JP3138889B2 - イソクエン酸脱水素酵素反応の停止剤、及び停止方法 - Google Patents
イソクエン酸脱水素酵素反応の停止剤、及び停止方法Info
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- JP3138889B2 JP3138889B2 JP04160015A JP16001592A JP3138889B2 JP 3138889 B2 JP3138889 B2 JP 3138889B2 JP 04160015 A JP04160015 A JP 04160015A JP 16001592 A JP16001592 A JP 16001592A JP 3138889 B2 JP3138889 B2 JP 3138889B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本願発明は、イソクエン酸脱水素
酵素（ＩＣＤＨ）反応の停止剤、及び停止方法に関す
る。更に詳しくは、試料の前処理によって生成したＮＡ
Ｄ+ またはＮＡＤＰ+ を夫々ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ
に還元するために使用した、イソクエン酸脱水素酵素
（ＩＣＤＨ）の反応を停止するための停止剤、及び停止
方法に関するものである。本明細書において、ＩＣＤＨ
とはイソクエン酸脱水素酵素、ＮＡＤ+ とは酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＰ+ とは酸
化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト、ＮＡＤＨとは還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド、ＮＡＤＰＨとは還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフェートをいう。
酵素（ＩＣＤＨ）反応の停止剤、及び停止方法に関す
る。更に詳しくは、試料の前処理によって生成したＮＡ
Ｄ+ またはＮＡＤＰ+ を夫々ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ
に還元するために使用した、イソクエン酸脱水素酵素
（ＩＣＤＨ）の反応を停止するための停止剤、及び停止
方法に関するものである。本明細書において、ＩＣＤＨ
とはイソクエン酸脱水素酵素、ＮＡＤ+ とは酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＰ+ とは酸
化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト、ＮＡＤＨとは還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド、ＮＡＤＰＨとは還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフェートをいう。
【０００２】
【従来の技術】臨床診断の分野において、ＮＡＤＨまた
はＮＡＤＰＨから、ＮＡＤ+ またはＮＡＤＰ+ への反応
速度または、反応量を測定することにより、生体液、特
に血液中や尿中に存在する目的物質（例えば尿素や中性
脂肪等）や、これらに関する各種酵素の活性を測定する
ことが日常的に行われている。
はＮＡＤＰＨから、ＮＡＤ+ またはＮＡＤＰ+ への反応
速度または、反応量を測定することにより、生体液、特
に血液中や尿中に存在する目的物質（例えば尿素や中性
脂肪等）や、これらに関する各種酵素の活性を測定する
ことが日常的に行われている。
【０００３】例えば尿素を定量する場合、ウレアーゼに
よってアンモニアを生成させ、生成したアンモニアを補
酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの共存下、グルタミン酸脱水素酵素
によって、α−ケトグルタル酸をグルタミン酸に変換す
るとき、 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ――→ＮＡＤ（Ｐ）+ の共役反応に伴って減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を波長
３４０ｎｍにて測定することによって尿素を定量できる
ことが知られている。また中性脂肪を定量する場合に
は、リパーゼによって脂肪酸を生成させ、次いでＣｏ
Ａ、ＡＴＰの存在下でアシルＣｏＡシンセターゼにより
アシルＣｏＡ、ＡＭＰ、ピロリン酸を生成させる。この
生成ＡＭＰはミオキナーゼの作用によってＡＤＰとな
り、ＡＤＰはホスホエノールピルビン酸と共にピルビン
酸キナーゼの作用を受けてＡＴＰとピルビン酸を生成す
るので、生成したピルビン酸を補酵素ＮＡＤＨの共存下
乳酸脱水素酵素によって乳酸に変換するとき、 ＮＡＤＨ――→ＮＡＤ+ の共役反応に伴って減少するＮＡＤＨの量を波長３４０
ｎｍにて測定することによって中性脂肪を定量できるこ
とが知られている。
よってアンモニアを生成させ、生成したアンモニアを補
酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの共存下、グルタミン酸脱水素酵素
によって、α−ケトグルタル酸をグルタミン酸に変換す
るとき、 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ――→ＮＡＤ（Ｐ）+ の共役反応に伴って減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を波長
３４０ｎｍにて測定することによって尿素を定量できる
ことが知られている。また中性脂肪を定量する場合に
は、リパーゼによって脂肪酸を生成させ、次いでＣｏ
Ａ、ＡＴＰの存在下でアシルＣｏＡシンセターゼにより
アシルＣｏＡ、ＡＭＰ、ピロリン酸を生成させる。この
生成ＡＭＰはミオキナーゼの作用によってＡＤＰとな
り、ＡＤＰはホスホエノールピルビン酸と共にピルビン
酸キナーゼの作用を受けてＡＴＰとピルビン酸を生成す
るので、生成したピルビン酸を補酵素ＮＡＤＨの共存下
乳酸脱水素酵素によって乳酸に変換するとき、 ＮＡＤＨ――→ＮＡＤ+ の共役反応に伴って減少するＮＡＤＨの量を波長３４０
ｎｍにて測定することによって中性脂肪を定量できるこ
とが知られている。
【０００４】ところが前記定量法においては、尿素から
生ずるアンモニアや中性脂肪から生ずる脂肪酸等は検体
中に元々存在しているため、予め前処理（尿素から生ず
るアンモニア、中性脂肪から生ずる脂肪酸測定と同様な
処理）により除去しておく必要がある。しかしこれらの
前処理によっても、当然反応系に存在するＮＡＤ（Ｐ）
Ｈが消費されるので、目的物質を測定する際にＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ量の不足が生じるおそれがある。
生ずるアンモニアや中性脂肪から生ずる脂肪酸等は検体
中に元々存在しているため、予め前処理（尿素から生ず
るアンモニア、中性脂肪から生ずる脂肪酸測定と同様な
処理）により除去しておく必要がある。しかしこれらの
前処理によっても、当然反応系に存在するＮＡＤ（Ｐ）
Ｈが消費されるので、目的物質を測定する際にＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ量の不足が生じるおそれがある。
【０００５】このＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量の不足を補う方法と
して、イソクエン酸またはその塩（基質）、マグネシウ
ムイオンまたはマンガンイオン等の金属イオン、及びＩ
ＣＤＨ等を添加して共存させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成
したＮＡＤ（Ｐ）+ を再びＮＡＤ（Ｐ）Ｈにリサイクル
することで、目的物質を測定する本反応の際に必要なＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈの不足を補う前処理方法が開示された（特
開昭５９−３１６９７号）。さて、この前処理方法を行
えば、前処理終了後においては、ＩＣＤＨを不活性化し
て、反応が全く起こらないように（完全に停止）してお
く必要がある（さもないと目的物質を測定する本反応の
際にも、ＮＡＤ（Ｐ）+ とＮＡＤ（Ｐ）Ｈがリサイクル
してしまい測定が困難となるからである）。
して、イソクエン酸またはその塩（基質）、マグネシウ
ムイオンまたはマンガンイオン等の金属イオン、及びＩ
ＣＤＨ等を添加して共存させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成
したＮＡＤ（Ｐ）+ を再びＮＡＤ（Ｐ）Ｈにリサイクル
することで、目的物質を測定する本反応の際に必要なＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈの不足を補う前処理方法が開示された（特
開昭５９−３１６９７号）。さて、この前処理方法を行
えば、前処理終了後においては、ＩＣＤＨを不活性化し
て、反応が全く起こらないように（完全に停止）してお
く必要がある（さもないと目的物質を測定する本反応の
際にも、ＮＡＤ（Ｐ）+ とＮＡＤ（Ｐ）Ｈがリサイクル
してしまい測定が困難となるからである）。
【０００６】以上の観点から、例えばＮＡＤ+ を補酵素
とするＩＣＤＨによる、イソクエン酸――→α−ケトグ
ルタル酸で表される反応を、ＡＴＰ（アデノシン三リン
酸）または／及びキレート剤を添加することにより停止
する方法（特開昭６１−２４７４００号）が、またＮＡ
ＤＰ+ を補酵素とするＩＣＤＨ反応を、キレート剤の添
加によって停止する方法（特開昭６２−６６９９号）が
開示された。
とするＩＣＤＨによる、イソクエン酸――→α−ケトグ
ルタル酸で表される反応を、ＡＴＰ（アデノシン三リン
酸）または／及びキレート剤を添加することにより停止
する方法（特開昭６１−２４７４００号）が、またＮＡ
ＤＰ+ を補酵素とするＩＣＤＨ反応を、キレート剤の添
加によって停止する方法（特開昭６２−６６９９号）が
開示された。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の停止方法によれば、例えばクレアチンキナーゼやピル
ビン酸キナーゼのようなＡＴＰを生成する反応系に、Ｉ
ＣＤＨの活性を止める為に別途ＡＴＰを添加するので、
これら酵素の反応性が悪くなる欠点がある。また、キレ
ート剤を添加して反応を停止する方法は、金属イオン要
求性の酵素、例えばクレアチンキナーゼやピルビン酸キ
ナーゼ等を用いる反応系には使用することができない。
更に、ＮＡＤＰ+ を補酵素とするＩＣＤＨの場合、停止
剤としてＡＴＰを用いることができないこと、また停止
効果が不十分であるなど、ＩＣＤＨの特性差、即ちＮＡ
Ｄ+ を補酵素とするＩＣＤＨと、ＮＡＤＰ+ を補酵素と
するＩＣＤＨでは、その反応停止方法が異なる等の問題
点がある。すなわち、一般にキレート剤やＡＴＰなどの
影響を受ける酵素は数多くあるため、ＩＣＤＨの反応停
止効果が高く、かつ反応系に用いられる酵素等に影響を
与えないＩＣＤＨの反応停止剤及び停止方法の開発が強
く望まれていたのである。
の停止方法によれば、例えばクレアチンキナーゼやピル
ビン酸キナーゼのようなＡＴＰを生成する反応系に、Ｉ
ＣＤＨの活性を止める為に別途ＡＴＰを添加するので、
これら酵素の反応性が悪くなる欠点がある。また、キレ
ート剤を添加して反応を停止する方法は、金属イオン要
求性の酵素、例えばクレアチンキナーゼやピルビン酸キ
ナーゼ等を用いる反応系には使用することができない。
更に、ＮＡＤＰ+ を補酵素とするＩＣＤＨの場合、停止
剤としてＡＴＰを用いることができないこと、また停止
効果が不十分であるなど、ＩＣＤＨの特性差、即ちＮＡ
Ｄ+ を補酵素とするＩＣＤＨと、ＮＡＤＰ+ を補酵素と
するＩＣＤＨでは、その反応停止方法が異なる等の問題
点がある。すなわち、一般にキレート剤やＡＴＰなどの
影響を受ける酵素は数多くあるため、ＩＣＤＨの反応停
止効果が高く、かつ反応系に用いられる酵素等に影響を
与えないＩＣＤＨの反応停止剤及び停止方法の開発が強
く望まれていたのである。
【０００８】本願発明者等は、ＮＡＤ（Ｐ）+ を補酵素
とするＩＣＤＨによって、ＮＡＤ（Ｐ）+ をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに変換した後、該ＩＣＤＨ反応を効率的に停止
することができると共に、目的物質を測定する反応系
（本反応）には影響を与えないＩＣＤＨ反応の停止剤、
及び停止方法を開発すべく鋭意研究した結果、胆汁酸ま
たはその塩類が極めて有効であることを知り、本願発明
を完成した。
とするＩＣＤＨによって、ＮＡＤ（Ｐ）+ をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに変換した後、該ＩＣＤＨ反応を効率的に停止
することができると共に、目的物質を測定する反応系
（本反応）には影響を与えないＩＣＤＨ反応の停止剤、
及び停止方法を開発すべく鋭意研究した結果、胆汁酸ま
たはその塩類が極めて有効であることを知り、本願発明
を完成した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本願発明は以上の問題点
を解消するためになされたもので、次の（１）〜（３）
の請求項により構成されている。 （１）胆汁酸またはその塩類を含むことを特徴とするイ
ソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）反応の停止剤。 （２）胆汁酸またはその塩類を添加することを特徴とす
るイソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）反応の停止方
法。 （３）イソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）反応を用い
て、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ+ ）または酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフェート（ＮＡＤＰ+ ）を還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
（ＮＡＤＰＨ）に変換（還元）した後、胆汁酸またはそ
の塩類から選択される１種類以上を添加することによっ
て該反応を停止させることを特徴とするイソクエン酸脱
水素酵素の反応停止方法。
を解消するためになされたもので、次の（１）〜（３）
の請求項により構成されている。 （１）胆汁酸またはその塩類を含むことを特徴とするイ
ソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）反応の停止剤。 （２）胆汁酸またはその塩類を添加することを特徴とす
るイソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）反応の停止方
法。 （３）イソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）反応を用い
て、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ+ ）または酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフェート（ＮＡＤＰ+ ）を還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
（ＮＡＤＰＨ）に変換（還元）した後、胆汁酸またはそ
の塩類から選択される１種類以上を添加することによっ
て該反応を停止させることを特徴とするイソクエン酸脱
水素酵素の反応停止方法。
【００１０】本願発明で用いられるＩＣＤＨ反応の停止
剤は、胆汁酸若しくはその塩類、またはこれらを含むこ
とを特徴としている。また、本願発明のＩＣＤＨ反応の
停止方法は、胆汁酸またはその塩類をＩＣＤＨ反応系に
添加することを特徴としている。ここで胆汁酸またはそ
の塩類とは、コラン酸を母体とするステロイドのヒドロ
キシ酸またはその塩であり、具体的には、例えば、コー
ル酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオ
キシコール酸、リトコール酸、デヒドロコール酸、ケノ
デオキシコール酸等またはその塩等が挙げられる。これ
らの胆汁酸または塩類から選択されるものを単独に、あ
るいは複数種を適宜組合せて用いることができる。
剤は、胆汁酸若しくはその塩類、またはこれらを含むこ
とを特徴としている。また、本願発明のＩＣＤＨ反応の
停止方法は、胆汁酸またはその塩類をＩＣＤＨ反応系に
添加することを特徴としている。ここで胆汁酸またはそ
の塩類とは、コラン酸を母体とするステロイドのヒドロ
キシ酸またはその塩であり、具体的には、例えば、コー
ル酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオ
キシコール酸、リトコール酸、デヒドロコール酸、ケノ
デオキシコール酸等またはその塩等が挙げられる。これ
らの胆汁酸または塩類から選択されるものを単独に、あ
るいは複数種を適宜組合せて用いることができる。
【００１１】これらの添加量としては、ＩＣＤＨの反応
を停止させるに十分な量であれば特に限定されないが、
例えばＩＣＤＨ１．０ＩＵ／ｍｌ（国際単位）に対し
て、最終濃度として１．０ｍＭ以上、好ましくは２．０
ｍＭ以上、特に好ましくは３．０ｍＭ以上の濃度となる
ように胆汁酸またはその塩類を添加して存在させれば良
い。また複数種を組合せて用いる場合でも、それぞれの
総量が上述の濃度以上あれば良い。胆汁酸またはその塩
類の濃度が低く過ぎると、ＩＣＤＨ反応の停止が不十分
で好ましくなく、また、必要以上に添加すると溶解性の
面で好ましくない。
を停止させるに十分な量であれば特に限定されないが、
例えばＩＣＤＨ１．０ＩＵ／ｍｌ（国際単位）に対し
て、最終濃度として１．０ｍＭ以上、好ましくは２．０
ｍＭ以上、特に好ましくは３．０ｍＭ以上の濃度となる
ように胆汁酸またはその塩類を添加して存在させれば良
い。また複数種を組合せて用いる場合でも、それぞれの
総量が上述の濃度以上あれば良い。胆汁酸またはその塩
類の濃度が低く過ぎると、ＩＣＤＨ反応の停止が不十分
で好ましくなく、また、必要以上に添加すると溶解性の
面で好ましくない。
【００１２】このように構成した本願発明の反応系を図
１に示す。前記反応（１）で、目的物質以外の物質によ
りＮＡＤ（Ｐ）Ｈが消費される。ここで消費されたＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈを、反応（２）、つまりＩＣＤＨによる共役
反応によりＮＡＤ（Ｐ）+ をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換させ
て消費された分を補充する。この目的物質以外の物質が
全て反応した後、胆汁酸またはその塩類を添加して反応
（２）を完全に停止させる。次いで、本来の目的物質あ
るいはそれから誘導される物質による反応（１）を行
い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量や減少速度（あるいはＮＡ
Ｄ（Ｐ）+ の生成量や生成速度）を、例えば波長３４０
ｎｍ付近における吸光度を測定し、目的物質を正確に定
量することができる。
１に示す。前記反応（１）で、目的物質以外の物質によ
りＮＡＤ（Ｐ）Ｈが消費される。ここで消費されたＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈを、反応（２）、つまりＩＣＤＨによる共役
反応によりＮＡＤ（Ｐ）+ をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換させ
て消費された分を補充する。この目的物質以外の物質が
全て反応した後、胆汁酸またはその塩類を添加して反応
（２）を完全に停止させる。次いで、本来の目的物質あ
るいはそれから誘導される物質による反応（１）を行
い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量や減少速度（あるいはＮＡ
Ｄ（Ｐ）+ の生成量や生成速度）を、例えば波長３４０
ｎｍ付近における吸光度を測定し、目的物質を正確に定
量することができる。
【００１３】反応式中のＭｇ2+はＩＣＤＨ反応の必須金
属であり、マグネシウムイオンの他に、マンガンイオ
ン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオン等を使用するこ
とができる。
属であり、マグネシウムイオンの他に、マンガンイオ
ン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオン等を使用するこ
とができる。
【００１４】本発明で使用するＩＣＤＨは、酵母由来あ
るいは細菌由来等その起源は限定されることはなく、Ｎ
ＡＤ+ を補酵素とするＩＣＤＨあるいはＮＡＤＰ+ を補
酵素とするＩＣＤＨのどちらでも、その特性に関係なく
用いることができる。
るいは細菌由来等その起源は限定されることはなく、Ｎ
ＡＤ+ を補酵素とするＩＣＤＨあるいはＮＡＤＰ+ を補
酵素とするＩＣＤＨのどちらでも、その特性に関係なく
用いることができる。
【００１５】前記反応系を応用して、生体液中特に血液
中や尿中等に含まれる尿素、中性脂肪、リパーゼ活性等
の測定を行う場合、生体液中に含まれる反応系中間産生
物質の影響をまったく受けずに、それらを正確に測定す
ることができる。
中や尿中等に含まれる尿素、中性脂肪、リパーゼ活性等
の測定を行う場合、生体液中に含まれる反応系中間産生
物質の影響をまったく受けずに、それらを正確に測定す
ることができる。
【００１６】本発明において、胆汁酸またはその塩類に
よるＩＣＤＨ反応の停止方法は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨの双方の系で使用することができ、また、反応停止
効果も極めて高いものである。それにより、目的物質を
正確に定量できるという、優れた効果を有するものであ
る。
よるＩＣＤＨ反応の停止方法は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨの双方の系で使用することができ、また、反応停止
効果も極めて高いものである。それにより、目的物質を
正確に定量できるという、優れた効果を有するものであ
る。
【００１７】以下に実施例により、本発明の具体例を示
すが、本発明はこれにより限定されるものではない。
すが、本発明はこれにより限定されるものではない。
＜実施例１＞以下の試薬を調製した。 試薬Ａ：ＮＡＤ+ を補酵素とするＩＣＤＨ（オリエンタ
ル酵母社製）１００Ｕ／ｍｌを含むグリセロール溶液。 試薬Ｂ：表１に示す各胆汁酸 ０〜１０ｍ
Ｍ 試薬Ｃ：塩化マグネシウム・６水塩 ５．０ｍ
Ｍ イソクエン酸 ２０．０ｍＭ ＮＡＤ+ ２．０ｍＭ 上記を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） 操作：試薬Ａ ２５μｌと試薬Ｂ １．６ｍｌを混合、
攪拌し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｃを０．４ｍｌ添
加する。添加後から１分間にかけての波長３４０ｎｍに
おける吸光度変化量等によってＩＣＤＨ活性を求めた。
結果を表１に示す。比較例として、各胆汁酸に代えてＡ
ＴＰ、キレート剤としてＥＤＴＡ・２Ｎａを用いて同様
に操作を行った。結果を表１に示す。
ル酵母社製）１００Ｕ／ｍｌを含むグリセロール溶液。 試薬Ｂ：表１に示す各胆汁酸 ０〜１０ｍ
Ｍ 試薬Ｃ：塩化マグネシウム・６水塩 ５．０ｍ
Ｍ イソクエン酸 ２０．０ｍＭ ＮＡＤ+ ２．０ｍＭ 上記を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） 操作：試薬Ａ ２５μｌと試薬Ｂ １．６ｍｌを混合、
攪拌し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｃを０．４ｍｌ添
加する。添加後から１分間にかけての波長３４０ｎｍに
おける吸光度変化量等によってＩＣＤＨ活性を求めた。
結果を表１に示す。比較例として、各胆汁酸に代えてＡ
ＴＰ、キレート剤としてＥＤＴＡ・２Ｎａを用いて同様
に操作を行った。結果を表１に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】＜実施例２＞以下の試薬を調製した。 試薬Ｄ：ＮＡＤＰ+ を補酵素とするＩＣＤＨ（オリエン
タル酵母社製）１００Ｕ／ｍｌを含むグリセロール溶
液。 試薬Ｅ：表２に示す各胆汁酸 ０〜１０ｍ
Ｍ 試薬Ｆ：塩化マグネシウム・６水塩 ５．０ｍ
Ｍ イソクエン酸 ２０．０ｍＭ ＮＡＤＰ+ ２．０ｍＭ 上記を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） 操作：試薬Ｄ ２５μｌと試薬Ｅ １．６ｍｌを混合、
攪拌し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｆを０．４ｍｌ添
加する。添加後から１分間にかけての波長３４０ｎｍに
おける吸光度変化量によってＩＣＤＨ活性を求めた。結
果を表２に示す。比較例として、胆汁酸等に代えてＡＴ
Ｐ、キレート剤としてＥＤＴＡ・２Ｎａを用いて同様に
操作を行った。結果を表２に示す。
タル酵母社製）１００Ｕ／ｍｌを含むグリセロール溶
液。 試薬Ｅ：表２に示す各胆汁酸 ０〜１０ｍ
Ｍ 試薬Ｆ：塩化マグネシウム・６水塩 ５．０ｍ
Ｍ イソクエン酸 ２０．０ｍＭ ＮＡＤＰ+ ２．０ｍＭ 上記を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） 操作：試薬Ｄ ２５μｌと試薬Ｅ １．６ｍｌを混合、
攪拌し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｆを０．４ｍｌ添
加する。添加後から１分間にかけての波長３４０ｎｍに
おける吸光度変化量によってＩＣＤＨ活性を求めた。結
果を表２に示す。比較例として、胆汁酸等に代えてＡＴ
Ｐ、キレート剤としてＥＤＴＡ・２Ｎａを用いて同様に
操作を行った。結果を表２に示す。
【００２１】
【表２】
【００２２】表１及び表２の結果によれば、ＮＡＤ+ 、
またはＮＡＤＰ+ のいずれを補酵素とするＩＣＤＨ反応
であっても、本願発明の胆汁酸またはその塩類を添加す
れば、極めて低濃度でＩＣＤＨ反応を停止することが可
能である。
またはＮＡＤＰ+ のいずれを補酵素とするＩＣＤＨ反応
であっても、本願発明の胆汁酸またはその塩類を添加す
れば、極めて低濃度でＩＣＤＨ反応を停止することが可
能である。
【００２３】
【発明の効果】本願発明に係るイソクエン酸脱水素酵素
反応の停止剤及び停止方法は、以上のように構成したの
で、ＮＡＤ（Ｐ）+ を補酵素とするＩＣＤＨによって、
試料の前処理によって生成したＮＡＤ（Ｐ）+ をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに変換した後、該ＩＣＤＨ反応を効率的に停止
（不活性化）することができるので、目的物質を測定す
る際の反応系（本反応）には影響を与えることがない。
従って、生体液中特に血液中や尿中等に含まれる尿素、
中性脂肪、リパーゼ活性等の測定を行う場合、生体液中
に含まれる反応系中間産生物質の影響をまったく受けず
に、それらを正確に測定することができるという効果を
有する。
反応の停止剤及び停止方法は、以上のように構成したの
で、ＮＡＤ（Ｐ）+ を補酵素とするＩＣＤＨによって、
試料の前処理によって生成したＮＡＤ（Ｐ）+ をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに変換した後、該ＩＣＤＨ反応を効率的に停止
（不活性化）することができるので、目的物質を測定す
る際の反応系（本反応）には影響を与えることがない。
従って、生体液中特に血液中や尿中等に含まれる尿素、
中性脂肪、リパーゼ活性等の測定を行う場合、生体液中
に含まれる反応系中間産生物質の影響をまったく受けず
に、それらを正確に測定することができるという効果を
有する。
【図１】ＩＣＤＨ反応の説明図である。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭64−55179（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−214182（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−6699（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−22496（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−48482（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−247400（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−31697（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 胆汁酸またはその塩類を含むことを特徴
とするイソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）反応の停止
剤。 - 【請求項２】 胆汁酸またはその塩類を添加することを
特徴とするイソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）反応の
停止方法。 - 【請求項３】 イソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）反
応を用いて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤ+ ）または酸化型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ+ ）を還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）また
は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフ
ェート（ＮＡＤＰＨ）に変換（還元）した後、胆汁酸ま
たはその塩類から選択される１種類以上を添加すること
によって該反応を停止させることを特徴とするイソクエ
ン酸脱水素酵素の反応停止方法。
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| JP04160015A JP3138889B2 (ja) | 1992-05-28 | 1992-05-28 | イソクエン酸脱水素酵素反応の停止剤、及び停止方法 |
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| JP04160015A JP3138889B2 (ja) | 1992-05-28 | 1992-05-28 | イソクエン酸脱水素酵素反応の停止剤、及び停止方法 |
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| JPH067162A JPH067162A (ja) | 1994-01-18 |
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ID=15706139
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| JP (1) | JP3138889B2 (ja) |
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1992
- 1992-05-28 JP JP04160015A patent/JP3138889B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPH067162A (ja) | 1994-01-18 |
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