CN1261588C - 比色分析方法及其使用的试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能在短时间内简单地实现可信的分析的比色分析方法。通过氧化还原酶，借助介质，将电子从分析对象转移到通过还原而发色的发色剂上，通过测定因此而产生的所述发色剂的发色来进行所述分析对象的定性或定量。该比色分析方法的酶反应是一步反应，由于借助介质发生发色反应，因此可能在短时间内进行测定。由于该反应不需要过氧化氢和氧，所以测定值的可信度也高。

Description

比色分析方法及其使用的试剂
技术领域
本发明涉及比色分析方法及其使用的试剂。
背景技术
在临床检查或生物化学检查等的领域，使用比色分析作为进行葡萄糖、胆固醇等的成分分析的一种方法。举例来说，葡萄糖的比色分析通常如下：首先葡萄糖氧化酶与葡萄糖(底物)作用，产生葡糖酸内酯和过氧化氢，在过氧化物酶的存在下，通过Trinder试剂等的发色剂检测过氧化氢。这种借助过氧化氢间接测定底物浓度的方法不限于葡萄糖，也适用于胆固醇等其他的成分分析。
但是，以前的比色分析具有以下问题。首先，因为不是直接测定分析对象，而是借助过氧化氢间接测定，所以测定时间长，举例来说，在葡萄糖测定的情况下，需要30-60秒。其次，以前的比色分析法因为需要同时稳定两种酶反应系统，所以条件设定难。最后，由于必需氧，以前的比色分析法在氧不足时有反应不充分的问题。
发明内容
考虑到这样的事情，本发明的目的是提供分析时间短并且分析值可信的比色分析方法。
为了实现前述目的，本发明的比色分析方法通过氧化还原酶，借助介质，将电子从分析对象转移到通过还原而发色的发色剂上，通过测定因此而产生的所述发色剂的发色来对所述分析对象进行定性或定量，其中所述介质是选自铁络合物、钌络合物、锇络合物和铜络合物的至少一种。
由于该方法的酶反应为一步反应，因此反应系统简单并且稳定性良好。此外，酶反应为一步反应，因为在所述发色剂的反应中使用所述介质，因此酶反应至发色反应之间的时间极短，结果是，测定时间也缩短。举例来说，在葡萄糖作为本发明的比色分析方法中的底物的情况下，可能在约5秒或5秒以内的短时间内测定。另外，在本发明的比色分析方法中，由于至发色的反应快速，因此能够节约酶，从而在成本上有利。此外，本发明的比色方法由于不借助过氧化氢就使发色剂发色，并且不必需氧，因此分析值的可信度也高。
其次，本发明的试剂用于前述的本发明的比色分析方法，其含有氧化还原酶、介质和通过还原而发色的发色剂。此外，本发明的试验片含有前述本发明的试剂。这种试验片与产生过氧化氢的以前的比色分析用试验片相比，可能在极短时间内进行分析，其分析值的可信度也高。
附图说明
图1是表示本发明的一个实施例的葡萄糖浓度和发色之间的关系的图。
图2是表示本发明的另一实施例的葡萄糖浓度和发色之间的关系的图。
图3是表示本发明的又一实施例的葡萄糖浓度和发色之间的关系的图。
图4是表示本发明的又一实施例的葡萄糖浓度和发色之间的关系的图。
图5是表示本发明的又一实施例的发色剂的发色的图。
图6A、6B是表示本发明的又一实施例的发色剂的发色的图。
图7A、7B是表示本发明的又一实施例的发色剂的发色的图。
图8是表示本发明的又一实施例的发色剂的发色的图。
图9是表示本发明的又一实施例的发色剂的发色的图。
图10是表示本发明的又一实施例的发色剂的发色的图。
图11是表示本发明的又一实施例的发色剂的发色的图。
图12是表示本发明的又一实施例的发色剂的发色的图。
图13是表示本发明的又一实施例的发色剂的发色的图。
图14A、14B是表示本发明的又一实施例的发色剂的发色的图。
图15是表示本发明的又一实施例的发色剂的发色的图。
图16A、16B是表示本发明的又一实施例的发色剂的发色的图。
具体实施方式
在本发明的比色分析方法、试剂和试验片中，如前所述，所述介质优选是铁络合物、钌络合物、锇络合物或铜络合物，或者是它们的两种或两种以上的混合物。所述络合物的配体的配位原子优选为选自氮、氧和硫的至少一种。作为所述配体，例如，选自氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物的至少一种是优选的。所述络合物可以具有两种或两种以上配体，即，也可以是混合配体。所述配体的配位位置以外的氢原子的至少一个可以被取代基取代。作为所述取代基，例如烷基、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和卤素基团。
在本发明的比色分析方法、试剂和试验片中，氧化还原酶优选是脱氢酶或氧化酶。分析对象优选是，例如葡萄糖、胆固醇、乳酸、尿酸、丙酮酸、肌酸、肌酸酐，在这种情况下优选的氧化还原酶是对应于前述各物质的脱氢酶或氧化酶。优选地，随着酶量增多，反应加速。所述发色剂优选是四唑鎓盐。所述四唑鎓盐优选具有选自硝基苯基、噻唑基和苯并噻唑基的至少一种基团。所述四唑鎓盐的具体实例为MTT、INT、Neo-TB、硝基-TB、TB、WST-1、WST-3、WST-4、WST-5、WST-8、2-(2-苯并噻唑基)-3，5-二苯基四唑鎓溴化物、2-(2-苯并噻唑基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓溴化物、2，3-二(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓氯化物、2，3-二(4-硝基苯基)四唑鎓高氯酸盐、3-(3-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物，以及3-(4-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物。
本发明的试验片优选含有无机凝胶和所述试剂。通过无机凝胶阻断氧，能够防止发色剂氧化，也能够防止由于再氧化导致的发色后退色。
如上所述，在本发明中，所述介质优选是铁络合物、钌络合物、锇络合物、铜络合物，特别优选锇络合物。
(铁络合物)
铁络合物的配体的实例为氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物等。可以是它们中的两种或两种以上组合的混合配体。
在联吡啶的情况下，配位数是6。联吡啶可以是未取代的，或引入取代基的。通过引入取代基，例如，可能调节溶解度和氧化还原电位等。取代位置为4，4’位和5，5’位。取代基的实例为烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和卤素基团(例如溴、氯、碘等)。
联吡啶铁络合物的实例为[Fe(联吡啶)3]、[Fe(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)3]、[Fe(4，4’-二苯基-2，2’-联吡啶)3]、[Fe(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)3]、[Fe(4，4’-二羟基-2，2’-联吡啶)3]、[Fe(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)3]、[Fe(4，4’-二溴-2，2’-联吡啶)3]、[Fe(5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶)3]、[Fe(5，5’-二苯基-2，2’-联吡啶)3]、[Fe(5，5’-二氨基-2，2’-联吡啶)3]、[Fe(5，5’-二羟基-2，2’-联吡啶)3]、[Fe(5，5’-二羧基-2，2’-联吡啶)3]、[Fe(5，5’-二溴-2，2’-联吡啶)3]等。
在咪唑的情况下，配位数是6。咪唑可以是未取代的，或引入取代基的。通过引入取代基，例如，可能调节溶解度和氧化还原电位等。取代位置为2位、4位和5位。取代基的实例为烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和卤素基团(例如溴、氯、碘等)。
咪唑铁络合物的实例为[Fe(咪唑)6]、[Fe(4-甲基-咪唑)6]、[Fe(4-苯基-咪唑)6]、[Fe(4-氨基-咪唑)6]、[Fe(4-羟基-咪唑)6]、[Fe(4-羧基-咪唑)6]和[Fe(4-溴-咪唑)6]等。
氨基酸的实例为精氨酸(L-Arg)。精氨酸铁络合物通常具有溶解性高的优点。混合配体的实例是联吡啶和咪唑的组合、联吡啶和氨基酸的组合。例如，[Fe(咪唑)2(联吡啶)2]或[Fe(L-Arg)2(联吡啶)2]。使用混合配体可以赋予络合物各种性质，例如使用精氨酸提高络合物的溶解性。
(钌络合物)
钌络合物的配体的实例为氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物等。可以是它们中的两种或两种以上组合的混合配体。
在联吡啶的情况下，配位数是6。联吡啶可以是未取代的，或引入取代基的。通过引入取代基，例如，可能调节溶解度和氧化还原电位等。取代位置为4，4’位和5，5’位。取代基的实例为烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和卤素基团(例如溴、氯、碘等)。
联吡啶钌络合物的实例为[Ru(联吡啶)3]、[Ru(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)3]、[Ru(4，4’-二苯基-2，2’-联吡啶)3]、[Ru(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)3]、[Ru(4，4’-二羟基-2，2’-联吡啶)3]、[Ru(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)3]、[Ru(4，4’-二溴-2，2’-联吡啶)3]、[Ru(5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶)3]、[Ru(5，5’-二苯基-2，2’-联吡啶)3]、[Ru(5，5’-二氨基-2，2’-联吡啶)3]、[Ru(5，5’-二羟基-2，2’-联吡啶)3]、[Ru(5，5’-二羧基-2，2’-联吡啶)3]、[Ru(5，5’-二溴-2，2’-联吡啶)3]等。
在咪唑的情况下，配位数是6。咪唑可以是未取代的，或引入取代基的。通过引入取代基，例如，可能调节溶解度和氧化还原电位等。取代位置为2位、4位和5位。取代基的实例为烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和卤素基团(例如溴、氯、碘等)。
咪唑钌络合物的实例为[Ru(咪唑)6]、[Ru(4-甲基-咪唑)6]、[Ru(4-苯基-咪唑)6]、[Ru(4-氨基-咪唑)6]、[Ru(4-羟基-咪唑)6]、[Ru(4-羧基-咪唑)6]和[Ru(4-溴-咪唑)6]等。
氨基酸的实例为精氨酸(L-Arg)。精氨酸钌络合物具有溶解性高的优点。混合配体的实例为联吡啶和咪唑的组合、联吡啶和氨基酸的组合。例如，[Ru(咪唑)2(联吡啶)2]、[Ru(L-Arg)2(联吡啶)2]。使用混合配体可以赋予络合物各种性质，例如使用精氨酸提高络合物的溶解性。
(锇络合物)
锇络合物的配体的实例为氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物等。可以是它们中的两种或两种以上组合的混合配体。
在联吡啶的情况下，配位数是6。联吡啶化合物可以是未取代的，或引入取代基的。通过引入取代基，例如，可能调节溶解度和氧化还原电位等。取代位置为4，4’位和5，5’位。取代基的实例为烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和卤素基团(例如溴、氯、碘等)。
联吡啶锇络合物的实例为[Os(联吡啶)3]、[Os(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)3]、[Os(4，4’-二苯基-2，2’-联吡啶)3]、[Os(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)3]、[Os(4，4’-二羟基-2，2’-联吡啶)3]、[Os(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)3]、[Os(4，4’-二溴-2，2’-联吡啶)3]、[Os(5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶)3]、[Os(5，5’-二苯基-2，2’-联吡啶)3]、[Os(5，5’-二氨基-2，2’-联吡啶)3]、[Os(5，5’-二羟基-2，2’-联吡啶)3]、[Os(5，5’-二羧基-2，2’-联吡啶)3]、[Os(5，5’-二溴-2，2’-联吡啶)3]。
在咪唑的情况下，配位数是6。咪唑可以是未取代的，或引入取代基的。通过引入取代基，例如，可能调节溶解度和氧化还原电位等。取代位置为2位、4位和5位。取代基的实例为烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和卤素基团(例如溴、氯、碘等)。
咪唑锇络合物的实例为[Os(咪唑)6]、[Os(4-甲基-咪唑)6]、[Os(4-苯基-咪唑)6]、[Os(4-氨基-咪唑)6]、[Os(4-羟基-咪唑)6]、[Os(4-羧基-咪唑)6]和[Os(4-溴-咪唑)6]等。
氨基酸的实例为精氨酸(L-Arg)。精氨酸锇络合物具有溶解性高的优点。混合配体的实例为联吡啶和咪唑的组合、联吡啶和氨基酸的组合。例如，[Os(咪唑)2(联吡啶)2]或[Os(L-Arg)2(联吡啶)2]。使用混合配体可以赋予络合物各种性质，例如使用精氨酸提高络合物的溶解性。
(铜络合物)
铜络合物的配体的实例为氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物等。可以是它们中的两种或两种以上组合的混合配体。
在联吡啶的情况下，配位数是4或6，但从稳定性的角度而言，联吡啶优选为2配位。联吡啶可以是未取代的，或引入取代基的。通过引入取代基，例如，可能调节溶解度和氧化还原电位等。取代位置为4，4’位和5，5’位。取代基的实例为烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和卤素基团(例如溴、氯、碘等)。
联吡啶铜络合物的实例为[Cu(联吡啶)2]、[Cu(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)2]、[Cu(4，4’-二苯基-2，2’-联吡啶)2]、[Cu(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)2]、[Cu(4，4’-二羟基-2，2’-联吡啶)2]、[Cu(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)2]、[Cu(4，4’-二溴-2，2’-联吡啶)2]、[Cu(5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶)2]、[Cu(5，5’-二苯基-2，2’-联吡啶)2]、[Cu(5，5’-二氨基-2，2’-联吡啶)2]、[Cu(5，5’-二羟基-2，2’-联吡啶)2]、[Cu(5，5’-二羧基-2，2’-联吡啶)2]、[Cu(5，5’-二溴-2，2’-联吡啶)2]、[Cu(联吡啶)3]、[Cu(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)3]、[Cu(4，4’-二苯基-2，2’-联吡啶)3]、[Cu(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)3]、[Cu(4，4’-二羟基-2，2’-联吡啶)3]、[Cu(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)3]、[Cu(4，4’-二溴-2，2’-联吡啶)3]、[Cu(5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶)3]、[Cu(5，5’-二苯基-2，2’-联吡啶)3]、[Cu(5，5’-二氨基-2，2’-联吡啶)3]、[Cu(5，5’-二羟基-2，2’-联吡啶)3]、[Cu(5，5’-二羧基-2，2’-联吡啶)3]、[Cu(5，5’-二溴-2，2’-联吡啶)3]等。
在咪唑的情况下，配位数是4。咪唑可以是未取代的，或引入取代基的。通过引入取代基，例如，可能调节溶解度和氧化还原电位等。取代位置为2位、4位和5位。取代基的实例为烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和卤素基团(例如溴、氯、碘等)。
咪唑铜络合物的实例为[Cu(咪唑)4]、[Cu(4-甲基-咪唑)4]、[Cu(4-苯基-咪唑)4]、[Cu(4-氨基-咪唑)4]、[Cu(4-羟基-咪唑)4]、[Cu(4-羧基-咪唑)4]和[Cu(4-溴-咪唑)4]等。
氨基酸的实例为精氨酸(L-Arg)。精氨酸铜络合物具有溶解性高的优点。混合配体的实例为联吡啶和咪唑的组合、联吡啶和氨基酸的组合。例如，[Cu(咪唑)2(联吡啶)]或[Cu(L-Arg)2(联吡啶)]。使用混合配体可以赋予铜络合物各种性质，例如使用精氨酸提高络合物的溶解性。
以上的过渡金属络合物的说明基于过渡金属类型而举例，但本发明并不限于它们。以下，将基于配体说明过渡金属络合物。
具有N、O、S的配位原子的配体在分子中具有，例如，＝N-OH、-COOH、-OH、-SH、＞C＝O等基团。具有这种配体的金属络合物的实例是NN螯合物、NO螯合物、NS螯合物、OO螯合物、OS螯合物、SS螯合物(二齿配位)、N螯合物(一齿)、NNN螯合物(三齿)等，组合是多种多样的。当配体具有双键时，Cu、Fe、Ru和Os等金属趋向于具有电子转移/接受功能。配体优选具有芳香环。如前所述，在配体中可以引入各种取代基。举例来说，如果引入砜基，则金属络合物的溶解度上升。在形成金属络合物中，可以混合两种或两种以上配体并用作混合配体。举例来说，当配体之一是氨基酸时，则与酶的亲合性良好。另外，中心金属的一部分的部位可以连接有各种卤素(例如Cl、F、Br、I)。以下是按配体的类型分类的转移金属络合物的实例。
(NN-配位型)
菲咯啉衍生物
Cu+1，10-菲咯啉
Fe+1，10-菲咯啉
Cu+红菲绕啉
Fe+红菲绕啉
Cu+红菲绕啉磺酸
Fe+红菲绕啉磺酸
联吡啶衍生物
Cu+2，2’-联吡啶
Fe+2，2’-联吡啶
Fe+4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶
Cu+4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶
三嗪衍生物
Cu+TPTZ(2，4，6-三吡啶基-S-三嗪)
Fe+TPTZ(2，4，6-三吡啶基-S-三嗪)
Fe+PDTS(3-(2-吡啶基)-5，6-二(4-磺苯基)-1，2，4-三嗪)
联喹啉衍生物
Cu+亚铜试剂(2，2’-联喹啉)
吡啶基偶氮衍生物
Fe+硝基-PAPS(2-(5-硝基-2-吡啶基偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)
(NO配位型)
Fe+亚硝基-PSAP(2-亚硝基-5-[N-正丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)
Fe+亚硝基-ESAP(2-亚硝基-5-[N-乙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)
Fe+1-亚硝基-2-萘酚
(NS配位型)
Fe+2-氨基-4-噻唑乙酸
(OO配位型)
Fe+1，2-萘醌-4-磺酸
(混合配体型)
Os+Cl，咪唑，4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶
Os+咪唑，4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶
Cu+L-精氨酸，2，2’-联吡啶
Cu+乙二胺，2，2’-联吡啶
Cu+咪唑，2，2’-联吡啶
在本发明中，所述的发色剂没有特别的限制，可以是2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(INT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物(MTT)、3，3’-(1，1’-二苯基-4，4’-二基)-二(2，5-二苯基-2H-四唑鎓氯化物)(Neo-TB)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4，4’-二基]-二[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(硝基-TB)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4，4’-二基]-二(2，5-二苯基-2H-四唑鎓氯化物)(TB)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓，一钠盐(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓，一钠盐(WST-3)、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑鎓(WST-4)、2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-二[4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-二亚苯基)二四唑鎓，二钠盐(WST-5)、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓，一钠盐(WST-8)、2-(2-苯并噻唑基)-3，5-二苯基四唑鎓溴化物、2-(2-苯并噻唑基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓溴化物、2，3-二(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓氯化物、2，3-二(4-硝基苯基)四唑鎓高氯酸盐、3-(3-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物、3-(4-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物、铁络合物、铜络合物。铁络合物、铜络合物具有介质的功能，但在本发明中，也可以用作发色剂。例如，如上所述，铜络合物的实例为联吡啶铜络合物、咪唑铜络合物、氨基酸(例如精氨酸)铜络合物、咪唑·联吡啶铜络合物和咪唑·氨基酸铜络合物等。铜络合物通过电子转移从蓝色(Cu2+)变化为红棕色(Cu+)。在铜络合物用作发色剂的情况下，可以将铜络合物以外的过渡金属络合物用作介质，并且锇络合物和钌络合物是优选的。
以下，以将锇络合物用作介质，将MTT用作发色剂，葡萄糖为分析对象的情况为例，说明本发明的比色分析方法适用于试验片的例子。胆固醇等其它的成分分析除了相应地改变氧化还原酶以外，基本上相同。
首先，准备锇络合物。锇络合物可以使用市售品，也可以通过下述实施例的方法生产。将锇络合物溶解在缓冲溶液中，然后在溶液中溶解MTT、粘合剂等添加剂、葡萄糖脱氢酶(GDH)，得到试剂溶液。缓冲溶液为磷酸缓冲液、Good缓冲液等。相对于全部缓冲溶液，锇络合物的浓度例如为1-10wt％。粘合剂的实例为羟丙基纤维素(HPC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺和牛血清白蛋白(BSA)等，在它们中，HPC是优选的。粘合剂的浓度例如在0.5-5wt％的范围内。GDH的浓度例如为1000-50000U/ml。MTT的浓度没有特别的限制。通过将滤纸等多孔片在所述试剂溶液中浸渍，然后干燥，制得葡萄糖分析用试验片。在所述试剂溶液浸渍前，优选将所述多孔片在无机凝胶溶液中浸渍并干燥。无机凝胶的实例为蒙脱石等。所述无机凝胶溶液的无机凝胶浓度例如为1-5wt％，优选为1-3wt％，更优选为1.5-2wt％。所述无机凝胶溶液还可以含有CHAPS等两性表面活性剂。相对于全部所述无机凝胶溶液，两性表面活性剂的浓度例如为0.1-2wt％，优选为0.1-1wt％，更优选为0.2-0.4wt％。以多孔片的空隙体积为基准，所述无机凝胶对所述多孔片的浸渍量例如为1-50mg/cm3，优选为10-30mg/cm3，15-20mg/cm3。所述多孔片可以是孔径在厚度方向或者在片表面方向上变化的不对称多孔膜。当将血液等含有葡萄糖的样品滴到该试验片上时，所述MTT对应于其浓度而发色。通过测定这种发色的程度，可能进行葡萄糖的定性或定量分析。分析所需要的时间为滴样后约1～3秒。如果该试验片中浸渍有无机凝胶，能够得到更均一且稳定的发色。
所述无机凝胶，例如，优选使用膨润性粘土矿物。在膨润性粘土矿物中，膨润土、蒙脱石、蛭石或合成的氟云母是更优选的，特别优选合合成锂蒙脱石或合成滑石粉等蒙脱石，或者以合成氟云母为代表的膨润性合成云母(或Na型云母)等的合成云母(天然的云母通常是非膨润性的粘土矿物)。
接下来，以将锇络合物用作介质，将MTT用作发色剂，葡萄糖为分析对象的情况为例，说明本发明的比色分析方法适用于液体系统分析的例子。胆固醇等其它的成分分析除了相应地改变氧化还原酶以外，基本上相同。
通过在缓冲液中溶解锇络合物、GDH和MTT来制备试剂溶液。尽管可以在水中溶解，但是在缓冲液中溶解是优选的。缓冲液的pH例如在pH6-8的范围内，优选在pH6.5-7的范围内。锇络合物的浓度例如为0.1-60mM，优选为0.2-10mM，更优选为0.3-0.6mM。GDH的浓度例如为10-1000U/ml，优选为50-500U/ml，更优选为100-200U/ml。MTT的浓度没有特别的限制。当将血液等含有葡萄糖的样品添加到该试验溶液中时，例如，在5秒或5秒以内的短时间内，所述试验溶液对应于样品的葡萄糖浓度而发色。这种变化可以通过目视确认，或者用分光光度计等光学测定装置来测定。相对于1毫升所述试剂溶液，所述样品的添加量例如在1-100微升的范围内，优选在3-10微升的范围内，更优选在5-10微升的范围内。
实施例
以下将说明本发明的实施例。在下文中，PQQ代表任何含有一个吡咯环及一个喹啉环的醌，其它试剂在下表中详细阐明。
  试剂   生产商名   备注(正式名称等)
  PQQGDH   东洋纺   PQQ-葡萄糖脱氢酶
  GOD   Sigma   葡萄糖氧化酶X-S型
  丙酮酸氧化酶   BoehringerMannheim
MTT 同仁化学   3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物
WST-4 同仁化学   2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑鎓
WST-5 同仁化学   2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-二[4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-二亚苯基)二四唑鎓，二钠盐
  葡萄糖   和光纯药   D(+)-葡萄糖
  丙酮酸   和光纯药   一水合丙酮酸锂
实施例1
首先，合成了锇络合物[OsCl(Him)(dmbpy)2]。首先，将2.00克(4.56毫摩尔)的(NH4)2[OsCl6]和1.68克(9.11毫摩尔)的二甲基联吡啶(dmbpy)在氮气流下于乙二醇(60毫升)中回流1小时。在冷却至室温后，在30分钟内加入1M亚硫酸氢钠水溶液(120毫升)，接着在冰浴中冷却30分钟。减压过滤得到的沉淀，用水充分洗涤(使用500-1000毫升)。接着用乙醚洗涤两次后，减压干燥。这样得到1.5-1.7克[OsCl2(dmbpy)2]。将1.56克(2.60毫摩尔)的所得[OsCl2(dmbpy)2]和0.36克(5.2毫摩尔)的咪唑(Him)在氮气流下于水/甲醇混合溶剂(50毫升)中回流2小时。在冷却至室温后，加入饱和NaCl水溶液(300毫升)。减压过滤得到的沉淀，用饱和NaCl水溶液洗涤后，再减压干燥，得到[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2。将所得[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2溶解在尽可能少量的乙腈/甲醇(1∶1v/v)中，并且通过柱色谱(吸收剂：活性铝土，展开溶剂：乙腈/甲醇)。蒸发溶剂后，在少量丙酮中溶解，用乙醚再沉淀。减压过滤所得的沉淀后，通过减压干燥得到纯化的[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2。
制备含有锇络合物的下述试剂溶液。将5微升各种浓度的葡萄糖(GLU)水溶液(浓度：0、200、400、600mg/100ml)放入光路长10毫米的微量吸收池(材质·聚甲基丙烯酸酯)中，接着加入1000微升以下试剂溶液，同时在600纳米的波长处测定吸光度。图1示出了其结果。如图所示，发色与葡萄糖浓度对应。因为反应快速进行，所以至底物完全消耗基本上只花了2秒种。
试剂溶液组成：
MTT(同仁化学公司生产)                            0.5mM
[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2                        0.1mM
PIPES(pH 7.0)                                    40mM
PQQGDH                                           200U/ml
实施例2
制备含有锇络合物的以下试剂溶液。将5微升各种浓度的葡萄糖(GLU)水溶液(浓度：0、200、400、600mg/100ml)放入光路长10毫米的微量吸收池(材质·聚甲基丙烯酸酯)中，接着加1000微升以下试剂溶液，同时在600纳米的波长处测定吸光度。图2示出了其结果。如图所示，发色与葡萄糖浓度对应。因为反应快速进行，所以至底物完全消耗基本上只花了1秒种。
试剂溶液组成：
WST-5(同仁化学公司生产)                        0.5mM
[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2                      0.1mM
PIPES(pH7.0)                                   40mM
PQQGDH                                         200U/ml
实施例3
制备含有钌络合物的以下试剂溶液。将5微升各种浓度的葡萄糖(GLU)水溶液(浓度：0、200、400、600mg/100ml)放入光路长10毫米的微量吸收池(材质·聚甲基丙烯酸酯)中，接着加入1000微升以下试剂溶液，同时在600纳米的波长处测定吸光度。图3示出了其结果。如图所示，发色与葡萄糖浓度对应。因为反应快速进行，所以至底物完全消耗基本上只花了2秒种。
试剂溶液组成：
WST-5(同仁化学公司生产)                            0.5mM
[Ru(NH3)6Cl3](Aldrich公司生产)                10mM
PIPES(pH7.0)                                       40mM
PQQGDH                                             200U/ml
实施例4
在约80℃的温浴中，将CuCl2和2，2’-联吡啶(bpy)以1∶2的摩尔比混合，合成[Cu(bpy)2]Cl2，接着制备含有该铜络合物的以下试剂溶液。将5微升各种浓度的葡萄糖(GLU)水溶液(浓度：0、200、400、600mg/100ml)放入光路长10毫米的微量吸收池(材质·聚甲基丙烯酸酯)中，接着加入1000微升以下试剂溶液，同时在600纳米的波长处测定吸光度。图4示出了其结果。如图所示，发色与葡萄糖浓度对应。因为反应快速进行，所以至底物完全消耗基本上只花了2秒种。
试剂溶液组成：
WST-5(同仁化学公司生产)                          0.5mM
[Cu(bpy)2]Cl2                                 1mM
PIPES(pH7.0)                                     40mM
PQQGDH                                           200U/ml
实施例5
制备具有各种配体的铜络合物。将氯化铜(II)和以下配体以1∶2的摩尔比混合，溶解在纯水中，在约80℃的温浴中保温10分钟来配位，得到络合物溶液。
  配体   生产商名   络合物
  1，10-菲咯啉   和光纯药   [Cu(1，10-菲咯啉)2]
  红菲绕啉   和光纯药   [Cu(红菲绕啉)2]
  红菲绕啉磺酸二钠盐   Nacalai Tesque   [Cu(红菲绕啉磺酸)2]
  2，2’-联吡啶   和光纯药   [Cu(2，2’-联吡啶)2]
  TPTZ   同仁化学   [Cu(TPTZ)2]
  亚铜试剂   和光纯药   [Cu(亚铜试剂)2]
实施例6
使用以下所示的配体和联吡啶作为配体，制备铜的混合配体络合物。将铜∶以下配体∶联吡啶以1∶2∶1的摩尔比混合，溶解在纯水中，在约80℃的温浴中保温10分钟来配位，得到以下配体。
  配体   生产商名   络合物
  L-精氨酸   Nacalai Tesque   [Cu(L-Arg)(bpy)]
  乙二胺   Nacalai Tesque   [Cu(en)(bpy)]
  咪唑   和光纯药   [Cu(Him)(bpy)]
实施例7
使用各种配体制备铁络合物。将氯化铁(III)和以下配体以1∶3的摩尔比混合，溶解在纯水中，在约80℃的温浴中保温10分钟来配位，得到络合物溶液。
 配体   生产商名   络合物
 1，10-菲咯啉   和光纯药   [Fe(1，10-菲咯啉)3]
 红菲绕啉   和光纯药   [Fe(红菲绕啉)3]
 红菲绕啉磺酸二钠盐   Nacalai Tesque   [Fe(红菲绕啉磺酸)3]
 2，2’-联吡啶   和光纯药   [Fe(2，2’-联吡啶)3]
4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶 本公司合成   [Fe(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)3]
 TPTZ   同仁化学   [Fe(TPTZ)3]
 PDTS   同仁化学   [Fe(PDTS)3]
 硝基-PAPS   同仁化学   [Fe(亚硝基-PAPS)3]
 亚硝基-ESAP   同仁化学   [Fe(亚硝基-ESAP)3]
 1-亚硝基-2-萘酚   关东化学   [Fe(1-亚硝基-2-萘酚)3]
2-氨基-4-噻唑乙酸 Lancaster   [Fe(2-氨基-4-噻唑乙酸)3]
 1，2-萘醌-4-磺酸   Nacalai Tesque   [Fe(1，2-萘醌-4-磺酸)3]
 亚硝基-PSAP   同仁化学   [Fe(亚硝基-PSAP)3]
实施例8
如以下制备两种钌络合物。
[Ru(NH3)6]
首先，在水中溶解市售的钌络合物(Aldrich公司，六氨合氯化钌(III)，得到[Ru(NH3)6]的络合物溶液。
[Ru(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)3]
<配体>在120毫升冰浴冷却的浓硫酸中缓慢溶解11.8克(63.0毫摩尔)的2，2’-联吡啶-N，N’-二氧化物(Aldrich公司生产)，将反应溶液加热至100℃。然后，缓慢滴加64.0克(630毫摩尔)硝酸钾的100毫升浓硫酸溶液，其后加热搅拌1小时。反应后，将溶液放冷至室温，倒入碎冰中，过滤得到4，4’-二硝基-2，2’-联吡啶-N，N’-氧化物的固体。在氩气流下，将7.0克(25毫摩尔)的4，4’-二硝基-2，2’-联吡啶-N，N’-氧化物和6.0克10％的钯炭悬浮于23毫升乙醇中。向该溶液中滴加6.3克(126毫摩尔)一水合肼的47毫升乙醇溶液，回流8小时。将反应溶液放冷后，过滤，浓缩滤液。通过硅胶柱进行纯化，得到4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶。
<合成>在50毫升的两颈瓶中放入乙二醇(10毫升)，并于搅拌下依次溶解DA-bpy(0.2克)、RuCl3(0.1克)，在N2气流下，用覆套式电阻加热器于剧烈搅拌下加热，回流约4小时。
<纯化>在N2气流下搅拌并放冷后，转入100毫升的茄形瓶中，用丙酮(5毫升)+乙醚(20毫升)洗涤反应溶液。重复用丙酮(5毫升)+乙醚(20毫升)洗涤，直至溶剂的乙二醇完全除去。将充分洗涤的目的物溶解在乙醇中，通过加入乙醚来沉淀目的物。过滤并用乙醚洗涤，减压干燥，得到[Ru(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)3]的固体。将其水溶得到络合物溶液。
实施例9
如以下制备两种锇络合物。
[OsCl(Him)(dmbpy)2]
<合成>将2.00克(4.56毫摩尔，Aldrich)的(NH4)2[OsCl6]和1.68克(9.11毫摩尔)的4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶(dmbpy，和光纯药)在氮气流下于乙二醇(60毫升)中回流1小时。在冷却至室温后，在30分钟内加入120毫升1M亚硫酸氢钠水溶液，在冰浴中冷却30分钟。减压过滤得到的沉淀，用水充分洗涤(使用500-1000毫升)。接着用乙醚洗涤两次，减压干燥。这样得到1.5-1.7克[OsCl2(dmbpy)2]。将1.56克(2.60毫摩尔)的所得[OsCl2(dmbpy)2]和0.36克(5.2毫摩尔)的咪唑(Him)在氮气流下于水/甲醇混合溶剂(50毫升)中回流2小时。在冷却至室温后，加入300毫升饱和NaCl溶液。减压过滤得到的沉淀，用饱和NaCl水溶液洗涤后，减压干燥，得到[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2。
<纯化>将[OsCl(Him)(dmpyy)2]Cl2溶解在尽可能少量的乙腈/甲醇(1∶1 v/v)中，通过柱色谱(吸收剂：活性铝土，展开溶剂：乙腈/甲醇)纯化。蒸发溶剂后，在少量丙酮中溶解，用乙醚再沉淀。减压过滤所得的沉淀，减压干燥。将其水溶，得到络合物溶液。
[Os(Him)2(dmbpy)2]
<合成>将2.00克(4.56毫摩尔)的(NH4)2[OsCl6]和1.68克(9.11毫摩尔)dmbpy在氮气流下于60毫升乙二醇中回流1小时。在冷却至室温后，在30分钟内加入120毫升1M亚硫酸氢钠水溶液，在冰浴中冷却30分钟。减压过滤得到的沉淀，用水充分洗涤(500-1000毫升)。接着用乙醚洗涤两次，减压干燥。这样得到1.5-1.7克[OsCl2(dmbpy)2]。将1.56克(2.60毫摩尔)的所得[OsCl2(dmbpy)2]和0.36克(5.2毫摩尔)的Him在氮气流下于50毫升1，2-乙二醇溶剂中回流2小时。在冷却至室温后，加入300毫升饱和NaCl水溶液。减压过滤得到的沉淀，用饱和NaCl水溶液洗涤后，减压干燥，得到[Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2。
<纯化>将[Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2溶解在尽可能少量的乙腈/甲醇(1∶1 v/v)中，通过柱色谱(吸收剂：活性铝土，展开溶剂：乙腈/甲醇)纯化。蒸发溶剂后，在少量丙酮中溶解，用乙醚再沉淀。减压过滤所得的沉淀后，减压干燥。将其水溶，得到络合物溶液。
实施例10
以以下所示组成混合络合物、酶、发色剂、缓冲液而制备试剂溶液。所述络合物使用上述实施例中合成的。以下实施例也是同样的。测定所述试剂溶液的光谱作为空白，接着添加与所述络合物等量的葡萄糖，在颜色改变后测定光谱。图5示出了其结果。如图所示，因为金属络合物作为电子转移试剂来还原WST-5，所以显示还原型WST-5特有的光谱。
试剂溶液组成：
PQQ-GDH                                    50U/ml
[Ru(NH3)6]                             0.8mM
WST-5                                      0.2mM
PIPES pH7                            50mM
Triton X-100                         0.5％
实施例11
以以下所示组成混合络合物、酶、发色剂、缓冲液而制备试剂溶液，测定它们的光谱作为空白，接着添加与所述络合物等量的葡萄糖，在颜色改变后测定光谱。图6A、6B示出了其结果。如图所示，因为金属络合物作为电子转移试剂来还原MTT，所以显示还原型MTT特有的光谱。
试剂溶液组成1：图6A
PQQ-GDH                                50U/ml
[Cu(1，10-菲咯啉)2]                   1mM
MTT                                    1mM
PIPES pH7                              50mm
Triton X-100                           0.5％
试剂溶液组成2：图6B
PQQ-GDH                                50U/ml
[Fe(红菲绕啉)3]                       1mM
MTT                                    1mM
PIPES pH7                              50mM
Triton X-100                           0.5％
(红菲绕啉＝4，7-二苯基菲咯啉)
实施例12
以以下所示组成混合络合物、酶、发色剂、缓冲液而制备试剂溶液，测定它们的光谱作为空白，接着添加与所述络合物等量的葡萄糖，在颜色改变后测定光谱。图7A、7B示出了其结果。如图所示，因为金属络合物作为电子转移试剂来还原MTT，所以显示还原型MTT特有的光谱。
试剂溶液组成1：图7A
PQQ-GDH                                    50U/ml
[Fe(2，2’-联吡啶)3]                      1mM
MTT                                        1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5％
试剂溶液组成2：图7B
PQQ-GDH                                    50U/ml
[Fe(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)3]        0.1mM
MTT                                        1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5％
实施例13
以以下所示组成混合络合物、酶、发色剂、缓冲液而制备试剂溶液，测定它们的光谱作为空白，接着添加与所述络合物等量的葡萄糖，在颜色改变后测定光谱。图8示出了其结果。如图所示，因为金属络合物作为电子转移试剂来还原MTT，所以显示还原型MTT特有的光谱。
试剂溶液组成：
PQQ-GDH                                    50U/ml
[Fe(TPTZ)3                                0.1mM
MTT                                        1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5％
(TPTZ＝2，4，6-三吡啶基-s-三嗪)
实施例14
以以下所示组成混合络合物、酶、发色剂、缓冲液而制备试剂溶液，测定它们的光谱作为空白，接着添加与所述络合物等量的葡萄糖，在颜色改变后测定光谱。图9示出了其结果。如图所示，因为金属络合物作为电子转移试剂来还原MTT，所以显示还原型MTT特有的光谱。
试剂溶液组成：
PQQ-GDH                                    50U/ml
[Cu(亚铜试剂)2]                           1mM
MTT                                        1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5％
(亚铜试剂＝2，2’-联喹啉)
实施例15
以以下所示组成混合络合物、酶、发色剂、缓冲液而制备试剂溶液，测定它们的光谱作为空白，接着添加与所述络合物等量的葡萄糖，在颜色改变后测定光谱。图10示出了其结果。如图所示，因为金属络合物作为电子转移试剂来还原MTT，所以显示还原型MTT特有的光谱。
试剂溶液组成：
PQQ-GDH                                    50U/ml
[Fe(硝基-PAPS)3]                          0.02mM
MTT                                        1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5％
实施例16
以以下所示组成混合络合物、酶、发色剂、缓冲液而制备试剂溶液，测定它们的光谱作为空白，接着添加与所述络合物等量的葡萄糖，在颜色改变后测定光谱。图11示出了其结果。如图所示，因为金属络合物作为电子转移试剂来还原MTT，所以显示还原型MTT特有的光谱。
试剂溶液组成：
PQQ-GDH                                    50U/ml
[Fe(1-亚硝基-2-萘酚)3]                    0.1mM
MTT                                        1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5％
实施例17
以以下所示组成混合络合物、酶、发色剂、缓冲液而制备试剂溶液，测定它们的光谱作为空白，接着添加与所述络合物等量的葡萄糖，在颜色改变后测定光谱。图12示出了其结果。如图所示，因为金属络合物作为电子转移试剂来还原MTT，所以显示还原型MTT特有的光谱。
试剂溶液组成：
PQQ-GDH                                    50U/ml
[Fe(2-氨基-4-噻唑乙酸)3]                  1mM
MTT                                        1mM
PIPES pH7                                  50mM
Triton X-100                               0.5％
实施例18
以以下所示组成混合络合物、酶、发色剂、缓冲液而制备试剂溶液，测定它们的光谱作为空白，接着添加与所述络合物等量的葡萄糖，在颜色改变后测定光谱。图13示出了其结果。如图所示，因为金属络合物作为电子转移试剂来还原MTT，所以显示还原型MTT特有的光谱。
试剂溶液组成：
PQQ-GDH                               50U/ml
[Fe(1，2-萘醌-4-磺酸)3]              1mM
MTT                                   1mM
PIPES pH7                             50mM
Triton X-100                          0.5％
实施例19
以以下所示组成1、2混合络合物、酶、发色剂、缓冲液而制备试剂溶液，测定它们的光谱作为空白，接着添加与所述络合物等量的葡萄糖，在颜色改变后测定光谱。图14A、14B示出了其结果。如图所示，因为金属络合物作为电子转移试剂来还原MTT，所以显示还原型MTT特有的光谱。
试剂溶液组成1：图14A
PQQ-GDH                                50U/ml
[OsCl(Him)(dmbpy)2]                  0.1mM
MTT                                    1mM
PIPES pH7                              50mM
Triton X-100                           0.5％
(Him＝咪唑)
(dmbpy＝4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)
试剂溶液组成2：图14B
PQQ-GDH                                50U/ml
[Os(Him)2(dmbpy)2]                 0.1mM
MTT                                    1mM
PIPES pH7                              50mM
Triton X-100                           0.5％
(Him＝咪唑)
(dmbpy＝4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)
实施例20
以以下所示组成混合络合物、酶(丙酮酸氧化酶)、发色剂、缓冲液而制备试剂溶液，测定它们的光谱作为空白，接着添加与所述络合物等量的葡萄糖，在颜色改变后测定光谱。图15示出了其结果。如图所示，因为金属络合物作为电子转移试剂来还原MTT，所以显示还原型MTT特有的光谱。
试剂溶液组成：
丙酮酸氧化酶                              100U/ml
[OsCl(Him)(dmbpy)2]                     0.1mM
MTT                                       1mM
PIPES pH7                                 50mM
Triton X-100                              0.5％
(Him＝咪唑)
(dmbpy＝4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)
实施例21
该实施例证明试剂的反应速度可以通过增加酶量来提高。首先，将两块网状纤维(10厘米×10厘米)用1毫升以下组成1、2的试剂溶液浸泡，用热风干燥。将这些纤维附着到聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜上，裁成预定形状，制得酶量不同的两种试验片。将血清基的葡萄糖标准溶液0、200、400、600mg/dl作为样品滴到该试验片上，通过反射率测定装置(LED/波长660纳米)来观察30秒内的K/S变化。所述血清基的葡萄糖标准溶液如下制备：冷冻并熔化经糖酵解的人全血的血浆，向得到的血清中加入葡萄糖溶液。图16A和16B示出了其结果。如图所示，与1000U/ml的情况相比，在酶量为5000U/ml的情况下，反应速度提高，反应在约5秒时达到终点。在认为反应达到终点时的5秒钟附近时取样信号，可能进行葡萄糖定量，从反应开始到终了时的时程斜率也可能进行葡萄糖定量。
试剂溶液组成1：图16A
PQQ-GDH                              1000U/ml
[OsCl(Him)(dmbpy)2]                1mM
MTT                                  30mM
PIPES pH6.5                          80mM
MEGA-8(同仁化学公司生产)             1％
聚丙烯酰胺                           0.1％
BSA                                  1％
试剂溶液组成2(图16B)：
PQQ-GDH                              5000U/ml
[OsCl(Him)(dmbpy)2]                1mM
MTT                                  30mM
PIPES(pH6.5)                         80mM
MEGA-8(同仁化学公司生产)             1％
聚丙烯酰胺                           0.1％
BSA                                  1％
工业实用性
如上所述，本发明的比色分析方法可以在短时间内实现简单且可信的分析。

Claims (24)

1.一种比色分析方法，其通过氧化还原酶，借助介质，将电子从分析对象转移到通过还原而发色的发色剂上，通过测定因此而产生的所述发色剂的发色来对所述分析对象进行定性或定量，其中所述介质是选自铜络合物、铁络合物、锇络合物和钌络合物的至少一种。
2.根据权利要求1的比色分析方法，其中所述络合物的配体的配位原子为选自氮、氧和硫的至少一种。
3.根据权利要求1的比色分析方法，其中所述络合物的配体为选自氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物的至少一种。
4.根据权利要求3的比色分析方法，其中配体的配位位置以外的氢原子的至少一个被取代基取代。
5.根据权利要求4的比色分析方法，其中取代基为选自烷基、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和卤素基团的至少一种。
6.根据权利要求1的比色分析方法，其中络合物具有两种或两种以上配体。
7.根据权利要求1的比色分析方法，其中氧化还原酶是脱氢酶或氧化酶。
8.根据权利要求1-7之任一项的比色分析方法，其中发色剂是四唑鎓盐。
9.根据权利要求8的比色分析方法，其中四唑鎓盐具有选自硝基苯基、噻唑基和苯并噻唑基的至少一种基团。
10.根据权利要求8的比色分析方法，其中四唑鎓盐是选自MTT、INT、Neo-TB、硝基-TB、TB、WST-1、WST-3、WST-4、WST-5、WST-8、2-(2-苯并噻唑基)-3，5-二苯基四唑鎓溴化物、2-(2-苯并噻唑基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓溴化物、2，3-二(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓氯化物、2，3-二(4-硝基苯基)四唑鎓高氯酸盐、3-(3-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物，以及3-(4-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物的至少一种发色剂。
11.根据权利要求1的比色分析方法，其中分析对象是葡萄糖、胆固醇、尿酸、肌酸、肌酸酐、丙酮酸或乳酸，而氧化还原酶是对应于前述各物质的脱氢酶或氧化酶。
12.用于权利要求1的比色分析方法的试剂，该试剂含有氧化还原酶、介质和通过还原而发色的发色剂，其中所述介质是选自铜络合物、铁络合物、锇络合物和钌络合物的至少一种试剂。
13.根据权利要求12的试剂，其中络合物的配体的配位原子为选自氮、氧和硫的至少一种。
14.根据权利要求13的试剂，其中所述络合物的配体为选自氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物的至少一种。
15.根据权利要求14的试剂，其中配体的配位位置以外的氢原子的至少一个被取代基取代。
16.根据权利要求15的试剂，其中取代基为选自烷基、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和卤素基团的至少一种。
17.根据权利要求12的试剂，其中络合物具有两种或两种以上配体。
18.根据权利要求12的试剂，其中氧化还原酶是脱氢酶或氧化酶。
19.根据权利要求12的试剂，其中发色剂是四唑鎓盐。
20.根据权利要求19的试剂，其中四唑鎓盐具有选自硝基苯基、噻唑基和苯并噻唑基的至少一种基团。
21.根据权利要求19的试剂，其中四唑鎓盐是选自MTT、INT、Neo-TB、硝基-TB、TB、WST-1、WST-3、WST-4、WST-5、WST-8、2-(2-苯并噻唑基)-3，5-二苯基四唑鎓溴化物、2-(2-苯并噻唑基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓溴化物、2，3-二(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓氯化物、2，3-二(4-硝基苯基)四唑鎓高氯酸盐、3-(3-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物，以及3-(4-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物的至少一种发色剂。
22.根据权利要求12的试剂，其中分析对象是葡萄糖、胆固醇、尿酸、肌酸、肌酸酐、丙酮酸或乳酸，而氧化还原酶是对应于前述各物质的脱氢酶或氧化酶。
23.含有权利要求12的试剂的比色分析用试验片。
24.根据权利要求23的试验片，进一步含有无机凝胶。
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