JPH08505476A

JPH08505476A - 電気的に活性なポリマ電極を用いたパルス式電気化学的検出方法

Info

Publication number: JPH08505476A
Application number: JP6519375A
Authority: JP
Inventors: ジョンエムリヴィエロ; ゴードンウォーレス; オモウンミアモクサディク
Original assignee: ユニヴァーシティーオブウーロンゴング
Priority date: 1993-03-05
Filing date: 1994-03-04
Publication date: 1996-06-11
Also published as: US5403451A; WO1994020841A1; EP0690983A4; CA2157503A1; AU6254894A; EP0690983A1

Abstract

(57)【要約】第１の実施形態において、溶液中の目標分析物は、周期的な交流電圧が接続される導電性の電気的に活性なポリマを含む電極に溶液を曝すことにより検出される。分析物に曝されると、電極の特性が変えられ、この変化が時間及び周期的な交流電圧の関数として電極電流を測定することにより検出される。交流電圧波形は、酸化時間周期と還元時間周期を有し、これら周期及び波形のデューティサイクルは、電極感度、選択度を向上すると共に、電極の汚染及びデータヒステリシスを実質的に排除するように制御される。第２の実施形態においては、受容体が電極に接合され、電極には交流電圧波形が接続されて、相手となる目標物質を受容体に可逆に結合できるようにし、電極電流の測定値がこのような可逆の結合の尺度を与えるようにする。この第２の実施形態は、抗体、抗原、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び酵素を検出するのに特に有用である。いずれの実施形態も、フロースルー電気化学セル、流れ注入分析、液体及びイオンクロマトグラフィー及び毛細管電気泳動における検出に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】電気的に活性なポリマ電極を用いたパルス式電気化学的検出方法発明の分野本発明は、目標分析物を検出し、そして電気化学的電極センサを用いて抗体− 抗原の付着のような生物学的な相互作用を検出するための方法及び装置に係り、より詳細には、検出中に汚染されない電気化学的な電極センサを用いた方法及び装置に係る。先行技術の説明電気的に不活性な分析物（検体）を含む溶液中の分析物を溶液中において検出するために電気化学的電極センサを使用することが知られている。又、このようなセンサを、抗体−抗原対の間、受容体及び配位子、タンパク質、酵素、電気触媒、金属錯化グループの間の付着の溶液中検出に使用することも知られている。導電性の電気的に活性のポリマ（ＣＥＰ）は、このような用途において電気化学的センサ電極として有望であることを示している。このようなセンサ電極を製造する場合には、導電性の不活性な金属電極が、ポリピロール、ポリチオフェン又はポリアニヒンのようなＣＥＰで処理される。製造後に、ＣＥＰは、出来上がった電気化学センサの活性成分となる。電極の安定性及び再現性の理由で、金属電極には、ポテンショダイナミック、ポテンショスタティック及びガルバノスタティック技術をしばしば用いて、電気蒸着又は電気重合により導電性のポリマ被膜が付着される。或いは又、適当な溶媒中のモノマ溶液を金属電極の表面に塗布しそして蒸発させることもできる。ＣＥＰ電極の形成は公知であるから、これ以上詳細に説明しない。図１Ａ及び１Ｂは、ＣＥＰ電極を検出用に使用した一般的なシステムを示しており、溶液２は、ＣＥＰ作用電極４と、基準電極６及びいわゆる反対電極８とに曝される。一般に、基準電極は、基準ノード、好ましくは接地点に接続され、そして反対電極は、同じノードに電気的に接続される。図１Ａ及び１Ｂにおいて、溶液２は、問題とする目標分析物１０（この分析物は比較的電気的に不活性である）、及び／又はＣＥＰ電極４に付着した適当な受容体１４にぴったりと接続し得る他の目標物１２をおそらく含むものとして示されている。受容体又は配位子１４がＣＥＰ電極の外面に付着することは公知である。吸引親和性目標物１２をもつ受容体１４は、とりわけ、抗原（この場合、目標物１２は抗体である）、抗体（この場合、目標物１２は抗原である）、酵素、タンパク質を含むことができる。図１Ａの構成では、可変電流源１６がＣＥＰ電極４に接続され、そしてＣＥＰ電極と基準電極との間の電圧が電圧計（又は他の装置）１８で測定される。一般に、電流源１６はゆっくりと変化され、そして電圧計の読みが記録される。この形式の測定構成は、しばしば、電位差計法と称される。これに対し、図１Ｂは、いわゆる電流計法の構成を示しており、ＣＥＰ電極と基準電極との間には可変電圧源１８’が接続され、そしてＣＥＰ電極に流れる電流が電流計１６’で監視される。一般に、電圧源１８’により与えられる電圧はゆっくりと変化又はスイープされ（図示されていないポテンショメータを変化させることにより）、そして電流の読みが記録される。ＣＥＰは、合成中に適当な反対イオンを組み込んだ際に酸化形態から還元形態へと電気化学的に切り換えることができる。反対イオンがＣＥＰに付着し、即ち「フック」したときには、ＣＥＰがドープ又は酸化されると言われ、そして反対イオンが解離するときには、ＣＥＰがアンドープ又は還元されると言われる。ＣＥＰが受ける電気的な環境を変えることにより、中性状態、ドープ状態又はアンドープ状態を生じさせることができる。例えば、ＣＥＰのいわゆる背骨に正味の正電荷を満たすために反対イオンが必要とされるときには付着を生じさせることができ、そして背骨に正の正味電荷を満たす必要がもはやない時には解離を生じさせることができる。ＣＥＰ電極が、酸化形態から還元形態へ切り換わる間にイオン種を組み込んだり追放したりするときには、有用な分析信号を発生することができる。例えば、ＣＥＰは、カソード電位でアンドープできるが、容易に組み込まれるアニオン分析物、例えば、燐酸塩又は硝酸塩の存在中でアノード電位に復帰するときには再ドープできることがハイネマン氏等により長年にわたって示唆されている。Ｙ．イカラヤマ、Ｃ．カリアストサトス、及びＷ．Ｒ．ハイネマン、Ｓ．ヤマンチ著の「Ｓｅｎｓ．Ａｃｔ．１２」（１９８７年）、４５５；及びＹ．イカラヤマ、及びＷ．Ｒ．ハイネマン著の「Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５８」（１９８６年）１８０３を参照されたい。これらの現象の正確なメカニックは完全に理解されていないが、合成中に組み込まれる反対イオンが、導電率、電気化学的スイッチング電位、及びイオン交換選択性シリーズを含むＣＥＰの特性に著しい作用を及ぼし得る。例えば、図１Ａにおいて、電流源１６によりセットされた適当なバイアス状態のもとでＣＥＰ電極４に適当な分析物１０が付着すると、電圧計１８により測定される差電圧が測定可能に変化し得る。同様に、図１Ｂにおいて、電圧源１８’ によって決定された適当なバイアス状態のもとでＣＥＰ電極に分析物が付着すると、電流計１６’により測定される電流が変化し得る。同様に、いずれの形態においても、受容体１４に適当な目標物が吸引されると、有用な分析信号が生じ得る。抗原及び抗体は、相互作用の選択性を与えるが、不都合なことに、公知技術においては、このような相互作用に応答して意味のある再現性のある分析信号を発生することが困難である。抗原−抗体の吸引を検出するときには、吸引により生じる測定可能な電流又は電圧は、抗体−抗原反応生成物によるものではないと考えられる。むしろ、ＣＥＰ自体の特性が反対イオンのオン又はオフ状態によって変化すると考えられる。有用な相互作用信号を感知する試みにおけるこれらの問題は、ファラディ（例えば、電子の移送）信号の欠如、及び抗体−抗原プロセス自体の不可逆な性質に起因すると思われる。公知技術では、電位測定、間接的電流計則による免疫学的検定技術、及び直接的測定を用いて、抗体−抗原相互作用の後にセンサ表面の容量特性の変化を感知することによりこれら測定上の問題を克服するように試みている。不都合なことに、これらの手順は、平衡時間が長く及び／又は多段階の手順が必要とされるために、時間のかかるものである。更に、抗体−抗原相互作用を逆転するためには抗体を含む面を化学的に再生しなければならない。抗体は、対応する抗原との特定の反応を促進するために合成中にＣＥＰに容易に組み込むことができる。交流（ＡＣ）電圧測定を使用すると、充分な感度を与えることはできるが、再現性と、作用電極を再使用する能力は失われる。図１Ｃは、図１Ｂの構成により通常発生される繰り返しの電圧電流図（ＣＶ）を示しており、単一のスイープが示されている。図１Ｃのデータは、分析物カチオンがナトリウムであるナトリウムオクタンサルフォネートの溶液において行われる実験の典型例である。通常、図ＩＢの電圧源１８’は、おそらく２０ｍＶ／秒の割合でゆっくりとスイープされ、これは、１．６ＶＤＣをスイープして図１Ｃに示すデータを発生するのにほぼ１．５分を要することを意味する。図１Ｂ及び１Ｃを参照すれば、ＣＥＰは最初は中性である。電源１８’を最初に約０Ｖとする。このとき、ＣＥＰは、中性であり、実質的に非酸化されると考えられる。電圧が正に（左方向に）例えば＋０．６Ｖ（例えば６００ｍＶ）までスイープされると、ＣＥＰは正に荷電される（酸化される）。電荷バランスを保つために、この正の電荷は、周囲の溶液中で負の電荷（イオン）から中性化することを必要とする。これらイオンはＣＥＰ構造体へと組み込まれることになり、そして点Ｂにおいて、ＣＥＰにアニオンが完全に組み込まれた（ドープされた）ときに電流が増加する。これらのイオンがＣＥＰ構造体へ移動すると（イオンのサイズが小さいことにより）、認知し得る電流が生じる。ここで、電圧が更に負へ（例えば、右側へ）スイープするにつれて、ＣＥＰは、正の電荷を失い始め、還元されると言える。電荷の中性度を例えば約−０．３Ｖに維持するために、２つの作用の１つを生じさせることができる。既に組み込まれたアニオンは、ＣＥＰの網を離れることができるか、或いは周囲の溶液からのカチオン種を組み込むことができる。電圧が更に負になると、ＣＥＰは、更に還元された状態となる（例えば、実効正電荷未満）。約−１Ｖにおいて、カチオンが組み込まれた状態となり、電流の大きさ及び方向が切り換わる。ここで電圧が更に正になると（−０．５Ｖに向かう）、点Ａに達するが、ＣＥＰは還元状態となり、そして再び酸化状態になり始める。電圧のスイープをゆっくりと繰り返した場合には、電流ピークＡ及びＢがほぼ同じ電圧で生じるが、ＣＶの形状はおそらく変化する。それにより生じるヒステリシスは、主として、ポリマが組み込まれた電荷を容易に再ドープできないために、ＣＥＰ電極の汚染及び校正ずれを表すことになろう。従って、一定電位においてＣＥＰ電極で得られたデータは、あまり再現性が良くない。というのは、ＣＥＰに組み込まれる目標物が、組み込み場所がそれ以上なくなるまで、組み込まれた状態に保たれる傾向となるからである。これは、検出感度のロスを招くと共に、注目すべき校正ずれ及び電極の汚染を生じる。従って、数分使用した後に電極を頻繁に交換又は清掃しなければならない。ＣＥＰを適当な電位でゆっくりと繰り返し動作し、例えば、−１．５ＶＤＣで１０分間動作することにより、ＣＥＰ電極を還元し、例えば、それを回復させることが知られている。明らかに、ＣＥＰ電極を交換したり、或いは電極を電気的に還元することによりＣＥＰに組み込まれている目標物を追放したりすることは、不所望にも時間がかかり且つルーチン分析を妨げることになる。作用電極が実験により不所望に且つ明らかに非可逆に変更されるのに加えて、図１Ａ及び１Ｂの公知構成は、他の欠点に悩まされている。これら構成は、電流Ｉ又は電圧Ｖのいずれかを測定中一定に維持するので、例えば、分析と分析との間を確認できるような選択性は存在しない。全てのアニオン（又はカチオン）がＣＥＰ電極に付着するので、全アニオン（又は全カチオン）を測定することしかできない。このように、非選択性の公知ＣＥＰ電極は、全てのアニオンがＣＥＰと相互作用するので、塩化物のみ又はフッ化物のみを検出することはできない。たとえ幾つかのアニオン種がＣＥＰと異なるように相互作用したとしても、公知技術ではそれらの種を区別することができない。例えば、ＣＥＰの公知の用途では、非常に効果的に相互作用するアニオン種の比較的低い密度により生じる電圧又は電流の変化を、あまり効果的でなく相互作用するアニオン種の高い密度により生じる電圧又は電流の変化と区別することができない。その各々に対する総検出信号は見掛け上同一になる。又、公知技術では、非ＣＥＰ電極、例えば、周期的電圧のソースに接続された不活性金属電極を使用することも知られている。これらの技術は、「パルス式クーロン計測検出（ＰＣＤ）」又は「パルス式電流計則検出（ＰＡＤ）」としばしば称されている。ＰＣＤ方法は、一般に、検出に先立って絶対的に必要なものとして化学的な作用電極反応を必要とする。一般的に、ＰＣＤは、例えば、作用電極と水素との間の最初の化学吸着反応により電流が確立されるような間接的な方法である。この電流は、次いで、作用電極と化学的分析物との間の吸着反応によって減衰される。このような用途では、作用電極は白金でよいが、例えば、金にすることはできない。というのは、水素原子が金により吸着されないからである。逆に、作用電極の組成に係わりなく、測定前の段階で電極の化学的な吸着が必要なことにより、作用電極に吸着しない化学物質に対する間接的な測定が除外される。ＰＣＤ技術の改良された変形が、ジョンソン氏等の米国特許第４，９３９，９２４号（１９９０年７月）に開示されており、この場合は、周期的な段階状電位波形が不活性な金属作用電極に接続され、そして電流の積分により測定ノイズが補償される。電位段階状ＰＣＤに対しＰＳ−ＰＣＤと称するジョンソン氏等の方法は、作用電極を含むフロースルーセルにおいて分析物をより直接的に検出するものである。この方法においては、パルス段階状又は傾斜状電位波形が作用電極に印加されそして全電位波形の繰り返し部分にわたって電流を積分することにより分析物が電気化学的に直接検出される。これにより、ジョンソン氏等は、電気化学的酸化により直接生じる電荷の測定に基づいて有機分子を検出することができる。図１Ｄは、ジョンソン氏等により開示された改良されたＰＣＤ技術を示している。図示されたように、目標分析物１０を含む溶液２は、不活性金属の作用電極２４に曝されると共に、基準電極６及び反対電極８に曝される。電圧波形発生器２８は、作用電極２４と基準電極との間に接続され、図１Ｅ、１Ｆ及び１Ｇに示す波形のような繰り返し電圧波形を出力する。電流積分器３０は、作用電極の電流を積分し、検出信号を記録器又は他の計器３２へ発生する。図１Ｅないし１Ｇに示されたように、発生器２８によって出力される電圧波形は、通常、おそらく６０Ｈｚの繰返数を有し、そしておそらく１ないし２ボルトのピーク・ピーク最大行程を有する。この波形は、第１の電位値Ｅ１を有し、このとき、作用電極の表面は酸化のない状態で存在する。次いで、波形の電位は、Ｅ１から更に高いＥ１’へ増加し、作用電極の表面に酸化物を形成できると同時に、可溶物及び／又は分析物の電気触媒酸化反応を形成できるようにする。波形の電位は、保持時間中第１の値Ｅ１に復帰し、この間に、作用電極の表面に形成された酸化物は触媒作用で剥離される。電位がＥ１’に充分長時間保持される場合には、それ以上の酸化還元は不要である。さもなくば、電位は更に高い値Ｅ２へ上昇され、電極表面の完全な酸化清掃が行われる。最も負の電位Ｅ３にされる場合には、Ｅ１及び／又はＥ２において形成された表面酸化物のカソード分解による電極の再活性化が生じ得る。図１Ｄにおいて、検出周期の全時間は、電位Ｅ１における時間と、電位Ｅ１’ における（又はそこに至る途中の）時間との和である。電流積分器３０は、電位Ｅ１が最初に与えられたときに作動され、そして積分された電流出力は、Ｅ１’ の後に、電位Ｅ１への復帰の終わりにサンプリングされる。不都合なことに、ＰＣＤ、ＰＡＤ及びＰＳ−ＰＣＤの公知システムには、電気的に不活性な分析物を検出できないという本来の制約がある。関連する電気化学的酸化により生じる電荷が存在しない場合には、このような目標物は非検出となる。要約すれば、選択性を与えながらも作用電極の汚染を防止する安定な再現性のあるやり方で、電気的に不活性な分析物を含む目標物を検出するための方法及び装置が要望されている。このような方法及び装置は、流れ注入分析、液体及びイオンクロマトグラフィー、及び毛細管電気泳動に適用できるのが好ましい。本発明は、このような方法及び装置を開示する。発明の要旨本発明は、周期的パルス状波形又は他の過渡電圧波形が接続される導電性電気的活性ポリマ（ＣＥＰ）作用電極を提供する。電圧波形は、見掛け上、ＣＥＰの形態を変化させ、１つの形態は、目標分析物との検出可能な相互作用を促進し、このとき、少なくとも１つの電極特性が可逆に影響を受ける。検出の可逆特性によって、ＣＥＰ電極は、アニオン、カチオン、有機酸、アミン、金属錯化グループ、抗原、抗体、酵素及びその他の当該目標物を含む種々の目標物を検出することができる。選択的な検出は、安定で且つ再現性のある仕方で行われ、電極の汚染や検出データにおけるヒステリシス作用は生じない。更に、製造中にＣＥＰを変更することにより、付加的な検出の選択性が与えられる。イオンやカチオンのような分析物は、過渡電圧が第１の大きさであるときにはＣＥＰの背骨に組み込まれる（又は「ドープ」される）に充分な小さいものであり、そして電圧が第２の大きさであるときにはそこに組み込まれない（又は「デドープ」される）。電圧を充分急速に推移させることにより、ドープ／デドープを反転することができ、これにより、電極の汚染、校正ずれ及びデータのヒステリシスを排除することができる。目標分析物はＣＥＰの網に可逆に組み込まれるので、それにより生じる電荷の再バランスでＣＥＰの網の特性を変更し、例えば信号検出へ電流を切り換えることができる。目標分析物が生物学的分子であるときには、分子のサイズが大き過ぎてＣＥＰ構造体に密接に組み込むことができない。しかしながら、適当な受容体をＣＥＰ電極に接合することにより（例えば、抗原を検出するときには抗体）、大きな目標分析物とその受容体との一致した相互作用を検出することができる。この一致した相互作用は、ＣＥＰの網自体を変更するとは考えられず、接合した受容体の配座を変更すると考えられ、これは、直接ＣＥＰの網の特性に測定し得る状態で影響するものではない。１つの特徴において、ＣＥＰ検出選択性は、ＣＥＰ電極に接続される過渡電圧波形に対して電流がサンプリングされる時点を制御することにより与えられる。分析物を検出する際には、可逆の分析物／電極相互作用の運動エネルギーに基づいて時間の関数として異なる電流を測定することができる。別の特徴においては、パルス状であるか、ステップ状であるか、傾斜状であるか、さもなくば時間の関数として変化するような付与される過渡電位波形の性質により、選択性が維持される。従って、電流のサンプリング点を一定に保持しながら付与される電位波形を変更することにより、検出選択性を制御することができる。更に別の特徴においては、ＣＥＰの化学的組成を用いて検出選択性を影響を及ぼすようにし、ＣＥＰ化学組成の変更は、ポリマの合成中に行うのが好ましい。重合されるべきモノマ、コモノマ及び支持電解質の性質は、各々独特の検出選択性を有する異なる導電性ポリマを形成することができる。本発明による検出は、フロースルー電気化学セル、流れ注入分析、液体及びイオンクロマトグラフィー、及び毛細管電気泳動に使用することができる。ＣＥＰと目標物との間の関連相互作用は、特定及び非特定の吸着、測光効果、及びカラー変化を生じ得る分光電気化学効果を含むことができる。ＣＥＰの状態変化によって変更される測定パラメータは、電流、抵抗、キャパシタンス又は質量変化を含む。又、同じ又は異なる過渡電圧源に接続された多数のＣＥＰ電極を使用し、互いに異なるＣＥＰ電極の使用も含むことにより、区別及び確証分析を行うこともできる。本発明の他の特徴及び効果は、添付図面に関連して好ましい実施の形態を詳細に述べた以下の説明から明らかとなろう。図面の簡単な説明図１Ａは、公知技術により、ゆっくりと変化する電流源に接続されたＣＥＰを用いて目標物を検出するための一般的な電位差計法構成を示す図である。図１Ｂは、公知技術により、ゆっくりと変化する電圧源に接続されたＣＥＰを用いて目標物を検出するための一般的な電流計法構成を示す図である。図１Ｃは、公知技術により、図１Ａ又は図１Ｂの構成を用いて非可逆なＣＥＰの相互作用及びＣＥＰの汚染の検出データ特性におけるヒステリシスを示す繰り返し電圧電流図である。図１Ｄは、公知技術により、段階状電位源に接続された金属作用電極を用いて電気的に活性の分析物を検出するための一般的な段階状電位ＰＣＤ（ＰＳ−ＰＣＤ）構成を示す図である。図１Ｅないし１Ｇは、図１Ｄの公知構成及び本発明に使用される電圧発生器の出力波形を示す図である。図２Ａは、本発明による導電率及び電流計測検出を与える一般的な流れ注入分析システムを示す図である。図２Ｂ及び２Ｃは、本発明に使用する電圧発生器の出力波形を示す図である。図３は、＋０．４ＶＤＣに接続されたＰＰ／ＮＯ₃ＣＥＰ電極を用いて異なる濃度のＮａＮＯ₃溶液を注入するための図２Ａの構成について得られた応答を示す図である。図４Ａないし４Ｄは、選択された分析に対し図２の構成で得られる校正曲線を示すグラフである。図５Ａ及び５Ｂは、グリシンキャリアを用いたＣＥＰマイクロ電極に対する流体力学電圧電流図である。図６は、本発明によるマイクロ電極検出セルを示す図である。図７Ａ及び７Ｂは、本発明による各々グリシン溶離液及び蒸留水溶離液におけるマイクロ電極に対する校正曲線を示すグラフである。図８は、本発明による一連の流れ注入分析システム応答を示す図である。図９は、本発明による抑制を用いたイオンクロマトグラフィーシステムのシステム概略図である。図１０Ａ及び１０Ｂは、本発明により得たクロマトグラムである。図１０Ｃは、本発明を用いて得た導電率検出データを示す図である。図１１は、本発明により検出された無機及び有機アニオンの勾配分離を示す図である。図１２Ａは、本発明によりパルス電位の関数としてパルス式電位流体力学電圧電流計測ＨＳＡ検出を示す図である。図１２Ｂは、本発明によりパルス巾の関数としてパルス式電位流体力学電圧電流計測ＨＳＡ検出を示す図である。図１３Ａは、本発明によるＨＳＡに対する流れ注入分析応答を示す図である。図１３Ｂは、図１３Ａに示されたデータに対する校正曲線である。好ましい実施形態の詳細な説明ここで使用する「目標分析物」（例えば、図１Ａの要素１０）という用語は、実験者が測定又は決定のために選択した分析物（検体）を意味する。本発明については、目標分析物は、有機イオン、低分子量の目標物、例えば、有機酸、アミンを含み、タンパク質やペプチドのような大きな重量の生物学的分子も含む（これに限定されるものではない）。本発明は、イオンクロマトグラフィー分離装置に検出機構として接続できるので、目標分析物は、イオンクロマトグラフィーを用いて分離される全ての分析物を含む。更に、ここで使用する「不動化受容体」（例えば、図１Ａの要素１４）は、通常は、ＣＥＰに組み込まれる比較的大きな分子であって、ある生物学的な活動又は相互作用を有する分子である。このような受容体（及びそれらの対応部、例えば、図１Ａの要素１２）は、抗体、抗原、酵素、酵素基体を含むことができる。一般に、このような受容体は、免疫学的検定を受ける受容体、例えば、単クローン抗体や、多クローン抗体を含む。ここで使用する「酸化」という用語は、ポリマの形態を指し、ドープ（例えば目標分析物をＣＥＰ構造体へ組み込む）のための有利な環境を設定できるが、酸化それ自体がドープを確保するものではない。要約すれば、本発明は、２つの基本的なメカニズム又はモデルを用いて機能すると考えられる。第１のメカニズムは、ポリマの電荷バランスが重要な役割を演じると思われる小さな目標分析物の検出に関連している。第２のメカニズムは、ポリマの背骨（又は網）の電荷の半分が所望の相互作用によって直接的に密接な影響を受けないと思われる大きな分析物の検出に関連している。適切な状態にある小さな目標分析物、例えば、アニオン、カチオンは、ポリマの網（又は背骨）へ運び込み、組み込み又はドープすることができ、或いはそこから組み込み解除（又はデドープ（ドープ解除））することができる。より詳細には、パルス式又は過渡電圧電源がＣＥＰ電極に接続される。電圧があるレベルであるときは、目標分析物がポリマに組み込まれるが、電圧が異なるレベルであるときは、目標分析物がポリマから除去される。これらの電圧レベル間を充分に迅速にパルス動作又はスイッチングすることにより、分析物の組み込みを可逆とすることができ、例えば、他方の電圧レベルが生じたときに、分析物を組み込み解除することができる。これは、好都合にも、公知技術で生じたように電極の汚染や検出システムの校正ずれを伴うことなく、本発明による検出を行うことができるようにする。この第１のメカニズムは、目標分析物をＣＥＰ構造体へ入れる熱力学的駆動力としての電荷バランスに依存すると考えられる。（これに対し、生物学的な目標分析物は一般にＣＥＰ網に入るには大き過ぎる。）それらがポリマの網に組み込まれると、その組み込まれた分析物は、例えば、電流を監視することにより測定を行えるやり方でポリマに変更を生じさせる。分析物は、ポリマの網に入ると、ポリマの典型的な正の電荷を中性化し、そしてそのプロセスにおいて、水の分子も入れられる。その結果、ポリマに関連した配座の変化及び水分含有量の変化が得られる。これに対し、第２のメカニズムは、大きな目標分析物（例えば、抗原、抗体）に関連し、電荷バランスに依存しないと考えられる。これらの目標分析物は、ＣＥＰの背骨又は網に個々に入り込んだり又はそれを変更したりするには大き過ぎる。このような目標物を検出する際には、受容体（これに所望の目標分析物がぴったりと吸引する）が実験の前にＣＥＰ電極に取り付けられる。印加電圧によりＣＥＰがある形態にされたときに、目標分析物が受容体と相互作用すると（例えば、Ａｂ−Ａｇの相互作用）、受容体は、ポリマの配座を変更し且つポリマ全体で電荷を保持する能力を変更すると考えられる。配座の変更を受けるのに加えて、ポリマが酸化するときは（一般に正の荷電により）、正に荷電された場所が、電荷バランスを得るために負の電荷（例えば、イオン）を必要とする。負のイオン（例えば、塩化物）は、ポリマへ水分を運び込み、ＣＥＰの水分含有量を増加させる。生物学的な相互作用（例えば、Ａｂ− Ａｇ）は、配座がしかるべき配向で生じることを必要とすると思われる。ＣＥＰ電極がパルス動作されると、受容体（及びおそらくはＣＥＰの表面）は、配座の変更を受ける。相手となる目標分析物との相互作用を許したり許さなかったりすると考えられるのは、この配座の変更である。図２Ａは、本発明による一般的な流れ注入分析システムを示している。図示されたように、検出されるべき目標物を含む液体の流れは、検出前システム３０、例えば、他のシステムの中でもとりわけ、流れ注入分析器、液体又はイオンクロマトグラフィー、毛細管電気泳動システムからの出力として与えられる。通常、この流れは、導電率検出器３２を通過し、そして電気化学的流れ検出セル３４へ送られる。（流れ検出セル３４の好ましい実施形態は、図６について詳細に説明する。）流れ検出セル３４は、少なくとも１つの作用ＣＥＰ電極３６と、通常は銀／塩化銀、角水銀鉱及び／又はｐＨである基準電極３８と、通常はステンレススチールや白金のような不活性金属である反対電極４０とを備えている。しかし、ある用途においては、反対電極４０は、ＣＥＰ作用電極３６に関連したＣＥＰと同じであるか又は異なるＣＥＰ被膜を有してもよい。液体流は、流れセル３４を通過すると、通常は廃水容器４２へ捨てられる。作用電極と基準電極との間には電圧波形発生器４４が接続される。この発生器４４は、傾斜状、パルス状又はその組合せである好ましくは周期的な電圧波形を出力し、ピーク・ピーク出力電圧は、大きいところで約４Ｖ（例えば、＋２Ｖから−２Ｖ）から小さいところで５０ｍＶまでの範囲であり、繰り返し率はおそらく約１Ｈｚから約６０Ｈｚである。発生器４２によって出力される典型的な波形が図２Ｂ及び２Ｃに示されており、実際には、図１Ｅないし１Ｇに示された波形も使用できる。通常は、高利得低ノイズの前置増幅器４６がＣＥＰ作用電極３６に接続されて信号の増幅を与えると共に、もし所望ならば、付加的な監視装置４８をＣＥＰ作用電極に接続してもよい。好ましくは、図２Ａに示すように、ファラデーケージ５０が流れセル及び関連部品を包囲する。前置増幅器４６からの出力は検出器５２に接続され、その出力は、例えば、記録器５４に表示される。測定されるべき分析信号の特性により、どんな形式の検出器５２を使用するかが決定される。例えば、ＣＥＰ電極に関連した電流を測定するためには、電流計測検出器が使用される。しかしながら、ＣＥＰ電極の抵抗、キャパシタンス又は質量の変化も、検出信号として使用される。図２Ａの構成は、パルス式電流計則検出（ＰＡＤ）に使用するものとある程度類似している。しかしながら、本発明は、裸の金電極や他の不活性金属電極ではなくてＣＥＰ作用電極を使用する。もちろん、２つ以上のＣＥＰ作用電極３６がセル３４内に使用されてもよい。多数のＣＥＰ作用電極は、互いに同一である必要はなく、多数の電圧発生器４４に接続されるが、その全てが同一の波形を出力する必要もない。多数のＣＥＰ作用電極、電圧発生器及び検出器を使用すると、区別及び確証分析機能を与えることができる。本発明のＣＥＰ作用電極は、不活性金属の導体（例えば、ステンレススチールや、白金や、金）であってその表面がＣＥＰ材料で覆われているのが好ましい。作用電極は、ある範囲の大きさをもつことができ、例えば、ＣＥＰ直径は約０．０１ｍｍないし約１０ｍｍであり、内側の不活性金属導体を包囲する。直径が約５０μｍ未満のＣＥＰ電極を、マイクロ電極と称し、これは、マクロ電極サイズの反対部分よりも優れた感度及び電気化学的制御性を与えることができる。ＣＥＰは、当業者に良く知られた種々の仕方で作用電極を形成するように金属導体に塗布することができる。ＣＥＰ作用電極は、ポテンショダイナミック、ポテンショスタティック及びガルバノスタティック技術を用いた電気蒸着又は電気重合によるか、或いは適当な溶媒におけるモノマー溶液の蒸着によって形成できるが、これに限定されるものではない。しかしながら、本発明による検出は、ＰＣＤ、ＰＡＤ及び電位段階状ＰＣＤを含む公知技術を用いたときに生じるものよりも相当に多くの化学作用を伴うことを強調しておかねばならない。本発明の検出においては、ＣＥＰ作用電極の酸化及び還元の際に、イオン交換機構が生じると考えられる。アニオンだけでなく、カチオンも、ドープ及びデドープ中に、ＣＥＰへ可逆に組み込むことができる。更に、酸化及び還元プロセス中には、配座及び／又は水分含有量の変化（水和作用の変化）がＣＥＰに生じる。本発明は、検出事象、例えば、目標分析物の可逆結合（例えば、目標抗体又は抗原とその免疫学的反対部分との相互接続）に関連したＣＥＰ電極の状態の変化を監視することにより検出を行うことができる。このような組み込み又は相互作用事象は、ＣＥＰに関連した少なくとも１つの特性を検出信号として監視できる仕方でＣＥＰの構造を変更すると思われる。しかしながら、このような事象がＣＥＰ構造を可逆に変更して測定信号を与えるメカニズムは証明されていない。例えば、発生器４４によってＣＥＰ電極に電位が接続されるときには、組み込み又は相互接続事象は、作用電極の電流が測定信号を与えるようにＣＥＰ構造を変更すると思われる。この電流は、研究を続ける対象である多数の現象から生じると思われる。１つの電流成分は、発生器４４により印加された総電位の結果としてポリマの酸化又は還元によって生じるファラデー電流であると思われる。しかしながら、このファラデー電流成分の大きさは、酸化段階においてＣＥＰに生じる正の電荷をＣＥＰ電極の周囲の溶液中のあるアニオンによっていかに容易に満たせるかに基づいている。例えば、比較的移動度の高いアニオンは容易に付着することができ、ＣＥＰの多くが参加され、大きな電流成分が生じることになる。しかしながら、その同じアニオンは、明らかにポリマの網へと移動することにより、関連しているが異なる電流成分も生じると考えられる。又、ＣＥＰの反対イオンがそこから容易に放出されない場合にはカチオンの移動による電流成分も生じる。このような反対イオンが保持される場合には、電圧発生器がＣＥＰ電極を還元状態にするときに、アニオンがＣＥＰの網に組み込まれたままとなるために、電荷の不平衡が生じる。この点において、周囲の溶液からのカチオンがポリマの網へと移動し、ポリマにアニオン成分を満たすことができる。例えば、ＣＥＰ作用電極が還元状態にあって塩化ナトリウムを含む溶液で取り巻かれていると仮定する。次いで、電圧発生器は、ＣＥＰ作用電極の酸化を生じさせるパルスを与え、作用電極は正に荷電された状態となる。次いで、塩化物はポリマに関連して正のポリマ電荷を満たすことができ、この点において、ＣＥＰはアニオン交換機に類似したものになる。更に別の例として、塩化ナトリウムではなく、実質的に大きく且つ移動度の低いアニオン、例えば、ナトリウムオクタンサルフォニック又はオクタンサルフォネートが存在してもよい。これらのアニオンは、酸化中にＣＥＰにある程度まで関連し、ポリマ電荷を満たす。しかしながら、ＣＥＰ作用電極を還元するときには、これらのアニオンは、ポリマの正の部分に対して親和性が強いために正の電荷に強力に結合する。この例において、アニオンは、密接に保持されるか又は移動度が低いので、ポリマからほとんど放出されない。ＣＥＰ作用電極の還元は、依然生じるが、アニオンは保持される。電荷の中性度を維持するために、カチオンがポリマの網に入りそして組み込まれて、移動電流成分を生じなければならない。本発明は、これらの同時化学作用の存在を効果的に使用して、被測定パラメータ、例えば、電流を変調しようとするものである。本発明によるＣＥＰ電極を用いてデータが収集された幾つかの作用例について以下に説明する。例１−マクロサイズのＣＥＰ電極を用いて流れ注入分析で電気的に不活性のイオンをパルス式電気化学検出する。第１の例において、本発明は、流れ注入分析で電気的に不活性なイオンを検出するのに使用され、この検出は、従来のＰＡＤ、ＰＣＤ又はＰＳ−ＰＣＤ技術を用いては不可能なものである。マクロサイズのポリピロール電極は、ピロールモノマ（０．１Ｍ）を水溶液から白金基板にガルバノスタティック的に電気重合することにより作成した。白金電極は、布及びアルミナを用いて研磨され、そして電気重合の前に超音波処理を受けた。重合化のための反対イオン溶液は、０．５Ｍの塩化物、アセテート、ドデシル硫酸塩、燐酸塩又は炭酸塩のナトリウム塩を含むものであった。出版された文献によれば、これら状態のもとでは、２４ｍＣ／ｃｍ²が約０．１μｍ厚みのＣＥＰ膜を生じると仮定される。溶液は、電気重合化の前に１０分間窒素で脱酸素処理された。ポリピロールは、０．８５ｍＡ／ｃｍ²の電流密度を用いて５分間付着された。図２Ａに示す流れ注入分析の実験設定を使用し、電圧発生器４４は最初一定のＤＣ出力電位を発生した。塩化物、硝酸塩、燐酸塩、炭酸塩、アセテート及びドデシル硫酸塩（ＤＳ）を含むアニオンの検出が行われると考えられた。特に指示のない限り、使用するカチオンは、全ての場合にナトリウムであった。イオン交換プロセスを検出するためには適当な電圧電位を使用しなければならず、以下のデータは、ＣＥＰ電極を過渡電位波形ではなくて一定電位に接続して得たものである。−１．００ＶＤＣの電位を３分間印加し、その後に、硝酸塩の場合に電流ピーク高さに対するアノード（酸化）電位の作用を試験した。（硝酸塩を選択した理由は、全ての電極に対する電圧電流図がこの媒体において良好に定められたからである。）流れ注入分析を使用すると、得られる応答は、アノード電位の増加と共に増加したが、＋０．６Ｖより正の電位においてポリマの劣化が観察され、考慮すべき分析物に係わりなく全ての電極について同様の傾向が得られた。これらのデータは、一定電位の分析の場合に、約＋０．４Ｖのアノード電位が適度な感度を与えることを示唆した。更に、＋０．４Ｖの電位では、ポリマがその酸化形態にある間に通常のイオン交換プロセスを受けるので、作用電極の寿命が延びた。図３は、図２Ａの構成について得た測定電流応答を、＋０．４Ｖに接続されたＰＰ／ＮＯ３電極、１Ｍグリシンキャリア、及び１．０ｍＬ／分の流量を用いて検出セル３６に注入された硝酸塩溶液濃度の関数として示している。図示されたように、２ｘ１０^-5Ｍないし１ｘ１０^-3Ｍの溶液濃度に対し測定電流に著しい差がある。選択された種に対し高い分析物濃度において得られる流れ注入分析校正曲線が図４Ａないし４Ｄに示されている。これらのデータは、図２Ａの構成で得られたものであり、キャリアは１Ｍのグリシンであり、流量は１．０ｍＬ／分でありそして注入量は５０μLであった。図４Ａにおいて、ＰＰ／Ｃｌ（ＰＰ／塩化物）電極が使用され、分析物はＮＯ₃及びＣＯ₃₂であった。図４Ｂにおいて、電極はＰＰ／ＮＯ₃でありそして分析物はＣＯ₃₂であった。図４Ｃのデータは、ＰＰ／ＰＯ⁴³電極及びＣＨ₃ＣＯＯ分析物に対して得られたものである。図４Ｄは、ＰＰ／ＤＳ電極を用いて、ＮＯ₃及びＰＯ₄₃分析物に対して得られたものである。図４Ａないし４Ｄを更に参照すれば、低い濃度においては、おそらく信号発生のメカニズムが媒体の低いイオン強度によって歪められるために、得られる校正曲線がほとんど非直線的であった。このため、検出範囲は、１０^-5Ｍ領域に限定された。以下のテーブルＩは、上記校正曲線の直線部分から得られた分析物イオン感度を示している。テーブルＩにおいて、かっこのないデータは、アンドープせずに一定の＋０．４ＶＤＣを用いて得た感度を表し、一方、かっこ内のデータは、＋０．４Ｖないし−１．０Ｖの範囲の６０ｍｓパルスを用いて得た感度を示している。従って、テーブルＩに示すように、パルス動作により、試験した全てのイオンに対し感度が改善された。次いで、電極感度を変えるために、界面活性剤を含む溶離液、即ちドデシル硫酸ナトリウム（ＤＳＤ）をキャリアとして使用した。曲線の直線部分から感度を得、テーブルＩＩに示した。テーブルＩＩにおいて、かっこのないデータは、アンドープせずに一定の＋０．４０ＶＤＣを用いて得た感度を表し、一方、かっこ内のデータは、＋０．４Ｖないし−１．０Ｖの範囲の６０ｍｓパルス及び０．１ＭのＤＳをキャリアとして用いて得た感度を示している。特に、感度比のような感度係数変化を考慮するときには、どのキャリアを使用するかによって得られる一連の感度に影響が及ぶことに注意されたい。塩化ポリピロール（ＰＰ／Ｃｌ）がグリシン内に含まれた状態では、硝酸塩／燐酸塩は、６．８の感度係数を示すが、ＳＤＳキャリアを用いると、２．５の感度係数が生じる。しかしながら、ＳＤＳを用いると、硝酸塩／アセテートの比は８．４であるが、グリシンを用いると、この比は１．３に過ぎない。同様に、ポリピロールドデシル硫酸塩（ＰＰ／ＤＳ）の作用電極の場合には、硝酸塩／燐酸塩感度係数は、グリシンにおいて１．２に過ぎないが、ＳＤＳキャリアにおいては９．２である。このキャリアの依存性は、分析物とＣＥＰとの間のイオン交換が、観察される信号に貢献するという本出願人の仮説を支援すると思われる。これは、キャリアイオンが使用できる場所に対して競合し、選択度を変更するためであると思われる。更に、このキャリア導電率においては、分析物が注入されたときに差がほとんどなくなる。例えば、０．１Ｍのドデシル硫酸ナトリウムの比コンダクタンスは、５．７８ｍＳであるが、０．０１Ｍの硝酸ナトリウムについては、比コンダクタンスが４．２３ｍＳとなる。得られた校正曲線の形状は、グリシンを溶離液として用いて得られるものと同様であり、検出範囲は、１０^-5Ｍの範囲に限定された。パルス状の電位波形をＣＥＰ作用電極に接続して使用することにより検出信号が増幅されると考えられる。というのは、分析物が存在する場合に、ポリマが連続的に酸化及び還元される（付随するアニオン又はカチオン交換が促進されるようにして）からである。グリシン媒体を用いたときでも、本発明は、電圧パルスがＣＥＰ作用電極に接続されたときに検出感度の増加を生じる。例えば、テーブルＩ及びＩＩにおいて、グリシン及びＳＤＳキャリアについて各々得られた感度に注意されたい。特に関心をもつべきは、相対的な感度、ひいては、得られる選択度係数の変化である。これは、ＣＥＰ作用電極にパルス状の電位を印加したときに、カチオン（又はアニオン）の組み込み／追放が信号発生プロセスにおいて主たる役割を演じることができるからであると推測される。例えば、カチオンは、負の電位でＣＥＰに組み込めるが、次いで、正の電位においてＣＥＰから追放される。このように、電圧がＣＥＰ電極に接続されたときの本発明に関連した組み込み／追放プロセスは、好都合にも見掛け上可逆の性質であるように推移する。これは、もちろん、電極の汚染や感度の低下や校正ずれやヒステリシスやが一般的であった公知技術で経験されたものとは対照的である。テーブルＩＩのデータは、ＳＤＳキャリアと共にパルス状電位を使用すると、一般に、より大きな作用が感度に及ぶことを示唆している。更に、ＳＤＳキャリアにおいてＣＥＰ作用電極にパルス状電位を接続して使用すると、感度の変化を誘起することができる。例２マイクロサイズのＣＥＰ電極を用いた流れ注入分析において電気的に不活性なイオンをパルス式に電気化学的検出する。上記したように、独特の信号発生メカニズムが、ポリピロールのようなＣＥＰと共に存在すると考えられる。このメカニズムは、当該分析物と、イオンをポリマに容易に組み込めないような適当なキャリアとの存在中でポリマの酸化／還元によって信号を発生すると思われる。このとき、ポリマの酸化は、より容易に組み込まれるイオン（分析物）の存在に基づき、そして酸化／還元の程度は、これらの種の濃度に基づく。しかしながら、容易に組み込まれないアニオンと共にキャリアを使用すると、導電率の低いキャリアを使用することになるという点で、窮地に陥る。公知の電気化学的セルでは、大きなオーミック（ｉ・Ｒ）低下が生じるのに伴い、印加電圧、ひいては、検出メカニズムに対する制御が失われる。本発明においては、マイクロ電極（例えば、横方向寸法が５０μｍより小さい電極）の使用に伴い、検出電流が小さくなり、ひいては、低導電率キャリアにおけるオーミックｉ・Ｒ低下が小さなものとなる。従って、パルス電圧源（例えば電圧発生器４４）に接続されたＣＥＰマイクロ電極は、オーミック低下を著しく減少する。これは、次いで、良好なポテンショスタティック制御を達成する際の歪みを最小にする。更に、ＣＥＰマイクロ電極は、低いキャパシタンス値に関連し、これは、信号対雑音比を効果的に改善することができる。ポリピロール電極は、直径が１０μｍないし５０μｍの範囲の白金電極上に水溶液からピロールモノマ（０．５Ｍ）をガルバノスタティック重合化することにより作成された。重合化のための反対イオン溶液は、１Ｍの塩化ナトリウム、１Ｍの燐酸三ナトリウム及び０．１Ｍのドデシル硫酸ナトリウムを含むものであった。２ｍＡ／ｃｍ²の電流密度を使用しそしてポリピロールを１０分間付着した。ＰＰ／Ｃｌ、ＰＰ／ＤＳ又はＰＰ／ＰＯ４の成長がマクロ電極に対して既に報告したものと同様になった後に、繰り返しの電圧電流図（ＣＶ）を記録した。良好に定められた酸化／還元応答が観察され、これらの応答に対応する電圧の大きさ及びそれにより得られる電流の大きさは、それを支持する電解質の性質によって左右される。各々の場合に、マイクロ電極の電流の大きさは、マクロ電極から与えられる電流よりも低く、ＰＰ／ＰＯ４では電流が著しく小さくなる。図５Ａ及び５Ｂを参照すれば、種々のアニオンに対しグリシンにおいて繰り返しの電圧電流図が得られ、このＣＶは、ポリマが最初に塩化物媒体において繰り返し動作されるとすれば、良好に定められた酸化及び還元応答を示す。パルス状の流体力学電圧電流図（ＰＨＤ）がグリシン媒体において記録され、この場合に初期電位（Ｅｉ）は約０．４Ｖに一定に保持され、そして最終電位（Ｅｆ）は変化された。図５Ａ及び５Ｂは、ＮａＮＯ３分析物、５ｘ１０^-2Ｍに対するこのようなデータを１ｍＬ／分の流量において示しており、ｘ軸はＥｆでありそしてｙ軸は検出電流である。実験において、ｔｉ＝６０ｍｓ、ｔｆ＝６０ｍｓであり、電流はｔｉの終わりにサンプリングされ（例えば、６０ｍｓサンプリング点）、検出器の応答時間は３５０ｍｓである。これらのデータは、より負の電位へのパルス動作が、明らかにポリマの可逆のドーピング／デドーピングにより、いかに感度を高めるかを示している。Ｅｆが０．２Ｖに増加されたときに信号強度が増加した。０．２ないし−０．６Ｖでは、信号強度は平坦であるが、更に負の電位では、おそらくカチオンが組み込まれることにより再び増加した。本発明は、マイクロサイズのＣＥＰ電極を用いて容易に達成される電位範囲を使用して効率的なパルス状の電気化学的制御を与えることが明らかである。これは、アニオン及びカチオンをポリマに組み込むことができるようにし、従って、本発明を用いてカチオン又はアニオンを検出する能力が与えられる。図６は、図２Ａに示された流れ注入分析システムを用いてマイクロサイズのＣＥＰ電極データを収集するのに使用される変形検出セル６０を示すもので、この場合には、グリシン又は水がキャリア溶液として使用される。このように、検出セル６０は、図２Ａに示されたセル３４の１つの実施形態である。図６を参照すれば、検出セル本体自体の上部６２は、反対電極（例えば、図２Ａの電極４０）として働き、該電極への電気的接触はワイヤ６４によってなされる。保持部６６は、基準電極（例えば、図２Ａの電極３８）を保持し、該電極への電気的接触はワイヤ６８によってなされる。図示されたように、上部領域６２は、被検査溶液を通す流体入口ポート８４及び流体出口ポート８６を画成する。図６の実施形態において、セル部分６２は、カリフォルニア州、サニーベールのジオネクス社から入手できるジオネクス薄層電気化学セル、モデル番号３７７５２である。検出セル６０は、更に、ガラスを２５％含む３．７ｃｍｘ２．３ｃｍｘ１．２ｃｍのＴｅｆｌｏｎ（登録商標）ブロックで形成された下部７２も備えている。約０．１７８ｍｍ厚みのＴｅｆｌｏｎ（登録商標）材料で形成されたスペーサ７４が部分６２と７２との間に配置され、約０．５ｍｍ巾の流れチャンネル７６を画成する。下部の中央には、保持器７８を受け入れるために直径０．６ｃｍの穴が開けられ、保持器７８は、白金ワイヤコアＣＥＰ作用電極８０（例えば、図２Ａの電極３６）を保持する。ＣＥＰ電極８０への電気的接触はワイヤ８２を経て行われる。図６のこの構成は、電極保持器のためのねじ嵌合を与え、従って、電極の取り外し及び交換を容易にする。図示された検出セルの構成は、例えば、ガラスカーボンや、金や、カーボンペーストのような他の作用電極材料で製造するように容易に適用することができる。図２Ａの構成を使用し、図示されたファラデーカーゴ内で測定を行うようにして、硝酸塩、塩化物、炭酸塩、燐酸塩、アセテート及びドデシル硫酸塩のナトリウム塩の電気化学的検出を行った。電圧発生器４４は、＋０．４Ｖないし−１．０Ｖの範囲のパルスを発生し、正のパルスの終わりに電流をサンプリングした。ＰＰ／Ｃｌを１ｍＬ／分の溶離液（キャリア）流量で使用した。全てのイオンに対し、良好に定められた応答が観察され、その検出限界をテーブルＩＩＩに要約する。テーブルＩＩＩにおいて、Ｅｉは、ｔｉ＝６０ｍｓに対して＋０．４ＶＤＣであり、そしてＥｆは、ｔｆ＝６０ｍｓに対して−１．０ＶＤＣであり、Ｅｉパルスの終わりに電流サンプルが取り出された。テーブル３に要約されたデータに関しては、試験した範囲、例えば、検出限界から１ｘ１０^-2Ｍ塩まで、応答が直線的であった。校正曲線は、ＰＰ／ＰＯ４マイクロ電極及びグリシン溶離液を使用してアニオンについて図７Ａに示されており、そして蒸留水を溶離液として用いてＰＰＣｌマイクロ電極について図７Ｂに示されている。テーブルＩＶは、マイクロ電極及びグリシンをキャリアとして用いてこれらの校正曲線から得た感度（ｎＡ／ｎＭｏｌ）を要約したものである。図７Ａ及び７Ｂのデータは、１．０ｍＬ／分の流量、Ｅｉ＝＋０．４Ｖ、Ｅｆ＝ −１．０Ｖ、ｔｉ＝ｔｆ＝６０ｍｓにおいて得られたものである。テーブルＩＶにおいて、かっこ内の値は、マクロ電極を用いてパルス式電気化学的検出で得た感度を表し、ＮＤは、「検出されず」を指し、そしてその他の実験条件は、テーブルＩＩＩについて上記した通りである。図８は、上記構成で得られた一連の流れ注入分析システム応答を示しており、ピーク電流が異なる硝酸ナトリウム濃度について時間の関数としてプロットされている。例３−ＣＥＰ電極及び抑制器を用いたイオンクロマトグラフィー分析において電気的に不活性なイオンをパルス式に電気化学的検出する。この例では、抑制装置を用いた従来のイオンクロマトグラフィーシステムに、３ｍｍ白金基板ＰＰ／ＣｌのＣＥＰ電極（その製造は前記した通りである）及びパルス式電気化学的検出機構が設けられた。図９は、このシステムの概略を示すもので、溶離液９０は、ポンプシステム９２により噴射バルブ９４に通される。分離モードメカニズム９６及び検出モードメカニズム９８が設けられ、その後にデータサービス１００が設けられる。ＣＥＰ電極をもつ本発明のパルス式電気化学的検出器と、従来の抑制式導電率検出との比較を、検出メカニズム９８に関連して電気化学セルの下流に導電率セルを設けることにより行うことができる。図１０Ａにおいて、約６０ｍｓ間０Ｖで、次いで、６０ｍｓ間＋０．５Ｖで、次いで、６０ｍｓ間−１．５Ｖで、次いで、６０ｍｓ間０Ｖに戻り、等々となる電圧波形を印加した。図１０Ａのデータに対して使用した電流サンプリング周期は、７０ないし１６０ｍｓであり、図１０Ｂの場合には、電流サンプリング周期が８０ないし１６０ｍｓであった。炭酸ナトリウム及びナトリウムキャリアを分離に使用した。抑制器を通過した後に、キャリアは、低導電率キャリア（１６μＳ／ｃｍ）をもつ炭酸に変換された。以下に述べる図１０Ａないし図１０Ｃにおいて、番号１ないし６は、Ｆ^-、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-、ＮＯ₃ ^-、ＰＯ₄ ^3-及びＳＯ₄ ²¹を各々示している。図１０Ｃは、このシステムから得た典型的なクロマトグラムを示し、カラムはＩｏｎＰａｃＡＳ₄ＡＳＣで、キャリアは１．８ｍＭＮａ₂ＣＯ₃、１．７ｍＭＮａＨＣＯ₃で、流量は２．０ｍＬ／分で、そして注入量は２０μＬである。抑制装置は、カリフォルニア州サニーベールのジオネクス社から入手できるＡＭＭＳＩＩで、０．０１２ＭＨ₂ＳＯ₄ＭＨｌ２２ＳＯ₄の再生液及び導電率検出器（ＣＤＭＩＩ）を用いたものである。パルス式電気化学的検出を使用して、図１０Ａ及び１０Ｂに示すデータを得、パルスシーケンス及び電流サンプリング点は、検出器の応答に非常に大きな作用を及ぼすと思われた。例えば、電流サンプリング点を１０ｍｓだけ変えると、硫酸塩のピークが反転した。この現象は、この検出技術の選択性を示している。例えば、図１０Ａと同じ構成を用いてデータが得られた図１０Ｂを参照されたい。又、導電率検出クロマトグラムに比して硝酸塩に対する相対的なピーク高さの差にも注意されたい（導電率検出データを示す図１０Ｃを参照されたい）。ほとんどの分析物の検出範囲は、導電率検出に比較し得る低いｐｐｂ範囲である。データの直線性は、イオンクロマトグラフィーシステムについては典型的であって、即ち約３桁の大きさに及ぶ。非常に低い導電率のキャリアにおいてＣＥＰ電極をテストするために、水酸化ナトリウムキャリアを用いてアニオンの勾配分離を行った。この場合に、水酸化ナトリウムは抑制装置において水に変換され、背景導電率は１ないし４μＳであり、そしてアニオンは酸の形態に変換された。図１１は、図１０Ａについて述べた検出条件を用いて検出された無機及び有機アニオンの勾配分離を示している。図１１に示された番号１ないし１６は、ピーク識別番号である。この例は、パルス式電気化学的検出に組み合わされたＣＥＰ電極が広い範囲のイオンを検出できることを示している。例４−ＣＥＰを含む抗体を用いてタンパク質をパルス式電気化学的検出する。次の実施形態は、ＣＥＰのドーピング−デドーピングを伴うものでないが、他の測定に対してＣＥＰによるパルス式電気化学的検出の効果を示すものである。この実施形態は、抗体（Ａｂ）を使用して、電気化学的感知においてこれまで得られなかった選択度を与えるものである。対応する抗原（Ａｇ）に対する抗体（Ａｂ）の固有の分子確認能力は、本発明において非常に有用である。前記したように、公知技術では、抗体−抗原相互作用に応答して有用な再現性のある信号を発生することは困難であり或いはＡｂ− Ａｇ相互作用の後にＣＥＰ作用電極を再使用できるようにすることは困難であると分かっている。ここに述べる本発明の実施形態では、所望のＡｂがＣＥＰ作用電極の表面に接合された。次いで、作用電極を流れ注入分析システムに使用し、図２Ａの発生器４４のようなパルス電圧源に接続することができる。ポリピロールの抗人血清アルブミン（ＡＨＳＡ）をテストケースとして使用した。０．５ｍＡ／ｃｍ²の電流密度を用いて白金基板上に１００ｐｐｍのＡＨＳＡ溶液を含む水溶液からピロールモノマ（０．５Ｍ）をガルバノスタティック的に電気重合化することによりポリピロール／ＡＨＳＡ作用電極を作成した。繰り返しの電圧計則により、通常のポリマ酸化／還元プロセスが生じることが確認された。この技術において従来そうであったのと同様に、抗体を含むＣＥＰ電極をＨＳＡに曝したときには繰り返し電圧計測の変化は生じない。流れ注入分析システムを用いて、ＰＰ／ＡＨＳＡを流れにおいてテストした。このシステムは、最初、＋０．６ＶＤＣの一定電位でテストした。このＤＣ電位では、ＨＳＡの注入について分析応答を得ることができるが、感度が悪く、検出範囲は２５ｐｐｍに過ぎない。更に、おそらくは一定の印加電位ではＡｂ−Ａｇの相互作用が不可逆であることにより末尾のピークを生じるために、形成された応答に影響が生じた。次いで、パルス式電気化学的波形を使用した実験を行い、ＰＰ／ＡＨＳＡを用いて分析信号を発生した。対称的な１２０ｍｓ巾のパルスを用いて、パルス状の電位の流体力学的電圧電流図が得られた。初期電位（Ｅｉ）を、Ａｂ−Ａｇ相互作用が促進される範囲である＋０．４ＶＤＣに維持した。Ｅ２の大きさを−０．４Ｖないし＋０．９０Ｖの間で変え（図１２Ａ参照）、電流のサンプリングは、常に、Ｅ２の端で行った。更に正の電位へのパルス動作は、電位と共に増加しない小さな信号を生じた。しかしながら、電位が０．０ＶＤＣに対して負にパルス動作されると、信号の大きさが増加した。しかし、負の電位範囲がそれ以上低下すると、応答は減少された。手短に述べると、パルス電位の使用により、得られる応答の大きさは著しく増加した。この増幅は、パルス動作の際に得られる容量静電流が増加し且つパルス動作がおそらく多数のＡｂ−Ａｇ相互作用を誘起することによると思われる。これらの初期及び最終電位状態を用いて、得られる応答に対するパルス巾の影響を考察した（Ｅｉ＝０．４Ｖ及びＥｆ＝−１．０Ｖの図１２Ｂを参照）。感度は、パルス巾を６０ｍｓから１２０ｍｓへ増加したときには著しく増加したが、パルス巾をそれ以上増加しても僅かに増加するだけであることが分かった。６０ｍｓから１２０ｍｓへのパルス巾における感度の変化は、Ａｂ−Ａｇ相互作用の運動エネルギーが信号発生において演じる役割を強調する。実際上の目的として、充分な感度及び分解能を与えることから２３０ｍｓのパルス巾が使用された。典型的な応答が図１３Ａに示されており、パルス波形は、Ｅ１＝＋０．４Ｖ、Ｅ２＝０．００Ｖ、ｔ１（又はＴａ）＝１２０ｍｓ、そしてｔ２（又はＴｂ）＝１２０ｍｓである。図１３Ａは、種々の濃度でのＨＳＡの注入を比較したものである。図１３Ｂは、校正曲線を示しており、検出された信号が実際にＡｂ−Ａｇ相互作用によるものであることを確認するために白金及びＰＰ／ＮＯ３に対するブランク校正曲線も得られている。得られた応答の再現性は、５ｐｐｍないし５０ｐｐｍタンパク質の範囲において充分なものであり（例えば、１０回の注入に対し＋５％）、検出限界は約０．５ｐｐｍであった。要約すれば、上記の実施形態は、ＰＰ／ＡＨＳＡを用いたＨＳＡのための検出方法であって、流れ注入分析システムにおいてパルス式電気化学的検出を行う迅速で、高感度で且つ再現性の良い検出方法が実現されたことを実証している。ここに述べたシステムは、直接的な電気化学的な免疫学的検定に従来関連していた多数の実際的な問題を克服し、そして他のＡｂ−Ａｇシステムに特に有用なものである。請求の範囲に規定する本発明の要旨及び精神から逸脱せずに、ここに開示した実施形態に修正や変更がなされ得ることを理解されたい。

【手続補正書】【提出日】１９９５年９月５日【補正内容】請求の範囲１．溶液内の目標分析物を検出する方法において、（ａ）導電性の電気的に活性のポリマを含む電極に上記溶液を露出させ、（ｂ）上記電極に周期的な交流電圧を接続し、そして（ｃ）上記電極に流れる電流を時間及び上記交流電圧の関数として測定して、上記溶液内の上記目標分析物を検出し、上記電極の特性を上記目標分析物に曝す際に変更して、上記電極に流れる電流を変化させるようにしたことを特徴とする方法。２．上記段階（ｂ）において、上記交流電圧は、上記電圧が上記電極を酸化させる少なくとも酸化時間間隔と、上記電圧が上記電極を僅かに酸化させ及び／又は還元させる還元時間間隔とを含んだ周期を有している請求項１に記載の方法。３．上記交流電圧は、（ｉ）分析物による電極の汚染を最小にし、（ii）分析物に対する電極の検出感度を向上し、（iii）所望の分析物グループに対する選択度を向上し、（iv）所望の分析物に対する選択度を向上し、（ｖ）検出されたデータにおけるヒステリシス作用を実質的に排除し、そして（vi）上記周期的交流電圧が非対称である、ことより成る群から少なくとも１つの基準を満たすように選択されたデューティサイクル及び周期を有する請求項２に記載の方法。４．上記目標分析物はアニオンであり、そして上記目標分析物は、上記酸化時間間隔の少なくとも一部分中に上記電極に可逆に付着する請求項２に記載の方法。５．上記目標分析物はカチオンであり、そして上記目標分析物は、上記還元時間間隔の少なくとも一部分中に上記電極に可逆に付着する請求項２に記載の方法。６．上記段階（ｃ）において、上記電流は、（ｉ）上記電圧の印加に関連したファラデー電流、（ii）上記電極への上記分析物の移動に関連した電流、そして（iii）上記目標分析物とは逆の電荷のイオンが上記電極へ移動することに関連した反対電流、より成る群から選択された少なくとも１つの成分を含む請求項１に記載の方法。７．不動化受容体に対して付着親和性を有する結合可能な目標物質を検出する方法において、（ａ）結合可能な目標物質に結合し得る不動化受容体を含む導電性の電気的に活性なポリマ層を有する電極を形成し、（ｂ）結合可能な目標物質を含む水溶液に上記電極を接触させ、（ｃ）上記電極に周期的な交流電圧を接続し、そして（ｄ）上記電極に流れる電流を時間及び上記交流電圧の関数として測定して、上記不動化受容体への上記結合可能な目標物質の付着が生じたかどうか決定し、上記不動化受容体と上記結合可能な目標物質との間の付着の際に上記電極の少なくとも１つの特性を変えて、上記電極に流れる電流を変化させることを特徴とする方法。８．上記不動化受容体は、（ｉ）抗体、（ii）抗原、（iii）ハプテン、（iv ）ＤＮＡ、（ｖ）ＲＮＡ及び（vi）酵素より成る群から選択される請求項７に記載の方法。９．上記段階（ｃ）において、上記交流電圧は、上記電圧が上記電極を酸化させる少なくとも酸化時間間隔と、上記電圧が上記電極を僅かに酸化させ及び／又は還元させる還元時間間隔とを含んだ周期を有している請求項７に記載の方法。１０．上記交流電圧は、（ｉ）電極の汚染を最小にし、（ii）電極の検出感度を向上し、（iii）選択度を向上し、（iv）上記不動化受容体と上記結合可能な目標物質との間の付着の可逆性を促進し、（ｖ）上記電圧の関数としての上記電流の繰り返し測定におけるヒステリシスを実質的に排除し、そして（vi）上記交流電圧が非対称である、ことより成る群から少なくとも１つの基準を満たすように選択されたデューティサイクル及び周期を有する請求項７に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 30/64 Ｃ 7363−2Ｊ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウォーレスゴードンオーストラリアニューサウスウェールズウーロンゴングフランシスストリート 35 (72)発明者サディクオモウンミアモクオーストラリアニューサウスウェールズ 2500 キーラヴィルピーオーボックス 19

Claims

【特許請求の範囲】１．溶液内の目標分析物を検出する方法において、（ａ）導電性の電気的に活性のポリマを含む電極に上記溶液を露出させ、（ｂ）上記電極に周期的な交流電圧を接続し、そして（ｃ）上記電極に流れる電流を時間及び上記交流電圧の関数として測定して、上記溶液内の上記目標分析物を検出し、上記電極の特性を上記目標分析物に曝す際に変更して、上記電極に流れる電流を変化させるようにしたことを特徴とする方法。２．上記段階（ｂ）において、上記交流電圧は、上記電圧が上記電極を酸化させる少なくとも酸化時間間隔と、上記電圧が上記電極を僅かに酸化させ及び／又は還元させる還元時間間隔とを含んだ周期を有している請求項１に記載の方法。３．上記交流電圧は、（ｉ）分析物による電極の汚染を最小にし、（ii）分析物に対する電極の検出感度を向上し、（iii）所望の分析物グループに対する選択度を向上し、（iv）所望の分析物に対する選択度を向上し、（ｖ）検出されたデータにおけるヒステリシス作用を実質的に排除し、そして（vi）上記周期的交流電圧が非対称である、ことより成る群から少なくとも１つの基準を満たすように選択されたデューティサイクル及び周期を有する請求項２に記載の方法。４．上記目標分析物はアニオンであり、そして上記目標分析物は、上記酸化時間間隔の少なくとも一部分中に上記電極に可逆に付着する請求項２に記載の方法。５．上記目標分析物はカチオンであり、そして上記目標分析物は、上記還元時間間隔の少なくとも一部分中に上記電極に可逆に付着する請求項２に記載の方法。６．上記段階（ｃ）において、上記電流は、（ｉ）上記電圧の印加に関連したファラデー電流、（ii）上記電極への上記分析物の移動に関連した電流、そして（iii）上記目標分析物とは逆の電荷のイオンが上記電極へ移動することに関連した反対電流、より成る群から選択された少なくとも１つの成分を含む請求項１に記載の方法。７．上記段階（ｃ）において、上記電圧は、（ｉ）１つの周期内で約＋２ＶＤＣから約−２ＶＤＣへと変化する電圧の大きさ、（ii）約５０ｍｓないし約２５０ｍｓの周期、（iii）上記電圧が上記電極を酸化させるところの約１０ｍsないし約５０ｍｓの範囲の第１時間間隔を含む周期、そして（iv）上記電圧が上記電極を再酸化させるところの約１０ｍｓないし約５０ｍｓの範囲の第２時間間隔を含む周期、より成る群から選択された少なくとも１つの特性を有する請求項１に記載の方法。８．上記電圧は、上記電圧の関数として上記電流の繰り返し測定におけるヒステリシスを実質的に排除する波形を有する請求項１に記載の方法。９．上記の溶液は、（ｉ）流れ注入分析システムからの出力に関連した流れ、（ii）液体クロマトグラフィーからの出力に関連した流れ、（iii）イオンクロマトグラフィーからの出力に関連した流れ、そして（iv）毛細管電気泳動システムからの出力に関連した流れ、より成る群から選択される請求項１に記載の方法。１０．不動化受容体に対して付着親和性を有する結合可能な目標物質を検出する方法において、（ａ）結合可能な目標物質に結合し得る不動化受容体を含む導電性の電気的に活性なポリマ層を有する電極を形成し、（ｂ）結合可能な目標物質を含む水溶液に上記電極を接触させ、（ｃ）上記電極に周期的な交流電圧を接続し、そして（ｄ）上記電極に流れる電流を時間及び上記交流電圧の関数として測定して、上記不動化受容体への上記結合可能な目標物質の付着が生じたかどうか決定し、上記不動化受容体と上記結合可能な目標物質との間の付着の際に上記電極の少なくとも1つの特性を変えて、上記電極に流れる電流を変化させることを特徴とする方法。１１．上記不動化受容体は、（ｉ）抗体、（ii）抗原、（iii）ハプテン、（i v）ＤＮＡ、（ｖ）ＲＮＡ及び（vi）酵素より成る群から選択される請求項１０に記載の方法。１２．上記段階（ｃ）において、上記交流電圧は、上記電圧が上記電極を酸化させる少なくとも酸化時間間隔と、上記電圧が上記電極を僅かに酸化させ及び／又は還元させる還元時間間隔とを含んだ周期を有している請求項１０に記載の方法。１３．上記交流電圧は、（ｉ）電極の汚染を最小にし、（ii）電極の検出感度を向上し、（iii）選択度を向上し、（iv）上記不動化受容体と上記結合可能な目標物質との間の付着の可逆性を促進し、（ｖ）上記電圧の関数としての上記電流の繰り返し測定におけるヒステリシスを実質的に排除し、そして（vi）上記交流電圧が非対称である、ことより成る群から少なくとも１つの基準を満たすように選択されたデューティサイクル及び周期を有する請求項１０に記載の方法。１４．上記段階（ｄ）において、上記交流電圧は、（ｉ）１つの周期内で約＋２Ｖから約−２Ｖへと変化する電圧の大きさ、（ii）約５０ｍｓないし約２５０ｍｓの周期、（iii）上記電圧が上記電極を酸化させるところの約１０ｍｓないし約５０ｍｓの範囲の酸化時間間隔を含む周期、そして（iv）上記電圧が上記電極を再酸化させるところの約１０ｍｓないし約５０ｍｓの範囲の還元時間間隔を含む周期、より成る群から選択された少なくとも１つの特性を有する請求項１０に記載の方法。１５．上記段階（ｂ）において、上記溶液は、（ｉ）流れ注入分析システムからの出力に関連した流れ、（ii）液体クロマトグラフィーからの出力に関連した流れ、（iii）イオンクロマトグラフィーからの出力に関連した流れ、及び（iv ）毛細管電気泳動システムからの出力に関連した流れ、より成る群から選択される請求項１０に記載の方法。