PL213316B1 - Sposób analizy kolorymetrycznej, odczynnik i próbka do badan - Google Patents
Sposób analizy kolorymetrycznej, odczynnik i próbka do badanInfo
- Publication number
- PL213316B1 PL213316B1 PL369143A PL36914303A PL213316B1 PL 213316 B1 PL213316 B1 PL 213316B1 PL 369143 A PL369143 A PL 369143A PL 36914303 A PL36914303 A PL 36914303A PL 213316 B1 PL213316 B1 PL 213316B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- group
- complex
- reagent
- bipyridyl
- nitrophenyl
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Spectrometry And Color Measurement (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu analizy kolorymetrycznej, odczynnika stosowanego w tym sposobie oraz próbki do badań zawierającej taki odczynnik.
W dziedzinie badań klinicznych i biochemicznych wykorzystuje się analizę kolorymetryczną jako metodę analizowania składników takich jak glukoza, cholesterol lub tym podobne w próbce. Na przykład analiza kolorymetryczna glukozy jest na ogół następująca: oksydaza glukozy reaguje z glukozą (substratem) wytwarzając glukonolakton i nadtlenek wodoru; a nadtlenek wodoru wykrywa się odczynnikiem kolorymetrycznym, takim jak odczynnik Trindera, w obecności peroksydazy. Metoda ta, w której stężenie substratu mierzy się pośrednio poprzez nadtlenek wodoru nie ogranicza się tylko do glukozy, ale stosuje się ją również do cholesterolu lub tym podobnych.
Jednak z konwencjonalną analizą kolorymetryczną wiążą się następujące problemy. Po pierwsze, czas wymagany do pomiaru jest długi, ponieważ analitu nie mierzy się bezpośrednio, ale pośrednio poprzez nadtlenek wodoru. Na przykład pomiar glukozy zabiera 30 do 60 sekund. Po drugie, trudno jest ustalić warunki, ponieważ należy jednocześnie ustabilizować dwa różne układy reakcji enzymatycznych. Na koniec, konwencjonalna analiza kolorymetryczna wymaga tlenu, a niedostatek tlenu może prowadzić do niekompletnej reakcji.
Uwzględniając powyższe, przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu analizy kolorymetrycznej, który pozwala osiągnąć analizę w krótkim czasie i niezawodne wartości otrzymane za pomocą tej analizy.
Przedmiotem wynalazku jest sposób analizy kolorymetrycznej, polegający na tym, że przenosi się elektron z analitu wybranego spośród glukozy, cholesterolu, kwasu moczowego, kwasu pirogronowego, kwasu mlekowego, kreatyny lub kreatyniny, do czynnika pośredniczącego poprzez zastosowanie dehydrogenazy lub oksydazy, przenosi się elektron z czynnika pośredniczącego do odczynnika kolorymetrycznego, który wytwarza barwę dzięki redukcji, oraz przeprowadza się analizę jakościową lub ilościową analitu poprzez pomiar barwy wytwarzanej w odczynniku kolorymetrycznym, przy czym jako czynnik pośredniczący stosuje się co najmniej jeden kompleks wybrany spośród kompleksu miedzi, kompleksu żelaza, kompleksu osmu i kompleksu rutenu, ligandem w kompleksie jest co najmniej jeden ligand wybrany spośród amoniaku, bipirydylu, imidazolu, fenantroliny, argininy, triazyny, bichinoliny, pirydyloazo, nitrozo, i każdego z tych związków podstawionego, w pozycji innej niż pozycja koordynacyjna ligandu, co najmniej jednym podstawnikiem wybranym z grupy składającej się z grupy alkilowej, grupy arylowej, grupy allilowej, grupy fenylowej, grupy hydroksylowej, grupy alkoksylowej, grupy karboksylowej, grupy karbonylowej, grupy sulfonowej, grupy sulfonylowej, grupy nitrowej, grupy nitrozowej, pierwszorzędowej aminy, drugorzędowej aminy, trzeciorzędowej aminy, grupy aminowej, grupy acylowej, grupy amidowej i grupy fluorowcowej, jako odczynnik kolorymetryczny stosuje się sól tetrazoliową.
Korzystnie stosuje się kompleks zawierający dwa lub więcej rodzajów ligandów.
Korzystnie sól tetrazoliowa zawiera co najmniej jedną grupę wybraną z grupy nitrofenylowej, grupy tiazolilowej i grupy benzotiazolilowej.
Korzystnie sól tetrazoliowa jest co najmniej jednym odczynnikiem kolorymetrycznym wybranym z grupy składającej się z MTT, INT, Neo-TB, Nitro-TB, TB, WST-1, WST-3, WST-4, WST-5, WST-8, bromku 2-(2-benzotiazolilo)-3,5-difenylotetrazoliowego, bromku 2-(2-benzotiazolilo)-3-(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowego, chlorku 2,3-bis(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowego, nadchloranu 2,3-di(4-nitrofenylo)tetrazoliowego, chlorku 3-(3-nitrofenylo)-5-metylo-2-fenylotetrazoliowego i chlorku 3-(4-nitrofenylo)-5-metylo-2-fenylotetrazoilowego.
Przedmiotem wynalazku jest także odczynnik stosowany w sposobie analizy kolorymetrycznej jak określono powyżej, charakteryzujący się tym, że składa się z:
dehydrogenazy lub oksydazy; czynnika pośredniczącego; i odczynnika kolorymetrycznego do wytwarzania barwy poprzez redukcję, w którym czynnikiem pośredniczącym jest co najmniej jeden kompleks wybrany spośród kompleksu miedzi, kompleksu żelaza, kompleksu osmu i kompleksu rutenu, ligandem w kompleksie jest co najmniej jeden ligand wybrany spośród amoniaku, bipirydylu, imidazolu, fenantroliny, argininy, triazyny, bichinoliny, pirydyloazo, nitrozo, i każdego z tych związków
PL 213 316 B1 podstawionego, w pozycji innej niż pozycja koordynacyjna ligandu, co najmniej jednym podstawnikiem wybranym z grupy składającej się z grupy alkilowej, grupy arylowej, grupy allilowej, grupy fenylowej, grupy hydroksylowej, grupy alkoksylowej, grupy karboksylowej, grupy karbonylowej, grupy sulfonowej, grupy sulfonylowej, grupy nitrowej, grupy nitrozowej, pierwszorzędowej aminy, drugorzędowej aminy, trzeciorzędowej aminy, grupy aminowej, grupy acylowej, grupy amidowej i grupy fluorowcowej, odczynnikiem kolorymetrycznym jest sól tetrazoliowa.
Korzystnie kompleks zawiera co najmniej dwa lub więcej rodzajów ligandów.
Korzystnie sól tetrazoliowa ma co najmniej jedną grupę wybraną spośród grupy nitrofenylowej, grupy tiazolilowej i grupy benzotiazolilowej.
Korzystnie sól tetrazoliowa jest co najmniej jednym odczynnikiem kolorymetrycznym wybranym z grupy składającej się z MTT, INT, Neo-TB, Nitro-TB, TB, WST-1, WST-3, WST-4, WST-5, WST-8, bromku 2-(2-benzotiazolilo)-3,5-difenylotetrazoliowego, bromku 2-(2-benzotiazolilo)-3-(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowego, chlorku 2,3-bis(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowego, nadchloranu 2,3-di(4-nitrofenylo)tetrazoliowego, chlorku 3-(3-nitrofenylo)-5-metylo-2-fenylotetrazoliowego i chlorku 3-(4-nitrofenylo)-5-metylo-2-fenylotetrazoliowego.
Korzystnie analitem jest glukoza, cholesterol, kwas moczowy, kwas pirogronowy, kwas mlekowy, kreatyna lub kreatynina.
Przedmiot wynalazku stanowi również próbka do badań charakteryzująca się tym, że zawiera odczynnik określony powyżej i korzystnie środek wiążący oraz porowaty arkusz, przy czym próbkę do badań stosuje się do badania próbek zawierających analit wybrany spośród glukozy, cholesterolu, kwasu moczowego, kwasu pirogronowego, kreatyny, kreatyniny i kwasu mlekowego, a środek wiążący obejmuje co najmniej jeden wybrany spośród hydroksypropylocelulozy, alkoholu poliwinylowego, poliwinylopirolidonu, poliakryloamidu i albuminy surowicy bydlęcej.
Korzystnie próbka do badań zawiera ponadto żel nieorganiczny.
Sposób analizy kolorymetrycznej według niniejszego wynalazku obejmuje przenoszenie elektronu z analitu do odczynnika kolorymetrycznego, który wytwarza barwę dzięki redukcji poprzez czynnik pośredniczący i z zastosowaniem oksydoreduktazy; oraz wykonanie analizy jakościowej i ilościowej analitu za pomocą pomiaru barwy wytworzonej przez odczynnik kolorymetryczny. Czynnikiem pośrednim jest co najmniej jeden z grupy składającej się z kompleksu żelaza, kompleksu rutenu, kompleksu osmu i kompleksu miedzi.
Sposób ten obejmuje tylko jedną reakcję enzymatyczną. Tak więc układ reakcyjny jest prosty i ma dobrą stabilność. Ponadto czas pomiędzy reakcją enzymatyczną, a reakcją wytworzenia barwy jest bardzo krótki, ponieważ układ reakcji enzymatycznej jest prosty, a do redukcji odczynnika kolorymetrycznego stosuje się czynnik pośredniczący. Powoduje to również krótszy czas pomiaru. Na przykład, gdy jako substrat w sposobie analizy kolorymetrycznej według niniejszego wynalazku stosuje się glukozę, pomiar można wykonać w krótkim czasie (około 5 sekund lub mniej). Ponadto szybka reakcja prowadząca do wytworzenia barwy pozwala zaoszczędzić enzym, tak że sposób analizy kolorymetrycznej jest ekonomicznie korzystny. Metoda ta pozwala, aby odczynnik kolorymetryczny wytworzył barwę bez pośrednictwa nadtlenku wodoru i nie wymaga tlenu, zapewniając w ten sposób wysoce niezawodne wartości otrzymane za pomocą analizy.
Do powyższym sposobie analizy kolorymetrycznej jest stosowany odczynnik według niniejszego wynalazku. Odczynnik ten zawiera oksydoreduktazę, czynnik pośredniczący i odczynnik kolorymetryczny do wytwarzania barwy za pomocą redukcji. Próbka do badań według niniejszego wynalazku zawiera ten odczynnik. W porównaniu z konwencjonalną próbką do analizy kolorymetrycznej, która wytwarza nadtlenek wodoru, próbka do badań według niniejszego wynalazku pozwala uzyskać bardzo krótki czas analizy i wysoce niezawodne wyniki analizy.
Krótki opis rysunków
Fig. 1 jest wykresem pokazującym zależność pomiędzy stężeniem glukozy a wytworzeniem barwy przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 2 jest wykresem pokazującym zależność pomiędzy stężeniem glukozy a wytworzeniem barwy innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 3 jest wykresem pokazującym zależność pomiędzy stężeniem glukozy, a wytworzeniem barwy jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 4 jest wykresem pokazującym zależność pomiędzy stężeniem glukozy a wytworzeniem barwy jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
PL 213 316 B1
Fig. 5 jest wykresem pokazującym zabarwienie wytworzone w odczynniku kolorymetrycznym jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 6A i 6B są wykresami pokazującymi zabarwienie wytworzone w odczynniku kolorymetrycznym jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 7A i 7B są wykresami pokazującymi zabarwienie wytworzone w odczynniku kolorymetrycznym jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 8 jest wykresem pokazującym zabarwienie wytworzone w odczynniku kolorymetrycznym jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 9 jest wykresem pokazującym zabarwienie wytworzone w odczynniku kolorymetrycznym jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 10 jest wykresem pokazującym zabarwienie wytworzone w odczynniku kolorymetrycznym jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 11 jest wykresem pokazującym zabarwienie wytworzone w odczynniku kolorymetrycznym jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 12 jest wykresem pokazującym zabarwienie wytworzone w odczynniku kolorymetrycznym jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 13 jest wykresem pokazującym zabarwienie wytworzone w odczynniku kolorymetrycznym jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 14A i 14B są wykresami pokazującymi zabarwienie wytworzone w odczynniku kolorymetrycznym jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 15 jest wykresem pokazującym zabarwienie wytworzone w odczynniku kolorymetrycznym jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Fig. 16A i 16B są wykresami pokazującymi zabarwienie wytworzone w odczynniku kolorymetrycznym jeszcze innego przykładu według niniejszego wynalazku.
Korzystnie jest, aby w sposobie analizy kolorymetrycznej, odczynniku i próbce do badań według niniejszego wynalazku, czynnik pośredniczący był kompleksem żelaza, kompleksem rutenu, kompleksem osmu, kompleksem miedzi lub mieszaniną zawierającą co najmniej dwa takie kompleksy. Korzystne jest, aby atom koordynacyjny ligandu w kompleksie był co najmniej jednym wybranym z grupy składającej się z azotu, tlenu i siarki. Korzystne jest, aby ligand był co najmniej jednym wybranym z grupy składającej się z amoniaku, związku bipirydylowego związku imidazolowego, związku fenantrolinowego, związku etylenodiaminowego, aminokwasu, związku triazynowego, związku bichinolinowego, związku pirydyloazowego, związku nitrozowego, związku oksynowego, związku benzotiazolowego, związku acetyloacetonowego, związku antrachinonowego, związku ksantenowego, kwasu szczawiowego i pochodnej każdego z tych związków. Kompleks może mieć dwa lub więcej rodzajów ligandów, to znaczy może być kompleksem z ligandem mieszanym. Co najmniej jeden atom wodoru, który zajmuje pozycję inną niż pozycja koordynacyjna ligandu, może być zastąpiony podstawnikiem. Przykłady podstawnika obejmują grupę alkilową, grupę arylową, grupę allilową, grupę fenylową, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową, grupę karboksylową, grupę karbonylową, grupę sulfonową, grupę sulfonylową, grupę nitrową, grupę nitrozową, pierwszorzędową aminę, drugorzędową aminę, trzeciorzędową aminę, grupę aminową, grupę acylową, grupę amidową i grupę halogenową.
Korzystne jest, aby w sposobie analizy kolorymetrycznej, odczynniku i próbce do badań według niniejszego wynalazku, oksydoreduktaza była dehydrogenazą lub oksydazą. Analit jest korzystnie np. glukozą, cholesterolem, kwasem mlekowym, kwasem moczowym, kwasem pirogronowym, kreatyną lub kreatyniną. W takim przypadku dehydrogenaza lub oksydaza, która odpowiada każdemu z tych analitów nadaje się jako oksydoreduktaza. Szybkość reakcji rośnie z ilością enzymu. Korzystnie jest, gdy odczynnik kolorymetryczny jest solą tetrazoliową. Korzystnie jest, aby sól tetrazoliowa miała co najmniej jedną grupę wybraną spośród grupy nitrofenylowej, grupy tiazolilowej i grupy benzotiazolilowej. Przykłady soli tetrazoliowej obejmują zwłaszcza MTT, INT, Neo-TB, Nitro-TB, TB, WST-1, WST-3, WST-4, WST-5, WST-8, bromek 2-(2-benzotiazolilo)-3,5-difenylotetrazoliowy, bromek 2-(2-benzotiazolilo)-3-(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowy, chlorek 2,3-bis(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowy, nadchloran 2,3-di(4-nitrofenylo)tetrazoliowy, chlorek 3-(3-nitrofenylo)-5-metylo-2-fenylotetrazoliowy i chlorek 3-(4-nitrofenylo)-5-metylo-2-fenylotetrazoliowy.
Korzystnie jest, gdy próbka do badań według niniejszego wynalazku zawiera żel nieorganiczny jak również odczynnik. Żel nieorganiczny służy do blokowania tlenu, zapobiegając przez to utlenieniu odczynnika kolorymetrycznego i zanikaniu barwy wytworzonej w odczynniku kolorymetrycznym w związku z reoksydacją.
PL 213 316 B1
Jak opisano powyżej, kompleks żelaza, kompleks rutenu, kompleks osmu lub kompleks miedzi nadają się jako czynnik pośredniczący według niniejszego wynalazku, a szczególnie odpowiedni jest kompleks osmu.
Kompleks żelaza
Przykłady ligandu w kompleksie żelaza obejmują amoniak, związek bipirydylowy, związek imidazolowy, związek fenantrolinowy, związek etylenodiamonowy, aminokwas, związek triazynowy, związek bichinolinowy, związek pirydylazowy, związek nitrozowy, związek oksynowy, związek benzotiazolowy, związek acetyloacetonowy, związek antrachinonowy, związek ksantenowy, kwas szczawiowy i pochodną każdego z tych związków. Można także użyć ligand mieszany z dwoma lub więcej rodzajami tych ligandów.
Dla związku bipirydylowego liczba koordynacyjna wynosi 6. Związek bipirydylowy może być niepodstawiony lub podstawiony. Wprowadzenie podstawnika umożliwia kontrolowanie, np. rozpuszczalności i potencjału utleniająco-redukcyjnego kompleksu. Przykłady pozycji podstawnika obejmują pozycję 4,4' i pozycję 5,5'. Przykłady podstawnika obejmują grupę alkilową (taką jak grupa metylowa, grupa etylowa lub grupa propylowa), grupę arylową, grupę allilową, grupę fenylową, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową (taką jak grupa metoksylowa lub grupa etoksylowa), grupę karboksylową, grupę karbonylową, grupę sulfonową, grupę sulfonylową, grupę nitrową, grupę nitrozową, pierwszorzędową aminę, drugorzędową aminę, trzeciorzędową aminę, grupę aminową, grupę acylową, grupę amidową i grupę halogenową (taką jak brom, chlor lub jod).
Przykłady bipirydylowych kompleksów żelaza obejmują [Fe(bipirydyl)3], [Fe(4,4'-dimetylo-2,2'-bipirydyl)3], [Fe(4,4'-difenylo-2,2'-bipirydyl)3], [Fe(4,4'-diamino-2,2'-bipirydyl)3], [Fe(4,4'-dihydroksy-2,2'-bipirydyl)3], [Fe(4,4'-dikarboksy-2,2'-bipirydyl)3], [Fe(4,4'-dibromo-2,2'-bipirydyl)3], [Fe(5,5'-dimetylo-2,2'-bipirydyl)3], Fe(5,5'-difenylo-2,2'-bipirydyl)3], [Fe(5,5'-diamino-2,2'-bipirydyl)3], [Fe(5,5'-dihydroksy-2,2'-bipirydyl)3], [Fe(5,5'-dikarboksy-2,2'-bipirydyl)3] i [Fe(5,5'-dibromo-2,2'-bipirydyl)3].
Dla związku imidazolowego liczba koordynacyjna wynosi 6. Związek imidazolowy może być niepodstawiony lub podstawiony. Wprowadzenie podstawnika umożliwia kontrolowanie, np. rozpuszczalności i potencjału utleniająco-redukującego kompleksu. Przykłady pozycji podstawnika obejmują pozycję 2, pozycję 4 i pozycję 5. Przykłady podstawnika obejmują grupę alkilową (taką jak grupa metylowa, grupa etylowa lub grupa propylowa), grupę arylową, grupę allilową, grupę fenylową, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową (taką jak grupa metoksylowa lub grupa etoksylowa), grupę karboksylową, grupę karbonylową, grupę sulfonową, grupę sulfonylową, grupę nitrową, grupę nitrozową, pierwszorzędową aminę, drugorzędową aminę, trzeciorzędową aminę, grupę aminową, grupę acylową, grupę amidową i grupę halogenową (taką jak brom, chlor lub jod).
Przykłady imidazolowych kompleksów żelaza obejmują [Fe(imidazol)6], [Fe(4-metyloimidazol)6], [Fe(4-fenyloimidazol)6], [Fe(4-aminoimidazol)6], [Fe(4-hydroksyimidazol)6], [Fe(4-karboksyimidazol)6] i [Fe(4-bromoimidazol)6].
Aminokwas obejmuje, np. argininę (L-Arg). Kompleks żelaza z argininą posiada na ogół zaletę dobrej rozpuszczalności. Mieszany ligand może być kombinacją związków bipirydylowych i związków imidazolowych lub kombinacją związków bipirydylowych i aminokwasu, taką jak [Fe(imidazol)2(bipirydyl)2] lub [Fe(L-Arg)2(bipirydyl)2]. Użycie mieszanego ligandu może nadać kompleksowi różne cechy, np. arginina polepsza rozpuszczalność kompleksu.
Kompleks rutenu
Przykłady ligandu w kompleksie rutenu obejmują amoniak, związek bipirydylowy, związek imidazolowy, związek fenantrolinowy, związek etylenodiaminowy, aminokwas, związek triazynowy, związek bichinolinowy, związek pirydazolowy, związek nitrozowy, związek oksynowy, związek benzotiazolowy, związek acetyloacetonowy, związek antrachinonowy, związek ksantenowy, kwas szczawiowy i pochodną każdego z tych związków. Można stosować mieszany ligand dwóch lub więcej rodzajów tych ligandów.
Dla związku bipirydylowego liczba koordynacyjna wynosi 6. Związek bipirydylowy może być niepodstawiony lub podstawiony. Wprowadzenie podstawnika umożliwia kontrolę, np. rozpuszczalności i potencjału utleniająco-redukującego kompleksu. Przykłady pozycji podstawnika obejmują pozycję 4,4' i pozycję 5,5'. Przykłady podstawnika obejmują grupę alkilową (taką jak grupa metylowa, grupa etylowa lub grupa propylowa), grupę arylową, grupę allilową, grupę fenylową, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową (taką jak grupa metoksylowa lub grupa etoksylowa), grupę karboksylową, grupę karbonylową, grupę sulfonową, grupę sulfonylową, grupę nitrową, grupę nitrozową, pierwszorzędową
PL 213 316 B1 aminę, drugorzędową aminę, trzeciorzędową aminę, grupę aminową, grupę acylową, grupę amidową i grupę halogenową (taką jak brom, chlor lub jod).
Przykłady bipirydylowego kompleksu rutenu obejmują [Ru(bipirydyl)3], [Ru(4,4'-dimetylo-2,2'-bipirydyl)3], [Ru(4,4'-difenylo-2,2'-bipirydyl)3], [Ru(4,4'-diamino-2,2'-bipirydyl)3], [Ru(4,4'-dihydroksy-2,2'-bipirydyl)3], [Ru(4,4'-dikarboksy-2,2'-bipirydyl)3], [Ru(4,4'-dibromo-2,2'-bipirydyl)3], [Ru(5,5'-dimetylo-2,2'-bipirydyl)3], [Ru(5,5'-difenylo-2,2'-bipirydyl)3], [Ru(5,5'-diamino-2,2'-bipirydyl)3], [Ru(5,5'-dihydroksy-2,2'-bipirydyl)3], [Ru(5,5'-dikarboksy-2,2'-bipirydyl)3] i [Ru(5,5'-dibromo-2,2'-bipirydyl)3].
Dla związku imidazolowego liczba koordynacyjna wynosi 6. Związek imidazolowy może być niepodstawiony lub podstawiony. Wprowadzenie podstawnika umożliwia kontrolę, np. rozpuszczalności i potencjału utleniająco-redukującego kompleksu. Przykłady pozycji podstawnika obejmują pozycję 2, pozycję 4 i pozycję 5. Przykłady podstawnika obejmują grupę alkilową (taką jak grupa metylowa, grupa etylowa lub grupa propylowa), grupę arylową, grupę allilową, grupę fenylową, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową (taką jak grupa metoksylowa lub grupa etoksylowa), grupę karboksylową, grupę karbonylową, grupę sulfonową, grupę sulfonylową, grupę nitrową, grupę nitrozową, pierwszorzędową aminę, drugorzędową aminę, trzeciorzędową aminę, grupę aminową, grupę acylową, grupę amidową i grupę halogenową (taką jak brom, chlor lub jod).
Przykłady imidazolowego kompleksu rutenu obejmują [Ru(imidazol)6], [Ru(4-metyloimidazol)6], [Ru(4-fenyloimidazol)6], [Ru(4-aminoimidazol)6], [Ru(4-hydroksyimidazol)6], [Ru(4-karboksyimidazol)6] i [Ru(4-bromoimidazol)6].
Aminokwas obejmuje np. argininę (L-Arg). Kompleks argininowy rutenu posiada na ogół zaletę dobrej rozpuszczalności. Mieszany ligand może być kombinacją związków bipirydylowych i związków imidazolowych lub kombinacją związków bipirydylowych i aminokwasu, taką jak [Ru(imidazol)2(bipirydyl)2] lub [Ru(L-Arg)2(bipirydyl)2]. Użycie mieszanego ligandu może nadać kompleksowi różne właściwości, np. arginina polepsza rozpuszczalność kompleksu.
Kompleks osmu
Przykłady ligandu w kompleksie osmu obejmują amoniak, związek bipirydylowy, związek imidazolowy, związek fenantrolinowy, związek etylenodiaminowy, aminokwas, związek triazynowy, związek bichinolinowy, związek pirydylazowy, związek nitrozowy, związek oksynowy, związek benzotiazolowy, związek acetyloacetonowy, związek antrachinonowy, związek ksantenowy, kwas szczawiowy i pochodną każdego z tych związków. Można użyć mieszany ligand z dwoma lub więcej rodzajami tych ligandów.
Dla związku bipirydylowego liczba koordynacyjna wynosi 6. Związek bipirydylowy może być niepodstawiony lub podstawiony. Wprowadzenie podstawnika umożliwia kontrolę, np. lepkości i potencjału utleniająco-redukującego kompleksu. Przykłady pozycji podstawnika obejmują pozycję 4,4' i pozycję 5,5'. Przykłady podstawnika obejmują grupę alkilową (taką jak grupa metylowa, grupa etylowa lub grupa propylowa), grupę arylową, grupę allilową, grupę fenylową, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową (taką jak grupa metoksylowa lub grupa etoksylowa), grupę karboksylową, grupę karbonylową, grupę sulfonową, grupę sulfonylową, grupę nitrową, grupę nitrozową, pierwszorzędową aminę, drugorzędową aminę, trzeciorzędową aminę, grupę aminową, grupę acylową, grupę amidową i grupę halogenową (taką jak brom, chlor lub jod).
Przykłady bipirydylowego kompleksu osmu obejmują [Os(bipirydyl)3], [Os(4,4'-dimetylo-2,2'-bipirydyl)3], [Os(4,4'-difenylo-2,2'-bipirydyl)3], [Os(4,4'-diamino-2,2'-bipirydyl)3], [Os(4,4'-dihydroksy-2,2'-bipirydyl)3], [Os(4,4'-dikarboksy-2,2'-bipirydyl)3], [Os(4,4'-dibromo-2,2'-bipirydyl)3], [Os(5,5'-dimetylo-2,2'-bipirydyl)3], [Os(5,5'-difenylo-2,2'-bipirydyl)3], [Os(5,5'-diamino-2,2'-bipirydyl)3], [Os(5,5'-dihydroksy-2,2'-bipirydyl)3], [Os(5,5'-dikarboksy-2,2'-bipirydyl)3] i [Os(5,5'-dibromo-2,2'-bipirydyl)3].
Dla związku imidazolowego liczba koordynacyjna wynosi 6. Związek imidazolowy może być niepodstawiony lub podstawiony. Wprowadzenie podstawnika umożliwia kontrolowanie, np. rozpuszczalności i potencjału utleniająco-redukującego kompleksu. Przykłady pozycji podstawnika obejmują pozycję 2, pozycję 4 i pozycję 5. Przykłady podstawnika obejmują grupę alkilową (taką jak grupa metylowa, grupa etylowa lub grupa propylowa), grupę arylową, grupę allilową, grupę fenylową, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową (taką jak grupa metoksylowa lub grupa etoksylowa), grupę karboksylową, grupę karbonylową, grupę sulfonową, grupę sulfonylową, grupę nitrową, grupę nitrozową, pierwszorzędową aminę, drugorzędową aminę, trzeciorzędową aminę, grupę aminową, grupę acylową, grupę amidową i grupę halogenową (taką jak brom, chlor lub jod).
PL 213 316 B1
Przykłady imidazolowego kompleksu osmu obejmują [Os(imidazol)6], [Os(4-metylimidazol)6],
[Os(4-fenylo-imidazol)6], [Os(4-aminoimidazol)6], [Os(4-hydroksyimidazol)6], [Os(4-karboksyimidazol)6] i [Os(4-bromoimidazol)6].
Aminokwas obejmuje np. argininę (L-Arg). Argininowy kompleks osmu posiada zaletę dobrej rozpuszczalności. Mieszany ligand może być kombinacją związków bipirydylowych i związków imidazolowych lub kombinacją związków bipirydylowych i aminokwasu, taką jak [Os(imidazol)2(bipirydyl)2] lub [Os(L-Arg)2(bipirydyl)2]. Użycie mieszanego ligandu może nadać kompleksowi różne właściwości, np. arginina polepsza rozpuszczalność kompleksu.
Kompleks miedzi
Przykłady ligandu w kompleksie miedzi obejmują amoniak, związek bipirydylowy, związek imidazolowy, związek fenantrolinowy, związek etylenodiaminowy, aminokwas, związek triazynowy, związek bichinolinowy, związek pirydazolowy, związek nitrozowy, związek oksynowy, związek benzotiazolowy, związek acetyloacetonowy, związek antrachinonowy, związek ksantenowy, kwas szczawiowy i pochodną każdego z tych związków. Można stosować mieszany ligand z dwoma lub więcej rodzajami tych ligandów.
Dla związku bipirydylowego liczba koordynacyjna wynosi 4 lub 6. Z punktu widzenia trwałości, związek bipirydylowy powinien być koordynowany w kompleksie w dwóch pozycjach. Związek bipirydylowy może być niepodstawiony lub podstawiony. Wprowadzenie podstawnika umożliwia kontrolowanie, np. rozpuszczalności i potencjału utleniająco-redukującego kompleksu. Przykłady pozycji podstawnika obejmują pozycję 4,4' i pozycję 5,5'. Przykłady podstawnika obejmują grupę alkilową (taką jak grupa metylowa, grupa etylowa lub grupa propylowa), grupę arylową, grupę allilową, grupę fenylową, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową (taką jak grupa metoksylowa lub grupa etoksylowa), grupę karboksylową, grupę karbonylową, grupę sulfonową, grupę sulfonylową, grupę nitrową, grupę nitrozową, pierwszorzędową aminę, drugorzędową aminę, trzeciorzędową aminę, grupę aminową, grupę acylową, grupę amidową i grupę halogenową (taką jak brom, chlor lub jod).
Przykłady bipirydylowego kompleksu miedzi obejmują [Cu(bipirydyl)2], [Cu(4,4'-dimetylo-2,2'-bipirydyl)2], [Cu(4,4'-difenylo-2,2'-bipirydyl)2], [Cu(4,4'-diamino-2,2'-bipirydyl)2], [Cu(4,4'-dihydroksy-2,2'-bipirydyl)2], [Cu(4,4'-dikarboksy-2,2'-bipirydyl)2], [Cu(4,4'-dibromo-2,2'-bipirydyl)2], [Cu(5,5'-dimetylo-2,2'-bipirydyl)2], [Cu(5,5'-difenylo-2,2'-bipirydyl)2], [Cu(5,5'-diamino-2,2'-bipirydyl)2], [Cu(5,5'-dihydroksy-2,2'-bipirydyl)2], [Cu(5,5-dikarboksy-2,2'-bipirydyl)2], [Cu(5,5'-dibromo-2,2'-bipirydyl)2], [Cu(bipirydyl)3], [Cu(4,4'-dimetylo-2,2'-bipirydyl)3], [Cu(4,4'-difenylo-2,2'-bipirydyl)3], [Cu(4,4'-diamino-2,2'-dipirydyl)3], [Cu(4,4'-dihydroksy-2,2'-bipirydyl)3], [Cu(4,4'-dikarboksy-2,2'-bipirydyl)3], [Cu(4,4'-dibromo-2,2'-bipirydyl)3], [Cu(5,5'-dimetylo-2,2'-bipirydyl)3], [Cu(5,5'-difenylo-2,2'-bipirydyl)3], [Cu(5,5'-diamino-2,2'-bipirydyl)3], [Cu(5,5'-dihydroksy-2,2'-bipirydyl)3], [Cu(5,5'-dikarboksy-2,2'-bipirydyl)3] i [Cu(5,5'-dibromo-2,2'-bipirydyl)3].
Dla związku imidazolowego liczba koordynacyjna wynosi 4. Związek imidazolowy może być niepodstawiony lub podstawiony. Wprowadzenie podstawnika umożliwia kontrolowanie, np. rozpuszczalności i potencjału utleniająco-redukującego kompleksu. Przykłady pozycji podstawnika obejmują pozycję 2, pozycję 4 i pozycję 5. Przykłady podstawnika obejmują grupę alkilową (taką jak grupa metylowa, grupa etylowa lub grupa propylowa), grupę arylową, grupę allilową, grupę fenylową, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową (taką jak grupa metoksylowa lub grupa etoksylowa), grupę karboksylową, grupę karbonylową, grupę sulfonową, grupę sulfonylową, grupę nitrową, grupę nitrozową, pierwszorzędową aminę, drugorzędową aminę, trzeciorzędową aminę, grupę aminową, grupę acylową, grupę amidową i grupę halogenową (taką jak brom, chlor lub jod).
Przykłady imidazolowego kompleksu miedzi obejmują [Cu(imidazol)4], [Cu(4-metyloimidazol)4], [Cu(4-fenyloimidazol)4], [Cu(4-aminoimidazol)4], [Cu(4-hydroksyimidazo)4], [Cu(4-karboksyimidazol)4] i [Ru(4-bromoimidazol)4].
Aminokwas obejmuje np. argininę (L-Arg). Zaletą argininowego kompleksu miedzi jest na ogół dobra rozpuszczalność. Mieszany ligand może być kombinacją związków bipirydylowych i związków imidazolowych lub kombinacją związków bipirydylowych i aminokwasu, taką jak [Cu(imidazol)2(bipirydyl)2] lub [Cu(L-Arg)2(bipirydyl)2]. Zastosowanie mieszanego ligandu może nadać kompleksowi różne właściwości, np. arginina polepsza rozpuszczalność kompleksu.
Powyższy opis kompleksów metali przejściowych oparto na rodzaju metalu przejściowego, a niniejszy wynalazek nie ogranicza się do niego. Poniżej kompleksy metali przejściowych zostaną opisane w oparciu o ich ligandy.
PL 213 316 B1
Ligand zawiera atomy koordynacyjne N, O i S i ma w cząsteczce takie grupy jak =N-OH, -COOH, -OH, -SH, >C=O. Przykładami kompleksów metali zawierającymi ten rodzaj ligandu są chelat NN, chelat NO, chelat NS, chelat OO, chelat OS, chelat SS (dwudonorowy), chelat N (jednodonorowy) i chelat NNN (trójdonorowy). Kombinacja jest różnorodna. Gdy ligand ma podwójne wiązanie, Cu, Fe, Ru i Os kompleksu mają tendencję do posiadania funkcji przenoszenia/przyjmowania elektronów. Korzystnie jest, gdy ligand ma pierścień aromatyczny. Jak opisano powyżej, do ligandu można wprowadzić różne podstawniki. Na przykład wprowadzenie grupy sulfonowej może polepszyć rozpuszczalność kompleksu metalu. Kompleks metalu można tworzyć przez mieszanie dwóch lub więcej rodzajów ligandów i stosować jako kompleks z ligandem mieszanym. Na przykład, gdy jeden z ligandów jest aminokwasem, kompleks metalu może mieć dobre powinowactwo z enzymem. Ponadto, można przyłączać różne atomy chlorowców (takich jak Cl, F, Br i J) aby zajęły część miejsca centralnego metalu. Poniższe stanowią przykłady kompleksów metali przejściowych, które sklasyfikowano według typu koordynacji.
Postać koordynacyjna NN
Pochodna fenantrolinowa
Cu + 1,10-fenantrolina
Fe + 1,10-fenantrolina
Cu + batofenantrolina
Fe + batofenantrolina
Cu + kwas batofenantrolinosulfonowy
Fe + kwas batofenantrolinosulfonowy
Pochodna bipirydylowa
Cu + 2,2'-bipirydyl
Fe + 2,2'-bipirydyl
Fe + 4,4'-diamino-2,2'-bipirydyl
Ru + 4,4'-diamino-2,2'-bipirydyl
Pochodna triazynowa
Cu + TPTZ(2,4,6-tripirydylo-S-triazyna)
Fe + TPTZ(2,4,6-tripirydylo-S-triazyna)
Fe + PDTS(3-(2-pirydylo)-5,6-bis(4-sulfofenylo)-1,2,4-triazyna)
Pochodna bichinolinowa
Cu + kuproina(2,2'-bichinolina)
Pochodna pirydyloazowa
Fe + nitro-PAPS(2-(5-nitro-2-pirydyloazo)-5-[N-n-propylo-N-(3-sulfopropylo)amino]fenol)
Postać koordynacyjna NO
Fe + nitrozo-PSAP(2-nitrozo-5-[N-n-propylo-N-(3-sulfopropylo)amino]fenol)
Fe + nitrozo-ESAP(2-nitrozo-5-[N-etylo-N-(3-sulfopropylo)amino]fenol)
Fe + 1-nitrozo-2-naftol
Postać koordynacyjna NS
Fe + kwas 2-amino-4-tiazolooctowy
Postać koordynacyjna OO
Fe + kwas 1,2-naftochinono-4-sulfonowy
Postać mieszanego ligandu
Os + Cl, imidazol, 4,4'-dimetylo-2,2'-bipirydyl
Os + imidazol, 4,4'-dimetylo-2,2'-bipirydyl
Cu + L-Arginina, 2,2'-bipirydyl
Cu + etylenodiamina, 2,2-bipirydyl
Cu + imidazol, 2,2'-bipirydyl
Odczynnik kolorymetryczny według niniejszego wynalazku nie jest szczególnie ograniczony i może być chlorkiem 2-(4-jodofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-fenylo-2H-tetrazoliowym (INT), bromkiem 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H-tetrazoliowym (MTT),
3,3'-(chlorkiem 1,1'-bifenylo-4,4'-diilo)-bis(2,5-difenylo-2H-tetrazoliowym (Neo-TB), chlorkiem 3,3'-[3,3'-dimetoksy-(1,1'-bifenylo-4,4'-diilo]-bis[2-(4-nitrofenylo)-5-fenylo-2H-tetrazoliowym (Nitro-TB),
3,3'-[chlorkiem 3,3'-dimetoksy-(1,1'-bifenylo)-4,4'-diilo]-bis(2,5-difenylo-2H-tetrazoliowym) (TB)
PL 213 316 B1 solą monosodową 2-(4-jodofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-(2,4-disulfofenylo)-2H-tetrazolium (WST-1), solą monosodową 2-(4-jodofenylo)-3-(2,4-dinitrofenylo)-5-(2,4-disulfofenylo)-2H-tetrazolium (WST-3),
2-benzotiazolilo-3-(4-karboksy-2-metoksyfenylo)-5-[4-(2-sulfoetylokarbamoilo)fenylo]-2H-tetrazolium (WST-4), solą disodową 2,2'-dibenzotiazolilo-5,5'-bis[4-di(2-sulfoetylo)karbamoilofenylo]-3,3'-(3,3'-dimetoksy-4,4'-bifenyleno)ditetrazolium (WST-5), solą monosodową 2-(2-metoksy-4-nitrofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-(2,4-disulfofenylo)-2H-tetrazolium (WST-8), bromkiem 2-(2-benzotiazolilo)-3,5-difenylotetrazoliowym, bromkiem 2-(2-benzotiazolilo)-3-(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowym, chlorkiem 2,3-bis(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowym nadchloranem 2,3-di(4-nitrofenylo)tetrazolium, chlorkiem 3-(3-nitrofenylo)-5-metylo-2-fenylotetrazolium, chlorkiem 3-(4-nitrofenylo)-5-metylo-2-fenylotetrazolium, kompleksem żelaza lub kompleksem miedzi. Kompleks żelaza i kompleks miedzi, które działają jako czynnik pośredniczący, można stosować również jako odczynnik kolorymetryczny w niniejszym wynalazku. Jak opisano powyżej, przykłady kompleksów miedzi obejmują bipirydylowy kompleks miedzi, imidazolowy kompleks miedzi, kompleks miedzi z aminokwasem (np. argininą), imidazolowo-bipirydylowy kompleks miedzi i imidazolowo-aminokwasowy kompleks miedzi. Barwa kompleksu miedzi zmienia się dzięki przeniesieniu elektronu, z błękitnej (Cu2+) na czerwono- brązową (Cu+). Gdy kompleks miedzi stosuje się jako odczynnik kolorymetryczny, można użyć jako czynnik pośredniczący kompleks dowolnego metalu przejściowego, inny niż kompleks miedzi, przy czym korzystny jest kompleks osmu i kompleks rutenu.
Sposób analizy kolorymetrycznej według niniejszego wynalazku stosuje się w próbce do badań. W tym przypadku stosuje się kompleks osmu jako czynnik pośredniczący, MTT stosuje się jako odczynnik kolorymetryczny, a glukozę stosuje się jako analit. Inne anality, takie jak cholesterol, analizuje się w zasadzie w taki sam sposób, z tym wyjątkiem, że oksydoreduktazę zmienia się w zależności od każdego z analitów.
Po pierwsze, otrzymuje się kompleks osmu. Kompleks osmu może być produktem dostępnym w handlu. Alternatywnie, można go wytworzyć dowolną metodą opisaną w następujących przykładach. Kompleks osmu rozpuszcza się w roztworze buforu, a następnie rozpuszcza się MTT, dodatki (np. środek wiążący) i dehydrogenazę glukozową (GDH), co daje roztwór odczynnika. Roztwór buforu może być buforem fosforanowym, buforem Good'a lub tym podobnym. Stężenie kompleksu osmu w stosunku do całkowitego roztworu buforu sięga np. od 1 do 10% wagowych. Przykłady środka wiążącego obejmują hydroksypropylocelulozę (HPC), alkohol poliwinylowy (PVA), poliwinylopirolidon (PVP), poliakryloamid i albuminę z surowicy cielęcej (BSA), przy czym korzystna jest HPC. Stężenie środka wiążącego sięga, np. od 0,5 do 5% wagowych. Stężenie GDH sięga, np. od 1000 do 50000 U/ml. Stężenie MTT nie jest szczególnie ograniczone. Porowaty arkusz (np. bibułę filtracyjną) impregnuje się za pomocą roztworu odczynnika i suszy, wytwarzając w ten sposób próbkę do analizy glukozy. Korzystnie jest przed impregnowaniem roztworem odczynnika impregnować porowaty arkusz roztworem nieorganicznego żelu i wysuszyć. Nieorganiczny żel może być smektyczny lub temu podobny. Stężenie żelu nieorganicznego w roztworze sięga na przykład od 1 do 5% wagowych, korzystnie od 1 do 3% wagowych, a jeszcze korzystniej od 1,5 do 2% wagowych. Roztwór nieorganicznego żelu może również zawierać amfoteryczny środek powierzchniowo czynny, taki jak CHAPS. Stężenie amfoterycznego środka powierzchniowo czynnego względem całkowitego roztworu żelu nieorganicznego sięga np.
od 0,1 do 2% wagowych, korzystnie 0,1 do 1% wagowego, a jeszcze korzystniej 0,2 do 0,4% wago3 wego. Ilość nieorganicznego żelu impregnowanego na porowaty arkusz sięga np. od 1 do 50 mg/cm3, 33 korzystnie 10 do 30 mg/cm3, a jeszcze korzystniej 15 do 20 mg/cm3 mierząc w stosunku do objętości pustych przestrzeni w porowatym arkuszu. Porowaty arkusz może być niesymetrycznie porowatą folią, w której wielkość porów zmienia się wraz z grubością lub w kierunku powierzchni arkusza. Gdy na tester nakropli się próbkę zawierającą glukozę (np. krew), MTT wytwarza barwę zależną od stężenia glukozy. Tak więc można wykonać analizę jakościową i ilościową mierząc intensywność wytworzonej barwy. Czas wymagany na analizę wynosi około 1 do 3 sekund od nakroplenia próbki. Jeżeli próbka jest impregnowana żelem nieorganicznym, barwa może być bardziej jednorodna i trwała.
Żel nieorganiczny jest korzystnie pęczniejącym iłem nieorganicznym. Pośród pęczniejących iłów nieorganicznych korzystniejsze są bentonit, smektyt, wermikulit lub syntetyczna mika fluorowa. Korzystny jest zwłaszcza syntetyczny smektyt, taki jak syntetyczny hektoryt lub syntetyczny saponit albo
PL 213 316 B1 syntetyczna mika (naturalna mika jest na ogół nie pęczniejącym nieorganicznym iłem), taka jak pęczniejąca syntetyczna mika (lub mika Na), jak syntetyczna mika fluorowa.
Sposób analizy kolorymetrycznej według niniejszego wynalazku stosuje się również do analizy w układzie ciekłym. W takim przypadku stosuje się kompleks osmu jako czynnik pośredniczący, MTT stosuje się jako odczynnik kolorymetryczny, a glukozę stosuje się jako analit. Inne anality, takie jak cholesterol analizuje się w zasadzie w ten sam sposób z tym wyjątkiem, że oksydoreduktaza zmienia się zależnie od każdego z analitów.
Roztwór odczynnika otrzymuje się przez rozpuszczenie kompleksu osmu, GDH i MTT w roztworze buforu. Chociaż można je rozpuścić w wodzie, korzystny jest roztwór buforowy. Wartość pH roztworu buforowego sięga np. od 6 do 8, a korzystnie od 6,5 do 7. Stężenie kompleksu osmu sięga np. od 0,1 do 60 mM, korzystnie 0,2 do 10 mM, a korzystniej 0,3 do 0,6 mM. Stężenie GDH sięga np. od 10 do 1000 U/ml, korzystnie 50 do 500 U/ml, a korzystniej 100 do 200 U/ml. Stężenie MTT nie jest szczególnie ograniczone.
Gdy próbkę zawierającą glukozę (np. krew) doda się do roztworu odczynnika, roztwór odczynnika wytwarza barwę w zależności od stężenia glukozy, w krótkim czasie, np. 5 sekund lub mniej. Zmianę tę można obserwować wizualnie lub mierzyć za pomocą optycznego urządzenia pomiarowego, takiego jak spektrofotometr. Ilość dodawanej próbki sięga np. od 1 do 100 μ|, korzystnie 3 do 10 μ|, a korzystniej 5 do 10 μΐ przy 1 ml roztworu odczynnika.
P r z y k ł a d y
Poniżej zostaną opisane przykłady niniejszego wyna|azku. PQQ oznacza piro|ochino|inochinon, a inne odczynniki opisano szczegółowo w następującej tabeli.
| Odczynnik | Wytwórca | Uwaga (nazwa, itd.) |
| PQQGDH | TOYOBO, Co., Ltd. | Dehydrogenaza PQQ-glukozowa |
| GOD | Sigma | Oksydaza glukozowa typu X-s |
| Oksydaza pirogronianowa | Boehringer Mannheim | |
| MTT | DOJINDO LABORATORIES | bromek 3(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H-tetrazolium |
| WST-4 | DOJINDO LABORATORIES | 2-benzotiazolilo-3-(4-karboksy-2- -metoksyfenylo)-5-[4-(2-sulfoetylo- karbamoilo)fenylo]-2H-tetrazolium |
| WST-5 | DOJINDO LABORATORIES | 2,2'-dibenzotiazolilo-5,5'-bis[4-di(2- -sulfoetylo)karbamoilofenylo]-3,3'-(3,3'- -dimetoksy-4,4'-bifenyleno)ditetrazo- lium, sól disodowa |
| Glukoza | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | D(+)-glukoza |
| Kwas pirogronowy | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | Monohydrat pirogronianu litu |
P r z y k ł a d 1
Zsyntezowano komp|eks osmu [OsC|(Him)(dmbpy)2]. Najpierw ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną 2,00 g (4,56 mmo|a) (NH4)2[OsC|6] i 1,68 g (9,11 mmo|a) dimety|obipirydy|u (dmbpy) w g|iko|u ety|enowym (60 m|) przez 1 godzinę w strumieniu azotu. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodano w ciągu 30 minut 1M roztwór (120 ml) wodorosiarczynu sodu, a następnie chłodzono w łaźni z lodem przez 30 minut. Tak otrzymane osady sączono pod obniżonym ciśnieniem i dokładnie przemyto wodą (500 do 1000 ml). Następnie osady przemyto dwukrotnie eterem dietylowym, a potem suszono pod obniżonym ciśnieniem. Tak otrzymano 1,5 do 1,7 g [OsCl2(d mbpy)2]. Następnie 1,56 g (2,60 mmola) powstałego [OsC|2(dmbpy)2] i 0,36 g (5,2 mmo|a) imidazo|u (Him) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w mieszanym rozpuszczalniku woda/metanol (50 ml) przez 2 godziny w strumieniu azotu. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodano nasycony roztwór NaCl (300 m|). Tak otrzymane osady odsączono pod obniżonym ciśnieniem, przemyto nasyconym roztworem NaCl i suszono pod obniżonym ciśnieniem. Tak otrzymano [OsC|(Him)(dmbpy)2]C|2. [OsC|(Him)(dmbpy)2]C|2 rozpuszczono w możliwie jak najmniejszej ilości acetonitrylu/metano|u (1:1, v/v) i oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej (absorbent: aktywowany tlenek glinu, faza rozwijająca: acetonitry|/metano|). Rozpuszcza|nik odparowano, pozostałość rozpuszczono w możliwie najmniejszej
PL 213 316 B1 ilości acetonu i ponownie wytrącono eterem dietylowym. Tak otrzymane osady przesączono i suszono pod obniżonym ciśnieniem, co dało oczyszczony [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2.
Otrzymano następujący roztwór odczynnika zawierający kompleks osmu. Najpierw umieszczono 5 μΐ roztworu glukozy (GLU) o różnych stężeniach (0,200,400,600 mg/100 ml) w naczynku (wykonanym z polimetakrylanu) o długości ścieżki optycznej 10 mm. Następnie dodano 1000 μΐ roztworu odczynnika i natychmiast zmierzono absorbancję przy długości fali 600 nm. Fig. 1 pokazuje wyniki. Wykres wykazuje, że barwa powstawała w zależności od stężenia glukozy. Ponieważ reakcję przeprowadzono szybko, całkowite zużycie substratu w zasadzie zajęło 2 sekundy.
Skład roztworu odczynnika
MTT (DOJINDO LABORATORIES) 0,5 mM
[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2 0,1 mM
PIPES (pH 7,0) 40 mM
PQQGDH 200 U/ml
P r z y k ł a d 2
Otrzymano następujący roztwór odczynnika zawierający kompleks osmu. Najpierw umieszczono 5 μΙ roztworu glukozy (GLU) o różnych stężeniach (0,200,400,600 mg/100 ml) w naczynku (wyk onanym z polimetakrylanu) o długości ścieżki optycznej 10 mm. Następnie dodano 1000 μΙ roztworu odczynnika i natychmiast zmierzono absorbancję przy długości fali 600 nm. Fig. 2 pokazuje wyniki. Wykres wykazuje, że barwa powstawała w zależności od stężenia glukozy. Ponieważ reakcję przeprowadzono szybko, całkowite zużycie substratu w zasadzie zajęło 1 sekundę.
Skład roztworu odczynnika
WST-5 (DOJINDO LABORATORIES) 0,5 mM
[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2 0,1 mM
PIPES (pH 7,0) 40 mM
PQQGDH 200 U/ml
P r z y k ł a d 3
Otrzymano następujący roztwór odczynnika zawierający kompleks rutenu. Najpierw umieszczono 5 μΙ roztworu glukozy (GLU) o różnych stężeniach (0,200,400,600 mg/100 ml) w naczynku (wyk onanym z polimetakrylanu) o długości ścieżki optycznej 10 mm. Następnie dodano 1000 μΙ roztworu odczynnika i natychmiast zmierzono absorbancję przy długości fali 600 nm. Fig. 3 pokazuje wyniki. Wykres wykazuje, że barwa powstawała w zależności od stężenia glukozy. Ponieważ reakcję przeprowadzono szybko, całkowite zużycie substratu w zasadzie zajęło 2 sekundy.
Skład roztworu odczynnika
WST-5 (DOJINDO LABORATORIES) 0,5 mM
[Ru(NH3)6]Cl3 (Aldrich) 10 mM
PIPES (pH 7,0) 40 mM
PQQGDH 200 U/ml
P r z y k ł a d 4
CuCl2 i 2,2'-bipirydyl (bpy) zmieszano w stosunku molowym 1:2 w łaźni wodnej, w około 80°C i zsyntezowano uzyskując [Cu(bpy)2]Cl2. Otrzymano następujący roztwór odczynnika tego kompleksu. Najpierw umieszczono 5 μl roztworu glukozy (GLU) o różnych stężeniach (0,200,400,600 mg/100 ml) w naczynku (wykonanym z polimetakrylanu) o długości ścieżki optycznej 10 mm. Następnie dodano 1000 μl roztworu odczynnika i natychmiast zmierzono absorbancję przy długości fali 600 nm. Fig. 4 pokazuje wyniki. Wykres wykazuje, że barwa powstawała w zależności od stężenia glukozy. Ponieważ reakcję przeprowadzono szybko, całkowite zużycie substratu w zasadzie zajęło 2 sekundy.
Skład roztworu odczynnika
WST-5 (DOJINDO LABORATORIES) 0,5 mM
[Cu(bpy)2]Cl2 1 mM
PIPES (pH 7,0) 40 mM
PQQGDH 200 U/ml
P r z y k ł a d 5
Otrzymano kompleks miedzi stosując różne ligandy. Chlorek miedzi (II) i każdy z następujących ligandów mieszano w stosunku molowym 1:2, rozpuszczano w oczyszczonej wodzie i inkubowano przez 10 minut w łaźni wodnej w około 80°C tak, że ligandy koordynowały się z metalem kompleksu. W ten sposób otrzymano roztwór kompleksu.
PL 213 316 B1
| Ligand | Wytwórca | Kompleks |
| 1,10-fenantrolina | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | [Cu(1,10-fenantrolina)2] |
| batofenantrolina | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | [Cu(batofenantrolina)2] |
| batofenantrolina sól disodowa kwasu sulfonowego | Nacalai Tesque, Inc. | [Cu(batofenantrolina kwas sulfonowy)2] |
| 2,2'-bipirydyl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | [Cu(2,2'-bipirydyl)2] |
| TPTZ | DOJINDO LABORATORIES | [Cu(TPTZ)2] |
| Kuproina | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | [Cu(kuproina)2] |
P r z y k ł a d 6
Otrzymano kompleks miedzi z mieszanym ligandem stosując każdy z następujących ligandów i związki pirydylowe. Miedź, każdy z następujących ligandów i związki bipirydylowe mieszano w stosunku molowym 1:2:1, rozpuszczano w oczyszczonej wodzie i inkubowano przez 10 minut w łaźni wodnej w około 80°C tak, aby ligandy i związki bipirydylowe skoordynowały się z metalem. W ten sposób otrzymano roztwór kompleksu.
| Ligand | Wytwórca | Kompleks |
| L-arginina | Nacalai Tesque, Inc. | [Cu(L-Arg)(bpy)] |
| etylenodiamina | Nacalai Tesque, Inc. | [Cu(en)(bpy)] |
| imidazol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | [Cu(Him)(bpy)] |
P r z y k ł a d 7
Otrzymano kompleks miedzi stosując różne ligandy. Chlorek żelaza (III) i każdy z następujących ligandów mieszano w stosunku molowym 1:3, rozpuszczono w oczyszczonej wodzie i inkubowano przez 10 minut w łaźni wodnej w około 80°C tak, aby ligandy skoordynowały się z metalem. W ten sposób otrzymano roztwór kompleksu.
| Ligand | Wytwórca | Kompleks |
| 1,10-fenantrolina | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | [Fe(1,10-fenantrolina)3] |
| batofenantrolina | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | [Fe(batofenantrolina)3] |
| Kwas batofenantrolinsulfonowy, sól disodowa | Nacalai Tesque, Inc. | [Fe(kwas batofenantrolinosulfonowy)3] |
| 2,2'-bipirydyl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | [Fe(2,2'-bipirydyl)3] |
| 4,4'-diamino-2,2'bipirydyl | Arkray, Inc. | [Fe(4,4'-fiamino-2,2'-bipirydyl)3] |
| TPTZ | DOJINDO LABORATORIES | [Fe(TPTZ)3] |
| PDTS | DOJINDO LABORATORIES | [Fe(PDTS)3] |
| nitro-PAPS | DOJINDO LABORATORIES | [Fe(nitrozo-PAPS)3] |
| nitrozo-ESAP | DOJINDO LABORATORIES | [Fe(nitrozo-ESAP)3] |
| 1-nitrozo-2-naftol | KANTO KAGAKU | [Fe(1-nitrozo-2-naftol)3] |
| Kwas 2-amino-4-tiazolooctowy | Lancaster | [Fe(kwas 2-amino-4-tiazolooctowy)3] |
| Kwas 1,2-naftochinono-4-sulfonowy | Nacalai Tesque, Inc. | [Fe(kwas 1,2-naftochinono-4-sulfonowy)3] |
| nitrozo-PSAP | DOJINDO LABORATORIES | [Fe(nitrozo-PSAP)3] |
PL 213 316 B1
P r z y k ł a d 8
W następujący sposób otrzymano dwa rodzaje kompleksów rutenu.
[Ru(NH3)6]
Dostępny w handlu kompleks rutenu (wytwarzany przez Aldrich, chlorek heksaaminorutenu (III)) rozpuszczono w wodzie otrzymując roztwór kompleksu [Ru(NH3)6].
[Ru(4,4'-diamino-2,2'-bipirydyl)3]
Ligand
Najpierw rozpuszczono wolno, w 120 ml stężonego kwasu siarkowego chłodzonego w łaźni z lodem, 11,8 g (63,0 mmola) N,N'-ditlenek 2,2'-bipirydylu (wytwarzany przez Aldrich) i powstały roztwór ogrzano do 100°C. Następnie roztwór stężonego kwasu siarkowego (100 ml) zawierający 64,0 g (630 mmola) azotanu potasu dodano wolno kroplami i mieszano, ogrzewając przez 1 godzinę. Po reakcji roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej, wylano na potłuczony lód i przesączono. Tak otrzymano stały N,N'-tlenek 4,4'-dinitro-2,2'-bipirydylu. Następnie 7,0 g (25 mM) N,N'-tlenku 4,4'-dinitro-2,2'-bipirydylu i 6,0 g 10% palladu na węglu zawieszono w etanolu (23 ml) w strumieniu argonu. Do tego roztworu dodano kroplami roztwór etanolu (47 ml) zawierający 6,3 g (126 mmoli) monohydratu hydrazyny, a następnie ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 8 godzin. Powstały roztwór ochłodzono i przesączono. Przesącz zatężono i oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym. Tak otrzymano 4,4'-diamino-2,2'-bipirydyl.
Synteza
Glikol etylenowy (10 mL) umieszczono w 50 ml kolbie dwuszyjnej i rozpuszczono w nim sukcesywnie, mieszając DA-bpy (0,2 g) i RuCl3 (0,1 g). Roztwór ogrzewano za pomocą czapy grzejnej mieszając energicznie w strumieniu azotu, a następnie ogrzewając do wrzenia pod chłodnica zwrotną przez około 4 godziny.
Oczyszczanie
Po mieszaniu w strumieniu N2 i ochłodzeniu przeniesiono roztwór do 100 ml jajowatej kolby i przemyto acetonem (5 mL) + eterem dietylowym (20 mL). To przemywanie acetonem (5 mL) + eterem dietylowym (20 mL) powtarzano do wystarczającego usunięcia rozpuszczalnika (glikolu etylenowego). Tak przemytą docelową substancję rozpuszczono w etanolu i wytrącono przez dodanie eteru dietylowego. Docelową substancję przesączono przemywając eterem dietylowym i suszono pod obniżonym ciśnieniem. Tak otrzymano stały [Ru(4,4'-diamino-2,2'-bipirydyl)3]. Tę stałą substancję rozpuszczono w wodzie uzyskując roztwór kompleksu.
P r z y k ł a d 9
W następujący sposób otrzymano dwa rodzaje kompleksów osmu.
[OsCl(Him)(dmbpy)2]
Synteza
Najpierw 2,00 g (4,56 mmola) (NH4)2[OsCl6] (wytworzony przez Aldrich) i 1,68 g (9,11 mmola) 4,4'-dimetylo-2,2'-bipirydylu (dmbpy, wytworzony przez Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w glikolu etylenowym (60 ml) przez 1 godzinę w strumieniu azotu. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodano w ciągu 30 minut 1M roztwór wodorosiarczynu sodu (120 ml), a następnie chłodzono w łaźni z lodem przez 30 minut. Tak otrzymane osady przesączono pod obniżonym ciśnieniem i odpowiednio przemyto wodą (500 do 1000 ml). Następnie osady przemyto dwukrotnie eterem etylowym, a potem suszono pod obniżonym ciśnieniem. Tak otrzymano 1,5 do 1,7 g [OsCl2(dmbpy)2]. Następnie 1,56 g (2,60 mmola) powstałego [OsCl2(dmbpy)2] i 0,36 g (5,2 mmola) imidazolu (Him) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w mieszanym rozpuszczalniku woda/metanol (50 ml) przez 2 godziny w strumieniu azotu. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodano nasycony roztwór NaCl (300 ml). Tak otrzymane osady przesączono pod obniżonym ciśnieniem, przemyto nasyconym roztworem NaCl i suszono pod obniżonym ciśnieniem. Tak otrzymano [OsCl(Him)dmbpy)2]Cl2.
Oczyszczanie
[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2 rozpuszczono w możliwie najmniejszej ilości acetonitrylu/metanolu (1:1, v/v) i oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej (absorbent: aktywowany tlenek glinu, faza rozwijająca: acetonitryl/metanol). Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość rozpuszczono w najmniejszej możliwej ilości acetonu i wytrącono ponownie eterem etylowym. Tak otrzymane osady przesączono i suszono pod obniżonym ciśnieniem, a następnie rozpuszczono w wodzie. Tak otrzymano roztwór kompleksu.
[Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2
PL 213 316 B1
Synteza
Najpierw 2,00 g (4,56 mmola) (NH4)2[OsCl6] i 1,68 g (9,11 mmola) dmbpy ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w glikolu etylenowym (60 ml) przez I godzinę w strumieniu azotu. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodano w ciągu 30 minut IM roztwór wodorosiarczynu sodu (120 ml), a następnie chłodzono w łaźni z lodem przez 30 minut. Tak otrzymane osady przesączono pod obniżonym ciśnieniem i odpowiednio przemyto wodą (500 do 1000 ml). Następnie osady przemyto dwukrotnie eterem dietylowym i suszono pod obniżonym ciśnieniem. Tak otrzymano 1,5 do 1,7 g [OsCl2(dmbpy)2]. Następnie 1,56 g (2,60 mmola) powstałego [OsCl2(dmbpy)2] i 0,36 g (5,2 mmola) imidazolu (Him) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w rozpuszczalniku 1,2-etanoditiolu (50 ml) przez 2 godziny w strumieniu azotu. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodano nasycony roztwór NaCl (300 ml). Tak otrzymane osady przesączono pod obniżonym ciśnieniem, przemyto nasyconym roztworem NaCl i suszono pod obniżonym ciśnieniem. Tak otrzymano [Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2.
Oczyszczanie
[Os(Him)2(dmbpy)2]CI2 rozpuszczono w najmniejszej możliwej ilości acetonitrylu/metanolu (1:1, v/v) i czyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej (absorbent: aktywowany tlenek glinu, faza rozwijająca: acetonitryl/metanol). Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość rozpuszczono w najmniejszej możliwej ilości acetonu i wytrącono ponownie eterem dietylowym. Tak otrzymane osady przesączono i suszono pod obniżonym ciśnieniem, a następnie rozpuszczono w wodzie. Tak otrzymano roztwór kompleksu.
P r z y k ł a d 10
Otrzymano roztwór odczynnika przez zmieszanie kompleksu, enzymu, odczynnika kolorymetrycznego i roztworu buforowego z następującą kompozycją. Kompleks był taki sam, jak zsyntezowany w powyższych przykładach. Jest tak również w następujących przykładach. Widmo roztworu odczynnika mierzono i określano jako ślepą próbę. Następnie do roztworu odczynnika dodawano glukozę w ilości równoważnej kompleksowi i mierzono widmo po zmianie barwy. Fig. 5 pokazuje wyniki. Wykres przedstawia widmo charakterystyczne dla zredukowanego WST-5, ponieważ kompleks metalu działał jako czynnik przenoszący elektrony redukując WST-5.
Kompozycja roztworu odczynnika
PQQ-GDH 50 U/ml [Ru(NH3)6] 0,8 mM
WST-5 0,2 mM
PIPES (pH 7,0) 50 mM
Triton X-100 0,5%
P r z y k ł a d 11
Roztwory odczynników otrzymywano przez zmieszanie kompleksu, enzymu, odczynnika kolorymetrycznego i roztworu buforowego z następującymi kompozycjami. Widmo każdego z roztworów odczynnika mierzono i określano jako ślepą próbę. Ponadto do każdego z roztworów odczynnika dodawano glukozę w ilości równoważnej kompleksowi i mierzono widmo po zmianie barwy. Fig. 6A i 6B pokazują wyniki. Obydwa wykresy przedstawiają widmo charakterystyczne dla zredukowanego MTT, ponieważ kompleks metalu działał jako czynnik przenoszący elektrony redukując MTT.
Kompozycja roztworu odczynnika 1 (Fig. 6A)
PQQ-GDH 50 U/ml
[Cu(1,10-fenatrolina)2] 1 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton X-100 0,5%
Kompozycja roztworu odczynnika 2 (Fig. 6B)
PQQ-GDH 50 U/ml
[Fe(batofenatrolina)3] 1 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton X-100 0,5% (batofenantrolina=4,7-difenylofenantrolina)
P r z y k ł a d 12
Roztwory odczynników otrzymywano przez zmieszanie kompleksu, enzymu, odczynnika kolorymetrycznego i roztworu buforowego z następującymi kompozycjami. Widmo każdego z roztworów
PL 213 316 B1 odczynnika mierzono i określano jako ślepą próbę. Następnie do roztworów odczynników dodawano glukozę w ilości równoważnej kompleksowi i mierzono widmo po zmianie barwy. Fig.7A i 7B pokazują wyniki. Obydwa wykresy przedstawiają widmo charakterystyczne dla zredukowanego MTT, ponieważ kompleks metalu działał jako czynnik przenoszący elektrony redukując MTT.
Kompozycja roztworu odczynnika 1 (Fig. 7A)
PQQ-GDH 50 U/ml
[Fe(2,2'-bipirydyl)3] 1 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton X-100 0,5%
Kompozycja roztworu odczynnika 2 (Fig. 7B)
PQQ-GDH 50 U/ml
[Fe(4,4'-diamino-2,2'-bipirydyl)3] 0,1 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton X-100 0,5%
P r z y k ł a d 13
Otrzymywano roztwór odczynnika przez zmieszanie kompleksu, enzymu, odczynnika kolorymetrycznego i roztworu buforowego z następującymi kompozycjami. Widmo roztworu odczynnika mierzono i określano jako ślepą próbę. Następnie do roztworu odczynnika dodawano glukozę w ilości równoważnej ilości kompleksu i mierzono widmo po zmianie barwy. Fig. 8 pokazuje wyniki. Wykres przedstawia widmo charakterystyczne dla zredukowanego MTT, ponieważ kompleks metalu działał jako czynnik przenoszący elektrony redukując MTT.
Kompozycja roztworu odczynnika
PQQ-GDH 50 U/ml
[Fe(TPTZ)3] 0,1 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton X-100 0,5% (TPTZ=2,4,6-tripirydylo-S-triazyna)
P r z y k ł a d 14
Roztwór odczynnika otrzymywano przez zmieszanie kompleksu, enzymu, odczynnika kolorymetrycznego i roztworu buforowego z następującymi kompozycjami. Widmo roztworu odczynnika mierzono i określano jako ślepą próbę. Następnie do roztworu odczynnika dodawano glukozę w ilości równoważnej kompleksowi i mierzono widmo po zmianie barwy. Fig. 9 pokazuje wyniki. Wykres przedstawia widmo charakterystyczne dla zredukowanego MTT, ponieważ kompleks metalu działał jako czynnik przenoszący elektrony redukując MTT.
Kompozycja roztworu odczynnika
PQQ-GDH 50 U/ml [Cu(kuproina)2] 1 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton X-100 0,5% (kuproina=2,2'-bichinolina)
P r z y k ł a d 15
Roztwór odczynnika otrzymywano przez zmieszanie kompleksu, enzymu, odczynnika kolorymetrycznego i roztworu buforowego z następującymi kompozycjami. Widmo roztworu odczynnika mierzono i określano jako ślepą próbę. Następnie do roztworu odczynnika dodawano glukozę w ilości równoważnej kompleksowi i mierzono widmo po zmianie barwy. Fig. 10 pokazuje wyniki. Wykres przedstawia widmo charakterystyczne dla zredukowanego MTT, ponieważ kompleks metalu działał jako czynnik przenoszący elektrony redukując MTT.
Kompozycja roztworu odczynnika
PQQ-GDH 50 U/ml
[Fe(nitro-PAPS)3] 0,02 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton X-100 0,5%
PL 213 316 B1
P r z y k ł a d 16
Roztwór odczynnika otrzymywano przez zmieszanie kompleksu, enzymu, odczynnika kolorymetrycznego i roztworu buforowego z następującymi kompozycjami. Widmo roztworu odczynnika mierzono i określano jako ślepą próbę. Następnie do roztworu odczynnika dodawano glukozę w ilości równoważnej kompleksowi i mierzono widmo po zmianie barwy. Fig. 11 pokazuje wyniki. Wykres przedstawia widmo charakterystyczne dla zredukowanego MTT, ponieważ kompleks metalu działał jako czynnik przenoszący elektrony redukując MTT.
Kompozycja roztworu odczynnika
PQQ-GDH 50 U/ml
[Fe(1-nitrozo-2-naftol)3] 0,1 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton X-100 0,5%
P r z y k ł a d 17
Roztwór odczynnika otrzymywano przez zmieszanie kompleksu, enzymu, odczynnika kolorymetrycznego i roztworu buforowego z następującymi kompozycjami. Widmo roztworu odczynnika mierzono i określano jako ślepą próbę. Następnie do roztworu odczynnika dodawano glukozę w ilości równoważnej kompleksowi i mierzono widmo po zmianie barwy. Fig. 12 pokazuje wyniki. Wykres przedstawia widmo charakterystyczne dla zredukowanego MTT, ponieważ kompleks metalu działał jako czynnik przenoszący elektrony redukując MTT.
Kompozycja roztworu odczynnika
PQQ-GDH 50 U/ml [Fe(kwas 2-amino-4-tiazolooctowy)3] 1 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton X-100 0,5%
P r z y k ł a d 18
Roztwór odczynnika otrzymywano przez zmieszanie kompleksu, enzymu, odczynnika kolorymetrycznego i roztworu buforowego z następującymi kompozycjami. Widmo roztworu odczynnika mierzono i określano jako ślepą próbę. Następnie dc roztworu odczynnika dodawano glukozę w ilości równoważnej kompleksowi i mierzono widmo po zmianie barwy. Fig. 13 pokazuje wyniki. Wykres przedstawia widmo charakterystyczne dla zredukowanego MTT, ponieważ kompleks metalu działał jako czynnik przenoszący elektrony redukując MTT.
Kompozycja roztworu odczynnika
PQQ-GDH 50 U/ml [Fe(kwas 1,2-naftochinono-4-sulfonowy)3] 1 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton X-100 0,5%
P r z y k ł a d 19
Roztwory odczynników otrzymywano przez zmieszanie kompleksu, enzymu, odczynnika kolorymetrycznego i roztworu buforowego z następującymi kompozycjami 1, 2. Widmo każdego z roztworów odczynnika mierzono i określano jako ślepą próbę. Następnie do każdego z roztworów odczynników dodawano glukozę w ilości równoważnej kompleksowi i mierzono widmo po zmianie barwy. Fig. 14A i 14B pokazują wyniki. Obydwa wykresy przedstawiają widmo charakterystyczne dla zredukowanego MTT, ponieważ kompleks metalu działał jako czynnik przenoszący elektrony redukując MTT.
| Kompozycja roztworu odczynnika I (Fig. 14A) | ||
| PQQ-GDH | 50 U/ml | |
| [OsCl(Him)(dmbpy)2] | 0,1 mM | |
| MTT | 1 mM | |
| PIPES (pH 7) | 50 mM | |
| Triton X-100 | 0,5% | |
| (Him - imidazol) | ||
| (dmbpy=4,4'-dimetylo-2,2'-bipirydyl) | ||
| Kompozycja roztworu odczynnika 2 (Fig. | 14B) | |
| PQQ-GDH | 50 U/ml |
PL 213 316 B1
[Os(Him)2(dmbpy)2] 0,1 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton X-100 0,5% (Him - imidazol) (dmbpy=4,4'-dimetylo-2,2'-bipirydyl)
P r z y k ł a d 20
Roztwór odczynnika otrzymywano przez zmieszanie kompleksu, enzymu, odczynnika kolorymetrycznego i roztworu buforowego z następującymi kompozycjami. Widmo roztworu odczynnika mierzono i określano jako ślepą próbę. Następnie do roztworu odczynnika dodawano glukozę w ilości równoważnej kompleksowi i mierzono widmo po zmianie barwy. Fig. 15 pokazuje wyniki. Wykres przedstawia widmo charakterystyczne dla zredukowanego MTT, ponieważ kompleks metalu działał jako czynnik przenoszący elektrony redukując MTT.
Kompozycja roztworu odczynnika
Oksydaza pirogronianowa 100 U/ml [OsCl(Him)(dmbpy)2] 0,2 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton X-100 0,5% (Him - imidazol) (dmbpy=4,4'-dimetylo-2,2'-bipirydyl)
P r z y k ł a d 21
Ten przykład udowodnił, że szybkość reakcji odczynnika można polepszyć zwiększając ilość enzymu. Dwie tkaniny siatkowe (10 cm x 10 cm) impregnowano odpowiednio roztworami odczynników (1 ml) mającymi następujące kompozycje 1 i 2 i suszono gorącym powietrzem. Tkaniny te przymocowano do folii z tereftalanu polietylenu (PET) i przycięto do określonego kształtu tworząc w ten sposób dwie próbki do badań o różnych ilościach enzymu. Jako próbki użyto roztwory referencyjne glukozy w surowicy (0,200,400,600 mg/dl) i każdą z próbek nakroplono na próbki do badań obserwując zmianę K/S po 30 minutach za pomocą urządzenia do pomiaru współczynnika odbicia (LED/długość fali 660 nm). Roztwory referencyjne glukozy w surowicy otrzymano w następujący sposób. Osocze ludzkiej krwi całkowicie zglikolizowano, zamrożono i rozmrożono w celu otrzymania surowicy. Następnie do tej surowicy dodano roztwór glukozy. Fig. 16Ά i 16B pokazują wyniki. Jak pokazano na wykresach roztwór odczynnika zawierający 5000 U/ml enzymu polepsza szybkość reakcji w porównaniu z roztworem odczynnika zawierającym 1000 U/ml, a reakcja przebiega do końca w około 5 sekund. Pomiar sygnałów w pobliżu 5 sekund, przy których reakcja wydaje się kończyć, umożliwia ilościowe oznaczanie glukozy. Nachylenie wykresu od początku do końca reakcji również można zastosować do ilościowego oznaczenia glukozy.
| Kompozycja roztworu odczynnika 1 (Fig. 16A) | ||
| PQQ-GDH | 1000 U/ml | |
| [OsCl(Him)(dmbpy)2] | 1 ml | |
| MTT | 30 mM | |
| PIPES (pH 6,5) | 80 mM | |
| MEGA-8 (DOJINDO LABORATORIES) | 1% | |
| Poliakryloamid | 0,1% | |
| BSA | 1% | |
| Kompozycja roztworu odczynnika 2 (Fig. | 16B) | |
| PQQ-GDH | 5000 U/ml | |
| [OsCl(Him)(dmbpy)2] | 1 ml | |
| MTT | 30 mM | |
| PIPES (pH 6,5) | 80 mM | |
| MEGA-8 (DOJINDO LABORATORIES) | 1% | |
| Poliakryloamid | 0,1% | |
| BSA | 1% | |
| Jak opisano powyżej, sposób analizy kolorymetrycznej według niniejszego wynalazku może |
służyć do prostej, szybkiej i niezawodnej analizy.
Claims (11)
1. Sposób analizy kolorymetrycznej, znamienny tym, że przenosi się elektron z analitu wybranego spośród glukozy, cholesterolu, kwasu moczowego, kwasu pirogronowego, kwasu mlekowego, kreatyny lub kreatyniny, do czynnika pośredniczącego poprzez zastosowanie dehydrogenazy lub oksydazy, przenosi się elektron z czynnika pośredniczącego do odczynnika kolorymetrycznego, który wytwarza barwę dzięki redukcji, oraz przeprowadza się analizę jakościową lub ilościową analitu poprzez pomiar barwy wytwarzanej w odczynniku kolorymetrycznym, przy czym jako czynnik pośredniczący stosuje się co najmniej jeden kompleks wybrany spośród kompleksu miedzi, kompleksu żelaza, kompleksu osmu i kompleksu rutenu, ligandem w kompleksie jest co najmniej jeden ligand wybrany spośród amoniaku, bipirydylu, imidazolu, fenantroliny, argininy, triazyny, bichinoliny, pirydyloazo, nitrozo, i każdego z tych związków podstawionego, w pozycji innej niż pozycja koordynacyjna ligandu, co najmniej jednym podstawnikiem wybranym z grupy składającej się z grupy alkilowej, grupy arylowej, grupy allilowej, grupy fenylowej, grupy hydroksylowej, grupy alkoksylowej, grupy karboksylowej, grupy karbonylowej, grupy sulfonowej, grupy sulfonylowej, grupy nitrowej, grupy nitrozowej, pierwszorzędowej aminy, drugorzędowej aminy, trzeciorzędowej aminy, grupy aminowej, grupy acylowej, grupy amidowej i grupy fluorowcowej, jako odczynnik kolorymetryczny stosuje się sól tetrazoliową.
2. Sposób analizy kolorymetrycznej według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się kompleks zawierający dwa lub więcej rodzajów ligandów.
3. Sposób analizy kolorymetrycznej według zastrz. 1, znamienny tym, że sól tetrazoliowa zawiera co najmniej jedną grupę wybraną z grupy nitrofenylowej, grupy tiazolilowej i grupy benzotiazolilowej.
4. Sposób analizy kolorymetrycznej według zastrz. 1, znamienny tym, że sól tetrazoliowa jest co najmniej jednym odczynnikiem kolorymetrycznym wybranym z grupy składającej się z MTT, INT, Neo-TB, Nitro-TB, TB, WST-1, WST-3, WST-4, WST-5, WST-8, bromku 2-(2-benzotiazolilo)-3,5-difenylotetrazoliowego, bromku 2-(2-benzotiazolilo)-3-(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowego, chlorku 2,3-bis(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowego, nadchloranu 2,3-di(4-nitrofenylo)tetrazoliowego, chlorku 3-(3-nitrofenylo)-5-metylo-2-fenylotetrazoliowego i chlorku 3-(4-nitrofenylo)-5-metylo-2-fenylotetrazoliowego.
5. Odczynnik stosowany w sposobie analizy kolorymetrycznej jak określono w zastrz. 1, znamienny tym, że składa się z:
dehydrogenazy lub oksydazy; czynnika pośredniczącego; i odczynnika kolorymetrycznego do wytwarzania barwy poprzez redukcję, w którym czynnikiem pośredniczącym jest co najmniej jeden kompleks wybrany spośród kompleksu miedzi, kompleksu żelaza, kompleksu osmu i kompleksu rutenu, ligandem w kompleksie jest co najmniej jeden ligand wybrany spośród amoniaku, bipirydylu, imidazolu, fenantroliny, argininy, triazyny, bichinoliny, pirydyloazo, nitrozo, i każdego z tych związków podstawionego, w pozycji innej niż pozycja koordynacyjna ligandu, co najmniej jednym podstawnikiem wybranym z grupy składającej się z grupy alkilowej, grupy arylowej, grupy allilowej, grupy fenylowej, grupy hydroksylowej, grupy alkoksylowej, grupy karboksylowej, grupy karbonylowej, grupy sulfonowej, grupy sulfonylowej, grupy nitrowej, grupy nitrozowej, pierwszorzędowej aminy, drugorzędowej aminy, trzeciorzędowej aminy, grupy aminowej, grupy acylowej, grupy amidowej i grupy fluorowcowej, odczynnikiem kolorymetrycznym jest sól tetrazoliowa.
6. Odczynnik według zastrz. 5, znamienny tym, że kompleks zawiera co najmniej dwa lub więcej rodzajów ligandów.
7. Odczynnik według zastrz. 5, znamienny tym, że sól tetrazoliowa ma co najmniej jedną grupę wybraną spośród grupy nitrofenylowej, grupy tiazolilowej i grupy benzotiazolilowej.
8. Odczynnik według zastrz. 5, znamienny tym, że sól tetrazoliowa jest co najmniej jednym odczynnikiem kolorymetrycznym wybranym z grupy składającej się z MTT, INT, Neo-TB, Nitro-TB, TB, WST-1, WST-3, WST-4, WST-5, WST-8, bromku 2-(2-benzotiazolilo)-3,5-difenylotetrazoliowego, bromku 2-(2-benzotiazolilo)-3-(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowego, chlorku 2,3-bis(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowego, nadchloranu 2,3-di(4-nitrofenylo)tetrazoliowego, chlorku 3-(3-nitrofenylo)-5-metylo-2-fenylotetrazoliowego i chlorku 3-(4-nitrofenylo)-5-metylo-2-fenylotetrazoliowego.
PL 213 316 B1
9. Odczynnik według zastrz. 5, znamienny tym, że analitem jest glukoza, cholesterol, kwas moczowy, kwas pirogronowy, kwas mlekowy, kreatyna lub kreatynina.
10. Próbka do badań, znamienna tym, że zawiera odczynnik określony w zastrz. 5 i korzystnie środek wiążący oraz porowaty arkusz, przy czym próbkę do badań stosuje się do badania próbek zawierających analit wybrany spośród glukozy, cholesterolu, kwasu moczowego, kwasu pirogronowego, kreatyny, kreatyniny i kwasu mlekowego, a środek wiążący obejmuje co najmniej jeden wybrany spośród hydroksypropylocelulozy, alkoholu poliwinylowego, poliwinylopirolidonu, poliakryloamidu i albuminy surowicy bydlęcej.
11. Próbka do badań według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera ponadto żel nieorganiczny.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001400380 | 2001-12-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL369143A1 PL369143A1 (pl) | 2005-04-18 |
| PL213316B1 true PL213316B1 (pl) | 2013-02-28 |
Family
ID=19189611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL369143A PL213316B1 (pl) | 2001-12-28 | 2003-01-06 | Sposób analizy kolorymetrycznej, odczynnik i próbka do badan |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7550273B2 (pl) |
| EP (2) | EP1457572B1 (pl) |
| JP (1) | JP4045323B2 (pl) |
| KR (2) | KR100693899B1 (pl) |
| CN (1) | CN1261588C (pl) |
| AT (2) | ATE426676T1 (pl) |
| AU (1) | AU2003201901B2 (pl) |
| CA (1) | CA2448128C (pl) |
| DE (2) | DE60334333D1 (pl) |
| ES (2) | ES2322990T3 (pl) |
| NZ (1) | NZ529279A (pl) |
| PL (1) | PL213316B1 (pl) |
| WO (1) | WO2003057905A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA200308519B (pl) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ529279A (en) | 2001-12-28 | 2005-12-23 | Arkray Inc | Method of colorimetry and reagent for use therein |
| US20050014213A1 (en) * | 2001-12-28 | 2005-01-20 | Kenji Nagakawa | Method of colorimetry and reagent for use therein |
| US7780828B2 (en) | 2004-01-07 | 2010-08-24 | Arkray, Inc. | Analytical instrument having improved arrangement of reagent section and analytical method |
| WO2009144881A1 (ja) * | 2008-05-16 | 2009-12-03 | パナソニック株式会社 | クレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス、及び測定装置、並びにそれらを用いた塩分量の測定方法、測定デバイス、及び測定装置 |
| EP2636750A1 (en) | 2012-03-06 | 2013-09-11 | Roche Diagniostics GmbH | Compatible solute ectoine as well as derivatives thereof for enzyme stabilization |
| WO2014180939A1 (en) | 2013-05-08 | 2014-11-13 | Roche Diagnostics Gmbh | Stabilization of enzymes by nicotinic acid |
| EP2927319A1 (en) | 2014-03-31 | 2015-10-07 | Roche Diagnostics GmbH | High load enzyme immobilization by crosslinking |
| ES2756714T3 (es) | 2014-08-25 | 2020-04-27 | Hoffmann La Roche | Tira reactiva de dos electrodos que compensan la interferencia |
| JP2019529935A (ja) | 2016-10-05 | 2019-10-17 | エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト | 多検体診断用試験エレメントのための検出試薬および電極配置、ならびにそれらを使用する方法 |
| US11986288B2 (en) | 2017-03-06 | 2024-05-21 | Medtronic Minimed, Inc. | Colorometric sensor for the non-invasive screening of glucose in sweat in pre and type 2 diabetes |
| WO2018165180A1 (en) | 2017-03-06 | 2018-09-13 | Medtronic Minimed, Inc. | Colorometric sensor for the non-invasive screening of glucose in sweat in pre and type 2 diabetes |
| JP7072797B2 (ja) * | 2018-02-20 | 2022-05-23 | 公立大学法人山陽小野田市立山口東京理科大学 | 化合物及び光触媒用助触媒 |
| CN116018084A (zh) | 2020-09-18 | 2023-04-25 | 美敦力迷你迈德公司 | 酮体感测装置和方法 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4233402A (en) * | 1978-04-05 | 1980-11-11 | Syva Company | Reagents and method employing channeling |
| JPS57192483A (en) | 1981-05-21 | 1982-11-26 | Mitsubishi Electric Corp | Electrochromic display element consisting of organic metal complex |
| EP0100217B1 (en) * | 1982-07-23 | 1987-10-07 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase |
| US4701420A (en) * | 1985-04-01 | 1987-10-20 | Eastman Kodak Company | Analytical compositions, elements and methods utilizing reduction of ferric ion chelates to form detectable dyes |
| US5036000A (en) * | 1986-12-16 | 1991-07-30 | Enzymatics, Inc. | Threshold color control system |
| JPH0659236B2 (ja) | 1987-12-14 | 1994-08-10 | 理化学研究所 | 生体基質濃度の測定方法及びそれに使用する酸素センサー |
| AU640162B2 (en) * | 1989-08-28 | 1993-08-19 | Lifescan, Inc. | Blood separation and analyte detection techniques |
| JPH0343096A (ja) | 1990-06-18 | 1991-02-25 | Iatron Lab Inc | 基質又は酵素の定量方法 |
| JP3131924B2 (ja) | 1991-02-27 | 2001-02-05 | ロシュ ダイアグノスティックス コーポレーション | 検体測定のための改良法及び試薬 |
| US5264348A (en) * | 1991-05-13 | 1993-11-23 | Miles Inc. | Ascorbate interference-resistant composition, device and method of assaying for predetermined analyte |
| FR2699170B1 (fr) * | 1992-12-15 | 1995-07-28 | Asulab Sa | Complexes d'un métal de transition à ligands 2,2'-bipyridine substitués par au moins un radical ammonium alkyle, leur procédé de fabrication et leur application comme médiateur redox. |
| ES2185647T3 (es) * | 1993-01-28 | 2003-05-01 | Roche Diagnostics Corp | Composiciones utiles en la determinacion anaerobia de analitos. |
| EP0813608B1 (en) * | 1995-02-14 | 2002-09-04 | Roche Diagnostics Corporation | Osmium-containing redox mediator |
| US5938917A (en) * | 1995-04-05 | 1999-08-17 | The Regents Of The University Of California | Electrodes for measurement of peroxides |
| JP3881415B2 (ja) | 1997-03-11 | 2007-02-14 | ロッシュ ディアグノスティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 免疫分析装置 |
| DE69820471T2 (de) | 1997-09-30 | 2004-06-09 | Amira Medical, Scotts Valley | Membranbasierte elektrochemische testvorrichtung und zugehörige verfahren |
| EP1001009B1 (en) * | 1998-11-10 | 2003-09-03 | Unilever Plc | Bleach and oxidation catalyst |
| DE60037592T2 (de) | 1999-09-20 | 2009-01-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Methode zur Messung eines Analyten mit Hilfe eines elektrochemischen Biosensors, der durch Anlegen eines Potentials abgeschaltet werden kann |
| US20050014213A1 (en) * | 2001-12-28 | 2005-01-20 | Kenji Nagakawa | Method of colorimetry and reagent for use therein |
| NZ529279A (en) | 2001-12-28 | 2005-12-23 | Arkray Inc | Method of colorimetry and reagent for use therein |
-
2003
- 2003-01-06 NZ NZ529279A patent/NZ529279A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-01-06 ES ES03700461T patent/ES2322990T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-06 AT AT03700461T patent/ATE426676T1/de active
- 2003-01-06 JP JP2003558198A patent/JP4045323B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-06 KR KR1020067001158A patent/KR100693899B1/ko active IP Right Grant
- 2003-01-06 KR KR1020037015691A patent/KR100557899B1/ko active IP Right Grant
- 2003-01-06 CA CA002448128A patent/CA2448128C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-01-06 EP EP03700461A patent/EP1457572B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-06 ES ES08006461T patent/ES2350507T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-06 WO PCT/JP2003/000027 patent/WO2003057905A1/ja active Application Filing
- 2003-01-06 PL PL369143A patent/PL213316B1/pl unknown
- 2003-01-06 DE DE60334333T patent/DE60334333D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-06 EP EP08006461A patent/EP1942195B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-06 DE DE60326814T patent/DE60326814D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-06 AU AU2003201901A patent/AU2003201901B2/en not_active Ceased
- 2003-01-06 CN CNB038006049A patent/CN1261588C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-06 US US10/476,298 patent/US7550273B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-06 AT AT08006461T patent/ATE482285T1/de active
- 2003-10-31 ZA ZA200308519A patent/ZA200308519B/en unknown
-
2009
- 2009-05-20 US US12/469,403 patent/US8574896B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ529279A (en) | 2005-12-23 |
| DE60334333D1 (de) | 2010-11-04 |
| PL369143A1 (pl) | 2005-04-18 |
| US20040142406A1 (en) | 2004-07-22 |
| EP1942195B1 (en) | 2010-09-22 |
| AU2003201901B2 (en) | 2006-09-21 |
| JP4045323B2 (ja) | 2008-02-13 |
| ZA200308519B (en) | 2004-11-04 |
| US20090233322A1 (en) | 2009-09-17 |
| KR100693899B1 (ko) | 2007-03-12 |
| US8574896B2 (en) | 2013-11-05 |
| AU2003201901A1 (en) | 2003-07-24 |
| DE60326814D1 (de) | 2009-05-07 |
| WO2003057905A1 (fr) | 2003-07-17 |
| ATE426676T1 (de) | 2009-04-15 |
| EP1457572A4 (en) | 2006-04-05 |
| ES2350507T3 (es) | 2011-01-24 |
| ES2322990T3 (es) | 2009-07-03 |
| CA2448128A1 (en) | 2003-06-28 |
| JPWO2003057905A1 (ja) | 2005-05-19 |
| KR20040010671A (ko) | 2004-01-31 |
| CA2448128C (en) | 2009-07-14 |
| ATE482285T1 (de) | 2010-10-15 |
| CN1261588C (zh) | 2006-06-28 |
| US7550273B2 (en) | 2009-06-23 |
| EP1457572A1 (en) | 2004-09-15 |
| EP1942195A1 (en) | 2008-07-09 |
| CN1522302A (zh) | 2004-08-18 |
| KR100557899B1 (ko) | 2006-03-10 |
| KR20060010872A (ko) | 2006-02-02 |
| EP1457572B1 (en) | 2009-03-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8574896B2 (en) | Colorimetric method and reagent used for the same | |
| JP2922003B2 (ja) | 過酸化活性物質の検定のための組成物、用具及び方法の改良 | |
| JPS5813398A (ja) | 過酸化水素もしくは過酸化水素を形成する基質またはペルオキシダ−ゼもしくはペルオキシダ−ゼのように作用する物質を検出するための剤および方法 | |
| JPH07155197A (ja) | クレアチニンの検出方法及び検出具 | |
| JP2008526990A (ja) | 水溶性テトラゾリウム塩 | |
| EP3183246B1 (en) | Redoxindicators | |
| CA2471660C (en) | Method and reagent of colorimetry employing an oxidoreductase and a transition metal complex that changes colour by transferring an electron | |
| EP0445412B1 (en) | Naphthotriazolium salts | |
| JP5231392B2 (ja) | 酸化発色化合物またはその塩およびその製造方法、ならびに試薬組成物およびこれを用いた試験具 | |
| JPH0599A (ja) | ホスフアターゼの活性測定法 | |
| WO1998049137A1 (fr) | Reactifs colorants oxydatifs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |