ag/AgCl参比电极放在该池的中心。辅助电极是固定在池底部的铂丝，其与所述40个工作电极的每一个距离相等。使用吡咯浓度为0.005M和SDS为0.0002M的聚合溶液，该浓度在以前的实验中(见实施例1和2)发现是最佳的。
通过在两个电极，即待涂敷的电极和辅助电极，之间施加三种连续的不同电流密度，使用μAutolab II恒电位-恒电流(EcoChemie)进行电化学聚合。对于第一、第二和第三水平，所用的电流密度分别为0.1mA/cm2、0.15mA/cm2和0mA/cm2。第二和最后的密度水平的持续时间保持恒定(分别为23和5s)。因此，所得的电量为33.5-93.5mC/cm2。
如前面的实施例中所述，在聚合后处理传感器，使用在0-10ng/ml范围内的生物素化HRP浓度，按实施例1中所述测试其分析灵敏度。
传感器的分析响应和曲线“信号-HRP浓度”形状取决于在聚合过程中通过电极的电量(图4)。
该实施例证明本发明的主要声明之一，即单体和支持电解质的浓度、它们之间的比例、在聚合过程中通过电极的电量协同影响聚吡咯基传感器的分析敏感性。
实施例5
该实施例证明应用一种以上聚合方案对传感器的分析灵敏性的影响。使用两种聚合方案：常规的恒电流方案和组合的恒电流-动电位过程。总电量及因此产生的聚合物薄膜厚度在这两种情况下是相同的。
使用在实施例4中所述的聚合溶液浓度和聚合电池结构依次进行恒电流和动电位过程。使用μAutolab II恒电位-恒电流(EcoChemie)进行电化学聚合，恒电流的电流密度为0.1mA/cm2，时间为150s(15mC/cm2)，然后进行单循环电压扫描，扫描速度为0.05V/sec，电位步长为2.44mV。下限电位是-0.2V。上限电位是1.90V(过程1)。恒电流过程用0.1mA/cm2进行300s(过程2)，其大致获得与过程1(15mC/cm2)相同的电量。其它参数与过程1相同。
如以前的实施例中所述，在聚合后处理所得的传感器，因此使用两种生物素化HRP浓度(0和0.1ng/ml)与实施例1中一样测试其分析灵敏性。
                     信号，mV
  施加过程   0ng/ml，[HRP-生物素]     0.1ng/ml[HRP-生物素]
  过程1   14     51
  过程2   11     23
该实施例证明应用两种聚合方案的影响。动电位步骤可以在恒电流过程中使用一种以上的电流量“模拟”(见前面的和下面的实施例)。
两种或多种方案的应用允许更严格控制聚合物薄膜的氧化还原性能并因此设计传感器的分析灵敏性。
实施例6
本实施例证明，通过改变恒电流方案的参数，可以设计电化学聚合沉积来适应特定检测的要求。在图5中，“方案1”生产具有高“灵敏性”(0-0.1ng/ml的响应)但是“动态”范围低(0-10ng/ml的响应)的传感器。使用“方案3”生产的的传感器具有远远更大的动态范围但是更低的灵敏性。使用μAutolab II(Ecochemie)计算机控制的电化学测量系统进行电化学聚合。将40个圆形设计的电极(直径＝1.5mm)放在与铂辅助电极平行的直线池。该池充满含有吡咯(7.5mM)和SDS(0.17mM)的水溶液。使用恒电流方案将聚合物沉积在电极上，在该恒电流方案中，进行一系列的电流步骤，得到13-24mC/cm2的总通过电荷。在电化学聚合物沉积结束后，如前面的实施例所述处理这些传感器，使用在0-10ng/ml范围内的生物素化HRP浓度确定其分析灵敏性。
实施例7
本实施例证明不同形状电极设计产生对相同生物素化HRP量响应略微不同的传感器。在图6中，圆形设计(直径＝1.5mm2)与直线设计(长度＝1mm，宽度＝0.25mm)比较。圆形电极设计产生具有比直线设计更低动态范围和更低灵敏性的传感器。
两种传感器都使用恒电流方案生产，条件如前面的实施例中所述。在聚合物沉积过程中通过的总电流对于圆形电极为24mC/cm2，对于直线电极为210mC/cm2。
参考文献
以下文献的内容将被认为并入申请中作为参考。
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Claims (45)

1.一种通过用导电性聚合物涂敷导电性电极来生产高灵敏性电位传感器的方法，该方法包括以下步骤：
(a)制备用于电化学聚合的水溶液，其包含导电性聚合物的单体单元，浓度为0.002-0.05M；和支持电解质，支持电解质也用作掺杂剂，其浓度为0.0001-0.005M。
(b)组装包含用于电化学聚合的溶液、辅助电极、一个或多个将要用导电性聚合物涂敷的工作电极和任选的参比电极的电化学聚合电池；和
(c)通过使用以下电化学方案的至少一种从电化学聚合溶液中电化学合成聚合物来用聚合物薄膜涂敷工作电极：
(i)在待涂敷工作电极和辅助电极之间施加相对于Ag/AgCl参比电极为-0.2至+0.2V的循环电压；
(ii)在单个或多个电流步骤中在待涂敷工作电极和辅助电极之间施加恒定电流，给定电流密度为0.01-1mA/cm2，该电流施加一定时间，使得通过工作电极的最终电量为10-250mC/cm2；
(iii)在单个或多个电位步骤中在待涂敷工作电极与辅助电极之间施加0-3V范围内的恒定电位，该电位的施加一定的时间，使得通过工作电极的最终电量为10-250mC/cm2；
(iv)任何其它电化学方案，其中按照上述的所有溶液浓度和电化学参数。
2.根据权利要求1的方法，其中在步骤(c)中，依次进行或以任何组合进行电化学方案(i)、(ii)、(iii)和(iv)，通过从电化学聚合溶液中电化学合成聚合物来用聚合物薄膜涂敷所述电极。
3.根据权利要求2的方法，其中步骤(c)包含依次进行电化学方案(i)、(ii)、(iii)。
4.一种通过用导电性聚合物涂敷导电性电极来生产高灵敏性电位传感器的方法，其中在恒电流方案中使用两个或多个电流步骤。
5.一种通过用导电性聚合物涂敷导电性电极来生产高灵敏性传感器的方法，其中在恒电位方案中使用两个或多个电压步骤。
6.一种通过用导电性聚合物涂敷导电性电极来生产高灵敏性传感器的方法，其中应用两个或多个聚合方案，优选选自恒电流、动电位、恒电位或其它电化学方案。
7.根据权利要求1-6的任一项的方法，其中在电化学聚合溶液中导电性聚合物的单体单元与支持电解质的浓度之间的比例在2∶1-30∶1，更优选在5∶1-30∶1范围内。
8.根据权利要求7的方法，其中在电化学聚合溶液中导电性聚合物的单体单元与支持电解质的浓度之间的比例约为25∶1。
9.根据权利要求1-8的任一项的方法，其中导电性聚合物的单体单元是吡咯、噻吩、呋喃或其任何混合物。
10.根据权利要求1-8的任一项的方法，其中使用十二烷基磺酸钠作为支持电解质。
11.根据权利要求1-10的方法，其用于在单一聚合反应中生产两个或多个高灵敏性电位传感器，其中在用于步骤(b)的电化学聚合的池中，两个或多个待涂敷电极组合在具有一个共用电触点的一个单元中。
12.根据权利要求11的方法，其中在动电位或恒电位方案中的所有待涂敷电极与辅助电极处于相等的距离。
13.根据权利要求11或12的方法，其中所有待涂敷电极优选与参比电极等距离布置。
14.根据权利要求1的方法，其中在步骤(i)中，施加循环电压1-15个周期。
15.根据权利要求1的方法，其中在步骤(ii)中，施加的电流步骤数量为1-5。
16.根据权利要求1-15的任一项的方法，其包含以下附加步骤：
(d)在去离子水中洗涤在步骤(c)中获得的导电性聚合物涂敷的电极；和
(e)从导电性聚合物层中除去未结合的水。
17.根据权利要求16的方法，其中在步骤(d)中，导电性聚合物涂敷的电极用去离子洗涤直至不再能检测到导电性聚合物的单体单元和支持电解质的痕迹。
18.根据权利要求16或17的方法，其中在步骤(e)中，通过在恒温箱中将电极加热至少8小时从导电性聚合物层中除去未结合的水。
19.根据权利要求18的方法，其中加热温度在25-50℃，优选30-40℃范围内。
20.根据权利要求16或17的方法，其中在步骤(e)中，通过冻干法从导电性聚合物层中除去未结合的水。
21.一种用于测试导电性聚合物涂敷的电位传感器的分析灵敏性的方法，该方法包括以下连贯的步骤：
(a)通过被动吸附用抗生物素蛋白链菌素涂敷传感器；
(b)对抗生物素蛋白链菌素涂敷蔗糖保护膜或者在步骤(a)中与抗生物素蛋白链菌素一起涂敷；
(c)使步骤(b)中获得的传感器与含有已知浓度的生物素标记的辣根过氧化物酶的溶液接触一定时间；
(d)当都浸渍在基础电解质溶液中时，监测传感器与参比电极之间的电位差；
(e)用与基础电解质溶液具有相同组成的增强剂电解质溶液取代基础电解质溶液，但是它另外含有用于辣根过氧化物酶的酶底物，并在浸入增强剂电解质溶液中时监测在传感器与参比电极之间的电位差；和
(f)计算在步骤(d)和(e)中获得的电位差测量结果之间的差异，并使所获得的结果与同时评价的利用预先确定的标准传感器或其它传感器获得的参考结果比较。
22.根据权利要求21的方法，其中通过将传感器浸渍到蔗糖水溶液中，然后干燥传感器来进行涂敷蔗糖保护薄膜的步骤。
23.根据权利要求21的方法，其中通过向传感器上涂敷一滴在蔗糖溶液中的抗生物素蛋白链菌素，然后干燥传感器，来同时进行步骤(a)和(b)。
24.根据权利要求21-23的任一项的方法，其中H-供体是由于与辣根过氧化物酶相互作用而具有氧化还原状态的高变化量的H-供体，从而提供高电位传感器响应。
25.根据权利要求24的方法，其中H-供体是由于与辣根过氧化物酶相互作用而对0.1ng/ml生物素化HRP提供至少10mV的传感器电位响应的H-供体。
26.根据权利要求24的方法，其中H-供体是松柏醇、愈创木酚或MBTH。
27.根据权利要求21-26的任一项的方法，其中用于辣根过氧化物酶的酶底物是过硼酸钠或过氧化氢。
28.根据权利要求21-26的任一项的方法，其中使用有机过氧化物作为辣根过氧化物酶的酶底物。
29.根据权利要求28的方法，其中有机过氧化物是甲基氢过氧化物、乙基氢过氧化物或对硝基过氧苯甲酸。
30.一种制备电位传感器的方法，该传感器包含用导电性聚合物涂敷的导电性电极，该方法包括：
(a)用包含导电性聚合物的单体单元和支持电解质的聚合溶液通过电化学聚合用导电性聚合物涂敷导电性电极；
(b)在去离子水中洗涤在步骤(a)中获得的导电性聚合物涂敷的电极；和
(c)从导电性聚合物层中除去未结合的水。
31.根据权利要求30的方法，其中在步骤(b)中，用去离子水洗涤导电性聚合物涂敷的电极直至不再能检测到导电性聚合物的单体单元和支持电解质的痕迹。
32.根据权利要求30或31的方法，其中在步骤(c)中，通过在恒温箱中使电极加热至少8小时从导电性聚合物层中除去未结合的水。
33.根据权利要求32的方法，其中加热温度在25-50℃，优选30-40℃范围内。
34.根据权利要求30或31的方法，其中在步骤(e)中，通过冻干法从导电性聚合物层中除去水。
35.一种电位传感器，其包含具有导电性聚合物的导电性电极，其用受体或生物受体或蛋白质涂敷，特征在于保护物质涂层涂敷在导电性聚合物上。
36.根据权利要求36的电位传感器，其中保护性物质是蛋白质稳定剂。
37.根据权利要求36的电位传感器，其中保护性物质是蔗糖、海藻糖、肌醇、纤维素二糖、乳糖醇或其与聚合物的混合物，优选为葡聚糖或聚乙二醇。
38.一种电化学检测样品中的分析物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供具有导电性聚合物涂层的电位传感器，该涂层中固定受体或者在其上吸附受体，所述受体能够结合到样品中希望的待检测分析物上；
(b)使传感器与包含样品的测试溶液接触，使得所述分析物结合到所述固定的或吸附的受体上；
(c)使传感器与包含次级受体的溶液接触，次级受体能够在与结合到固定的或吸附的受体空间上不同的位置结合到所述分析物上，所述次级受体与至少一种酶是共轭的；
(d)当传感器和参比电极都浸入在基础电解质溶液中时，检测传感器与参比电极之间的电位变化；
(e)将传感器和参比电极转移到与基础电解质溶液具有相同组成但是还含有酶的酶底物的增强剂电解质溶液中，并且当传感器和参比电极都浸渍在增强剂电解质溶液中时，监测传感器和参比电极之间的电位变化；
(f)计算在步骤(d)和(e)中获得的电位差测量之间的差值，并将所得的结果与样品中的分析物浓度相关联。
39.一种电化学检测样品中的分析物的方法，该方法薄膜以下步骤：
(a)提供具有导电性聚合物涂层的电位传感器，该涂层中固定受体或者在其上吸附受体，所述受体能够结合到样品中希望的待检测分析物上；
(b)使传感器与包含样品的测试溶液接触，使得所述希望的分析物结合到所述固定的或吸附的受体上；
(c)使传感器与包含竞争分子的溶液接触，竞争分子能够结合到所述固定的或吸附的受体上，所述竞争分子与至少一种酶是共轭的；
(d)当传感器和参比电极都浸入在基础电解质溶液中时，检测传感器与参比电极之间的电位变化；
(e)将传感器和参比电极转移到与基础电解质溶液具有相同组成但是还含有所述酶的酶底物的增强剂电解质溶液中，并且当传感器和参比电极都浸渍在增强剂电解质溶液中时，监测传感器和参比电极之间的电位变化；
(f)计算在步骤(d)和(e)中获得的电位差测量之间的差值，并将所得的结果与样品中的分析物浓度相关联。
40.根据权利要求38或39的方法，其中H-供体是由于与辣根过氧化物酶相互作用而对感兴趣的分析物浓度提供至少10mV的传感器电位响应的H-供体。
41.根据权利要求40的方法，其中H-供体是松柏醇、愈创木酚或MBTH。
42.根据权利要求40-41的任一项的方法，其中过氧化物酶酶底物是过硼酸钠、过氧化氢或有机过氧化物。
43.一种电化学检测样品中分析物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供具有导电性聚合物涂层的电位传感器，该涂层中固定受体或者在其上吸附受体，所述受体能够结合到样品中希望的待检测分析物上；
(b)使传感器与包含样品的测试溶液接触，使得所述分析物结合到所述固定的或吸附的受体上；
(c)使传感器与包含次级受体的溶液接触，次级受体能够在与结合到固定的或吸附的受体空间上不同的位置结合到所述分析物上，所述次级受体与过氧化物酶是共轭的；
(d)当传感器和参比电极都浸入在基础电解质溶液中时，检测传感器与参比电极之间的电位变化；
(e)将传感器和参比电极转移到与基础电解质溶液具有相同组成但是还含有过氧化物酶的酶底物的增强剂电解质溶液中，并且当传感器和参比电极都浸渍在增强剂电解质溶液中时，监测传感器和参比电极之间的电位变化，特征在于过氧化物酶的酶底物是过硼酸钠、过氧化氢或有机过氧化物；
(f)计算在步骤(d)和(e)中获得的电位差测量之间的差值，并将所得的结果与样品中的分析物浓度相关联。
44.一种电化学检测样品中的分析物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供具有导电性聚合物涂层的电位传感器，该涂层中固定受体或者在其上吸附受体，所述受体能够结合到样品中希望的待检测分析物上；
(b)使传感器与包含样品的测试溶液接触，使得所述希望的分析物结合到所述固定的或吸附的受体上；
(c)使传感器与包含竞争分子的溶液接触，竞争分子能够结合到所述固定的或吸附的受体上，所述竞争分子与过氧化物酶是共轭的；
(d)当传感器和参比电极都浸入在基础电解质溶液中时，检测传感器与参比电极之间的电位变化；
(e)将传感器和参比电极转移到与基础电解质溶液具有相同组成但是还含有过氧化物酶的酶底物的增强剂电解质溶液中，并且当传感器和参比电极都浸渍在增强剂电解质溶液中时，监测传感器和参比电极之间的电位变化，特征在于过氧化物酶的酶底物是过硼酸钠、过氧化氢或有机过氧化物；
(f)计算在步骤(d)和(e)中获得的电位差测量之间的差值，并将所得的结果与样品中的分析物浓度相关联。
45.根据权利要求43或44的方法，其中有机过氧化物是甲基氢过氧化物、乙基氢过氧化物或对硝基过氧苯甲酸。
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