JP3073076B2

JP3073076B2 - リパーゼ活性測定用組成物及びその組成物を用いるリパーゼ活性測定方法

Info

Publication number: JP3073076B2
Application number: JP03315221A
Authority: JP
Inventors: 三知夫浜; 道代中山; 満直田中
Original assignee: 株式会社ヤトロン
Priority date: 1991-11-05
Filing date: 1991-11-05
Publication date: 2000-08-07
Anticipated expiration: 2015-08-07
Also published as: JPH05123194A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体成分中に含まれる
リパーゼ活性を測定する方法、及びその測定に用いる組
成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】リパーゼは動物、植物を問わず自然界に
広く分布している酵素であり、その活性を測定する目的
も多岐に渡っている。臨床的見地からは、急性膵炎や膵
臓癌等の膵臓疾患の診断指標として特に重要である。従
って、従来から種々の方法により、リパーゼ活性が臨床
的に測定されてきた。血清中の膵臓由来のリパーゼの活
性測定では、古くからその基質としてトリグリセライド
が用いられてきた。

【０００３】例えば、トリグリセライドを主成分とする
オリーブ油にアラビアゴム又はポリビニルアルコールな
どを添加して乳化させたエマルジョンを基質として用
い、リパーゼの作用により遊離する脂肪酸の酸度をアル
カリ滴定する方法や、脂肪酸の銅錯塩抽出法〔臨床検査
１５（２）、１９１、１９７１〕が使われてきた。しか
し、この組成物はエマルジョンとして強い濁度を呈する
ので、作成後に相分離を起こし易いだけでなく、分光的
測定に使用することもできなかった。近年にはこの方法
も改良され、乳化オリーブ油を基質として用い、リパー
ゼ作用により減少する濁度を分光学的に測定する比濁法
が使われるようになっている。しかし、測定操作が簡便
にはなったものの、感度が低く、リパーゼ活性以外の要
因が濁度の減少ばかりでなく、増大をも引き起こす場合
があった。更に均一で安定な基質の調製が困難なために
ロット差が大きくなり、再現性の点でも問題が多く残さ
れていた。

【０００４】これらの問題を解消するために種々の界面
活性剤を用いた組成物が報告されている。例えば、非水
溶性物質の可溶化水溶液（特公昭59-391693 号公報）や
リパーゼ活性測定用組成物（特開昭59-91898号公報）で
あり、これらはいずれも高級脂肪酸を構成要素とするト
リグリセライド、モノグリセライド又は１，２−ジグリ
セライドを０．１％以上の非イオン性界面活性剤存在下
に水に可溶化して得られた組成物であるが、界面活性剤
の使用に依存するために現れるロット差の存在、試薬成
分の不安定化、その種類や検出系によっては界面活性剤
中の夾雑物の影響などの問題があった。一方、合成基質
を用いる発色法であるリパーゼ基質及びリパーゼの視覚
的測定法及び測定試薬（特開昭61-254197 号公報）にお
いては、特異性が不十分であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このように従来のリパ
ーゼ活性測定用組成物には、依然として組成物を構成す
る物質に起因する種々の問題があった。本発明者はこれ
らの問題点を解消するために種々の研究を重ねた結果、
脂肪酸及び／又は脂肪族アミンを用いてグリセライドを
超微粒子化することによって得られる水性透明液は、い
ずれのリパーゼ活性測定系にも使用することができる有
用な基質組成物であることを見出した。金属、金属酸化
物、その他の金属化合物（炭化物、窒化物など）、セラ
ミックス、有機化合物などの各種物質を微粉化すると表
面積が著しく増大し、その結果、例えば水不溶性ないし
水難溶性化合物の安定な水分散液を得ることは知られて
いる（特開昭62-106833 号公報）。しかし、本発明によ
れば、（ａ）グリセライドと（ｂ）脂肪酸及び／又は脂
肪族アミンと（ｃ）水とを混合し、例えば加温しながら
超音波処理を行なうことによって得られる水性透明液
は、驚くべきことに界面活性剤等を使用せずに、水不溶
性グリセライド（ａ）と水不溶性脂肪酸及び／又は脂肪
族アミン（ｂ）と溶媒としての水（ｃ）とだけからなる
にもかかわらず透明で安定な溶液を形成する。この水性
透明液は他に添加物（安定剤、溶解剤など）を使わない
点において従来の組成物と区別することができると同時
にリパーゼ活性の検出又は測定に用いる基質として極め
て良好であることが分かった。本発明は、こうした知見
に基づくものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、グリ
セライドと脂肪酸及び／又は脂肪族アミンとを、超微粒
子化された状態で、水中に均質に含有することを特徴と
する、リパーゼ活性測定用組成物に関する。また、本発
明は、グリセライドと脂肪酸及び／又は脂肪族アミンと
を超微粒子化された状態で均質に含有し、更に賦形剤を
含有することを特徴とする、リパーゼ活性測定用粉末状
組成物に関する。更に、本発明は、グリセライドからリ
パーゼの作用によって生成される化合物に作用して検出
可能な変化を生ずることのできる試薬の存在下に、グリ
セライド及び脂肪酸及び／又は脂肪族アミンを超微粒子
化された状態で水中に均質に含有する組成物と被検試料
とを接触させ、前記の検出可能な変化を検出することを
特徴とする、リパーゼの活性測定方法にも関する。

【０００７】本発明組成物においてリパーゼ活性測定用
の基質となるグリセライドは、脂肪酸と３価アルコール
であるグリセロールとのエステルであり、グリセロール
水酸基の３個、２個（１，２位あるいは１，３位）又は
１個（１位、２位又は３位）が脂肪酸によりエステル化
されたものであり、次の一般式（Ｉ）で表される。

【０００８】

【化１】

【０００９】前記一般式（Ｉ）のＲ₁、Ｒ₂及びＲ₃に
おける高級脂肪酸残基は、例えば以下の脂肪酸の残基で
ある。（１）飽和脂肪酸ラウリン酸Ｃ₁₁Ｈ₂₃ＣＯＯＨ；ミリスチン酸Ｃ₁₃Ｈ₂₇Ｃ
ＯＯＨ；パルミチン酸Ｃ₁₅Ｈ₃₁ＣＯＯＨ；ステアリン酸
Ｃ₁₇Ｈ₃₅ＣＯＯＨ；アラキン酸Ｃ₁₉Ｈ₃₉ＣＯＯＨ；ベヘ
ン酸Ｃ₂₁Ｈ₄₃ＣＯＯＨ。（２）不飽和脂肪酸リンデル酸Ｃ₁₂Ｈ₂₂Ｏ₂；ラウロレイン酸Ｃ₁₂Ｈ
₂₂Ｏ₂；ツヅ酸Ｃ₁₄Ｈ₂₆Ｏ₂；フィセトレイン酸Ｃ₁₄Ｈ
₂₆Ｏ₂；ミリストレイン酸Ｃ₁₄Ｈ₂₆Ｏ₂；パルミトオレ
イン酸Ｃ₁₆Ｈ₃₀Ｏ₂；ペトロセリン酸Ｃ₁₈Ｈ₃₄Ｏ₂；オ
レイン酸Ｃ₁₈Ｈ₃₄Ｏ₂；エライジン酸Ｃ₁₈Ｈ₃₄Ｏ₂；バ
クセン酸Ｃ₁₈Ｈ₃₄Ｏ₂；リノール酸Ｃ₁₈Ｈ₃₂Ｏ₂；リノ
レン酸Ｃ₁₈Ｈ₃₀Ｏ₂；α−エレオステアリン酸Ｃ₁₈Ｈ₃₀
Ｏ₂；β−エレオステアリン酸Ｃ₁₈Ｈ₃₀Ｏ₂；プニカ酸
Ｃ₁₈Ｈ₃₀Ｏ₂；パリナリン酸Ｃ₁₈Ｈ₂₈Ｏ₂；カドレイン
酸Ｃ₂₀Ｈ₃₈Ｏ₂；セトレイン酸Ｃ₂₂Ｈ₄₂Ｏ₂；エルカ酸
Ｃ₂₂Ｈ₄₂Ｏ₂；アラキドン酸Ｃ₂₀Ｈ₃₂Ｏ₂。

【００１０】本発明では、それらのグリセライドを水と
混ぜ合わせ、安定に維持するために添加剤として脂肪酸
及び／又は脂肪族アミンを用いる。本発明で添加剤とし
て用いる脂肪酸は、好ましくは炭素原子８〜３０個（よ
り好ましくは、炭素原子８〜２４個）の飽和又は不飽和
の脂肪酸であり、前記のグリセライド構成脂肪酸を用い
ることもできるが、特に好ましくは、カプリン酸、ミリ
スチン酸、パルミチン酸、オレイン酸又はリノレン酸等
を挙げることができる。

【００１１】また、本発明で用いる脂肪族アミンは、好
ましくは炭素原子８〜２４個（より好ましくは、炭素原
子１０〜２２個）の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素を有
する、第１アミン、第２アミン又は第３アミンであり、
例えば、ラウリルアミン又はステアリルアミンがある。

【００１２】本発明の基質溶液は、前記のグリセライド
の量に対して前記の脂肪酸及び／又は脂肪族アミン好ま
しくは０．５〜２００重量％、より好ましくは１〜５０
重量％を含ませることにより、前記のグリセライドを
０．００５〜０．５重量％の量で水中に含有することが
できる。

【００１３】本発明の基質溶液は、例えば、以下の方法
で調製することができる。（１）グリセライドの水性分散液に脂肪酸及び／又は脂
肪族アミンを添加し、物理的擾乱（perturbation）を与
える方法。（２）グリセライドの水性分散液と脂肪酸及び／又は脂
肪族アミンの水性分散液とを混合し、物理的擾乱を与え
る方法。（３）グリセライドと脂肪酸及び／又は脂肪族アミンと
の水性分散液に物理的擾乱を与える方法。（４）脂肪酸及び／又は脂肪族アミンの水性分散液にグ
リセライドを添加し、物理的擾乱を与える方法。

【００１４】グリセライドの水性分散液あるいは脂肪酸
及び／又は脂肪族アミンの水性分散液の調製は、グリセ
ライドあるいは脂肪酸及び／又は脂肪族アミンを精製
水、生理食塩水あるいは種々の緩衝液（例えば、リン酸
緩衝液又はホウ酸緩衝液）に加え、予備的に物理的擾乱
を加えることによって行うことができる。

【００１５】物理的擾乱は、超高速ホモジナイザーによ
る攪拌、超音波処理による方法、高圧ホモジナイザー、
フレンチプレス、コロイドミル等によって与えることが
できる。超音波処理による物理的擾乱が好ましく、超音
波は１０〜３０ＫＨｚで、水中における強さとしては１
０〜１００Ｗであれば充分である。また、高圧ホモジナ
イザーは１００〜1,000kg ／cm²の範囲、フレンチプレ
スは1,000 〜10,000kg／cm²の範囲、そしてコロイドミ
ルは1,000 〜20,000ｒｐｍの範囲であればそれぞれ充分
である。

【００１６】物理的擾乱を加える際に加温処理をするの
が好ましい。加温処理の温度は、その水性分散液に含ま
れているグリセライド、脂肪酸及び／又は脂肪族アミン
が変質しない温度で行う。好ましくは１００℃以下で行
う。

【００１７】また、グリセライドの濃度が比較的高い水
性透明液を調製する場合には、最初から所望濃度のグリ
セライドを水性分散液中に加えて目的とする水性透明液
を調製してもよいが、所望濃度よりも低濃度のグリセラ
イド含有水性透明液を最初に調製した後、減圧下で水分
を留去させることもできる。

【００１８】従来法でトリグリセライド（例えば、トリ
オレイン）を水と混ぜ合わせるには、例えば、特開昭58
-156330 号公報に開示されている方法、即ち、非イオン
界面活性剤水溶液の曇点を境にして現れる物理的作用の
変化を応用した特殊で複雑な方法を利用することができ
たが、それ以外では極めて困難であった。しかし、本発
明者が見出したところによれば、トリオレインを0.005
〜０．５重量％含有する水性透明液が、脂肪酸（例え
ば、パルミチン酸）をトリオレインの量に対して１〜２
０重量％共存させるだけで得られる。即ち、トリオレイ
ンに所望の濃度になるように精製水、生理食塩水あるい
は種々の緩衝液を加え、５〜６０秒間物理的擾乱として
超音波処理を行ない、そこにトリオレインの量に対して
１〜２０重量％のパルミチン酸を添加して分散させた
後、約７０℃に加温しながら超音波処理を行うだけでト
リオレインの水性透明液を調製することができる。こう
して調製されたトリオレインの水性透明液は極めて透明
性に優れ、波長５５０nm（可視域４００〜７００nmの中
間波長）におけるその透過率は９５％以上である。ま
た、調製後６ケ月経過してもその透明性に変化はない。

【００１９】前記の水性透明液は、粉末状組成物（例え
ば、凍結乾燥体）として長期間保存することができ、水
を加えるだけで簡単に元の水性透明液に再現することが
できる。一般的に凍結乾燥体を製造するには賦形剤が必
要である。賦形剤としては、糖類（例えば、グルコー
ス、サッカロース、ラクトース等）、多糖類（例えば、
デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロー
ス、フィコール等）、多糖類の誘導体、アミノ酸（グリ
シン等）、タンパク質（アルブミン等）、合成高分子化
合物（ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール
等）、無機塩（塩化カリウム等）等が用いられる。それ
ら賦形剤（１種又は２種以上）１〜１０％程度を水性透
明液に添加し、公知の方法によって凍結乾燥することで
製造することができる。こうして調製された粉末状組成
物に水を添加して得られる水性透明液の透明性は、凍結
乾燥前と比較して、同等かあるいは向上する。これは、
賦形剤が有する補助効果によるものである。

【００２０】前記の水性透明液及び粉末状組成物は、必
須の配合成分（即ち、前記のグリセライド、脂肪酸及び
／又は脂肪族アミン、並びに賦形剤）以外にも、所望に
より、従来から公知の任意の添加剤、例えば、界面活性
剤、安定剤、防腐剤等を含有することができる。しか
も、これら合成界面活性剤などの所望成分は、その使用
量を大幅に減少させても、目的とする効果を達成するこ
とができる。

【００２１】本発明のリパーゼ検出用組成物は、被検試
料中に存在するリパーゼの作用により、その基質である
グリセライドから脂肪酸又はグリセロールを生成させ、
それらの生成物を従来公知の手段により検出することに
基づいている。基質のグリセライドの反応時における濃
度は、０．０１〜０．５％、好ましくは０．０２〜０．
４％、より好ましくは０．０４〜０．２％となるように
調整する。コファクターであるコリパーゼの反応時にお
ける濃度は、５０〜３００μｇ／ml、好ましくは７５〜
１５０μｇ／mlである。

【００２２】必要に応じて反応促進剤として胆汁酸を存
在させることができる。胆汁酸としては、コラン酸類、
例えば、コール酸、デオキシコール酸又はリトコール酸
等、好ましくはそれらの塩類を用いることができる。胆
汁酸の反応時における濃度は、０．１〜１０mM、好まし
くは０．５〜２mMである。同様に必要に応じて塩化カル
シウムを存在させることができる。反応時における濃度
は、０．２〜５mM、好ましくは０．５〜２mMである。リ
パーゼ活性発現のpH範囲は７〜９であり、そのpH値を維
持するための緩衝液としては、５mM〜１Ｍ、好ましくは
１０mM〜５００mMのトリス緩衝液、グッド緩衝液、リン
酸緩衝液等の公知の緩衝液を使用することができる。ま
た、基質としてトリグリセライド又はジグリセライドを
用いる場合には、ジグリセライドリパーゼ及び／又はモ
ノグリセライドリパーゼを存在させることもできる。即
ち、基質のトリグリセライドからジグリセライドが生成
され、これからモノグリセライドあるいはグリセロール
が生成されるまでの反応を速やかに進行させるために、
これらの酵素を使用するのが好ましい。それぞれの酵素
は単独又は双方を存在させることができる。これらの酵
素は反応時において、０．１〜２０単位、好ましくは
０．５〜５単位を存在させればよい。以上の各成分を、
それぞれ個別に又は組合わせて又は１試薬として用いる
ことができる。更に、従来公知の安定剤や防腐剤を共存
させても何ら問題はない。

【００２３】基質から生成した脂肪酸又はグリセロール
を従来公知の手段で検出し、リパーゼ活性を測定する。
このようにして得られた本発明リパーゼ測定用試薬は、
リパーゼ活性を測定する試薬として非常に有効で安定な
組成物である。

【００２４】本発明の組成物は、従来公知の各種のリパ
ーゼ活性測定方法にそのまま適用することができる。リ
パーゼ活性の検出又は測定方法は、既知量の基質（即ち
グリセライド）から種々の酵素反応を経て得られる各種
生成物の生成量又は中間体の残存量を測定することによ
って行う。基質としてトリグリセライド又はジグリセラ
イドを用いる場合の反応系の例としては以下の式（１）
及び式（２）を挙げることができる。

【００２５】

【化２】

【００２６】基質であるトリグリセライド又はジグリセ
ライドから、リパーゼ反応によって脂肪酸及びモノグリ
セライドが生成する（１）。続いて、得られた脂肪酸は
コエンザイムＡ（ＣｏＡ）及びアデノシン３リン酸（Ａ
ＴＰ）の存在下にアシルコエンザイムＡシンセターゼ
（ＡＣＳ）の作用によって、アシルＣｏＡ、ＡＭＰ及び
ピロリン酸を生成する（２）。その後、前記の式（２）
において（イ）生成したアデノシン１リン酸（ＡＭＰ）を測定す
る方法、（ロ）生成したアシルＣｏＡを測定する方法、
又は（ハ）残存するＣｏＡを測定する方法を採用するこ
とができる。これらの各測定法の具体例を挙げると、測
定法（イ）では以下の反応式（３）〜（５）で示される
反応式を利用する。

【００２７】

【化３】

【００２８】即ち、ＡＭＰに、ＡＴＰとホスフォエノー
ルピルビン酸（ＰＥＰ）の共存下にミオキナーゼ（Ｍ
Ｋ）及びピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）を作用させ
〔（３）及び（４）〕、生じたピルビン酸に乳酸脱水素
酵素（ＬＤＨ）を作用させて還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の減少量を測定する
（５）。あるいは以下の反応式（６）で示す通り、ピル
ビン酸酸化酵素（ＰＯＰ）を用いてＨ₂Ｏ₂の生成量を
当業者に公知の比色法で測定する。

【００２９】

【化４】

【００３０】こうして、被検試料中に存在するリパーゼ
の活性を脂肪酸量として測定することができる。なお、
基質として用いる水性透明液の調製に脂肪酸を用いる場
合には水性透明液に脂肪酸が予め添加されていることが
あるが、その添加量はグリセライドに対する相対濃度が
数％（重量％）程度の低濃度であるので、単に試薬ブラ
ンクを差し引くという常法の操作だけで特別に問題にな
ることはない。また、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の減少量を測定する場合〔前
記反応式（５）〕に、被検試料中に含まれる脂肪酸の量
が多いと測定レンジがその分狭くなるため、必要に応じ
て反応式（５）の反応前に被検試料中に含まれる脂肪酸
の消去反応を行ってもよい。あるいは脂肪酸に代えて脂
肪族アミンを使って調製された基質水性透明液を用いて
もよい。

【００３１】前記測定法（イ）の例としては、ＡＤＰデ
アミナーゼを使用してアンモニアを測定する方法、ＡＭ
Ｐデアミナーゼを使用してアンモニアを測定する方法、
あるいはＡＭＰヌクレオチダーゼ、アデニンデアミナー
ゼを作用させてアンモニアを測定する方法、更にはＡＭ
Ｐピロホスホリラーゼ、アデニンデアミナーゼを作用さ
せアンモニアを測定する方法も挙げることができる。

【００３２】前記測定法（ロ）では、例えば、以下の反
応式（７）に示すように、アシルＣｏＡオキシダーゼ
（ＡＣＯ）を作用させて生成する過酸化水素をペルオキ
シダーゼあるいはカタラーゼの反応系を用いて測定する
等の例を挙げることができる。

【００３３】

【化５】

【００３４】生成した過酸化水素を測定する場合には、
ペルオキシダーゼ存在下に４−アミノアンチピリンと以
下に示す各種のカプラーとを酸化縮合させる。カプラー
としては、フェノール系、アニリン系又はトルイジン系
の化合物があり、例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイ
ジン、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシ
エチル）−アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、３，５−
ジメトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン等が
ある。その他、４−アミノアンチピリンに代えて、３−
メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンを用いた
り、あるいは４−アミノアンチピリン非存在下には、１
０−（３−メトキシカルボキシル−アミノメチル−ベン
ゾイル−カルバモイル）−３，７−ビス（ジメチル−ア
ミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン、３−ビス（４−クロ
ロフェニル）メチル−４−ジメチル−アミノフェニルア
ミン等のカプラーを用いてもよい。また、直接アシルＣ
ｏＡを脂肪酸代謝の主経路であるβ酸化系、即ち、アシ
ルＣｏＡをアシルＣｏＡオキシダーゼによって２，３−
トランス−エノイルＣｏＡにした後、エノイルＣｏＡヒ
ドラターゼ、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナ
ーゼ、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼを作用させＮＡ
ＤＨの増加量を測定してもよい。

【００３５】前記測定法（ハ）〔残存ＣｏＡの測定〕と
しては、以下の反応式（８）に示すように、残存するＣ
ｏＡをＳＨ基定量試薬である５，５’−ジチオビス−２
−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）等で測定することができ
る。

【００３６】

【化６】

【００３７】脂肪酸を測定する前記の方法の他に、前記
反応式（１）で脂肪酸と共に生成するモノグリセライド
を以下の反応式（９）に示すようにグリセロールに変
え、そのグリセロールを測定する方法もある。

【００３８】

【化７】

【００３９】即ち、モノグリセライドリパーゼの作用に
よってモノグリセライドからグリセロールと脂肪酸を生
成する（９）。このグリセロールは、ＡＴＰの存在下に
グリセロキナーゼにより、グリセロリン酸とＡＤＰを生
成し（１０）、更にグリセロリン酸はグリセロリン酸オ
キシダーゼによって、ジヒドロキシアセトンリン酸を生
成し、同時にＨ₂Ｏ₂を生じる（１１）。生成したＨ₂
Ｏ₂を前記の脂肪酸の場合と同様に公知の比色法によっ
て測定することができる。このように脂肪酸量としてだ
けではなく、モノグリセライド量（特開昭63-245672 号
公報）や、その代謝物であるグリセロール量（特開平1-
265899号公報) として測定する場合、本発明の組成物を
そのままリパーゼ測定用の基質溶液として用いてもよい
が、リパーゼ機能促進剤であるコリパーゼや胆汁酸塩を
添加するのが好ましい。更に、本発明の組成物とともに
各々の検出系の構成に必要な試薬を添加してもよい。

【００４０】基質としてモノグリセライドを用いる場合
には、前記式（９）〜（１１）で示した反応を利用する
ことができる。この時は、モノグリセライドリパーゼは
添加する必要はない。ヒト由来リパーゼの作用（基質特
異性）により、好ましくは、１−モノグリセライドを基
質として用いる。基質としてモノ−、ジ−又はトリグリ
セライドのいずれを用いるかは、被検試料中に含まれる
と予想されるリパーゼの種類によって選択することがで
きる。

【００４１】本発明によるリパーゼ活性測定方法は、基
質溶液として前記の水性透明液を用いる点でのみ従来の
リパーゼ活性測定方法と異なるだけで、その他の点では
従来法の操作及び試薬などをそのまま適用することがで
きるので、本発明方法で用いる「グリセライドからリパ
ーゼの作用によって生成される化合物に作用して検出可
能な変化を生ずることのできる試薬」は、被検試料の種
類や測定系の種類に応じて当業者が適宜選択することが
できるものである。被検試料も従来法のものと特に異な
るものではないので、当業者が適宜容易に準備や調整す
ることができるものである。従って、本発明方法で用い
る被検試料も、リパーゼを含有するおそれのあるもので
ある限り特に制限されるものではないが、特には、生体
試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、膵液等である。

【００４２】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１トリパルミチン１００mgをビーカーにとり、その量に対
してパルミチン酸５．０重量％を添加し、精製水１００
mlを加えた。温浴中で７０℃に加温し、５分間超音波処
理（５０Ｗ）を行なった。また、トリパルミチンに替え
て、１，２−ジパルミチン及び１，３−ジパルミチンそ
れぞれ１００mgを用いて同様の操作を行い、得られた基
質液を以下の実施例に使用した。更に、パルミチン酸に
替えてステアリルアミンを用いて同様に基質溶液を調製
した。

【００４３】実施例２反応生成物である脂肪酸を酵素法により測定した。即
ち、試験管に基質液として実施例１で調製した０．１％
トリパルミチン液（パルミチン酸含有）５０μｌを加
え、更にコファクターとして２０mMトリス塩酸緩衝液
（pH８．０）に溶解した１mg／mlのコリパーゼ（ブタ膵
臓由来）５μｌ、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．
８）に溶解した６．７mMデオキシコール酸１０μｌ及び
５０mM塩化カルシウム水溶液１μｌを添加してよく混和
した。３７℃で予加温をした後、リパーゼ溶液（予めリ
パーゼ活性値を求めておいた、ヒト膵液の５種の希釈
列）１μｌを加え、３７℃で反応させた。５分後に、
３．３mM４−アミノアンチピリンと０．２mMコエンザイ
ムＡと０．３Ｕ／mlのアシルコエンザイムＡシンセター
ゼとを含む２０mMグッド緩衝液（pH７．０）５００μｌ
を添加し、更に加温を継続して５分後に１mMＮ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−
トルイジンナトリウムと０．１mg／mlのペルオキシダー
ゼと１．５Ｕ／mlのアシルコエンザイムＡオキシダーゼ
とを含む５０mMグッド緩衝液（pH７．０）１mlを添加し
た。３７℃で５分間反応させた後、精製水を対照にして
５５０nmでの吸光度を測定した。図１に示すように良好
な結果を得た。ステアリルアミンを用いて得られたトリ
パルミチン基質液を使った場合も同様に良好な結果を得
た。なお、図１のリパーゼ希釈列において「１．０」
は、使用したリパーゼ溶液の活性値が５１．５Ｕ／リッ
トル（反応時）に相当する。

【００４４】実施例３リパーゼ反応の経時変化を脂肪酸量として酵素法により
測定した。試験管に基質液として実施例１で調製した
０．１％１，２−ジパルミチン液（パルミチン酸含有）
５００μｌを加え、更にコファクターとして２０mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH８．０）に溶解した１mg／mlのコリパ
ーゼ５０μｌ、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．８）
に溶解した６．７mMデオキシコール酸１００μｌ及び５
０mM塩化カルシウム水溶液１０μｌを添加して混和し
た。更に、リパーゼ溶液１０μｌを加え、３７℃に加温
して経時的に反応液５０μｌずつを試料として分取し
た。この試料を実施例２と同様の操作により反応させた
後、精製水を対照として５５０nmの吸光度を測定した。
また、１，２−ジパルミチンの替わりに１，３−ジパル
ミチン又はトリパルミチンを用いて同様に測定を行なっ
た。結果を図２に示した。なお、使用したリパーゼ溶液
の活性値は７７．４Ｕ／リットル（反応時）であった。
図２において、線１は１，２−ジパルミチン、線２はト
リパルミチン、そして線３は１，３−ジパルミチンのそ
れぞれの結果を示す。

【００４５】実施例４本例ではエステラーゼとの比較を行った。即ち、試料と
して種々の濃度のリパーゼ溶液と、種々の濃度のエステ
ラーゼ溶液を用い、基質として凍結乾燥したトリパルミ
チン粉末を精製水１mlで再溶解して用いた。他は実施例
２と同様に測定を行った。結果を図３に示した。図３に
おいて線４はリパーゼ、そして線５はエステラーゼであ
る。良好な反応性を示したリパーゼ（図３の１．０の反
応時で５１．８Ｕ／リットル）とは対照的に１３９２Ｕ
／ml（酵素液原液：図４の１．０に相当）までのエステ
ラーゼでも全く反応しないことが明らかであった。基質
として用いたトリパルミチン凍結乾燥粉末は以下のよう
に調製した。０．１％水性透明液９容量部に対して、賦
形剤としての３０％フィコール４００〔ショ糖とエピク
ロルヒドリンとの水易溶性合成高分子化合物（分子量約
４０万；ファルマシア社製）〕及び２０％ショ糖を含む
水溶液１容量部を混和し、１０ml用バイアル瓶に１mlず
つ分注し、−６０℃で冷却凍結して真空乾燥した。

【００４６】実施例５本例では界面活性剤を用いる従来法（特開平2-243617号
公報）との比較を行った。即ち、従来法による基質の作
成では、非イオン性界面活性剤としてエマルゲン７０９
（ポリオキシエチレン高級アルコール；曇点５６℃）
３．５ｇを精製水３２mlに溶解し、５６℃以上に加熱す
ると溶液が曇点に達して白濁した。そこへトリオレイン
０．３５ｇを添加し、５６℃以上に保ちながら約３０分
間攪拌してから加熱を止め、攪拌を続けながら放置し
た。液が透明となった時点で、フィコール４００（３
％）及びショ糖（２％）を含む水溶液３１５mlで希釈し
た。得られた溶液５mlをバイアル瓶に分注して凍結乾燥
を行ない保存した。保存しておいたバイアルの１瓶を精
製水５mlで溶解し、更に０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH
８．０）で３．３倍に希釈した。試験管にこの基質液５
０μｌと、コファクターとして２０mMトリス塩酸緩衝液
（pH８．０）に溶解した０．１８mg／mlのコリパーゼ５
μｌ、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．８）に溶解し
た５２mMデオキシコール酸１０μｌ及び７４mM塩化カル
シウム水溶液１μｌを添加してよく混和した。３７℃に
予加温をした後、リパーゼ溶液２μｌを加え、３７℃で
反応させた。５分後に、３．３mM４−アミノアンチピリ
ン及び０．２mMコエンザイムＡ０．３Ｕ／mlのアシルコ
エンザイムＡシンセターゼを含む２０mMグッド緩衝液
（pH７．０）２００μｌを添加し、更に加温を継続して
５分後に１mMＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム、０．３
mg／mlのペルオキシダーゼと１．５Ｕ／mlのアシルコエ
ンザイムＡオキシダーゼとを含む５０mMグッド緩衝液
（pH７．０）４００μｌを添加した。３７℃で５分間反
応させた後、精製水を対照にして５５０nmでの吸光度を
測定した。

【００４７】他方、本発明方法においては実施例１で調
製した０．１％１，２−ジパルミチン液（パルミチン酸
含有）５０μｌ、コファクターとして２０mMトリス塩酸
緩衝液（pH８．０）に溶解した１mg／mlのコリパーゼ５
μｌ、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．８）に溶解し
た６．７mMデオキシコール酸１０μｌ及び５０mM塩化カ
ルシウム水溶液１μｌを試験管に添加して混和した。こ
れにリパーゼ液２μｌを加え、３７℃で反応させた。続
いて、前記の従来法の場合と同様に測定を行ない、得ら
れた結果を表１に示した。本発明方法は従来法と比べて
測定感度及び再現性において良好な結果を示した。

【００４８】実施例６反応生成物であるモノグリセライドを酵素法により測定
した。即ち、実施例２と同様の操作により、３７℃でト
リパルミチンを基質としてコファクター存在下に反応さ
せた。５分後に１Ｕ／mlのモノグリセライドリパーゼ、
０．５Ｕ／mlのグリセロキナーゼ、２０Ｕ／mlのグリセ
ロリン酸オキシダーゼ、０．５mMアデノシン三リン酸
（ＡＴＰ）、０．７mM塩化マグネシウム、１０mM塩化ア
ンモニウム、１．１mM４−アミノアンチピリン、０．７
mMＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）−ｍ−トルイジンナトリウム、０．１mg／mlのペ
ルオキシダーゼを含む２０mMグッド緩衝液（pH７．７）
１．５mlを添加した。３７℃で５分間反応させ、精製水
を対照に５５０nmの吸光度を測定した。結果を図４に示
した。

【００４９】

【表１】

【００５０】

【発明の効果】本発明によれば、少量の脂肪酸及び／又
は脂肪族アミンを用いて調製した、水不溶性グリセライ
ドの安定な水性透明液を、リパーゼ活性の検出又は測定
用基質液として用いるので、比色技術を用いることがで
きる。また、基質液に界面活性剤が含まれていないの
で、界面活性剤由来によるロット差が解消され、試薬成
分の安定性も向上する。

【図面の簡単な説明】

【図１】トリグリセライドから生成される脂肪酸量とリ
パーゼ濃度との関係を示すグラフである。

【図２】各種グリセライドとリパーゼ反応時間との関係
を示すグラフである。

【図３】本発明の基質液に対するリパーゼ及びエステラ
ーゼの作用を示すグラフである。

【図４】トリグリセライドから生成されるモノグリセラ
イド量とリパーゼ濃度との関係を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭60−262600（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/25 - 1/61 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】グリセライドと脂肪酸又は脂肪族アミン
とを、超微粒子化された状態で、水中に均質に含有する
ことを特徴とする、リパーゼ活性測定用組成物。
【請求項２】グリセライドと脂肪酸又は脂肪族アミン
とを超微粒子化された状態で均質に含有し、更に賦形剤
を含有することを特徴とする、リパーゼ活性測定用粉末
状組成物。
【請求項３】グリセライドからリパーゼの作用によっ
て生成される化合物に作用して検出可能な変化を生ずる
ことのできる試薬の存在下に、グリセライド及び脂肪酸
又は脂肪族アミンを超微粒子化された状態で水中に均質
に含有する組成物と被検試料とを接触させ、前記の検出
可能な変化を検出することを特徴とする、リパーゼの活
性測定方法。