JP4045323B2 - 比色分析方法およびそれに用いる試薬 - Google Patents

比色分析方法およびそれに用いる試薬 Download PDF

Info

Publication number
JP4045323B2
JP4045323B2 JP2003558198A JP2003558198A JP4045323B2 JP 4045323 B2 JP4045323 B2 JP 4045323B2 JP 2003558198 A JP2003558198 A JP 2003558198A JP 2003558198 A JP2003558198 A JP 2003558198A JP 4045323 B2 JP4045323 B2 JP 4045323B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
compound
complex
bipyridyl
nitrophenyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2003558198A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2003057905A1 (ja
Inventor
健児 永川
朋吾 辻本
進 西野
正明 寺元
喜幸 川瀬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Arkray Inc
Original Assignee
Arkray Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arkray Inc filed Critical Arkray Inc
Publication of JPWO2003057905A1 publication Critical patent/JPWO2003057905A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4045323B2 publication Critical patent/JP4045323B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Spectrometry And Color Measurement (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Description

本発明は、比色分析方法およびそれに使用する試薬に関する。
臨床検査や生化学検査等の分野において、グルコース、コレステロール等の成分分析が行われており、その一手法として、比色分析がある。例えば、グルコースの比色分析では、まずグルコースオキシダーゼをグルコース（基質）に作用させて、グルコノラクトンおよび過酸化水素を発生させ、過酸化水素を、ペルオキシダーゼの存在下、トリンダー試薬等の発色剤により検出するのが一般的である。このように、過酸化水素を介して間接的に基質濃度を測定するという手法は、グルコースに限らず、コレステロール等の他の成分分析にも適用されている。
しかし、従来の比色分析では、つぎのような問題がある。まず、分析対象物を直接測定するのではなく、過酸化水素を介して、間接的に測定するため、測定に時間がかかり、例えば、グルコースの測定の場合、３０〜６０秒かかる。また、従来の比色分析法では、２種類の酵素反応系を同時に安定化する必要があり、条件設定が難しい。そして、酸素を必要とするため、従来の比色分析法では、酸素が不十分であると、反応が十分におこらないという問題もある。
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、分析時間が短時間であり、かつ分析値に信頼性がある比色分析方法の提供を、その目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の比色分析方法は、分析対象物の定性若しくは定量を行う比色分析方法であって、酸化還元酵素と前記分析対象物との反応により生じた電子をメディエータが受容し、前記メディエータが還元されて発色する発色剤に前記電子を伝達し、その結果生じる前記発色剤の発色を測定することを含み、前記メディエータが、銅錯体、鉄錯体、オスミウム錯体およびルテニウム錯体からなる群から選択される少なくとも一つの錯体であり、前記分析対象物が、グルコース又はピルビン酸であり、前記酸化還元酵素が、グルコース又はピルビン酸の酸化酵素又は脱水素酵素であり、前記発色剤が、テトラゾリウム塩である。
この方法によれば、酵素反応は１段階の反応であるため、反応系が簡単で安定性が良くなる。また、酵素反応が１段階であるのと、前記発色剤の反応に前記メディエータを使用するため、酵素反応から発色反応までの時間が極めて短くなり、その結果、測定時間も短くなる。例えば、本発明の比色分析方法において、グルコースを基質とした場合、約５秒以内の短時間で測定可能である。また、本発明の比色分析方法では、発色までの反応が速いので、酵素を節約することができ、コスト的に有利である。そして、本発明の比色分析方法は、過酸化水素を介さないで発色剤を発色させ、かつ酸素を必要としないことから、分析値の信頼性も高い。
つぎに、本発明の試薬は、前記本発明の比色分析方法に使用される試薬であり、酸化還元酵素、メディエータおよび還元により発色する発色剤を含む試薬である。また、本発明の試験片は、前記本発明の試薬を含む試験片である。この試験片は、従来の過酸化水素を発生させる比色分析用の試験片に比べ、極めて短時間で分析が可能であり、その分析値の信頼性も高い。
本発明の比色分析方法、試薬および試験片において、前述のように、前記メディエータは、鉄錯体、ルテニウム錯体、オスミウム錯体若しくは銅錯体またはこれらの２種類以上の混合物が好ましい。また、前記錯体の配位子の配位原子は、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましい。前記配位子としては、例えば、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、シュウ酸および前記各化合物の誘導体からなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましい。また、前記錯体は、配位子を２種類以上有していてもよく、すなわち、混合配位子でもよい。前記配位子の配位座以外における水素原子の少なくとも一つは、置換基により置換された配位子であってもよい。前記置換基としては、例えば、アルキル基、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基がある。
本発明の比色分析方法、試薬および試験片において、酸化還元酵素は、脱水素酵素若しくは酸化酵素が好ましい。また、分析対象物は、例えば、グルコース、コレステロール、乳酸、尿酸、ピルビン酸、クレアチン、クレアチニンが好ましく、この場合の好ましい酸化還元酵素は、前記各物質に対応する脱水素酵素若しくは酸化酵素である。酵素量を多くすれば、反応が速くなるので好ましい。前記発色剤は、テトラゾリウム塩が好ましい。前記テトラゾリウム塩は、ニトロフェニル基、チアゾリル基およびベンゾチアゾリル基の少なくとも一つの基を有することが好ましい。前記テトラゾリウム塩の具体例としては、例えば、ＭＴＴ、ＩＮＴ、Neo-ＴＢ、Nitro-ＴＢ、ＴＢ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＷＳＴ−８、2-(2-Benzothiazolyl)-3,5-diphenyltetrazolium Bromide、2-(2-Benzothiazolyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Bromide、2,3-Bis(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Chloride、2,3-Di(4-nitrophenyl)tetrazolium Perchlorate、3-(3-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride、および、3-(4-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chlorideがある。
本発明の試験片において、前記試薬に加え、さらに無機ゲルを含むことが好ましい。無機ゲルにより酸素を遮断すれば、発色剤の酸化を防止でき、また再酸化による発色後の退色も防止できる。
前述のように、本発明において、前記メディエータは、鉄錯体、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、銅錯体が好ましく、特に好ましくはオスミウム錯体である。
（鉄錯体）
鉄錯体の配位子としては、例えば、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、シュウ酸および前記各化合物の誘導体等の配位子があげられる。これらを２種類以上組み合わせて混合配位子としてもよい。
ビピリジルの場合、配位数は、６である。ビピリジルは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、４，４’位および５，５’位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
ビピリジル鉄錯体の例としては、例えば、［Fe(bipyridyl)3］、［Fe(4,4'‐dimethyl-2,2'-bipyridyl)3］、［Fe(4,4'‐diphenyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Fe(4,4'‐diamino-2,2'-bipyridyl)3］，［Fe(4,4'‐dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Fe(4,4'‐dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Fe(4,4'‐dibromo-2,2'-bipyridyl)3］，［Fe(5,5'‐dimethyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Fe(5,5'‐diphenyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Fe(5,5'‐diamino-2,2'-bipyridyl)3］，［Fe(5,5'‐dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Fe(5,5'‐dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Fe(5,5'‐dibromo-2,2'-bipyridyl)3］などがある。
イミダゾールの場合、配位数は、６である。イミダゾールは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、２位、４位および５位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
イミダゾール鉄錯体の例としては、例えば、［Fe(imidazole)6］，［Fe(4-metyl-imidazole)6］，［Fe(4-phenyl-imidazole)6］，［Fe(4-amino-imidazole)6］，［Fe(4-hydroxy-imidazole)6］，［Fe(4-carboxy-imidazole)6］，［Fe(4-bromo-imidazole)6］などがある。
アミノ酸としては、例えば、アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）がある。アルギニン鉄錯体は、溶解性が高いという利点を一般的に持つ。また、混合配位子として、例えば、ビピリジルとイミダゾールの組み合わせ、ビピリジルとアミノ酸の組み合わせがある。例えば、［Fe(imidazole)2(bipyridyl)2］，［Fe(L-Arg)2(bipyridyl)2］がある。混合配位子を用いると錯体に様々な性質を付与でき、例えば、アルギニンを用いると錯体の溶解性が向上する。
（ルテニウム錯体）
ルテニウム錯体の配位子としては、例えば、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、シュウ酸および前記各化合物の誘導体等の配位子があげられる。これらを２種類以上組み合わせて混合配位子としてもよい。
ビピリジルの場合、配位数は、６である。ビピリジルは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、４，４’位および５，５’位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
ビピリジルルテニウム錯体の例としては、例えば、［Ru(bipyridyl)3］，［Ru(4,4'‐dimethyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Ru(4,4'‐diphenyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Ru(4,4'‐diamino-2,2'-bipyridyl)3］，［Ru(4,4'‐dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Ru(4,4'‐dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Ru(4,4'‐dibromo-2,2'-bipyridyl)3］，［Ru(5,5'‐dimethyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Ru(5,5'‐diphenyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Ru(5,5'‐diamino-2,2'-bipyridyl)3］，［Ru(5,5'‐dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Ru(5,5'‐dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Ru(5,5'‐dibromo-2,2'-bipyridyl)3］等がある。
イミダゾールの場合、配位数は、６である。イミダゾールは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、２位、４位および５位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
イミダゾールルテニウム錯体の例としては、例えば、［Ru(imidazole)6］，［Ru(4-metyl-imidazole)6］，［Ru(4-phenyl-imidazole)6］，［Ru(4-amino-imidazole)6］，［Ru(4-hydroxy-imidazole)6］，［Ru(4-carboxy-imidazole)6］，［Ru(4-bromo-imidazole)6］等がある。
アミノ酸としては、例えば、アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）がある。アルギニンルテニウム錯体は、溶解性が高いという利点を持つ。また、混合配位子として、例えば、ビピリジルとイミダゾールの組み合わせ、ビピリジルとアミノ酸の組み合わせがある。例えば、［Ru(imidazole)2(bipyridyl)2］，［Ru(L-Arg)2(bipyridyl)2］がある。混合配位子を用いると錯体に様々な性質を付与でき、例えば、アルギニンを用いると錯体の溶解性が向上する。
（オスミウム錯体）
オスミウム錯体の配位子としては、例えば、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、シュウ酸および前記各化合物の誘導体等の配位子があげられる。これらを二種類以上組み合わせて混合配位子としてもよい。
ビピリジルの場合、配位数は、６である。ビピリジルは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、４，４’位および５，５’位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
ビピリジルオスミウム錯体の例としては、例えば、［Os(bipyridyl)3］，［Os(4,4'‐dimethyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Os(4,4'‐diphenyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Os(4,4'‐diamino-2,2'-bipyridyl)3］，［Os(4,4'‐dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Os(4,4'‐dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Os(4,4'‐dibromo-2,2'-bipyridyl)3］，［Os(5,5'‐dimethyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Os(5,5'‐diphenyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Os(5,5'‐diamino-2,2'-bipyridyl)3］，［Os(5,5'‐dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Os(5,5'‐dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Os(5,5'‐dibromo-2,2'-bipyridyl)3］等がある。
イミダゾールの場合、配位数は、６である。イミダゾールは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、２位、４位および５位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
イミダゾールオスミウム錯体の例としては、例えば、［Os(imidazole)6］，［Os(4-metyl-imidazole)6］，［Os(4-phenyl-imidazole)6］，［Os(4-amino-imidazole)6］，［Os(4-hydroxy-imidazole)6］，［Os(4-carboxy-imidazole)6］，［Os(4-bromo-imidazole)6］等がある。
アミノ酸としては、例えば、アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）がある。アルギニンオスミウム錯体は、溶解性が高いという利点を持つ。また、混合配位子として、例えば、ビピリジルとイミダゾールの組み合わせ、ビピリジルとアミノ酸の組み合わせがある。例えば、［Os(imidazole)2(bipyridyl)2］、［Os(L-Arg)2(bipyridyl)2］がある。混合配位子を用いると錯体に様々な性質を付与でき、例えば、アルギニンを用いると錯体の溶解性が向上する。
（銅錯体）
銅錯体の配位子としては、例えば、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、シュウ酸および前記各化合物の誘導体等の配位子があげられる。これらを二種類以上組み合わせて混合配位子としてもよい。
ビピリジルの場合、配位数は、４若しくは６であるが、安定性の見地から、ビピリジルは２個配位させることが好ましい。ビピリジルは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、４，４’位および５，５’位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
ビピリジル銅錯体の例としては、例えば、［Cu(bipyridyl)2］，［Cu(4,4'‐dimethyl-2,2'-bipyridyl)2］，［Cu(4,4'‐diphenyl-2,2'-bipyridyl)2］，［Cu(4,4'‐diamino-2,2'-bipyridyl)2］，［Cu(4,4'‐dihydroxy-2,2'-bipyridyl)2］，［Cu(4,4'‐dicarboxy-2,2'-bipyridyl)2］，［Cu(4,4'‐dibromo-2,2'-bipyridyl)2］，［Cu(5,5'‐dimethyl-2,2'-bipyridyl)2］，［Cu(5,5'‐diphenyl-2,2'-bipyridyl)2］，［Cu(5,5'‐diamino-2,2'-bipyridyl)2］，［Cu(5,5'‐dihydroxy-2,2'-bipyridyl)2］，［Cu(5,5'‐dicarboxy-2,2'-bipyridyl)2］，［Cu(5,5'‐dibromo-2,2'-bipyridyl)2］，［Cu(bipyridyl)3］，［Cu(4,4'‐dimethyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Cu(4,4'‐diphenyl-2,2'-bipyridyl)3 ］，［Cu(4,4'‐diamino-2,2'-bipyridyl)3］，［Cu(4,4'‐dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Cu(4,4'‐dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Cu(4,4'‐dibromo-2,2'-bipyridyl)3］，［Cu(5,5'‐dimethyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Cu(5,5'‐diphenyl-2,2'-bipyridyl)3］，［Cu(5,5'‐diamino-2,2'-bipyridyl)3］，［Cu(5,5'‐dihydroxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Cu(5,5'‐dicarboxy-2,2'-bipyridyl)3］，［Cu(5,5'‐dibromo-2,2'-bipyridyl)3］等がある。
イミダゾールの場合、配位数は、４である。イミダゾールは、置換してなくても良いし、置換基を導入してもよい。置換基を導入することにより、例えば、溶解度や酸化還元電位等を調整することが可能となる。置換位置としては、２位、４位および５位がある。置換基は、例えば、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基（例えば、臭素、塩素、ヨウ素等）がある。
イミダゾール銅錯体の例としては、例えば、［Cu(imidazole)4］，［Cu(4-metyl-imidazole)4］，［Cu(4-phenyl-imidazole)4］，［Cu(4-amino-imidazole)4］，［Cu(4-hydroxy-imidazole)4］，［Cu(4-carboxy-imidazole)4］，［Cu(4-bromo-imidazole)4］等がある。
アミノ酸としては、例えば、アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）がある。アルギニン銅錯体は、溶解性が高いという利点を持つ。また、混合配位子として、例えば、ビピリジルとイミダゾールの組み合わせ、ビピリジルとアミノ酸の組み合わせがある。例えば、［Cu(imidazole)2(bipyridyl)］、［Cu(L-Arg)2(bipyridyl)］がある。混合配位子を用いると銅錯体に様々な性質を付与でき、例えば、アルギニンを用いると錯体の溶解性が向上する。
以上の遷移金属錯体の説明は、遷移金属の種類に着目して例を挙げたものであり、本発明は、これらに限定されない。以下、遷移金属錯体について、配位子に着目して説明する。
Ｎ,Ｏ,Ｓの配位原子をもつ配位子とは、分子内に、例えば、=N-OH，-COOH，-OH，-SH，>C=Oなどの基を持っているものをいう。このような配位子を持つ金属錯体としては、例えば、NNキレート、NOキレート、NSキレート、OOキレート、OSキレート、SSキレート(二座配位)、Nキレート（単座）、NNNキレート（三座）等があり、組み合わせは多種に及ぶ。配位子に二重結合を有しているものを選べば、Cu,Fe,Ru,Osの金属は電子伝達/授受機能がつきやすい。配位子としては、好ましくは芳香環を有しているものが良い。前述のように、配位子に、様々な置換基を導入してもよい。例えば、スルホン基などを導入すれば、金属錯体の溶解度の上昇につながる。金属錯体を形成させる際に、配位子を二種以上混在させ、混合配位子錯体としても使用しても良い。例えば、配位子の一つとして、アミノ酸を混在させておけば酵素との親和性が良くなったりする場合がある。また、中心金属の一部のサイトに各種ハロゲン（例えば、Ｃｌ，Ｆ，Ｂｒ，Ｉ）を付けるなどしても良い。以下に、配位のタイプ別の分類した遷移金属錯体の一例を示す。
（ＮＮ配位型）
フェナントロリン誘導体
Cu + 1,10-Phenanthoroline
Fe + 1,10-Phenanthoroline
Cu + Bathophenanthroline
Fe + Bathophenanthroline
Cu + Bathophenanthroline sulfonic acid
Fe + Bathophenanthroline sulfonic acid
ビピリジル誘導体
Cu + 2,2'-Bipyridyl
Fe + 2,2'-Bipyridyl
Fe + 4,4'-Diamino-2,2'-bipyridyl
Ru + 4,4'-Diamino-2,2'-bipyridyl
トリアジン誘導体
Cu + TPTZ (2,4,6-Tripyridyl-S-triazine)
Fe + TPTZ (2,4,6-Tripyridyl-S-triazine)
Fe + PDTS (3-(2-Pyridyl)-5,6-bis(4-sulfophenyl)-1,2,4-triazine)
ビキノリン誘導体
Cu + Cuproin (2,2'-Biquinoline)
ピリジルアゾ誘導体
Fe + Nitro-PAPS (2-(5-Nitro-2-pyridylazo)-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl) amino] phenol)
（NO配位型）
Fe + Nitroso-PSAP (2-Nitroso-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl) amino] phenol)
Fe + Nitroso-ESAP (2-Nitroso-5-[N-ethyl-N-(3-sulfopropyl) amino] phenol)
Fe + 1-Nitroso-2-Naphthol
（NS配位型）
Fe + 2-Amino-4-thiazole acetic acid
（OO配位型）
Fe + 1,2-Naphthoquinone-4-Sulfonic acid
（混合配位子型）
Os + Cl, Imidazole, 4,4'-Dimethyl-2,2'-Bipyridyl
Os + Imidazole, 4,4'-Dimethyl-2,2'-Bipyridyl
Cu + L-Arginine, 2,2'-Bipyridyl
Cu + Ethylenediamine, 2,2'-Bipyridyl
Cu + Imidazole, 2,2'-Bipyridyl
つぎに、本発明において、前記発色剤は、特に制限されないが、2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitorophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride（ＩＮＴ）、3-(4,5,-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide（ＭＴＴ）、3,3'-(1,1'-Biphenyl-4,4'-diyl)-bis(2,5-diphenyl-2H-tetrazolium chloride)（Neo-ＴＢ）、3,3'-［3,3'-Dimethoxy-(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl］-bis［2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride（Nitro-ＴＢ）、3,3'-［3,3'-Dimethoxy-(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl］-bis（2,5-diphenyl-2H-tetrazolium chloride）（ＴＢ）、2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt（ＷＳＴ−１）、2-(4-Iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt（ＷＳＴ−３）、2-Benzothiazolyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium（ＷＳＴ−４）2,2'-Dibenzothiazolyl-5,5'-bis[4-di(2-sulfoethyl)carbamoylphenyl]-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylene)ditetrazolium,disodium salt（ＷＳＴ−５）、2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt（ＷＳＴ−８）、2-(2-Benzothiazolyl)-3,5-diphenyltetrazolium Bromide、2-(2-Benzothiazolyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Bromide、2,3-Bis(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Chloride、2,3-Di(4-nitrophenyl)tetrazolium Perchlorate、3-(3-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride、3-(4-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride、鉄錯体、銅錯体があげられる。なお、鉄錯体、銅錯体もメディエータとしての機能を有するが、本発明においては、発色剤として使用することも可能である。例えば、銅錯体としては、前述のように、例えば、ビピリジル銅錯体、イミダゾール銅錯体、アミノ酸（例えば、アルギニン等）銅錯体、イミダゾール・ビピリジル銅錯体、イミダゾール・アミノ酸銅錯体等がある。銅錯体は、電子の伝達により、青色（Ｃｕ2+）から赤褐色（Ｃｕ+）に色調が変化する。銅錯体を発色剤として使用する場合のメディエータとしては、銅以外の遷移金属錯体が使用され、オスミウム錯体、ルテニウム錯体が好ましい。
つぎに、本発明の比色分析方法を試験片に適用した例について、メディエータとしてオスミウム錯体を使用し、発色剤としてＭＴＴを使用し、かつグルコースを分析対象とした場合を例にとり説明する。なお、コレステロール等のその他の成分分析は、それに応じて酸化還元酵素を変える以外は、基本的に同様である。
まず、オスミウム錯体を準備する。これは、市販品を使用してもよいが、後述の実施例の方法で自家調製してもよい。オスミウム錯体は、バッファー溶液に溶解し、これに、ＭＴＴ、バインダー等の添加剤、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を溶解して試薬液とする。バッファーとしては、リン酸バッファー、グッドのバッファー等がある。オスミウム錯体の濃度は、バッファー溶液全体に対し、例えば、１〜１０質量％である。バインダーとしては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリルアミド、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等があり、このなかで、ＨＰＣが好ましい。また、バインダーの濃度は、例えば、０．５〜５質量％の範囲である。ＧＤＨの濃度は、例えば、１０００〜５００００Ｕ／ｍｌである。ＭＴＴの濃度は特に制限されない。そして、前記試薬液をろ紙等の多孔質シートに含浸させ、その後乾燥させることにより、グルコース分析用の試験片が作成できる。なお、前記試薬液の含浸に先立ち、無機ゲル溶液を前記多孔質シートに含浸させ、乾燥させることが好ましい。無機ゲルとしては、例えば、スメクタイト等がある。前記無機ゲル溶液の無機ゲル濃度は、例えば、１〜５質量％、好ましくは１〜３質量％、より好ましくは１．５〜２質量％である。前記無機ゲル溶液には、ＣＨＡＰＳ等の両性界面活性剤を含有させてもよい。前記無機ゲル溶液全体に対する前記両性界面活性剤の濃度は、例えば、０．１〜２質量％、好ましくは０．１〜１質量％、より好ましくは０．２〜０．４質量％である。前記無機ゲルの前記多孔質シートに対する含浸量は、多孔質シートの空隙体積基準で、例えば、１〜５０ｍｇ／ｃｍ3、好ましくは、１０〜３０ｍｇ／ｃｍ3、１５〜２０ｍｇ／ｃｍ3である。前記多孔質シートは、孔径が厚み方向若しくはシート面方向にしたがい変化する非対称多孔質膜でもよい。この試験片に、血液等のグルコースを含む試料を点着すると、その濃度に応じ、前記ＭＴＴが発色する。この発色の程度を測定することにより、グルコースの定性若しくは定量分析が可能である。また、分析に必要な時間は、試料点着後、約１〜３秒である。この試験片に無機ゲルが含浸させてあれば、より均一で安定な発色を得ることができる。
前記無機ゲルは、例えば、膨潤性粘土鉱物を使用することが好ましい。膨潤性粘土鉱物のうち、更に好ましいものはベントナイト、スメクタイト、バーミキュライトまたは合成フッ素雲母であり、特に好ましくは合成ヘクトライトもしくは合成サポナイト等の合成スメクタイト、または合成フッ素雲母で代表される膨潤性合成雲母（又はＮａ型雲母）等の合成雲母（天然の雲母は通常非膨潤性の粘土鉱物である）である。
つぎに、本発明の比色分析方法を、液系分析に適用した例を、メディエータとしてオスミウム錯体を使用し、発色剤としてＭＴＴを使用し、かつグルコースを分析対象とした場合を例にとり説明する。なお、コレステロール等のその他の成分分析は、それに応じて酸化還元酵素を変える以外は、基本的に同様である。
すなわち、オスミウム錯体、ＧＤＨ、ＭＴＴおよびバッファー溶液に溶解して試薬液を調製する。なお、水に溶解してもよいが、緩衝液に溶解するのが好ましい。緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８の範囲であり、好ましくはｐＨ６．５〜７の範囲である。また、オスミウム錯体の濃度は、例えば、０．１〜６０ｍＭであり、好ましくは０．２〜１０ｍＭであり、より好ましくは０．３〜０．６ｍＭである。ＧＤＨの濃度は、例えば、１０〜１０００Ｕ／ｍｌであり、好ましくは、５０〜５００Ｕ／ｍｌであり、より好ましくは、１００〜２００Ｕ／ｍｌである。ＭＴＴの濃度は特に制限されない。この試薬液に血液等のグルコースを含む検体を添加すると、例えば、５秒以内の短時間に、前記試薬液が、検体のグルコース濃度に応じ、発色する。この変化は目視で確認しても良いし、分光光度計等の光学系測定装置を用いて測定してもよい。前記検体の添加量は、前記試薬液１ｍｌに対し、例えば、１〜１００μｌの範囲であり、好ましくは３〜１０μｌの範囲であり、より好ましくは５〜１０μｌの範囲である。
（実施例）
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、下記において、ＰＱＱとはピロロキノリンキノンを示し、その他の試薬の詳細は以下のとおりである。
Figure 0004045323
まず、オスミウム錯体[OsCl(Him)(dmbpy)2]を合成した。すなわち、まず、(NH4)2[OsCl6]2.00g(4.56mmol)とジメチルビピリジル（dmbpy）1.68g(9.11mmol)を窒素気流下、エチレングリコール（60ml）中で１時間還流した。室温まで冷却した後、１Ｍ亜二チオン酸ナトリウム水溶液（120ml）を３０分かけて加え、氷浴中で３０分間冷却した。得られた沈澱を減圧ろ過し、十分に水で洗浄した(500〜1000ml使用)。さらにジエチルエーテルで２度洗浄した後、減圧乾燥した。これにより[OsCl2(dmbpy)2]を1.5〜1.7g得た。得られた[OsCl2(dmbpy)2]1.56g(2.60mmol)とイミダゾール（Him）0.36g(5.2mmol)とを窒素気流下、水/メタノール混合溶媒（50ml）中で２時間還流した。室温まで冷却した後、飽和NaCl水溶液（300ml）を加えた。得られた沈澱を減圧ろ過し、飽和NaCl水溶液で洗浄した後、減圧乾燥し、[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2を得た。得られた[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2をできるだけ少量のアセトニトリル/メタノール(1:1 v/v)で溶かし、カラムクロマトグラフィー（吸着剤：活性アルミナ，展開溶媒：アセトニトリル/メタノール）で精製した。溶媒をエバポレートした後、少量のアセトンに溶かし、ジエチルエーテルで再沈澱させた。得られた沈澱を減圧ろ過した後、減圧乾燥することにより、精製[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2を得た。
前記オスミウム錯体を含む下記試薬液を調製した。光路長10mmのマイクロセル(材質・ポリメタクリレート)に、種々濃度のグルコース（GLU）水溶液（濃度：0,200,400,600mg/100ml）を5μｌ入れ、さらに下記試薬液を1000μl入れると同時に波長600nmで吸光度を測定した。この結果を、図１のグラフに示す。図示のように、グルコース濃度に応じて、発色したことが分かる。また、反応は迅速に行われ、基質を消費し尽くすまでに実質２秒程度しかかからなかった。
（試薬液組成）
ＭＴＴ（同仁化学社製） 0.5mM
[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2 0.1mM
PIPES（pH7.0） 40mM
PQQGDH 200U/ml
前記オスミウム錯体を含む下記試薬液を調製した。光路長10mmのマイクロセル(材質・ポリメタクリレート)に、種々濃度のグルコース（GLU）水溶液（濃度：0,200,400,600mg/100ml）を5μｌ入れ、さらに下記試薬液を1000μl入れると同時に波長600nmで吸光度を測定した。この結果を、図２のグラフに示す。図示のように、グルコース濃度に応じて、発色したことが分かる。また、反応は迅速に行われ、基質を消費し尽くすまでに実質１秒程度しかかからなかった。
（試薬液組成）
ＷＳＴ−５（同仁化学社製） 0.5mM
[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2 0.1mM
PIPES（pH7.0） 40mM
PQQGDH 200U/ml
下記ルテニウム錯体を含む下記試薬液を調製した。光路長10mmのマイクロセル(材質・ポリメタクリレート)に、種々濃度のグルコース（GLU）水溶液（濃度：0,200,400,600mg/100ml）を5μｌ入れ、さらに下記試薬液を1000μl入れると同時に波長600nmで吸光度を測定した。この結果を、図３のグラフに示す。図示のように、グルコース濃度に応じて、発色したことが分かる。また、反応は迅速に行われ、基質を消費し尽くすまでに実質２秒程度しかかからなかった。
（試薬液組成）
ＷＳＴ−５（同仁化学社製） 0.5mM
[Ru(NH3)6]Cl3（Aldrich社製） 10mM
PIPES（pH7.0） 40mM
PQQGDH 200U/ml
CuCl2と2、2'-ビピリジル（bpy）をモル比１：２で約８０℃の温浴中で混合し、［Cu(bpy)2］Cl2を合成し、さらに、この銅錯体を含む下記試薬液を調製した。光路長10mmのマイクロセル(材質・ポリメタクリレート)に、種々濃度のグルコース（GLU）水溶液（濃度：0,200,400,600mg/100ml）を5μｌ入れ、さらに下記試薬液を1000μl入れると同時に波長600nmで吸光度を測定した。この結果を、図４のグラフに示す。図示のように、グルコース濃度に応じて、発色したことが分かる。また、反応は迅速に行われ、基質を消費し尽くすまでに実質２秒程度しかかからなかった。
（試薬液組成）
ＷＳＴ−５（同仁化学社製） 0.5mM
［Cu(bpy)2］Cl2 1mM
PIPES（pH7.0） 40mM
PQQGDH 200U/ml
種々の配位子を有する銅錯体を作製した。すなわち、塩化銅(II)と、以下の配位子をモル比１：２で混合、精製水で溶かし、約80℃の温浴中で10分間インキュベートして配位させ、錯溶液を得た。
Figure 0004045323
配位子として、以下に示す配位子とビピリジルを用い、銅の混合配位子錯体を作製した。すなわち、銅：以下の配位子：ビピリジルをモル比１：２：１で混合し、精製水で溶かし、約80℃の温浴中で10分間インキュベートして配位させ、以下の配位子を得た。
Figure 0004045323
種々の配位子を用いて鉄錯体を作製した。塩化鉄(III)と以下の配位子をモル比１：３で混合、精製水で溶かし、約80℃の温浴中で10分間インキュベートして配位させ、錯溶液を得た。
Figure 0004045323
以下のようにして、２種類のルテニウム錯体を作製した。
[Ru(NH3)6]
まず、市販のルテニウム錯体（Aldrich社 Hexaammineruthenium(III) chloride）を水溶して、[Ru(NH3)6]の錯溶液を得た。
[Ru(4,4'-Diamino-2,2'-bipyridyl)3]
＜配位子＞ 11.8g(63.0mmol)の2,2'-Bipyridil-N,N'-dioxide（Aldrich社製）を氷浴で冷やした濃硫酸120mlにゆっくり溶かし、反応液を100℃に加熱した。次に硝酸カリウム64.0g(630mmol)の100ml濃硫酸溶液をゆっくりと滴下し、その後１時間加熱攪拌した。反応後、溶液を室温まで放冷し、砕氷へ注ぎ、4,4'-Dinitro-2,2'-bipyridyl-N,N'-oxideの固体を濾過して得た。アルゴン気流下、4,4'-Dinitro-2,2'-bipyridyl-N,N'-oxide 7.0g(25mM)、10%パラジウム炭素6.0gをエタノール23mlに懸濁させた。この溶液にヒドラジン一水和物6.3g(126mmol)の47mlエタノール溶液を滴下し、8時間還流した。反応液を放冷後、濾過し、濾液を濃縮した。精製はシリカゲルカラムで行い、4,4'-Diamino-2,2'-bipyridylを得た。
＜合成＞ 50mLの2つ首フラスコにエチレングリコール(10mL)を入れ、DA-bpy(0.2g)、RuCl3(0.1g)を順次、撹拌溶解させ、N2気流下で強撹拌しながらマントルヒーターで加熱し、約４時間還流した。
＜精製＞ N2気流下で撹拌・放冷した後100mLのナス型フラスコに移し、反応液をアセトン(5mL)＋ジエチルエーテル(20mL)で洗浄した。溶媒のエチレングリコールが十分に除かれるまで、反応液をアセトン(5mL)＋ジエチルエーテル(20mL)で繰り返し洗浄した。十分に洗浄した目的物をエタノールで溶解させ、ジエチルエーテルを加えることによって目的物を沈殿させた。ジエチルエーテルで洗浄しながら濾別し、減圧乾燥させて、[Ru(4,4'-Diamino-2,2'-bipyridyl)3]の固体を得た。これを水溶して錯溶液を得た。
以下のようにして、2種類のオスミウム錯体を作製した。
[OsCl(Him)(dmbpy)2]
<合成> (NH4)2[OsCl6] 2.00g(4.56mmol、Aldrich)と4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridyl（dmbpy 和光純薬）1.68g(9.11mmol)を窒素気流下、エチレングリコール60ml中で1h還流した。室温まで冷却した後、1M亜二チオン酸ナトリウム水溶液120mlを30minかけて加え、氷浴中で30min冷却した。得られた沈澱を減圧ろ過し、十分に水で洗浄した(500〜1000ml使用)。さらにジエチルエーテルで２度洗浄した後、減圧乾燥した。これで[OsCl2(dmbpy)2]を1.5〜1.7g得る。得られた[OsCl2(dmbpy)2]1.56g(2.60mmol)とImidazole（Him）0.36g(5.2mmol)を窒素気流下、水/メタノール混合溶媒50ml中で2h還流した。室温まで冷却した後、飽和NaCl水溶液300mlを加えた。得られた沈澱を減圧ろ過し、飽和NaCl水溶液で洗浄した後、減圧乾燥し、[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2を得た。
<精製> [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2をできるだけ少量のアセトニトリル/メタノール(1:1v/v)で溶かし、カラムクロマトグラフィー（吸着剤：活性アルミナ，展開溶媒：アセトニトリル/メタノール）で精製した。溶媒をエバポレートした後、少量のアセトンに溶かし、ジエチルエーテルで再沈澱させた。得られた沈澱を減圧ろ過した後、減圧乾燥した。これを水溶して錯溶液を得た。
[Os(Him)2(dmbpy)2]
<合成> (NH4)2[OsCl6]2.00g(4.56mmol)とdmbpy1.68g(9.11mmol)を窒素気流下、エチレングリコール60ml中で1h還流した。室温まで冷却した後、1M亜二チオン酸ナトリウム水溶液120mlを30minかけて加え、氷浴中で30min冷却した。得られた沈澱を減圧ろ過し、十分に水で洗浄した(500〜1000ml使用)。さらにジエチルエーテルで２度洗浄した後、減圧乾燥した。これで[OsCl2(dmbpy)2]を1.5〜1.7g得る。得られた[OsCl2(dmbpy)2]1.56g(2.60mmol)とHim0.36g(5.2mmol)を窒素気流下、1,2-エタンジオール溶媒50ml中で2h還流した。室温まで冷却した後、飽和NaCl水溶液300mlを加えた。得られた沈澱を減圧ろ過し、飽和NaCl水溶液で洗浄した後、減圧乾燥し、[Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2を得た。
<精製> [Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2をできるだけ少量のアセトニトリル/メタノール(1:1v/v)で溶かし、カラムクロマトグラフィー（吸着剤：活性アルミナ，展開溶媒：アセトニトリル/メタノール）で精製した。溶媒をエバポレートした後、少量のアセトンに溶かし、ジエチルエーテルで再沈澱させた。得られた沈澱を減圧ろ過した後、減圧乾燥した。これを水溶して錯溶液を得た。
以下に示す組成で、錯体・酵素・発色剤・緩衝液を混合して試薬液を調製した。なお、前記錯体は、前述の実施例で合成したものを使用した。以下の実施例も同様である。前記試薬液のスペクトル測定してブランクとし、さらに前記錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を図５に示す。図示のように、金属錯体が電子伝達剤として働いてWST-5を還元し、還元型WST-5特有のスペクトルを示した。
(試薬液組成)
PQQ-GDH 50U/mL
[Ru(NH3)6] 0.8mM
WST-5 0.2mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
以下に示す組成で、錯体・酵素・発色剤・緩衝液を混合して試薬液を調製し、これをスペクトル測定し、ブランクとし、さらに前記錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を図６Ａ、図６Ｂに示す。図示のように、金属錯体が電子伝達剤として働いてMTTを還元し、還元型MTT特有のスペクトルを示した。
(試薬液組成１：図６Ａ)
PQQ-GDH 50U/mL
[Cu(1,10-Phenanthroline)2] 1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
(試薬液組成２：図６Ｂ)
PQQ-GDH 50U/mL
[Fe(Bathophenanthroline)3] 1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
（Bathophenanthroline＝4,7-Diphenyl phenanthoroline）
以下に示す組成で、錯体・酵素・発色剤・緩衝液を混合して試薬液を調製し、これをスペクトル測定し、ブランクとし、さらに前記錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を図７Ａ、図７Ｂに示す。図示のように、金属錯体が電子伝達剤として働いてMTTを還元し、還元型MTT特有のスペクトルを示した。
(試薬液組成１：図７Ａ)
PQQ-GDH 50U/mL
[Fe(2,2'-Bipyridyl)3] 1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
(試薬液組成２：図７Ｂ)
PQQ-GDH 50U/mL
[Fe(4,4'-Diamino-2,2'-Bipyridyl)3] 0.1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
以下に示す組成で、錯体・酵素・発色剤・緩衝液を混合して試薬液を調製し、これをスペクトル測定し、ブランクとし、さらに前記錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を図８に示す。図示のように、金属錯体が電子伝達剤として働いてMTTを還元し、還元型MTT特有のスペクトルを示した。
(試薬液組成)
PQQ-GDH 50U/mL
[Fe(TPTZ)3] 0.1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
（TPTZ＝2,4,6-Tripyridyl-s-triazine）
以下に示す組成で、錯体・酵素・発色剤・緩衝液を混合して試薬液を調製し、これをスペクトル測定し、ブランクとし、さらに前記錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を図９に示す。図示のように、金属錯体が電子伝達剤として働いてMTTを還元し、還元型MTT特有のスペクトルを示した。
(試薬液組成)
PQQ-GDH 50U/mL
[Cu(Cuproin)2] 1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
（Cuproin＝2,2'-Biquinoline）
以下に示す組成で、錯体・酵素・発色剤・緩衝液を混合して試薬液を調製し、これをスペクトル測定し、ブランクとし、さらに前記錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を図１０に示す。図示のように、金属錯体が電子伝達剤として働いてMTTを還元し、還元型MTT特有のスペクトルを示した。
(試薬液組成)
PQQ-GDH 50U/mL
[Fe(Nitro-PAPS)3] 0.02mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
以下に示す組成で、錯体・酵素・発色剤・緩衝液を混合して試薬液を調製し、これをスペクトル測定し、ブランクとし、さらに前記錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を図１１に示す。図示のように、金属錯体が電子伝達剤として働いてMTTを還元し、還元型MTT特有のスペクトルを示した。
(試薬液組成)
PQQ-GDH 50U/mL
[Fe(1-Nitroso-2-Naphthol)3] 0.1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
以下に示す組成で、錯体・酵素・発色剤・緩衝液を混合して試薬液を調製し、これをスペクトル測定し、ブランクとし、さらに前記錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を図１２に示す。図示のように、金属錯体が電子伝達剤として働いてMTTを還元し、還元型MTT特有のスペクトルを示した。
(試薬液組成)
PQQ-GDH 50U/mL
[Fe(2-Amino-4-thiazoleacetic acid)3] 1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
以下に示す組成で、錯体・酵素・発色剤・緩衝液を混合して試薬液を調製し、これをスペクトル測定し、ブランクとし、さらに前記錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を図１３に示す。図示のように、金属錯体が電子伝達剤として働いてMTTを還元し、還元型MTT特有のスペクトルを示した。
(試薬液組成)
PQQ-GDH 50U/mL
[Fe(1,2-Naphthoquinone-4-Sulfonic acid)3] 1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
以下に示す組成１，２で、錯体・酵素・発色剤・緩衝液を混合して試薬液を調製し、これをスペクトル測定し、ブランクとし、さらに前記錯体に対し当量のGlucoseを添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を図１４Ａに，図１４Ｂ示す。図示のように、金属錯体が電子伝達剤として働いてMTTを還元し、還元型MTT特有のスペクトルを示した。
(試薬液組成１：図１４Ａ)
PQQ-GDH 50U/mL
[OsCl(Him)(dmbpy)2] 0.1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
（Him＝Imidazole）
（dmbpy＝4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridyl）
(試薬液組成２：図１４Ｂ)
PQQ-GDH 50U/mL
[Os(Him)2(dmbpy)2] 0.1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
（Him＝Imidazole）
（dmbpy＝4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridyl）
以下に示す組成で、錯体・酵素（ピルビン酸オキシダーゼ）・発色剤・緩衝液を混合して試薬液を調製し、これをスペクトル測定し、ブランクとし、さらに前記錯体に対し当量のピルビン酸を添加し、色調変化後のスペクトルを測定した。この結果を図１５に示す。図示のように、金属錯体が電子伝達剤として働いてMTTを還元し、還元型MTT特有のスペクトルを示した。
(試薬液組成)
Pyruvate Oxidase 100U/mL
[OsCl(Him)(dmbpy)2] 0.1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
Triton X-100 0.5%
（Him＝Imidazole）
（dmbpy＝4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridyl）
この実施例は、酵素量を増やすことにより、試薬の反応速度を向上させることができることを確認した実施例である。まず、２つのメッシュ繊維（10cm×10cm）に対し、以下の組成１、２の試薬液を１ｍｌ含浸して，熱風で乾燥させた。この繊維をポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムに貼り付けて、所定形状に裁断し、酵素量が異なる２種類の試験片を作製した。この試験片に、試料として、血清ベースのグルコース標準液0,200,400,600mg/dl点着し、反射率測定装置（LED/波長660nm）により、30秒間のK/S変化を観察した。なお、前記血清ベースのグルコース標準液は、解糖しきったヒト全血の血漿を凍結融解し、得られた血清に対して、グルコース溶液を添加して調製したものである。この結果を、図１６Ａ、図１６Ｂに示す。図示のように、酵素量が５０００Ｕ／ｍｌの場合は、１０００Ｕ／ｍｌの場合に比べて反応速度が向上し、約５秒で反応が終局に達した。また、反応が終局に達したと思われる5秒付近のシグナルをサンプリングすれば、グルコース定量が可能であり、反応が終局に達するまでのタイムコース傾きからも、グルコース定量が可能であった。
（試薬液組成１：図１６Ａ）
PQQ-GDH 1000U/ml
[OsCl(Him)(dmbpy)2] 1ml
MMT 30mM
PIPES pH6.5 80mM
MEGA-8（同仁化学社製） 1%
Polyacrylamide 0.1%
BSA 1%
（試薬液組成２：図１６Ｂ）
PQQ-GDH 5000U/ml
[OsCl(Him)(dmbpy)2] 1ml
MMT 30mM
PIPES pH6.5 80mM
MEGA-8（同仁化学社製） 1%
Polyacrylamide 0.1%
BSA 1%
以上のように、本発明の比色分析方法によれば、短時間かつ簡単に信頼性のある分析を実施できる。
図１は、本発明の一実施例におけるグルコース濃度と発色との関係を示すグラフである。 図２は、本発明のその他の実施例におけるグルコース濃度と発色との関係を示すグラフである。 図３は、本発明のさらにその他の実施例におけるグルコース濃度と発色との関係を示すグラフである。 図４は、本発明のさらにその他の実施例におけるグルコース濃度と発色との関係を示すグラフである。 図５は、本発明のさらにその他の実施例における発色剤の発色を示すグラフである。 図６Ａ、図６Ｂは、本発明のさらにその他の実施例における発色剤の発色を示すグラフである。 図７Ａ、図７Ｂは、本発明のさらにその他の実施例における発色剤の発色を示すグラフである。 図８は、本発明のさらにその他の実施例における発色剤の発色を示すグラフである。 図９は、本発明のさらにその他の実施例における発色剤の発色を示すグラフである。 図１０は、本発明のさらにその他の実施例における発色剤の発色を示すグラフである。 図１１は、本発明のさらにその他の実施例における発色剤の発色を示すグラフである。 図１２は、本発明のさらにその他の実施例における発色剤の発色を示すグラフである。 図１３は、本発明のさらにその他の実施例における発色剤の発色を示すグラフである。 図１４Ａ、図１４Ｂは、本発明のさらにその他の実施例における発色剤の発色を示すグラフである。 図１５は、本発明のさらにその他の実施例における発色剤の発色を示すグラフである。 図１６Ａ、図１６Ｂは、本発明のさらにその他の実施例における発色剤の発色を示すグラフである。

Claims (18)

  1. 分析対象物の定性若しくは定量を行う比色分析方法であって、
    酸化還元酵素と前記分析対象物との反応により生じた電子をメディエータが受容し、前記メディエータが還元されて発色する発色剤に前記電子を伝達し、その結果生じる前記発色剤の発色を測定することを含み、
    前記メディエータが、銅錯体、鉄錯体、オスミウム錯体およびルテニウム錯体からなる群から選択された少なくとも一つであり、
    前記分析対象物が、グルコース又はピルビン酸であり、
    前記酸化還元酵素が、グルコース又はピルビン酸の酸化酵素又は脱水素酵素であり、
    前記発色剤が、テトラゾリウム塩である比色分析方法。
  2. 前記錯体の配位子の配位原子が、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択された少なくとも一つである請求項１記載の比色分析方法。
  3. 前記錯体の配位子が、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、シュウ酸および前記各化合物の誘導体からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１記載の比色分析方法。
  4. 配位子の配位座以外における水素原子の少なくとも一つが、置換基により置換された配位子である請求項３記載の比色分析方法。
  5. 置換基が、アルキル基、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基からなる群から選択された少なくとも一つである請求項４記載の比色分析方法。
  6. 錯体が、配位子を２種類以上有する請求項１から５のいずれか一項に記載の比色分析方法。
  7. テトラゾリウム塩が、ニトロフェニル基、チアゾリル基およびベンゾチアゾリル基の少なくとも一つの基を有する請求項１から６のいずれか一項に記載の比色分析方法。
  8. テトラゾリウム塩が、ＭＴＴ、ＩＮＴ、Neo-ＴＢ、Nitro-ＴＢ、ＴＢ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＷＳＴ−８、2-(2-Benzothiazolyl)-3,5-diphenyltetrazolium Bromide、2-(2-Benzothiazolyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Bromide、2,3-Bis(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Chloride、2,3-Di(4-nitrophenyl)tetrazolium Perchlorate、3-(3-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride、および、3-(4-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chlorideからなる群から選択された少なくとも一つの発色剤である請求項１から６のいずれか一項に記載の比色分析方法。
  9. 請求項１から８のいずれか一項に記載の比色分析方法に使用する試薬であって、
    酸化還元酵素、メディエータおよび還元により発色する発色剤を含み、
    前記メディエータが、銅錯体、鉄錯体、オスミウム錯体およびルテニウム錯体からなる群から選択された少なくとも一つであり、
    分析対象物が、グルコース又はピルビン酸であり、
    前記酸化還元酵素が、グルコース又はピルビン酸の酸化酵素又は脱水素酵素であり、
    前記発色剤が、テトラゾリウム塩である試薬。
  10. 錯体の配位子の配位原子が、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択された少なくとも一つである請求項９記載の試薬。
  11. 前記錯体の配位子が、アンモニア、ビピリジル化合物、イミダゾール化合物、フェナントロリン化合物、エチレンジアミン化合物、アミノ酸、トリアジン化合物、 ビキノリン化合物、ピリジルアゾ化合物、ニトロソ化合物、オキシン化合物、ベンゾチアゾール化合物、アセチルアセトン化合物、アントラキノン化合物、キサンテン化合物、シュウ酸および前記各化合物の誘導体からなる群から選択された少なくとも一つである請求項９記載の試薬。
  12. 配位子の配位座以外における水素原子の少なくとも一つが、置換基により置換された配位子である請求項１１記載の試薬。
  13. 置換基が、アルキル基、アリール基、アリル基、フェニル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、カルボニル基、スルホン基、スルホニル基、ニトロ基、ニトロソ基、１級アミン、２級アミン、３級アミン、アミノ基、アシル基、アミド基およびハロゲン基からなる群から選択された少なくとも一つである請求項１２記載の試薬。
  14. 錯体が、配位子を２種類以上有する請求項９から１３のいずれか一項に記載の試薬。
  15. テトラゾリウム塩が、ニトロフェニル基、チアゾリル基およびベンゾチアゾリル基の少なくとも一つの基を有する請求項９から１４のいずれか一項に記載の試薬。
  16. テトラゾリウム塩が、ＭＴＴ、ＩＮＴ、 Neo- ＴＢ、 Nitro- ＴＢ、ＴＢ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＷＳＴ−８、 2-(2-Benzothiazolyl)-3,5-diphenyltetrazolium Bromide 、 2-(2-Benzothiazolyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Bromide 、 2,3-Bis(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Chloride 、 2,3-Di(4-nitrophenyl)tetrazolium Perchlorate 、 3-(3-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride 、および、 3-(4-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride からなる群から選択された少なくとも一つの発色剤である請求項９から１４のいずれか一項に記載の試薬。
  17. 請求項９から１６のいずれか一項に記載の試薬を含む比色分析用の試験片。
  18. さらに、無機ゲルを含む請求項１７記載の試験片。
JP2003558198A 2001-12-28 2003-01-06 比色分析方法およびそれに用いる試薬 Expired - Lifetime JP4045323B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001400380 2001-12-28
JP2001400380 2001-12-28
PCT/JP2003/000027 WO2003057905A1 (fr) 2001-12-28 2003-01-06 Procede de colorimetrie et reactif utilise dans ce procede

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2003057905A1 JPWO2003057905A1 (ja) 2005-05-19
JP4045323B2 true JP4045323B2 (ja) 2008-02-13

Family

ID=19189611

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003558198A Expired - Lifetime JP4045323B2 (ja) 2001-12-28 2003-01-06 比色分析方法およびそれに用いる試薬

Country Status (14)

Country Link
US (2) US7550273B2 (ja)
EP (2) EP1457572B1 (ja)
JP (1) JP4045323B2 (ja)
KR (2) KR100557899B1 (ja)
CN (1) CN1261588C (ja)
AT (2) ATE426676T1 (ja)
AU (1) AU2003201901B2 (ja)
CA (1) CA2448128C (ja)
DE (2) DE60326814D1 (ja)
ES (2) ES2350507T3 (ja)
NZ (1) NZ529279A (ja)
PL (1) PL213316B1 (ja)
WO (1) WO2003057905A1 (ja)
ZA (1) ZA200308519B (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019142800A (ja) * 2018-02-20 2019-08-29 公立大学法人山陽小野田市立山口東京理科大学 化合物及び光触媒用助触媒

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL213316B1 (pl) 2001-12-28 2013-02-28 Arkray Sposób analizy kolorymetrycznej, odczynnik i próbka do badan
CN1306039C (zh) * 2001-12-28 2007-03-21 爱科来株式会社 比色分析方法及其使用的试剂
JP4717637B2 (ja) * 2004-01-07 2011-07-06 アークレイ株式会社 試薬部の配置を改良した分析用具および分析方法
WO2009144881A1 (ja) * 2008-05-16 2009-12-03 パナソニック株式会社 クレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス、及び測定装置、並びにそれらを用いた塩分量の測定方法、測定デバイス、及び測定装置
EP2636750A1 (en) 2012-03-06 2013-09-11 Roche Diagniostics GmbH Compatible solute ectoine as well as derivatives thereof for enzyme stabilization
EP2994536B1 (en) 2013-05-08 2017-06-14 Roche Diabetes Care GmbH Stabilization of enzymes by nicotinic acid
EP2927319A1 (en) 2014-03-31 2015-10-07 Roche Diagnostics GmbH High load enzyme immobilization by crosslinking
ES2756714T3 (es) 2014-08-25 2020-04-27 Hoffmann La Roche Tira reactiva de dos electrodos que compensan la interferencia
EP3523639A4 (en) 2016-10-05 2020-06-03 H. Hoffnabb-La Roche Ag DETECTION REAGENTS AND ELECTRODE ARRANGEMENTS FOR DIAGNOSTIC MULTIANALYTE TEST ELEMENTS AND METHOD FOR USE THEREOF
US11986288B2 (en) 2017-03-06 2024-05-21 Medtronic Minimed, Inc. Colorometric sensor for the non-invasive screening of glucose in sweat in pre and type 2 diabetes
WO2018165180A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Medtronic Minimed, Inc. Colorometric sensor for the non-invasive screening of glucose in sweat in pre and type 2 diabetes
CN116018084A (zh) 2020-09-18 2023-04-25 美敦力迷你迈德公司 酮体感测装置和方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
JPS57192483A (en) 1981-05-21 1982-11-26 Mitsubishi Electric Corp Electrochromic display element consisting of organic metal complex
DE3374019D1 (en) * 1982-07-23 1987-11-12 Wako Pure Chem Ind Ltd Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase
US4701420A (en) * 1985-04-01 1987-10-20 Eastman Kodak Company Analytical compositions, elements and methods utilizing reduction of ferric ion chelates to form detectable dyes
US5036000A (en) * 1986-12-16 1991-07-30 Enzymatics, Inc. Threshold color control system
JPH0659236B2 (ja) 1987-12-14 1994-08-10 理化学研究所 生体基質濃度の測定方法及びそれに使用する酸素センサー
AU640162B2 (en) 1989-08-28 1993-08-19 Lifescan, Inc. Blood separation and analyte detection techniques
JPH0343096A (ja) 1990-06-18 1991-02-25 Iatron Lab Inc 基質又は酵素の定量方法
WO1992015701A1 (en) 1991-02-27 1992-09-17 Boehringer Mannheim Corporation Improved method and reagent for determination of an analyte
US5264348A (en) 1991-05-13 1993-11-23 Miles Inc. Ascorbate interference-resistant composition, device and method of assaying for predetermined analyte
FR2699170B1 (fr) 1992-12-15 1995-07-28 Asulab Sa Complexes d'un métal de transition à ligands 2,2'-bipyridine substitués par au moins un radical ammonium alkyle, leur procédé de fabrication et leur application comme médiateur redox.
JP3217066B2 (ja) 1993-01-28 2001-10-09 ロシュ ダイアグノスティックス コーポレーション アナライトの嫌気的定量に有用な組成物
ES2182892T3 (es) * 1995-02-14 2003-03-16 Roche Diagnostics Corp Mediador redox conteniendo osmio.
US5938917A (en) * 1995-04-05 1999-08-17 The Regents Of The University Of California Electrodes for measurement of peroxides
JP3881415B2 (ja) 1997-03-11 2007-02-14 ロッシュ ディアグノスティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 免疫分析装置
WO1999017115A1 (en) * 1997-09-30 1999-04-08 Amira Medical Membrane based electrochemical test device and related methods
ES2206853T3 (es) * 1998-11-10 2004-05-16 Unilever N.V. Catalizadores de blanqueo y oxidacion.
AU7590300A (en) 1999-09-20 2001-04-24 Roche Diagnostics Corporation Small volume biosensor for continuous analyte monitoring
CN1306039C (zh) 2001-12-28 2007-03-21 爱科来株式会社 比色分析方法及其使用的试剂
PL213316B1 (pl) 2001-12-28 2013-02-28 Arkray Sposób analizy kolorymetrycznej, odczynnik i próbka do badan

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019142800A (ja) * 2018-02-20 2019-08-29 公立大学法人山陽小野田市立山口東京理科大学 化合物及び光触媒用助触媒
JP7072797B2 (ja) 2018-02-20 2022-05-23 公立大学法人山陽小野田市立山口東京理科大学 化合物及び光触媒用助触媒

Also Published As

Publication number Publication date
EP1942195A1 (en) 2008-07-09
KR20060010872A (ko) 2006-02-02
US20040142406A1 (en) 2004-07-22
EP1457572B1 (en) 2009-03-25
EP1457572A1 (en) 2004-09-15
US7550273B2 (en) 2009-06-23
CA2448128C (en) 2009-07-14
CN1522302A (zh) 2004-08-18
AU2003201901A1 (en) 2003-07-24
PL213316B1 (pl) 2013-02-28
KR100557899B1 (ko) 2006-03-10
NZ529279A (en) 2005-12-23
ES2322990T3 (es) 2009-07-03
ZA200308519B (en) 2004-11-04
KR20040010671A (ko) 2004-01-31
EP1942195B1 (en) 2010-09-22
ATE482285T1 (de) 2010-10-15
EP1457572A4 (en) 2006-04-05
US20090233322A1 (en) 2009-09-17
AU2003201901B2 (en) 2006-09-21
CN1261588C (zh) 2006-06-28
WO2003057905A1 (fr) 2003-07-17
ATE426676T1 (de) 2009-04-15
CA2448128A1 (en) 2003-06-28
JPWO2003057905A1 (ja) 2005-05-19
KR100693899B1 (ko) 2007-03-12
DE60334333D1 (de) 2010-11-04
PL369143A1 (en) 2005-04-18
US8574896B2 (en) 2013-11-05
DE60326814D1 (de) 2009-05-07
ES2350507T3 (es) 2011-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8574896B2 (en) Colorimetric method and reagent used for the same
JP4090435B2 (ja) 比色分析方法およびそれに用いる試薬
JPS61138163A (ja) 発色性カップラー及び過酸化水素又は他の被分析物の測定へのその使用
JP2005118014A (ja) 分析方法およびそれに用いる試薬
JP5231392B2 (ja) 酸化発色化合物またはその塩およびその製造方法、ならびに試薬組成物およびこれを用いた試験具
JPH01128797A (ja) 酵素活性の定量法
JPH09329598A (ja) 試薬組成物、試験片及び測定キット
JP4385212B2 (ja) 比色分析方法およびそれに用いる試験片
JP2005077314A (ja) 比色分析方法およびそれに用いる試薬
JP2566790B2 (ja) ジフェニルアミン誘導体
JP2001238697A (ja) デヒドロゲナーゼまたはその基質を測定するための安定化補酵素溶液およびその使用
JP2009084374A (ja) 酸化発色化合物、試薬組成物、および試験具
JPH03282259A (ja) レドックス反応に基づく過酸化活性物質測定用組成物及びそれを用いた試験片

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070111

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070309

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070403

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070601

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20070628

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070730

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070827

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20070831

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20070920

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20071016

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101130

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 4045323

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111130

Year of fee payment: 4

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121130

Year of fee payment: 5

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131130

Year of fee payment: 6

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term